JPH02245194A - モノクローナル抗体の使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、フィブロネクチンレセプター（以下、ＦＮ−
Ｒと略称する）に対して特異性を有するモノクローナル
抗体及びその使用方法に関する。

〔従来の技術〕

ＦＮ−Ｒは細胞膜上の接着因子レセプターファミリーの
１つで、α鎮、β鎖より成るヘテロダイマーであり、フ
ィブロネクチンのＲＧＤ配列を含む細胞接着部位を特異
的に認識するレセプターである〔ザイエンス（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ）、第２３８巻、第４９１〜４９７頁、１９８７
年〕。Ｉ’Ｎ−ｎは細胞の接着現象に関与するのみでな
く、より広範な細胞現象、細胞の増殖、細胞の移動等に
も関与することが明らかになって来ている。また、細胞
癌化、分化において、ＦＮ−Ｈの量的、質的変化等が報
告され〔キャンサーリサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａ
ｒｃｈ）　、第４８巻、第５７３０〜５７３７頁（１９
８８年）、セル（Ｃｅｌｌ）　、第５６巻、第２８１〜
２９０頁（１９８９年）〕、その測定は病的変化等の診
断上重要である。

ＦＮ−Ｒの測定方法としては、細胞より界面活性剤等を
用いＦＮ−Ｒを可溶化、電気泳動後、モノクローナル抗
体、ポリクローナル抗体で検出する方法、細胞よりＩ’
Ｎ−Ｒを可溶化後、フィブロネクチンの細胞接着部位を
固定化したカラムを用いたアフィニティークロマトグラ
フィーで精製後、電気泳動を行い、そのＦＮ−Ｒ泳動バ
ンドを染色し測定する方法、細胞をラジオアイソトープ
で標識後、ＦＮ−Ｒを可溶化し、前述と同様、アフィニ
ティークロマトグラフィーで精製後、電気泳動を行い、
ＦＮ−Ｒバンドの放射活性を測定する方法がある。また
、標識化されたモノクローナル抗体、ポリクローナル抗
体を用いる組織学的方法も知られている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、従来法は細胞からの可溶化、精製、電気
泳動等の煩雑な操作が必要であり、その結果定量性に乏
しかった。一方、組織学的方法は、熟練を要し、かつ定
量性にも問題があった。また、血液、尿等の試料を用い
て、その試料中のＦＮ−Ｉｔを測定したこともなく、Ｆ
Ｎ−Ｉｔが各疾患で血中等に出て来ることも知られてい
ない。

すなわち本発明の目的は、抗ＦＮ−Ｒモノクローナル抗
体及びそれを用いた簡便で定量性に優れ、各疾患との相
関性を明らかにする測定方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は抗ＦＮ−Ｒ
モノクローナル抗体に関し、また第２の発明はＩ’Ｎ−
Ｒの測定方法に関する発明であって、生体試料中のＦＮ
−Ｈの免疫学的測寓に際して、上記第１の発明の抗ＦＮ
−Ｒモノクローナル抗体を使用することを特徴とする。

。 本発明者らは、前述した課題を克服するため鋭意研究を
重ねた結果、細胞融合によりＩ’Ｎ−Ｒに対して特異性
を有するモノクローナル抗体を取得することに成功し、
このモノクローナル抗体を用いれば、ＰＮ−Ｒを簡便に
精度よく測定可能であることを見出し、本発明を完成す
るに至った。

本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合法に
よって製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細
胞との間に、融合ハイブリドーマを形成させ、該ハイブ
リドーマをクローン化し、ＦＮ−Ｒに対し特異化を示す
抗体を産生ずるクローンを選択することによって製造さ
れる。抗体産生細胞は例えばＦＮ−Ｒによって免疫され
た動物からの肺細胞、リンパ節細胞、８９２２４球が使
用できる。免疫させる動物としては、マウス、ラット、
馬、ヤギ、ウサギなどが例示される。抗原としては例え
ばヒト胎盤由来のＦＮ−’Ｒが利用可能であり、例えば
次のようにして製造され、免疫に使用される。よト胎盤
より、ＦＮ＝Ｒをオクチルグルコピラノシドを用いて可
溶化し、次いで、フィブロネクチン細胞接着活性部位配
列（２７９アミノ酸）゛（特願昭６３３１８２０号）を
固定化したアフィニティークロマトグラフィーで精製す
る。かくして得られたＦＮ−Ｒを直接フロイントのアジ
ュバントと混合し、動物の免疫用として使用する。

