JPH0739439B2 - モノクローナル抗体及びその使用方法 - Google Patents
モノクローナル抗体及びその使用方法Info
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- JPH0739439B2 JPH0739439B2 JP1062126A JP6212689A JPH0739439B2 JP H0739439 B2 JPH0739439 B2 JP H0739439B2 JP 1062126 A JP1062126 A JP 1062126A JP 6212689 A JP6212689 A JP 6212689A JP H0739439 B2 JPH0739439 B2 JP H0739439B2
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- JP
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- monoclonal antibody
- osteocalcin
- acid residue
- residue
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、γ−カルボキシグルタミン酸（以下、Glaと
略す）残基を有するオステオカルシン（以下、OCと略
す）に対して特異性を有する抗OCモノクローナル抗体及
びその使用方法に関する。
略す）残基を有するオステオカルシン（以下、OCと略
す）に対して特異性を有する抗OCモノクローナル抗体及
びその使用方法に関する。
OCはビタミンＫ依存性のGla残基を有するカルシウム結
合蛋白であり、骨芽細胞により合成される。一般に骨の
代謝が亢進している骨疾患において血中レベルの上昇が
認められ、骨代謝の生化学的な指標となるといわれてい
る。近年、閉経後骨粗鬆症、ミエローマ、ベージエツト
病、慢性腎不全、副甲状腺機能亢進症等の診断に有用な
指標であることが示されてきた。この目的のため、P.A.
プライスら〔P.A.Priceら、プロシーデイングス オブ
ナショナル アカデミー オブ サイエンシイス オ
ブ ザ USA（Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A）第77巻、第22
34頁（1980）〕によってポリクローナル抗体を用いたラ
ジオイムノアツセイ法が開発され、ヒト血中のOC濃度を
測定することが可能となつた。また、モノクローナル抗
体を用いるエンザイムイムアツセイ方法も本発明者らに
より先に提案されている（特願昭62−318564号）。
合蛋白であり、骨芽細胞により合成される。一般に骨の
代謝が亢進している骨疾患において血中レベルの上昇が
認められ、骨代謝の生化学的な指標となるといわれてい
る。近年、閉経後骨粗鬆症、ミエローマ、ベージエツト
病、慢性腎不全、副甲状腺機能亢進症等の診断に有用な
指標であることが示されてきた。この目的のため、P.A.
プライスら〔P.A.Priceら、プロシーデイングス オブ
ナショナル アカデミー オブ サイエンシイス オ
ブ ザ USA（Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A）第77巻、第22
34頁（1980）〕によってポリクローナル抗体を用いたラ
ジオイムノアツセイ法が開発され、ヒト血中のOC濃度を
測定することが可能となつた。また、モノクローナル抗
体を用いるエンザイムイムアツセイ方法も本発明者らに
より先に提案されている（特願昭62−318564号）。
一方、OCの持つ性質としてカルシウム及びハイドロキシ
アパタイトに対する親和性があり、OCを加熱脱炭酸反応
によりGla残基をGlu残基に変えるとカルシウム結合能が
消失すること〔J.W.ポーサー（J.W.Poser）、ジャーナ
ルオブ バイオロジカル ケミストリー（J.Biol.Che
m.）第254巻、第431頁（1979）〕から、Gla残基がカル
シウム結合に不可欠なことが示されている。したがつ
て、OC中のGla残基は骨から体液へのカルシウムの移動
を調整するという重要な役割を果たしていると考えられ
る。
アパタイトに対する親和性があり、OCを加熱脱炭酸反応
によりGla残基をGlu残基に変えるとカルシウム結合能が
消失すること〔J.W.ポーサー（J.W.Poser）、ジャーナ
ルオブ バイオロジカル ケミストリー（J.Biol.Che
m.）第254巻、第431頁（1979）〕から、Gla残基がカル
シウム結合に不可欠なことが示されている。したがつ
て、OC中のGla残基は骨から体液へのカルシウムの移動
を調整するという重要な役割を果たしていると考えられ
る。
しかしながら、従来報告されているOCの免疫学的測定方
法では抗OCポリクローナル抗体を用いたH.タナカ〔H.Ta
nakaら、ジャーナルオブ イムノロジカル メソツズ
（J.Immunol.Methods）第94巻、第19頁（1986）〕の方
法、 モノクローナル抗体を用いた本発明者らの方法（特願昭
62−318564号）においてもGla残基を有するOCと有しな
