JP2613105B2 - モノクローナル抗体の使用方法 - Google Patents
モノクローナル抗体の使用方法Info
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- JP2613105B2 JP2613105B2 JP1063577A JP6357789A JP2613105B2 JP 2613105 B2 JP2613105 B2 JP 2613105B2 JP 1063577 A JP1063577 A JP 1063577A JP 6357789 A JP6357789 A JP 6357789A JP 2613105 B2 JP2613105 B2 JP 2613105B2
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- Japan
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- monoclonal antibody
- fnr
- cell
- antibody
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、フィブロネクチンレセプター（以下,FN・
Ｒと略称する）に対して特異性を有するモノクローナル
抗体の使用方法に関する。
Ｒと略称する）に対して特異性を有するモノクローナル
抗体の使用方法に関する。
FN・Ｒは細胞膜上の接着因子レセプターファミリーの
１つで、α鎖、β鎖より成るヘテロダイマーであり、フ
ィブロネクチンのRGD配列を含む細胞接着部位を特異的
に認識するレセプターである〔サイエンス（Scienc
e）、第238巻、第491〜497頁、1987年〕。FN・Ｒは細胞
の接着現象に関与するのみでなく、より広範な細胞現
象、細胞の増殖、細胞の移動等にも関与することが明ら
かになって来ている。また、細胞癌化、分化において、
FN・Ｒの量的、質的変化等が報告され〔キャンサーリサ
ーチ（Cancer Research）、第48巻、第5730〜5737頁（1
988年）、セル（Cell）、第56巻、第281〜290頁（1989
年）〕、その測定は病的変化等の診断上重要である。
１つで、α鎖、β鎖より成るヘテロダイマーであり、フ
ィブロネクチンのRGD配列を含む細胞接着部位を特異的
に認識するレセプターである〔サイエンス（Scienc
e）、第238巻、第491〜497頁、1987年〕。FN・Ｒは細胞
の接着現象に関与するのみでなく、より広範な細胞現
象、細胞の増殖、細胞の移動等にも関与することが明ら
かになって来ている。また、細胞癌化、分化において、
FN・Ｒの量的、質的変化等が報告され〔キャンサーリサ
ーチ（Cancer Research）、第48巻、第5730〜5737頁（1
988年）、セル（Cell）、第56巻、第281〜290頁（1989
年）〕、その測定は病的変化等の診断上重要である。
FN・Ｒの測定方法としては、細胞より界面活性剤等を
用いFN・Ｒを可溶化、電気泳動後、モノクローナル抗
体、ポリクローナル抗体で検出する方法、細胞よりFN・
Ｒを可溶化後、フィブロネクチンの細胞接着部位を固定
化したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィ
ーで精製後、電気泳動を行い、そのFN・Ｒ泳動バンドを
染色し測定する方法、細胞をラジオアイソトープで標識
後、FN・Ｒを可溶化し、前述と同様、アフィニティーク
ロマトグラフィーで精製後、電気泳動を行い、FN・Ｒバ
ンドの放射活性を測定する方法がある。また、標識化さ
れたモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体を用いる
組織学的方法も知られている。
用いFN・Ｒを可溶化、電気泳動後、モノクローナル抗
体、ポリクローナル抗体で検出する方法、細胞よりFN・
Ｒを可溶化後、フィブロネクチンの細胞接着部位を固定
化したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィ
ーで精製後、電気泳動を行い、そのFN・Ｒ泳動バンドを
染色し測定する方法、細胞をラジオアイソトープで標識
後、FN・Ｒを可溶化し、前述と同様、アフィニティーク