免疫は動物の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に１回に２０
〜２００μｇ、２〜３週間に１回、３〜７週間投与する
ことによって行われる。最終免疫より約３〜５日後、免
疫動物から抗体産生細胞を分取する。

骨髄腫細胞としてはマウ・ス、ラット、ヒト等由来のも
のが使用される。細胞融合は例えばＧ。

ケラ−（Ｇ、　Ｋ＃ｈｌｅｒ）ネーチ＋　−（Ｎａｔｕ
ｒｅ）第２５６巻、第４９５頁（１９７５）に記載の方
法又はこれに準する方法によって行われる。この際３０
〜５０％ポリエヂレングリコール（分子量１０００〜４
０００）を用い、３０〜４０℃の温度下約１〜３分間程
度反応させることによって行われる。

細胞融合によって得られたハイブリドーマはスクリーニ
ングに付される。すなわち、スクリニングは酵素抗体法
等によって行われる。得られた抗体産生ハイブリドーマ
はクローニングに付される。すなわち、当該ハイブリド
ーマを例えば限界希釈法によってクローニングを行って
クローンを得る。得られたクローンは、次いで目的とす
るモノクローナル抗体を産生ずるクローンのスクリーニ
ングに付され、例えば酵素抗体法等によって行われる。

選ばれたクローンは、例えばあらかじめブリスタン（２
，６，１０，１４テトラメチルペンタデカン）を投与し
たＢ八ＬＢ／ｃマウスの腹腔内へ移植し、１０〜１４日
後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取する
。この腹水からのモノクローナル抗体の回収はＩｇの精
製法として従来既知の硫安分画法、ポリエチレングリコ
ール分画法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲルクロマ
トグラフ法等を応用することで容易に達成される。

かくして得られた抗ＦＮ−Ｒモノクローナル抗体は、生
体由来の試料、例えば血清、血しょう又は尿中のＦＮ−
Ｒを特異的に高感度で精度良く測定するために極めて好
適である。すなわち、従来は細胞試料中のＰＮ−Ｒのみ
が測定されていただけであり血液、又は尿中に疾患に伴
って、ＦＮ　−、Ｉｔが増加することは知られていなか
ったが、本発明によりその相関が明らかとなり、本発明
のモノクローナル抗体を用いることにより、疾患との相
関性及び定量性に優れた、しかも簡便なＦＮ−Ｒ測定方
法を確立することができた。この測定のために、モノク
ローナル抗体そのもの又はそれからの相応する免疫学的
特性を有するフラグメント、例えばＦａｂフラグメント
を使用することができる。

〔実施例〕

以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが
、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１モノクロ一ナル抗体の作成 （１）抗原の精製 ヒト胎盤を１００ｍＭオクチルグルコピラノシド、３ｍ
Ｍフェニルメチルスルホニルフルオライド、１５０　ｍ
Ｍ　ＮａＣ１を含む５０ｍＭ）リス・塩酸バッファー（
ｐｆ１７り中で細断し、１時間静置後１１００００ｒｐ
、２０分間の遠心処理を行いＦＮ−Ｒを含む、上澄画分
を得た。

２００　ｍｇのフィブロネクチン細胞接着部位配列（２
７９アミノ酸）を２０ｍｆ！のアガロースゲルに固定化
し、固定化カラムを作製し、２５ｍＭオクチルグルコピ
ラノシド、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライ
ド、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ　ｆｃ含む５０ｍＭ）リス塩
酸バッフ　ｙ　　（ｐＨ７，３）で平衡化した。この固
定化カラムに、前記遠心上澄画分を添加し、平衡化バッ
ファーで洗浄後、１０　ｍＭ　ＢＤＴＡを含む平衡化バ
ッファーで吸着蛋白質を溶出した。この溶出画分のＦＮ
−Ｉｔの純度を電気泳動で検削した結果、純度９０％以
上の画分２ｎ＋ｇ（ＢＳＡ換算値ニブラッドフォード法
）を得ることができ、その一部を抗原として使用した。