いOCを区別して測定することは不可能であり、実際に生
体内で生理作用を有するGla残基を持ったOC、すなわち
活性型OCの量を知ることはできなかつた。
法では抗OCポリクローナル抗体を用いたH.タナカ〔H.Ta
nakaら、ジャーナルオブ イムノロジカル メソツズ
（J.Immunol.Methods）第94巻、第19頁（1986）〕の方
法、 モノクローナル抗体を用いた本発明者らの方法（特願昭
62−318564号）においてもGla残基を有するOCと有しな
いOCを区別して測定することは不可能であり、実際に生
体内で生理作用を有するGla残基を持ったOC、すなわち
活性型OCの量を知ることはできなかつた。
本発明の目的は、Gla残基を有する活性型OCのみに特異
性を有するモノクローナル抗体及びその使用方法を提供
することにある。
性を有するモノクローナル抗体及びその使用方法を提供
することにある。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はGla残基を
有する、天然型のOCと反応し、Gla残基を脱炭酸して、
グルタミン酸（以下、Gluと略す）残基としたOCとは反
応しないモノクローナル抗体に関し、また第２の発明は
OCの測定方法に関する発明であつて、生体試料中のGla
残基を有する、天然型のOCの免疫学的な測定に際して、
上記第１の発明の抗OCモノクローナル抗体を使用するこ
とを特徴とする。
有する、天然型のOCと反応し、Gla残基を脱炭酸して、
グルタミン酸（以下、Gluと略す）残基としたOCとは反
応しないモノクローナル抗体に関し、また第２の発明は
OCの測定方法に関する発明であつて、生体試料中のGla
残基を有する、天然型のOCの免疫学的な測定に際して、
上記第１の発明の抗OCモノクローナル抗体を使用するこ
とを特徴とする。
本発明者らは、前述した課題を克服するため鋭意研究を
重ねた結果、細胞融合によりGla残基を有する、天然型
のOCに対して反応性を有するモノクローナル抗体を取得
することに成功し、このモノクローナル抗体を用いれ
ば、Gla残基を有する、天然型のOCのみを高感度で測定
可能であることを見いだし、本発明を完成するに至つ
た。
重ねた結果、細胞融合によりGla残基を有する、天然型
のOCに対して反応性を有するモノクローナル抗体を取得
することに成功し、このモノクローナル抗体を用いれ
ば、Gla残基を有する、天然型のOCのみを高感度で測定
可能であることを見いだし、本発明を完成するに至つ
た。
本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合法に
よつて製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細
胞との間に、融合ハイブリドーマを形成させ、該ハイブ
リドーマをクローン化し、Gla残基を有する、天然型のO
Cに対し特異性を示す抗体を産生するクローンを選択す
ることによつて製造される。抗体産生細胞は例えばGla
残基を有する、天然型のOCによつて免疫された動物から
の脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等が利用できる。
免疫させる動物としては、マウス、ラツト、馬、ヤギ、
ウサギ等が例示される。抗原としては動物の骨由来のOC
が利用可能であり、例えば次のようにして製造され、免
疫に使用される。ウシ骨粉末をEDTA溶液で抽出し、ODS
カラムを用いたHPLCによりウシOCを精製する。かくして
得られたウシOCは例えばKLH（Keyhole Limpet Hemocyan
in）に代表されるキヤリア蛋白と結合後、又はPVP（ポ
ニビニルピロリドン）と混合後、フロイントのアジユバ
ントと混合し、動物の免疫用として使用する。又はウシ
OCを直接フロイントのアジユバントと混合し、動物の免
疫用として使用する。特にGla残基又はこれを含有する
ペプチドを認識するモノクローナル抗体を取得するため
には、OCのアミノ基を利用してKLH等のキヤリア蛋白と
結合させることが望ましい。この目的においては例えば
SMCC〔スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート〕等により
マレイミド化したOCと、２−イミノチオレイン等によ
り、SH基を導入したKLHとを反応させることで達成され
る。
よつて製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細
胞との間に、融合ハイブリドーマを形成させ、該ハイブ
リドーマをクローン化し、Gla残基を有する、天然型のO
Cに対し特異性を示す抗体を産生するクローンを選択す
ることによつて製造される。抗体産生細胞は例えばGla
残基を有する、天然型のOCによつて免疫された動物から
の脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等が利用できる。
免疫させる動物としては、マウス、ラツト、馬、ヤギ、
ウサギ等が例示される。抗原としては動物の骨由来のOC