ロマトグラフィーで精製後、電気泳動を行い、FN・Ｒバ
ンドの放射活性を測定する方法がある。また、標識化さ
れたモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体を用いる
組織学的方法も知られている。
しかしながら、従来法は細胞からの可溶化、精製、電
気泳動等の煩雑な操作が必要であり、その結果定量性に
乏しかった。一方、組織学的方法は、熟練を要し、かつ
定量性にも問題があった。また、血液、尿等の試料を用
いて、その試料中のFN・Ｒを測定したこともなく、FN・
Ｒが各疾患で血中等に出て来ることも知られていない。
気泳動等の煩雑な操作が必要であり、その結果定量性に
乏しかった。一方、組織学的方法は、熟練を要し、かつ
定量性にも問題があった。また、血液、尿等の試料を用
いて、その試料中のFN・Ｒを測定したこともなく、FN・
Ｒが各疾患で血中等に出て来ることも知られていない。
すなわち本発明の目的は、抗FN・Ｒモノクローナル抗
体及びそれを用いた簡便で定量性に優れ、各疾患との相
関性を明らかにする測定方法を提供することにある。
体及びそれを用いた簡便で定量性に優れ、各疾患との相
関性を明らかにする測定方法を提供することにある。
本発明を概説すれば、本発明は疾病の検出方法に関す
る発明であって、生体試料中の体液可溶性FN・Ｒの量を
測定し、その値を健常値と比較することを特徴とする。
る発明であって、生体試料中の体液可溶性FN・Ｒの量を
測定し、その値を健常値と比較することを特徴とする。
本発明者らは、前述した課題を克服するため鋭意研究
を重ねた結果、細胞融合によりFN・Ｒに対して特異性を
有するモノクローナル抗体を取得することに成功し、こ
のモノクローナル抗体を用いれば、FN・Ｒを簡便に精度
よく測定可能であることを見出し、本発明を完成するに
至った。
を重ねた結果、細胞融合によりFN・Ｒに対して特異性を
有するモノクローナル抗体を取得することに成功し、こ
のモノクローナル抗体を用いれば、FN・Ｒを簡便に精度
よく測定可能であることを見出し、本発明を完成するに
至った。
本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合法
によって製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫
細胞との間に、融合ハイブリドーマを形成させ、該ハイ
ブリドーマをクローン化し、FN・Ｒに対し特異生を示す
抗体を産生するクローンを選択することによって製造さ
れる。抗体産生細胞は例えばFN・Ｒによって免疫された
動物からの脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球が使用で
きる。免疫させる動物としては、マウス、ラット、馬、
ヤギ，ウサギなどが例示される。抗原としては例えばヒ
ト胎盤由来のFN・Ｒが利用可能であり、例えば次のよう
にして製造され、免疫に使用される。ヒト胎盤より、FN
・Ｒをオクチルグリコピラノシドを用いて可溶化し、次
いで、フィブロネクチン細胞接着活性部位配列（279ア
ミノ酸）（特願昭63−31820号）を固定化したアフィニ
ティークロマトグラフィーで精製する。かくして得られ
たFN・Ｒを直接フロイントのアジュバントと混合し、動
物の免疫用として使用する。
によって製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫
細胞との間に、融合ハイブリドーマを形成させ、該ハイ
ブリドーマをクローン化し、FN・Ｒに対し特異生を示す
抗体を産生するクローンを選択することによって製造さ
れる。抗体産生細胞は例えばFN・Ｒによって免疫された
動物からの脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球が使用で
きる。免疫させる動物としては、マウス、ラット、馬、
ヤギ，ウサギなどが例示される。抗原としては例えばヒ
ト胎盤由来のFN・Ｒが利用可能であり、例えば次のよう
にして製造され、免疫に使用される。ヒト胎盤より、FN
・Ｒをオクチルグリコピラノシドを用いて可溶化し、次
いで、フィブロネクチン細胞接着活性部位配列（279ア
ミノ酸）（特願昭63−31820号）を固定化したアフィニ
ティークロマトグラフィーで精製する。かくして得られ