（２）　　マウスへの免疫 ＰＮ−Ｒを０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸
バッファー（ｐＨ７，４）に溶解し、フロイントの完全
アジュバントと１　：　１　　（ｖ／ｖ）の割合でよく
混合し、マウス１匹当りＦＮ−Ｒが５０Ｍｇとなるよう
に腹腔内に免疫した。初回免疫から２１日後にＩ’Ｎ−
Ｒ５０Ｍｇをフロイントの不完全アジュバントと混合し
腹腔的投与し、更にその１４日後、ＦＮ−Ｒ２０Ｍｇを
尾静脈より投与した。

（３）細胞融合及びクローニング 最終免疫の３日後にマウスの膵臓を取出し、その肺細胞
とマウスミエローマＰ３Ｕ１とを１０：１の割合で混合
し、前記ネーチャー記載のケラ−らの方法に準じて細胞
融合を行った。

次に、９６ウエルマイクロプレートに植え込み、ＨへＴ
　（ヒポキサンチンＩ　Ｘ　１０−’Ｍ、アミノプテリ
ン４　Ｘ　１０−’Ｍ、　ｆミジン１．６　Ｘ　１０−
５Ｍ）を含んだＤＭＢＭ−１０％ＦＣ３培地（ＩＩＡＴ
培地）で１０〜１７日間培養後、ＨＴ　（ヒポキサンチ
ン５１Ｘ１０−’Ｍ、チミジ’、’　　１．ＢｘｌＯ−
５Ｍ）を含んだＤＭＢＭ−、−１０％ＦＣ３培地（ＨＴ
培地）に移行し、更にフラスコ　（２５ｒｄ）に培養で
きるようになってからＤＭＢＭ−１０％ＦＣ３培地で培
養を続けた。

増殖の見られたウェルの培養上滑中の抗体価を酵素抗体
法により測定し、適切なウェルから限界希釈法により、
求めるハイブリドーマのクロニングを行った。すなわち
、マイクロプレートにウェル当り約２．５　Ｘ　１０　
’個のマウス胸腺細胞ヲ植工込ミ、次１．ｍ、ＤＭ［！
Ｍ培地で５．１、ｏ、５個１０．１ｍｇになるようにハ
イブリドーマを希釈し、これを上記マイクロプレートに
０．１ｒｄ／ウエルずつ植え込み培養した。培養開始後
１０〜１４日で肉眼で認められるコロニーが形成され、
クローン株を得た。

（４）　　スクリーニング法 ハイブリドーマ及びクローンが増殖したウェルの培養上
清を分取し、エンザイム　リンクドイムノソルベント　
アッセイ　（Ｅｎｚｙｍｅ　ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏ
ｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ　）　　（口ＬＩＳＡ）法
によりＰＮ・Ｒに対する抗体産生能を調べた。マイクロ
タイタープレートにＦＮ−Ｒを０．５μｇ１５０μＩｌ
／ウェルとなるように分注し、４℃で１８時間静置して
ＦＮ−Ｒを固相に吸着させた。１０ｍＭ！Ｊン酸緩衝生
理食塩水（Ｉ’ＢＳ）（ｐｆｌ　７．４）　２００μｌ
で３同各ウェルを洗浄した後、１％ウシ血清アルブミン
（口Ｓ八）含有ＰＢＳを１００μｍ／ウェル加え、３７
℃で１時間静置し、各ウェルの未吸着部分をブロックし
た。次いで、検体である培養液を５０μＩｌ／ウェル加
え、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄した
後、１０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウス
ＩｇＧ（カベル社製）を５０μＩｌ／ウエル添加し、３
７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで洗浄し、０、００１
％過酸化水素、０．５５　ｍｇ／　ｍ１２八ＢＴＳ［：
２゜２′−アジノージ（３−エチルベンゾチアシリ”Ｊ
−スＪＩｔ＊：＊−ト）］　　（ベーリンガーマンハイ
ム社製）を含む０．１　Ｍクエン酸バッファー（ｐ１１
４．０）を加え、波長４０５ｎｍでの吸光度を測定した
。試料中、ＦＮ−Ｒに対する抗体が存在した瑞合強い発
色がみられた。