が利用可能であり、例えば次のようにして製造され、免
疫に使用される。ウシ骨粉末をEDTA溶液で抽出し、ODS
カラムを用いたHPLCによりウシOCを精製する。かくして
得られたウシOCは例えばKLH（Keyhole Limpet Hemocyan
in）に代表されるキヤリア蛋白と結合後、又はPVP（ポ
ニビニルピロリドン）と混合後、フロイントのアジユバ
ントと混合し、動物の免疫用として使用する。又はウシ
OCを直接フロイントのアジユバントと混合し、動物の免
疫用として使用する。特にGla残基又はこれを含有する
ペプチドを認識するモノクローナル抗体を取得するため
には、OCのアミノ基を利用してKLH等のキヤリア蛋白と
結合させることが望ましい。この目的においては例えば
SMCC〔スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート〕等により
マレイミド化したOCと、２−イミノチオレイン等によ
り、SH基を導入したKLHとを反応させることで達成され
る。
免疫は動物の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に１回に20〜
200μｇ、２〜３週間に１回、３〜７週間投与すること
によつて行われる。最終免疫より約３〜５日後、免疫動
物から抗体産生細胞を分取する。
200μｇ、２〜３週間に１回、３〜７週間投与すること
によつて行われる。最終免疫より約３〜５日後、免疫動
物から抗体産生細胞を分取する。
骨髄腫細胞としてはマウス、ラツト、ヒト等由来のもの
が使用される。細胞融合は例えばG.ケラー（G.Khle
r）ネーチヤー（Nature）第256巻、第495頁（1975）に
記載の方法、又はこれに準ずる方法によつて行われる。
この際、30〜50％ポリエチレングリコール（分子量1000
〜4000）を用い、30〜40℃の温度下約１〜３分間程度反
応させることよつて行われる。
が使用される。細胞融合は例えばG.ケラー（G.Khle
r）ネーチヤー（Nature）第256巻、第495頁（1975）に
記載の方法、又はこれに準ずる方法によつて行われる。
この際、30〜50％ポリエチレングリコール（分子量1000
〜4000）を用い、30〜40℃の温度下約１〜３分間程度反
応させることよつて行われる。
細胞融合によつて得られたハイブリドーマはスクリーニ
ングに付される。すなわち、スクリーニングは抗原とし
てGla残基を有する、天然型のOCと、Gla残基を脱炭酸し
てGlu残基としたOCを用いて酵素抗体法等によつて行わ
れる。得られた抗体産生ハイブリドーマはクローニング
に付される。すなわち、当該ハイブリドーマを例えば限
界希釈法によつてクローニングを行つてクローンを得
る。得られたクローンは、次いで目的とするモノクロー
ナル抗体を産生するクローンのスクリーニングに付さ
れ、例えば酵素抗体法等によつて行われる。選ばれたク
ローンは、例えばあらかじめプリスタン（2,6,10,14,−
テトラメチルペンタデカン）を投与したBALB/cマウスの
腹腔内へ移植し、10〜14日後にモノクローナル抗体を高
濃度に含む腹水を採取する。この腹水からのモノクロー
ナル抗体の回収はイムノグロブリンの精製法として従来
既知の硫安分画法、ポリエチレングリコール分画法、イ
オン交換クロマトグラフ法、ゲルクロマトグラフ法、ア
フイニテイークロマトグラフ法等を応用することで容易
に達成される。
ングに付される。すなわち、スクリーニングは抗原とし
てGla残基を有する、天然型のOCと、Gla残基を脱炭酸し
てGlu残基としたOCを用いて酵素抗体法等によつて行わ
れる。得られた抗体産生ハイブリドーマはクローニング
に付される。すなわち、当該ハイブリドーマを例えば限
界希釈法によつてクローニングを行つてクローンを得
る。得られたクローンは、次いで目的とするモノクロー
ナル抗体を産生するクローンのスクリーニングに付さ
れ、例えば酵素抗体法等によつて行われる。選ばれたク
ローンは、例えばあらかじめプリスタン（2,6,10,14,−
テトラメチルペンタデカン）を投与したBALB/cマウスの
腹腔内へ移植し、10〜14日後にモノクローナル抗体を高
濃度に含む腹水を採取する。この腹水からのモノクロー
ナル抗体の回収はイムノグロブリンの精製法として従来
既知の硫安分画法、ポリエチレングリコール分画法、イ
オン交換クロマトグラフ法、ゲルクロマトグラフ法、ア
フイニテイークロマトグラフ法等を応用することで容易
に達成される。
かくして得られたGla残基を有する、天然型のOCと反応
するモノクローナル抗体は、生体由来の試料、例えば血
清、血しよう又は尿中のGla残基を有する、天然型のOC
すなわち活性型OCを高感度で測定するために極めて好適
である。この測定のために、モノクローナル抗体そのも
の、又は、それからの相応する免疫学的特性を有するフ
ラグメント、例えばFab′フラグメント等を使用するこ
とができる。
するモノクローナル抗体は、生体由来の試料、例えば血
清、血しよう又は尿中のGla残基を有する、天然型のOC
すなわち活性型OCを高感度で測定するために極めて好適
である。この測定のために、モノクローナル抗体そのも