たFN・Ｒを直接フロイントのアジュバントと混合し、動
物の免疫用として使用する。
免疫は動物の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に１回に20
〜200μｇ、２〜３週間に１回、３〜７週間投与するこ
とによって行われる。最終免疫より約３〜５日後、免疫
動物から抗体産生細胞を分取する。
〜200μｇ、２〜３週間に１回、３〜７週間投与するこ
とによって行われる。最終免疫より約３〜５日後、免疫
動物から抗体産生細胞を分取する。
骨髄腫細胞としてはマウス、ラット、ヒト等由来のも
のが使用される。細胞融合は例えばG.ケラー（G.K＃hle
r）ネーチャー（Nature）第256巻、第495頁（1975）に
記載の方法又はこれに準ずる方法によって行われる。こ
の際30〜50％ポリエチレングリコール（分子量1000〜40
00）を用い、30〜40℃の温度下約１〜３分間程度反応さ
せることによって行われる。
のが使用される。細胞融合は例えばG.ケラー（G.K＃hle
r）ネーチャー（Nature）第256巻、第495頁（1975）に
記載の方法又はこれに準ずる方法によって行われる。こ
の際30〜50％ポリエチレングリコール（分子量1000〜40
00）を用い、30〜40℃の温度下約１〜３分間程度反応さ
せることによって行われる。
細胞融合によって得られたハイブリドーマはスクリー
ニングに付される。すなわち、スクリーニングは酸素抗
体法等によって行われる。得られた抗体産生ハイブリド
ーマはクローニングに付される。すなわち、当該ハイブ
リドーマを例えば限界希釈法によってクローニングを行
ってクローンを得る。得られたクローンは、次いで目的
とするモノクローナル抗体を産生するクローンのスクリ
ーニングに付され、例えば酵素抗体法等によって行われ
る。運ばれたクローンは、例えばあらかじめプリスタン
（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン）を投与したB
ALB/cマウスの腹腔内へ移植し、10〜14日後にモノクロ
ーナル抗体を高濃度に含む腹水を採取する。この腹水か
らのモノクローナル抗体の回収はIgの精製法として従来
既知の硫安分画法、ポリエチレングリコール分画法、イ
オン交換クロマトグラフ法、ゲルクロマトグラフ法等を
応用することで容易に達成される。
ニングに付される。すなわち、スクリーニングは酸素抗
体法等によって行われる。得られた抗体産生ハイブリド
ーマはクローニングに付される。すなわち、当該ハイブ
リドーマを例えば限界希釈法によってクローニングを行
ってクローンを得る。得られたクローンは、次いで目的
とするモノクローナル抗体を産生するクローンのスクリ
ーニングに付され、例えば酵素抗体法等によって行われ
る。運ばれたクローンは、例えばあらかじめプリスタン
（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン）を投与したB
ALB/cマウスの腹腔内へ移植し、10〜14日後にモノクロ
ーナル抗体を高濃度に含む腹水を採取する。この腹水か
らのモノクローナル抗体の回収はIgの精製法として従来
既知の硫安分画法、ポリエチレングリコール分画法、イ
オン交換クロマトグラフ法、ゲルクロマトグラフ法等を
応用することで容易に達成される。
かくして得られた抗FN・Ｒモノクローナル抗体は、生
体由来の試料、例えば血清、血しょう又は尿中のFN・Ｒ
を特異的に高感度で精度良く測定するために極めて好適
である。すなわち、従来は細胞試料中のFN・Ｒのみが測
定されていただけであり血液、又は尿中に疾患に伴っ
て、FN・Ｒが増加することは知られていなかったが、本
発明によりその相関が明らかとなり、本発明のモノクロ
ーナル抗体を用いることにより、疾患との相関性及び定
量性に優れた、しかも簡便なFN・Ｒ測定方法を確立する
ことができた。この測定のために、モノクローナル抗体
そのもの又はそれからの相応する免疫学的特性を有する
フラグメント、例えばFabフラグメントを使用すること
ができる。
体由来の試料、例えば血清、血しょう又は尿中のFN・Ｒ
を特異的に高感度で精度良く測定するために極めて好適
である。すなわち、従来は細胞試料中のFN・Ｒのみが測
定されていただけであり血液、又は尿中に疾患に伴っ