この結果、抗体産生能の高いクローン株ＦＮＲ５及びＦ
ＮＲ−３１が得られた。

前記クローン株は、各々）Ｉｙｂｒｉｄｏｍａ　ＦＮＲ
−５と表示し微工研菌寄第１０６１０号（ＦＢＲＭ　Ｐ
−１０６１０）　、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ＦＮＲ−３１
と表示し微工研菌寄第１０６１１号（ＦＢＩｔＭ　Ｐ−
１０６１１）として、工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されている。

（５）モノクローナル抗体の作製 ７週令以上のＢＡＬＢ／ｃ系マウスにプリスタン（アル
ドリッチ社製）０．５ｍｌ！を腹腔内に投与し、１週間
以上経過した後、培養、増殖させたクローン株１〜９×
１０１１個／マウスを腹腔内接種した。１０〜１４日後
にマウスを殺し、腹水を採取した。これを３．００Ｏｒ
ｐｍ　１０分間遠心分離し、５〜１５−７匹のモノクロ
ーナル抗体含有腹水を得た。

（６）モノクローナル抗体の精製 上記（５）によって得られた腹水を脱脂綿でろ過して脂
肪を除き、５０ｍＭ！Ｉン酸バッファー（ｐＨ７，３）
で２倍希釈した後、等量の１００％飽和硫酸アンモニウ
ムを加え、沈殿画分を分取した。

この両分をなるべく少量の上記リン酸バッファーに溶解
させ、同バッファーに対して透析した。

このサンプルをＤＢＡＲ−セルロースカラムにかけ、抗
ＦＮ−Ｒモノクローナル抗体ＦＮＲ−５及び　ＦＮＲ３
１を得た。

（７）モノクローナル抗体の物理化学的性質の１ｇサブ
クラス　ＦＮＲ−５：　ＩｇＧ　２ａＦＮＲ−３１ニー
　ＩｇＧ　２− 精製したモノクローナル抗体の特定のクラスを、クラス
特異性抗マウスＩｇ抗体を使用してオフタロニーゲル拡
散試験で決定した。

■　分子量　　ＰＮＲ−５：　１５６．０００±５．０
００ＦＮＲ−３１：　　１６０．０００±５．０００Ｓ
Ｏ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２，５％）
でモノクローナル抗体の分子量を推定した。分子量マー
カーはバイオ−ラッド社の５Ｏ３−ＰへＧＢ分子量スタ
ンダード−旧ｇｈを用いた（ミオシン２００　ｋＤａ、
β・−ガラクトシダーゼ１１６　ｋＤａ、ホスホリパー
ゼｂ　９７　ｋＤａ。

血清アルブミン６６　ｋＤａ　、卵白アルブミン４３　
ｋＤａ）。

■　抗原との反応性 ＦＮＲ−５：　　ＦＮ−Ｒβ鎮を認識 ＦＮＲ−３１：　　ＦＮ−Ｒβ鎮を認識ＦＮ−Ｒを非還
元条件下でＳＯ３−ポリアクリルアミド電気泳動を行っ
た後、イムノプロット法によりＣＷ、　Ｎ、プルネット
（Ｗ、　Ｎ、Ｂｕｒｎｅｔｔｅ）、アナリティ力ルバイ
オケミストリー（Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）第１１２巻、第１９５〜２０３頁
（１９８１））モノクローナル抗体との反応性を検討し
た。

■　交差反応性 ＰＮＲ−５：ビトロネクチンレセプターと交差反応を示
さない ＦＮＲ−３１：　　　　　　同　　　上ヒト胎盤より、
ＦＮ−Ｒと同様の方法でビトロネクチンレセプターを可
溶化し、次いでＧＲＧＤＳＰペプチドを固定化したカラ
ムを用いビトロネクチンレセプターを精製した。このビ
トロネクチンレセプターを非還元条件下で５Ｏ６−ポリ
アクリルアミド電気泳動を行った後、イムノプロット法
によりｃ　ｗ、　Ｎ、ブルネ・ソト、アナリティ力ルバ
イオケミストリー、第１１２巻、第１９５〜２０３頁（
１９８１））モノクローナル抗体との反応性を検討した
。