の、又は、それからの相応する免疫学的特性を有するフ
ラグメント、例えばFab′フラグメント等を使用するこ
とができる。
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが本発
明はこれら実施例に限定されるものではない。
明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例1.モノクローナル抗体の作製 (1)抗体の精製 ウシ大腿骨を細砕し、0.5M EDTA（pH8）で骨蛋白を抽出
した。抽出懸濁液を遠心分離し、上清を凍結乾燥後ODS
カラムを用いたHPLCでウシOCを精製した。
した。抽出懸濁液を遠心分離し、上清を凍結乾燥後ODS
カラムを用いたHPLCでウシOCを精製した。
(2)マウスの免疫 ウシOC5mgを0.1Mリン酸バツフアー（pH7.0）0.5mlに溶
かし、SMCC2.9mgをDMC（ジメチルホルムアミド）10μ
に溶解した溶液を加え、30℃で１時間反応させた。この
反応液を0.1Mリン酸バツフアー（pH7.0）で平衡化した
セフアデツクスＧ−25カラム（1.0×45cm）に付し、マ
レイミド化したOCを得た。一方、KLH10mgを0.1Mリン酸
バツフアー（pH7.0、1mM EDTA含有）に溶かし、２−イ
ミノチオレイン0.3mgを加え、室温で30分反応させた。
この反応液を0.1Mリン酸バツフアー（pH7.0、0.1M EDTA
含有）で平衡化したセフアデツクスＧ−25カラム（1.0
×45cm）に付し、SH化KLHを得た。マレイミド化OC溶液
及びSH化KLH溶液を各々約1mlにまでコロジオンバツグを
用いて濃縮した後、混合し、４℃で一晩反応させ、0.1M
リン酸バツフアー（pH7.0）で平衡化させたウルトロゲ
ルAcA44カラム（1.5×48cm）に付し、100滴ずつ分画
し、分画番号12〜14をOC−KLH結合物として分取した。
かし、SMCC2.9mgをDMC（ジメチルホルムアミド）10μ
に溶解した溶液を加え、30℃で１時間反応させた。この
反応液を0.1Mリン酸バツフアー（pH7.0）で平衡化した
セフアデツクスＧ−25カラム（1.0×45cm）に付し、マ
レイミド化したOCを得た。一方、KLH10mgを0.1Mリン酸
バツフアー（pH7.0、1mM EDTA含有）に溶かし、２−イ
ミノチオレイン0.3mgを加え、室温で30分反応させた。
この反応液を0.1Mリン酸バツフアー（pH7.0、0.1M EDTA
含有）で平衡化したセフアデツクスＧ−25カラム（1.0
×45cm）に付し、SH化KLHを得た。マレイミド化OC溶液
及びSH化KLH溶液を各々約1mlにまでコロジオンバツグを
用いて濃縮した後、混合し、４℃で一晩反応させ、0.1M
リン酸バツフアー（pH7.0）で平衡化させたウルトロゲ
ルAcA44カラム（1.5×48cm）に付し、100滴ずつ分画
し、分画番号12〜14をOC−KLH結合物として分取した。
OC−KLH結合物溶液をフロイントの完全アジユバントと
1:1（v/v）の割合でよく混合し、マウス１匹当りOC−KL
H結合物が50μｇとなるように腹腔内に免疫した。初回
免疫から14日後にOC−KLH結合物溶液をフロイントの不
完全アジユバントと1:1（v/v）の割合でよく混合し、マ
ウス一匹当りOC−KLH結合物が50μｇとなるように腹腔
内に免疫した。更にその14日後、OC−KLH結合物をマウ
ス一匹当り50μｇを腹腔内に最終免疫した。
1:1（v/v）の割合でよく混合し、マウス１匹当りOC−KL
H結合物が50μｇとなるように腹腔内に免疫した。初回
免疫から14日後にOC−KLH結合物溶液をフロイントの不
完全アジユバントと1:1（v/v）の割合でよく混合し、マ
ウス一匹当りOC−KLH結合物が50μｇとなるように腹腔
内に免疫した。更にその14日後、OC−KLH結合物をマウ
ス一匹当り50μｇを腹腔内に最終免疫した。
(3)細胞融合及びクローニング 最終免疫の３日後にマウスの脾臓を取出し、その脾細胞
とマウスミエローマP3U1とを10:1の割合で混合し、前記
ネーチヤー記載のケラーらの方法を用いて細胞融合を行
つた。次に、96穴マイクロタイタープレートに植え込
み、HAT（ヒポキサンチン１×10-4Ｍ、アミノプテリン
４×10-7Ｍ、チミジン1.6×10-5Ｍ）を含んだDMEM−10
％FCS（HAT培地）で10〜17日間培養後、HT（ヒポキサン
チン１×10-4Ｍ、チミジン1.6×10-5Ｍ）を含んだDMEM
−10％FCS培地（HT培地）に移し、更にDMEM−10％FCS培
地で培養した。増殖の見られたウエルの培養上清中の抗
体価を酵素抗体法により測定し、抗体産生能のあつたウ
エルのハイブリドーマを限界希釈法により、クローニン
グを行い、クローニング株を得た。
とマウスミエローマP3U1とを10:1の割合で混合し、前記
ネーチヤー記載のケラーらの方法を用いて細胞融合を行
つた。次に、96穴マイクロタイタープレートに植え込
み、HAT（ヒポキサンチン１×10-4Ｍ、アミノプテリン
４×10-7Ｍ、チミジン1.6×10-5Ｍ）を含んだDMEM−10
％FCS（HAT培地）で10〜17日間培養後、HT（ヒポキサン