て、FN・Ｒが増加することは知られていなかったが、本
発明によりその相関が明らかとなり、本発明のモノクロ
ーナル抗体を用いることにより、疾患との相関性及び定
量性に優れた、しかも簡便なFN・Ｒ測定方法を確立する
ことができた。この測定のために、モノクローナル抗体
そのもの又はそれからの相応する免疫学的特性を有する
フラグメント、例えばFabフラグメントを使用すること
ができる。
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１モノクローナル抗体の作成 （１） 抗原の精製 ヒト胎盤を100mMオクチルグルコピラノシド、3mMフェ
ニルメチルスルホニルフルオライド、150mM NaClを含む
50mMトリス・塩酸バッファー（pH7.3）中で細断し、１
時間静置後10000rpm、20分間の遠心処理を行いFN・Ｒを
含む、上澄画分を得た。
ニルメチルスルホニルフルオライド、150mM NaClを含む
50mMトリス・塩酸バッファー（pH7.3）中で細断し、１
時間静置後10000rpm、20分間の遠心処理を行いFN・Ｒを
含む、上澄画分を得た。
200mgのフィブロネクチン細胞接着部位配列（279アミ
ノ酸）を20mlのアガロースゲルに固定化し、固定化カラ
ムを作製し、25mMオクチルグルコピラノシド、1mMフェ
ニルメチルスルホニルフルオライド、150mM NaClを含む
50mMトリス塩酸バッファー（pH7.3）で平衡化した。こ
の固定化カラムに、前記遠心上澄画分を添加し、平衡化
バッファーで洗浄後、10mM EDTAを含む平衡化バッファ
ーで吸着蛋白質を溶出した。この溶出画分のFN・Ｒの純
度を電気泳動で検討した結果、純度90％以上の画分2mg
（BSA換算値：ブラッドフォード法）を得ることがで
き、その一部を抗原として使用した。
ノ酸）を20mlのアガロースゲルに固定化し、固定化カラ
ムを作製し、25mMオクチルグルコピラノシド、1mMフェ
ニルメチルスルホニルフルオライド、150mM NaClを含む
50mMトリス塩酸バッファー（pH7.3）で平衡化した。こ
の固定化カラムに、前記遠心上澄画分を添加し、平衡化
バッファーで洗浄後、10mM EDTAを含む平衡化バッファ
ーで吸着蛋白質を溶出した。この溶出画分のFN・Ｒの純
度を電気泳動で検討した結果、純度90％以上の画分2mg
（BSA換算値：ブラッドフォード法）を得ることがで
き、その一部を抗原として使用した。
（２） マウスへの免疫 FN・Ｒを0.15M NaClを含む10mMリン酸バッファー（pH
7.4）に溶解し、フロイントの完全アジュバントと1:1
（v/v）の割合でよく混合し、マウス１匹当りFN・Ｒが5
0μｇとなるように腹腔内に免疫した。初回免疫から21
日後にFN・R50μｇをフロイントの不完全アジュバント
と混合し腹腔内投与し、更にその14日後、FN・R20μｇ
を尾静脈より投与した。
7.4）に溶解し、フロイントの完全アジュバントと1:1
（v/v）の割合でよく混合し、マウス１匹当りFN・Ｒが5
0μｇとなるように腹腔内に免疫した。初回免疫から21
日後にFN・R50μｇをフロイントの不完全アジュバント
と混合し腹腔内投与し、更にその14日後、FN・R20μｇ
を尾静脈より投与した。
（３） 細胞融合及びクローニング 最終免疫の３日後にマウスの脾臓を取出し、その脾細
胞とマウスミエローマP3U1とを10:1の割合で混合し、前
記ネーチャー記載のケラーらの方法に準じて細胞融合を
行った。次に、96ウエルマイクロプレートに植え込み、
HAT（ヒポキサンチン１×10-4M、アミノプテリン４×10
-7M、チミジン1.6×10-5M）を含んだDMEM−10％FCS培地
（HAT培地）で10〜17日間培養後、HT（ヒポキサンチン
１×10-4M、チミジン1.6×10-5M）を含んだDMEM−10％F
CS培地（HT培地）に移行し、更にフラスコ（25ml）に培
養できるようになってからDMEM−10％FCS培地で培養を
続けた。増殖の見られたウエルの培養上清中の抗体価を
酵素抗体法により測定し、適切なウエルから限界希釈法
により、求めるハイブリドーマのクローニングを行っ
た。すなわち、マイクロプレートにウエル当り約2.5×1
04個のマウス胸腺細胞を植え込み、次に、DMEM培地で
５、１、0.5個/0.1mlになるようにハイブリドーマを希