実施例２　モノクローナル抗体を用いたサンドイッチＢ
ＩＡ法によるＦＮ−Ｒの測定 実施例１で得たモノクローナル抗体Ｉ’ＮＲ−５、ＦＮ
Ｒ−３１を用いてＩ’Ｎ−Ｒ測定試薬を調整した。

（１）　　ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識モノクロー
ナル抗体の作製 モノクローナル抗体ＰＮＲ−３１をナカネ法（前出）に
よりＰＯＤ標識した。

（２）　　サンドイッチＢＩＡ法による測定系９６ウエ
ルマイクロタイタープレートの各ウェルにＰＢＳに溶解
したモノクローナル抗体ＦＮＲ−５（１０μｇ／顎）を
１００μβずつ添加し４℃で１晩インキユベートし１．
溶液を捨てた後、１％ＢＳ八を含むＰＢＳ溶液を２００
μβずつ各ウェルに添加し、３７℃で１時間ブロッキン
グを行った。ＰＢＳでよく洗浄したのち、サンプル２０
μｌを添加して引続き１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈し
たＰＯＤ標識ＦＮＲ−３１抗体液１００μ！を添加して
３７℃で３０分間反応させた後、ＰＢＳで３回洗浄し、
０．００１％過酸化水素、０．５５１１１ｇ／　ｍｌ　
ＡＢＴＳを含む０．１Ｍクエン酸−水酸化ナトリウムバ
ッファー（ｐＨ’４．０）を加え、波長４０５ｎｍの吸
光度を測定した。

（３）試料の測定 健常人２９例、腎不全５例、肝障害・肝炎２９例、肝硬
変２０例、膵炎９例、脳梗塞２０例より得た血清を上記
ＥＩＡ法で測定した。この時、精製ＰＮ−Ｒを標準品と
して得た検量線から各々検体のＦＮ−Ｒ濃度を求めた。

結果を第１図に示す。すなわち第１図は本発明のモノク
ロナール抗体を用いたサンドイッチＥＩＡ法による血清
のＰＮ−Ｉｔ測定結果をｌ’Ｎ−Ｒ濃度（Ｂ　Ｓ　Ａ換
算値ニブラックフォード法）（μｇ／−１′縦軸）と各
血清サンプル（横軸）との関係を示す図である。

健常人では平均±ＳＤは０．２９±０．１０μｇ／ｍ１
２であった。また、腎不全では０．３２±０．１５μｇ
／−で健常群との間に差は認められなかった。一方、肝
障害・肝炎群、肝硬変群、膵炎群、脳梗塞群では各々０
．７３±０．５５μｇ／ｒｎ１．．１．９０±０．６５
μｇ／ｍｃ、０．７３±０．６９μｇ／ｍｐ、、０．５
８±０．５５μｇ／艷と健常群と比べ高値を示し、健常
群の平均＋３３Ｄをカットオフ（ｃｕｔ　ｏｆｆ）値と
した場合、肝障害・肝炎群では２９例中１４例に、肝硬
変では２０例中２０例に、膵炎群では９例中４例に、脳
梗塞群では２００例中５に、異常値を示す症例が君忍め
られた。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明した通り、本発明によりｌ？Ｎ・Ｒに対
するモノクローナル抗体が提供された。

本発明の千ツクローナル抗体を利用することにより、簡
便で特異性の高いＦＮ−Ｈの測定が可醜となり、ＦＮ−
Ｒの生理作用の研究、肝臓疾患、脳梗塞等の診断に非常
に有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のモノクローナル抗体を用いたサンドイ
ッチＥ、ＩＡ法による血清中のＦＮ−Ｒ濃度の測定結果
を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗フィブロネクチンレセプターモノクローナル抗体
   。 ２、生体試料中のフィブロネクチンレセプターの測定に
   当り、抗フィブロネクチンレセプターモノクローナル抗
   体を使用することを特徴とするフィブロネクチンレセプ
   ターの測定方法。