チン１×10-4Ｍ、チミジン1.6×10-5Ｍ）を含んだDMEM
−10％FCS培地（HT培地）に移し、更にDMEM−10％FCS培
地で培養した。増殖の見られたウエルの培養上清中の抗
体価を酵素抗体法により測定し、抗体産生能のあつたウ
エルのハイブリドーマを限界希釈法により、クローニン
グを行い、クローニング株を得た。
(4)スクリーニング法 ハイブリドーマ及びクローンが増殖したウエルの培養上
清を分取し、エンザイム リンクドイムノソルベント
アツセイ（Enzyme Linked Immunosorbent Assay（ELIS
A）法によりGla残基を有する、天然型のウシOCには反応
するがGla残基を脱炭酸してGlu残基としたウシOCには反
応しない抗体を産生しているハイブリドーマ及びクロー
ンを調べた。なお、Gla残基を脱炭酸してGlu残基とした
OCはポーサーら （Poser,J.W.らジヤーナル オブ バイオケミストリー
第254巻、第431頁1979年）の方法により塩酸酸性下凍結
乾燥したウシOCを110℃加熱処理することで行つた。
清を分取し、エンザイム リンクドイムノソルベント
アツセイ（Enzyme Linked Immunosorbent Assay（ELIS
A）法によりGla残基を有する、天然型のウシOCには反応
するがGla残基を脱炭酸してGlu残基としたウシOCには反
応しない抗体を産生しているハイブリドーマ及びクロー
ンを調べた。なお、Gla残基を脱炭酸してGlu残基とした
OCはポーサーら （Poser,J.W.らジヤーナル オブ バイオケミストリー
第254巻、第431頁1979年）の方法により塩酸酸性下凍結
乾燥したウシOCを110℃加熱処理することで行つた。
マイクロタイタープレートにGla残基を有する、天然型
のウシOC又はGla残基を脱炭酸してGlu残基としたウシOC
を別々に各0.5μg/50μ／ウエルとなるように分注
し、４℃で18時間静置して両ウシOCを固相に吸着させ
た。10mMリン酸暖衝食塩水（PBS）（pH7.4）200μで
３回洗浄した後、１％ウシ血清アルブミン（BSA）を含
むPBS100μ／ウエルを加え、37℃で１時間静置し、各
ウエルの未吸着部分をブロツクした。次いで、試料であ
る培養上清を50μ／ウエルを加え、37℃で１時間反応
させた。PBSで３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識
抗マウスIgG（カペル社）を50μ／ウエル添加し、37
℃で１時間反応させた。PBSで３回洗浄した後、0.01％
過酸化水素、0.55mg/ml ABTS〔2,2′−アジノ−ジ（３
−エチルベンゾチアゾリン−スルホネート）、ベーリン
ガー マンハイム社）を含む0.1Mクエン酸−水酸化ナト
リウムバツフアー（pH4.0）を加え、波長410nmでの吸光
度を測定した。試料中、Gla残基を有する、天然型のウ
シOCに対して発色し、Gla残基を脱炭酸してGlu残基とし
たウシOCに対して発色を示さない抗体を産生しているハ
イブリドーマ及びクローン株をスクリーニングした。
のウシOC又はGla残基を脱炭酸してGlu残基としたウシOC
を別々に各0.5μg/50μ／ウエルとなるように分注
し、４℃で18時間静置して両ウシOCを固相に吸着させ
た。10mMリン酸暖衝食塩水（PBS）（pH7.4）200μで
３回洗浄した後、１％ウシ血清アルブミン（BSA）を含
むPBS100μ／ウエルを加え、37℃で１時間静置し、各
ウエルの未吸着部分をブロツクした。次いで、試料であ
る培養上清を50μ／ウエルを加え、37℃で１時間反応
させた。PBSで３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識
抗マウスIgG（カペル社）を50μ／ウエル添加し、37
℃で１時間反応させた。PBSで３回洗浄した後、0.01％
過酸化水素、0.55mg/ml ABTS〔2,2′−アジノ−ジ（３
−エチルベンゾチアゾリン−スルホネート）、ベーリン
ガー マンハイム社）を含む0.1Mクエン酸−水酸化ナト
リウムバツフアー（pH4.0）を加え、波長410nmでの吸光
度を測定した。試料中、Gla残基を有する、天然型のウ
シOCに対して発色し、Gla残基を脱炭酸してGlu残基とし
たウシOCに対して発色を示さない抗体を産生しているハ
イブリドーマ及びクローン株をスクリーニングした。
この結果、Gla残基を有する、天然型のウシOCに対して
のみ反応性を示すクローン株OC4−30が得られた。
のみ反応性を示すクローン株OC4−30が得られた。
本クローン株はHybridoma OC4−30と表示し、微工研条
寄第2725号（FERM PB−2725）として工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されている。一方、前記したGla
残基を有する、天然型のOC、Gla残基を脱炭酸してGlu残
基としたOCの両方に反応性を示すクローン株OC−G4が得
られ、本クローン株はHybridoma OC−G4と表示し、微工
研条寄第2724号（FERM BP−2724）として同じく寄託さ