釈し、これを上記マイクロプレートに0.1ml/ウエルずつ
植え込み培養した。培養開始後10〜14日で肉眼で認めら
れるコロニーが形成され、クローン株を得た。
胞とマウスミエローマP3U1とを10:1の割合で混合し、前
記ネーチャー記載のケラーらの方法に準じて細胞融合を
行った。次に、96ウエルマイクロプレートに植え込み、
HAT（ヒポキサンチン１×10-4M、アミノプテリン４×10
-7M、チミジン1.6×10-5M）を含んだDMEM−10％FCS培地
（HAT培地）で10〜17日間培養後、HT（ヒポキサンチン
１×10-4M、チミジン1.6×10-5M）を含んだDMEM−10％F
CS培地（HT培地）に移行し、更にフラスコ（25ml）に培
養できるようになってからDMEM−10％FCS培地で培養を
続けた。増殖の見られたウエルの培養上清中の抗体価を
酵素抗体法により測定し、適切なウエルから限界希釈法
により、求めるハイブリドーマのクローニングを行っ
た。すなわち、マイクロプレートにウエル当り約2.5×1
04個のマウス胸腺細胞を植え込み、次に、DMEM培地で
５、１、0.5個/0.1mlになるようにハイブリドーマを希
釈し、これを上記マイクロプレートに0.1ml/ウエルずつ
植え込み培養した。培養開始後10〜14日で肉眼で認めら
れるコロニーが形成され、クローン株を得た。
（４） スクリーニング法 ハイブリドーマ及びクローンが増殖したウエルの培養
上清を分取し、エンザイム リンクドイムノソルベント
アッセイ（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）（E
LISA）法によりFN・Ｒに対する抗体産生能を調べた。マ
イクロタイタープレートにFN・Ｒを0.5μg/50μ／ウ
エルとなるように分注し、４℃で18時間静置してFN・Ｒ
を固相に吸着させた。10mMリン酸緩衝生理食塩水（PB
S）（pH7.4）200μで３回各ウエルを洗浄した後、１
％ウシ血清アルブミン（BSA）含有PBSを100μ／ウエ
ル加え、37℃で１時間静置し、各ウエルの未吸着部分を
ブロックした。次いで、検体である培養液を50μ／ウ
エル加え、37℃で１時間反応させた。PBSで３回洗浄し
た後、1000倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスIg
G（カペル社製）を50μ／ウエル添加し、37℃で１時
間反応させた。PBSで洗浄し、0.001％過酸化水素、0.55
mg/mlABTS〔2,2′−アジノ−ジ（３−エチルベンゾチア
ゾリン−スルホネート）〕（ベーリンガーマンハイム社
製）を含む0.1Mクエン酸バッファー（pH4.0）を加え、
波長405nmでの吸光度を測定した。試料中、FN・Ｒに対
する抗体が存在した場合強い発色がみられた。
上清を分取し、エンザイム リンクドイムノソルベント
アッセイ（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）（E
LISA）法によりFN・Ｒに対する抗体産生能を調べた。マ
イクロタイタープレートにFN・Ｒを0.5μg/50μ／ウ
エルとなるように分注し、４℃で18時間静置してFN・Ｒ
を固相に吸着させた。10mMリン酸緩衝生理食塩水（PB
S）（pH7.4）200μで３回各ウエルを洗浄した後、１
％ウシ血清アルブミン（BSA）含有PBSを100μ／ウエ
ル加え、37℃で１時間静置し、各ウエルの未吸着部分を
ブロックした。次いで、検体である培養液を50μ／ウ
エル加え、37℃で１時間反応させた。PBSで３回洗浄し
た後、1000倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスIg
G（カペル社製）を50μ／ウエル添加し、37℃で１時
間反応させた。PBSで洗浄し、0.001％過酸化水素、0.55
mg/mlABTS〔2,2′−アジノ−ジ（３−エチルベンゾチア
ゾリン−スルホネート）〕（ベーリンガーマンハイム社
製）を含む0.1Mクエン酸バッファー（pH4.0）を加え、
波長405nmでの吸光度を測定した。試料中、FN・Ｒに対
する抗体が存在した場合強い発色がみられた。
この結果、抗体産生能の高いクローン株FNR−５及びF
NR−31が得られた。
NR−31が得られた。