れている。
寄第2725号（FERM PB−2725）として工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されている。一方、前記したGla
残基を有する、天然型のOC、Gla残基を脱炭酸してGlu残
基としたOCの両方に反応性を示すクローン株OC−G4が得
られ、本クローン株はHybridoma OC−G4と表示し、微工
研条寄第2724号（FERM BP−2724）として同じく寄託さ
れている。
(5)モノクローナル抗体の作製 ７週令のBALB/cマウスにプリスタン（アルドリツチ社）
0.5mlを腹腔内に投与し、１週間以上経過した後培養、
増殖させたクローン株１〜９×10-8個／マウスを腹腔内
に接種した。10〜14日後にマウスより腹水を採取した。
これを3,000rpm10分間遠心分離し、５〜15ml/匹のモノ
クローナル抗体含有腹水を得た。
0.5mlを腹腔内に投与し、１週間以上経過した後培養、
増殖させたクローン株１〜９×10-8個／マウスを腹腔内
に接種した。10〜14日後にマウスより腹水を採取した。
これを3,000rpm10分間遠心分離し、５〜15ml/匹のモノ
クローナル抗体含有腹水を得た。
(6)モノクローナル抗体の精製 上記(5)によつて得られた腹水を50mMリン酸バツフアー
（pH7.3）で２倍希釈した後、等量の飽和硫酸アンモニ
ウムを加え、沈殿画分を分取した。
（pH7.3）で２倍希釈した後、等量の飽和硫酸アンモニ
ウムを加え、沈殿画分を分取した。
この画分をなるべく少量の上記リン酸バツフアーに溶解
させ、同じバツフアーに対して透析した。このサンプル
をDEAE−セルロースカラムにかけ、クローン株OC4−30
からGla残基を有する、天然型のウシOCに特異的なモノ
クローナル抗体OC4−30を得た。また、同様にクローン
株OC−G4からモノクローナル抗体OC−G4を得た。
させ、同じバツフアーに対して透析した。このサンプル
をDEAE−セルロースカラムにかけ、クローン株OC4−30
からGla残基を有する、天然型のウシOCに特異的なモノ
クローナル抗体OC4−30を得た。また、同様にクローン
株OC−G4からモノクローナル抗体OC−G4を得た。
(7)モノクローナル抗体の物理化学的性質 モノクローナル抗体OC4−30のイムノグロブリンサブク
ラスはオクタロニー法によりIgG2aであつた。また分子
量はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により145
000であつた。また、モノクローナル抗体OC−G4のイム
ノグロブリンサブクラスはIgG1、分子量は145000であつ
た。
ラスはオクタロニー法によりIgG2aであつた。また分子
量はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により145
000であつた。また、モノクローナル抗体OC−G4のイム
ノグロブリンサブクラスはIgG1、分子量は145000であつ
た。
一方、ELISA法によりGla残基を有する、天然型のウシOC
とGla残基を脱炭酸してGlu残基としたウシOCに対する反
応性を表１に示すが、モノクローナル抗体OC4−30がGla
残基を有する、天然型のウシOCに特異的に反応している
ことが示された。
とGla残基を脱炭酸してGlu残基としたウシOCに対する反
応性を表１に示すが、モノクローナル抗体OC4−30がGla
残基を有する、天然型のウシOCに特異的に反応している
ことが示された。
実施例２ モノクローナル抗体を用いたサンドイツチEI
A法によるGla残基を有する、天然型のOCの定量 実施例１で得たモノクローナル抗体OC4−30、OC−G4を
用いてGla残基を有する、天然型のOC測定試薬を調整し
た。
A法によるGla残基を有する、天然型のOCの定量 実施例１で得たモノクローナル抗体OC4−30、OC−G4を
用いてGla残基を有する、天然型のOC測定試薬を調整し
た。
(1)西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識モノクロー
ナル抗体の作製 HRP4mgを1mlの蒸留水に溶かし、0.1M過ヨウ素酸ナトリ
ウム0.2mlを加えて室温で20分間反応させた後、1mM酢酸
ナトリウムバツフアー（pH9.5）0.02mlを加えてpH9〜9.
5にすると同時にモノクローナル抗体OC−G4 8mg/ml〔0.
01M炭酸ナトリウムバツフアー（pH9.5）に対して透析し
たもの〕を加える。室温で２時間反応させた後、水素化
ホウ酸ナトリウム4mg/mlを0.1ml加えて４℃で２時間反
応させる。これをセフアデツクスＧ−200カラムでゲル
ろ過し、0.1M NaClを含む0.1Mリン酸ナトリウムバツフ
アーpH7.5で溶出させ、HRP標識OC−G4モノクローナル抗
体を分取した。
ナル抗体の作製 HRP4mgを1mlの蒸留水に溶かし、0.1M過ヨウ素酸ナトリ
ウム0.2mlを加えて室温で20分間反応させた後、1mM酢酸
ナトリウムバツフアー（pH9.5）0.02mlを加えてpH9〜9.
5にすると同時にモノクローナル抗体OC−G4 8mg/ml〔0.
01M炭酸ナトリウムバツフアー（pH9.5）に対して透析し
たもの〕を加える。室温で２時間反応させた後、水素化
ホウ酸ナトリウム4mg/mlを0.1ml加えて４℃で２時間反
応させる。これをセフアデツクスＧ−200カラムでゲル
ろ過し、0.1M NaClを含む0.1Mリン酸ナトリウムバツフ
アーpH7.5で溶出させ、HRP標識OC−G4モノクローナル抗
体を分取した。
(2)サンドイツチEIA測定系 96ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルにPBSに
溶解したモノクローナル抗体OC4−30、20μg/mlを100μ
ずつ添加し、４℃１晩インキユベートし、溶液を捨て
た後、１％BSAを含むPBS溶液を100μずつ各ウエルに
添加し、37℃で１時間ブロツキングを行つた。PBSでよ
く洗浄し、試料50mを加え１％BSAを含むPBSで希釈し
たHRP標識OC−G4モノクローナル抗体液50μｌを添加し
て４℃で18時間反応させた。PBSで３回洗浄したのち、
0.01％過酸化水素、1mg/ml o−フエニレンジアミンを含
む0.1Mクエン酸バツフアー（pH4.5）0.1mlを加え、20分
間室温で反応させた後、1NH2SO40.1mlを加え、波長492n
mでの吸光度を測定した。
溶解したモノクローナル抗体OC4−30、20μg/mlを100μ
ずつ添加し、４℃１晩インキユベートし、溶液を捨て
た後、１％BSAを含むPBS溶液を100μずつ各ウエルに
添加し、37℃で１時間ブロツキングを行つた。PBSでよ
く洗浄し、試料50mを加え１％BSAを含むPBSで希釈し
たHRP標識OC−G4モノクローナル抗体液50μｌを添加し
て４℃で18時間反応させた。PBSで３回洗浄したのち、
0.01％過酸化水素、1mg/ml o−フエニレンジアミンを含
む0.1Mクエン酸バツフアー（pH4.5）0.1mlを加え、20分
間室温で反応させた後、1NH2SO40.1mlを加え、波長492n
mでの吸光度を測定した。
(3)測定系の感度、特異性 オリス工業社製オステオカルシンRIAキツト中の標準OC
溶液（0.5〜55ng/ml）、ヒト標準血清、及びGla残基を
脱炭酸してGlu残基としたOCを用いて感度及び特異性を
検討した。
溶液（0.5〜55ng/ml）、ヒト標準血清、及びGla残基を
脱炭酸してGlu残基としたOCを用いて感度及び特異性を
検討した。
その結果を第１図に示す。すなわち第１図は本発明のモ
ノクローナル抗体を用いたサンドイツチEIA法によるOC
測定の感度と特異性を示したグラフであり、横軸はOC濃
度（ng/ml）、縦軸は492nmでの吸光度である。第１図に
示すように、サンドイツチEIA法によるGla含有OC、すな
わち、Gla残基を有する、天然型のOC（図注●で示す）
の測定感度は0.5ng/mlであり、ヒト標準血清中のOC（図
注△で示す）の測定感度は6.0ng/mlであつた。更にGla
を含まないOC、すなわち、Gla残基を脱炭酸してGlu残基
としたOC（図注○で示す）の測定感度は1000ng/mlまで
発色は認められず、本モノクローナル抗体を用いた測定
系はGla残基を有する、天然型のOCの測定方法であり、
一方、ヒト血中OC量の測定も可能であることが示され
た。
ノクローナル抗体を用いたサンドイツチEIA法によるOC
測定の感度と特異性を示したグラフであり、横軸はOC濃
度（ng/ml）、縦軸は492nmでの吸光度である。第１図に
示すように、サンドイツチEIA法によるGla含有OC、すな
わち、Gla残基を有する、天然型のOC（図注●で示す）
の測定感度は0.5ng/mlであり、ヒト標準血清中のOC（図
注△で示す）の測定感度は6.0ng/mlであつた。更にGla
を含まないOC、すなわち、Gla残基を脱炭酸してGlu残基
としたOC（図注○で示す）の測定感度は1000ng/mlまで
発色は認められず、本モノクローナル抗体を用いた測定
系はGla残基を有する、天然型のOCの測定方法であり、
一方、ヒト血中OC量の測定も可能であることが示され
た。
以上詳細に説明した通り、本発明によりGla残基を有す
る、天然型のOCと反応するモノクローナル抗体が提供さ
れた。
る、天然型のOCと反応するモノクローナル抗体が提供さ
れた。
本発明のモノクローナル抗体を利用することで、Gla残
基を有する、天然型のOCに特異的な測定方法が可能にな
り、骨代謝における活性型OCの役割の解明、骨疾患にお
ける血中活性型OCの測定等に非常に有用である。
基を有する、天然型のOCに特異的な測定方法が可能にな
り、骨代謝における活性型OCの役割の解明、骨疾患にお
ける血中活性型OCの測定等に非常に有用である。
第１図は本発明のモノクローナル抗体を用いたサンドイ
ツチEIA法によるOC測定の感度と特異性を示したグラフ
である。
ツチEIA法によるOC測定の感度と特異性を示したグラフ
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 小山 信人 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 小原 加奈子 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内
Claims (3)
- 【請求項１】γ−カルボキシグルタミン酸残基を有す
る、天然型のオステオカルシンと反応し、γ−カルボキ
シグルタミン酸残基を脱炭酸してグルタミン酸残基とし
たオステオカルシンとは反応しないことを特徴とする抗
オステオカルシンモノクローナル抗体。 - 【請求項２】該抗オステオカルシンモノクローナル抗体
が、ハイブリドーマFERM BP−2725より産生され得る、
下記の性質を有するOC4−30である請求項１記載のモノ
クローナル抗体。 ａ）分子量:145,000 ｂ）Igクラス：IgG2a ｃ）反応性：少なくともγ−カルボキシグルタミン酸残
基を有する、天然型のウシ−オステオカルシンに対して
反応性を示し、γ−カルボキシグルタミン酸残基を脱炭