前記クローン株は、各々Hybridoma FNR−５と表示し
微工研菌寄第10610号（FERM P−10610）、Hybridoma FN
R−31と表示し微工研菌寄第10611号（FERM P−10611）
として、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて
いる。
微工研菌寄第10610号（FERM P−10610）、Hybridoma FN
R−31と表示し微工研菌寄第10611号（FERM P−10611）
として、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて
いる。
（５） モノクローナル抗体の作製 ７週令以上のBALB/c系マウスにプリスタン（アルドリ
ッチ社製）0.5mlを腹腔内に投与し、１週間以上経過し
た後、培養、増殖させたクローン株１〜９×108個／マ
ウスを腹腔内接種した。10〜14日後にマウスを殺し、腹
水を採取した。これを3,000rpm10分間遠心分離し、５〜
15ml/匹のモノクローナル抗体含有腹水を得た。
ッチ社製）0.5mlを腹腔内に投与し、１週間以上経過し
た後、培養、増殖させたクローン株１〜９×108個／マ
ウスを腹腔内接種した。10〜14日後にマウスを殺し、腹
水を採取した。これを3,000rpm10分間遠心分離し、５〜
15ml/匹のモノクローナル抗体含有腹水を得た。
（６） モノクローナル抗体の精製 上記（５）によって得られた腹水を脱脂綿でろ過して
脂肪を除き、50mMリン酸バッファー（pH7.3）で２倍希
釈した後、等量の100％飽和硫酸アンモニウムを加え、
沈殿画分を分取した。この画分をなるべく少量の上記リ
ン酸バッファーに溶解させ、同バッファーに対して透析
した。このサンプルをDEAE−セルロースカラムにかけ、
抗FN・Ｒモノクローナル抗体FNR−５及びFNR−31を得
た。
脂肪を除き、50mMリン酸バッファー（pH7.3）で２倍希
釈した後、等量の100％飽和硫酸アンモニウムを加え、
沈殿画分を分取した。この画分をなるべく少量の上記リ
ン酸バッファーに溶解させ、同バッファーに対して透析
した。このサンプルをDEAE−セルロースカラムにかけ、
抗FN・Ｒモノクローナル抗体FNR−５及びFNR−31を得
た。
（７） モノクローナル抗体の物理化学的性質 Igサブクラス FNR−5:IgG2a FNR−31:IgG2a 精製したモノクローナル抗体の特定のクラスを、クラ
ス特異性抗マウスIg抗体を使用してオクタロニーゲル拡
散試験で決定した。
ス特異性抗マウスIg抗体を使用してオクタロニーゲル拡
散試験で決定した。
分子量 FNR−5:156,000±5,000 FNR−31:160,000±5,000 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（12.5％）で
モノクローナル抗体の分子量を推定した。分子量マーカ
ーはバイオ−ラッド社のSDS−PAGE分子量スタンダード
−Highを用いた（ミオシン200kDa、β−ガラクトシダー
ゼ116kDa、ホスホリパーゼb97kDa、血清アルブミン66kD
a、卵白アルブミン43kDa）。
モノクローナル抗体の分子量を推定した。分子量マーカ
ーはバイオ−ラッド社のSDS−PAGE分子量スタンダード
−Highを用いた（ミオシン200kDa、β−ガラクトシダー
ゼ116kDa、ホスホリパーゼb97kDa、血清アルブミン66kD
a、卵白アルブミン43kDa）。
抗原との反応性 FNR−5:FN・Ｒβ鎖を認識 FNR−31:FN・Ｒβ鎖を認識 FN・Ｒを非還元条件下でSDS−ポリアクリルアミド電
気泳動を行った後、イムノブロット法により〔W.N.ブル
ネット（W.N.Burnette）、アナリティカルバイオケミス
トリー（Anal.Biochem.）第112巻、第195〜203頁（198
1）〕モノクローナル抗体との反応性を検討した。
気泳動を行った後、イムノブロット法により〔W.N.ブル
ネット（W.N.Burnette）、アナリティカルバイオケミス
トリー（Anal.Biochem.）第112巻、第195〜203頁（198
1）〕モノクローナル抗体との反応性を検討した。
交差反応性 FNR−5:ビトロネクチンレセプターと交差反応を示さな
い FNR−31: 同 上 ヒト胎盤より、FN・Ｒと同様の方法でビトロネクチン
レセプターを可溶化し、次いでGRGDSPペプチドを固定化
したカラムを用いビトロネクチンレセプターを精製し
た。このビトロネクチンレセプターを非還元条件下でSD
S−ポリアクリルアミド電気泳動を行った後、イムノブ
ロット法により〔W.N.ブルネット、アナリティカルバイ
オケミストリー、第112巻、第195〜203頁（1981）〕モ
ノクローナル抗体との反応性を検討した。
い FNR−31: 同 上 ヒト胎盤より、FN・Ｒと同様の方法でビトロネクチン
レセプターを可溶化し、次いでGRGDSPペプチドを固定化
したカラムを用いビトロネクチンレセプターを精製し
た。このビトロネクチンレセプターを非還元条件下でSD
S−ポリアクリルアミド電気泳動を行った後、イムノブ
ロット法により〔W.N.ブルネット、アナリティカルバイ
オケミストリー、第112巻、第195〜203頁（1981）〕モ
ノクローナル抗体との反応性を検討した。
実施例２ モノクローナル抗体を用いたサンドイッチEI
A法によるFN・Ｒの測定 実施例１で得たモノクローナル抗体FNR−５、FNR−31
を用いてFN・Ｒ測定試薬を調整した。
A法によるFN・Ｒの測定 実施例１で得たモノクローナル抗体FNR−５、FNR−31
を用いてFN・Ｒ測定試薬を調整した。
（１） ペルオキシダーゼ（POD）標識モノクローナル
抗体の作製 モノクローナル抗体FNR−31をナカネ法（前出）によ
りPOD標識した。
抗体の作製 モノクローナル抗体FNR−31をナカネ法（前出）によ
りPOD標識した。
（２） サンドイッチEIA法による測定系 96ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルにPBS
に溶解したモノクローナル抗体FNR−５（10μg/ml）を1
00μずつ添加し４℃で１晩インキュベートし、溶液を
捨てた後、１％BSAを含むPBS溶液を200μずつ各ウエ
ルに添加し、37℃で１時間ブロッキングを行った。PBS
でよく洗浄したのち、サンプル20μを添加して引続き
１％BSAを含むPBSで希釈したPOD標識FNR−31抗体液100
μを添加して37℃で30分間反応させた後、PBSで３回
洗浄し、0.001％過酸化水素、0.55mg/mlABTSを含む0.1M
クエン酸−水酸化ナトリウムバッファー（pH4.0）を加
え、波長405nmの吸光度を測定した。
に溶解したモノクローナル抗体FNR−５（10μg/ml）を1
00μずつ添加し４℃で１晩インキュベートし、溶液を
捨てた後、１％BSAを含むPBS溶液を200μずつ各ウエ
ルに添加し、37℃で１時間ブロッキングを行った。PBS
でよく洗浄したのち、サンプル20μを添加して引続き
１％BSAを含むPBSで希釈したPOD標識FNR−31抗体液100
μを添加して37℃で30分間反応させた後、PBSで３回
洗浄し、0.001％過酸化水素、0.55mg/mlABTSを含む0.1M
クエン酸−水酸化ナトリウムバッファー（pH4.0）を加
え、波長405nmの吸光度を測定した。
（３） 試料の測定 健常人29例、腎不全５例、肝障害・肝炎29例、肝硬変
20例、膵炎９例、脳梗塞20例より得た血清を上記EIA法
で測定した。この時、精製FN・Ｒを標準品として得た検
量線から各々検体のFN・Ｒ濃度を求めた。結果を第１図
に示す。すなわち第１図は本発明のモノクローナル抗体
を用いたサンドイッチEIA法による血清のFN・Ｒ測定結
果をFN・Ｒ濃度（BSA換算値：ブラックフォード法）
（μg/ml、縦軸）と各血清サンプル（横軸）との関係を
示す図である。
20例、膵炎９例、脳梗塞20例より得た血清を上記EIA法
で測定した。この時、精製FN・Ｒを標準品として得た検
量線から各々検体のFN・Ｒ濃度を求めた。結果を第１図
に示す。すなわち第１図は本発明のモノクローナル抗体
を用いたサンドイッチEIA法による血清のFN・Ｒ測定結
果をFN・Ｒ濃度（BSA換算値：ブラックフォード法）
（μg/ml、縦軸）と各血清サンプル（横軸）との関係を
示す図である。
健常人では平均±SDは0.29±0.10μg/mlであった。ま
た、腎不全では0.32±0.15μg/mlで健常群との間に差は
認められなかった。一方、肝障害・肝炎群、肝硬変群、
膵炎群、脳梗塞群では各々0.73±0.55μg/ml、1.90±0.