酸してグルタミン酸残基としたウシ−オステオカルシン
に対して反応性を示さない。 - 【請求項３】生体試料中のオステオカルシンの免疫学的
測定に際して、γ−カルボキシグルタミン酸残基を有す
る、天然型のオステオカルシンと反応し、γ−カルボキ
シグルタミン酸残基を脱炭酸してグルタミン酸残基とし
たオステオカルシンとは反応しない抗オステオカルシン
モノクローナル抗体を使用することを特徴とするオステ
オカルシンの測定方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1062126A JPH0739439B2 (ja) | 1989-03-16 | 1989-03-16 | モノクローナル抗体及びその使用方法 |
| DE19904008546 DE4008546A1 (de) | 1989-03-16 | 1990-03-16 | Osteocalcin-spezifischer monoclonaler antikoerper |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1062126A JPH0739439B2 (ja) | 1989-03-16 | 1989-03-16 | モノクローナル抗体及びその使用方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02242696A JPH02242696A (ja) | 1990-09-27 |
| JPH0739439B2 true JPH0739439B2 (ja) | 1995-05-01 |
Family
ID=13191065
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1062126A Expired - Lifetime JPH0739439B2 (ja) | 1989-03-16 | 1989-03-16 | モノクローナル抗体及びその使用方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0739439B2 (ja) |
| DE (1) | DE4008546A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69219451T2 (de) * | 1992-02-27 | 1997-10-23 | Delmas Pierre Dr | Einschätzung der Beinzerbrechlichkeit und Voraussage osteoporotischer Bruchaussicht unter Verwendung einer quantitativen Bestimmung zirkulierendes unterkarboxyliertes Osteokalzin |
| US6004765A (en) * | 1992-02-27 | 1999-12-21 | Delmas; Pierre | Assessment of bone fragility and prediction of osteoporotic fracture risk using a quantitative determination of circulating under-carboxylated osteocalcin |
| FI990693A0 (fi) | 1999-03-29 | 1999-03-29 | Kaekoenen Sanna Maria | Menetelmä luunmurtumien ennustamiseksi osteokalsiinimääritysten avulla |
| ATE265048T1 (de) * | 1999-08-14 | 2004-05-15 | November Ag Molekulare Medizin | Verfahren zur indirekten bestimmung des blutgerinnungsstatus |
| SE0000675D0 (sv) * | 2000-03-02 | 2000-03-02 | Protease Ab | Monoclonal antibodies |
| US7399466B2 (en) | 2000-08-23 | 2008-07-15 | Enobia Pharma Inc. | Method and compositions for promoting osteogenesis |
| JP5797596B2 (ja) | 2011-04-21 | 2015-10-21 | 株式会社ジェイテクト | 転がり軸受 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0678788A (ja) * | 1992-02-27 | 1994-03-22 | Pierre Dr Delmas | 骨ぜい弱性と骨粗しょう症骨折の危険性の検査方法 |
-
1989
- 1989-03-16 JP JP1062126A patent/JPH0739439B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-03-16 DE DE19904008546 patent/DE4008546A1/de active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0678788A (ja) * | 1992-02-27 | 1994-03-22 | Pierre Dr Delmas | 骨ぜい弱性と骨粗しょう症骨折の危険性の検査方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE4008546C2 (ja) | 1991-07-04 |
| DE4008546A1 (de) | 1990-09-20 |
| JPH02242696A (ja) | 1990-09-27 |
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