65μg/ml、0.73±0.69μg/ml、0.58±0.55μg/mlと健常
群と比べ高値を示し、健常群の平均＋3SDをカットオフ
（cut off）値とした場合、肝障害・肝炎群では29例中1
4例に、肝硬変では20例中20例に、膵炎群では９例中４
例に、脳梗塞群では20例中５例に、異常値を示す症例が
認められた。
た、腎不全では0.32±0.15μg/mlで健常群との間に差は
認められなかった。一方、肝障害・肝炎群、肝硬変群、
膵炎群、脳梗塞群では各々0.73±0.55μg/ml、1.90±0.
65μg/ml、0.73±0.69μg/ml、0.58±0.55μg/mlと健常
群と比べ高値を示し、健常群の平均＋3SDをカットオフ
（cut off）値とした場合、肝障害・肝炎群では29例中1
4例に、肝硬変では20例中20例に、膵炎群では９例中４
例に、脳梗塞群では20例中５例に、異常値を示す症例が
認められた。
以上詳細に説明した通り、本発明によりFN・Ｒに対す
るモノクローナル抗体が提供された。本発明のモノクロ
ーナル抗体を利用することにより、簡便で特異性の高い
FN・Ｒの測定が可能となり、FN・Ｒの生理作用の研究、
肝臓疾患、脳梗塞等の診断に非常に有用である。
るモノクローナル抗体が提供された。本発明のモノクロ
ーナル抗体を利用することにより、簡便で特異性の高い
FN・Ｒの測定が可能となり、FN・Ｒの生理作用の研究、
肝臓疾患、脳梗塞等の診断に非常に有用である。
第１図は本発明のモノクローナル抗体を用いたサンドイ
ッチEIA法による血清中のFN・Ｒ濃度の測定結果を示す
図である。
ッチEIA法による血清中のFN・Ｒ濃度の測定結果を示す
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (56)参考文献 Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅ ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ, 12［１］（1988），Ｐ．９〜16 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅ ｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，107（1988）, Ｐ．1881〜1891 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，177［２ ］（1988），Ｐ．303〜318 Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，162［１ ］（1985），Ｐ．157〜170
Claims (2)
- 【請求項１】生体試料中の体液可溶性フィブロネクチン
レセプターの量を測定し、その値を健常値と比較するこ
とを特徴とする疾病の検出方法。 - 【請求項２】疾病が肝炎、肝障害、肝硬変、膵炎、及び
脳梗塞から選択されるものである請求項１記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1063577A JP2613105B2 (ja) | 1989-03-17 | 1989-03-17 | モノクローナル抗体の使用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1063577A JP2613105B2 (ja) | 1989-03-17 | 1989-03-17 | モノクローナル抗体の使用方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02245194A JPH02245194A (ja) | 1990-09-28 |
| JP2613105B2 true JP2613105B2 (ja) | 1997-05-21 |
Family
ID=13233253
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1063577A Expired - Fee Related JP2613105B2 (ja) | 1989-03-17 | 1989-03-17 | モノクローナル抗体の使用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2613105B2 (ja) |
-
1989
- 1989-03-17 JP JP1063577A patent/JP2613105B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，１２［１］（１９８８），Ｐ．９〜１６ |
| Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７７［２］（１９８８），Ｐ．３０３〜３１８ |
| Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６２［１］（１９８５），Ｐ．１５７〜１７０ |
| Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０７（１９８８），Ｐ．１８８１〜１８９１ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02245194A (ja) | 1990-09-28 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |