JPH0755804A - 活性なオステオカルシンの測定法 - Google Patents
活性なオステオカルシンの測定法Info
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- JPH0755804A JPH0755804A JP21498293A JP21498293A JPH0755804A JP H0755804 A JPH0755804 A JP H0755804A JP 21498293 A JP21498293 A JP 21498293A JP 21498293 A JP21498293 A JP 21498293A JP H0755804 A JPH0755804 A JP H0755804A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 活性なオステオカルシンを特異的に測定す
る方法を提供することを目的とする。 【構成】 ハイドロキシアパタイト、およびオステオ
カルシンまたはそのフラグメントに結合性を有する物質
を測定試薬として使用することにより、活性なオステオ
カルシンのみを特異的に測定することができる。
る方法を提供することを目的とする。 【構成】 ハイドロキシアパタイト、およびオステオ
カルシンまたはそのフラグメントに結合性を有する物質
を測定試薬として使用することにより、活性なオステオ
カルシンのみを特異的に測定することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ハイドロキシアパタイ
ト、およびオステオカルシンまたはそのフラグメントに
結合性を有する物質（以下、オステオカルシン結合性物
質と略称することもある）を測定試薬として使用する、
活性なオステオカルシンの測定法及び該測定法に使用す
るキットに関するものである。
ト、およびオステオカルシンまたはそのフラグメントに
結合性を有する物質（以下、オステオカルシン結合性物
質と略称することもある）を測定試薬として使用する、
活性なオステオカルシンの測定法及び該測定法に使用す
るキットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】オステオカルシンは、ボ−ン・グラ・プ
ロテイン（ＢＧＰ）またはビタミンＫ依存性カルシウム
結合タンパクとも称され、骨芽細胞によって生合成され
る４９〜５０個のアミノ酸からなる非コラ−ゲン性タン
パク質（分子量約６，０００；ヒトおよびウシは４９
個、ラットは５０個のアミノ酸からそれぞれ構成され
る）であり、骨のタンパク質中に１〜２％程度存在す
る。
ロテイン（ＢＧＰ）またはビタミンＫ依存性カルシウム
結合タンパクとも称され、骨芽細胞によって生合成され
る４９〜５０個のアミノ酸からなる非コラ−ゲン性タン
パク質（分子量約６，０００；ヒトおよびウシは４９
個、ラットは５０個のアミノ酸からそれぞれ構成され
る）であり、骨のタンパク質中に１〜２％程度存在す
る。
【０００３】オステオカルシンの分子中には、３つのγ
−カルボキシグルタミン酸残基（Ｇｌａ残基；Ｎ末端か
ら数えて１７位、２１位および２４位に存在する）と１
つのＳ−Ｓ結合が存在し（Haemostasis, 16:258,(198
6)）、この３つのＧｌａ残基がハイドロキシアパタイト
との結合に重要な役割を演じているものと考えられてい
る（Biochemistry, 21:2538,(1982)）。すなわち、１７
位のＧｌａ残基は脱カルボキシル化（Ｇｌａ残基からグ
ルタミン酸（Ｇｌｕ）残基への変換）され易く、Ｇｌａ
残基が脱カルボキシル化される程度に比例してオステオ
カルシンのハイドロキシアパタイトへの結合力が減弱
し、全てのＧｌａ残基が脱カルボキシル化されるとハイ
ドロキシアパタイトへの結合力はほぼ完全に消失すると
されている（J Biol.Chem. 254:431(1979)）。
−カルボキシグルタミン酸残基（Ｇｌａ残基；Ｎ末端か
ら数えて１７位、２１位および２４位に存在する）と１
つのＳ−Ｓ結合が存在し（Haemostasis, 16:258,(198
6)）、この３つのＧｌａ残基がハイドロキシアパタイト
との結合に重要な役割を演じているものと考えられてい
る（Biochemistry, 21:2538,(1982)）。すなわち、１７
位のＧｌａ残基は脱カルボキシル化（Ｇｌａ残基からグ
ルタミン酸（Ｇｌｕ）残基への変換）され易く、Ｇｌａ
残基が脱カルボキシル化される程度に比例してオステオ
カルシンのハイドロキシアパタイトへの結合力が減弱
し、全てのＧｌａ残基が脱カルボキシル化されるとハイ
ドロキシアパタイトへの結合力はほぼ完全に消失すると
されている（J Biol.Chem. 254:431(1979)）。
【０００４】検体中のオステオカルシンを測定する方法
としては、抗ウシオステオカルシン抗体を利用したＲＩ
Ａ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:2234(1980)）、ヒトオ
ステオカルシンのＣ末端部（３７〜４９）に対する抗体
を用いる方法（Bone,6:9(1985)、 Calcif.Tissue Int.,
39:310(1986)）、ウシとヒトのオステオカルシンの共通
アミノ酸配列を利用し、２種類の抗ウシオステオカルシ
ンモノクロ−ナル抗体を用いたサンドイッチ法（J.Immu
nol.Meth.94:19(1986)、特開昭６２−３１８５６４号、
特開昭６３ー２０９５９６号、特開平１ー１６０４９３
号）などが報告されている。
としては、抗ウシオステオカルシン抗体を利用したＲＩ
Ａ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:2234(1980)）、ヒトオ
ステオカルシンのＣ末端部（３７〜４９）に対する抗体
を用いる方法（Bone,6:9(1985)、 Calcif.Tissue Int.,
39:310(1986)）、ウシとヒトのオステオカルシンの共通
アミノ酸配列を利用し、２種類の抗ウシオステオカルシ
ンモノクロ−ナル抗体を用いたサンドイッチ法（J.Immu
nol.Meth.94:19(1986)、特開昭６２−３１８５６４号、
特開昭６３ー２０９５９６号、特開平１ー１６０４９３
号）などが報告されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】検体中のオステオカル
シンの存在形態は一様ではなく、活性なオステオカルシ
ン、１〜３個のＧｌａ残基が脱カルボキシル化されたオ
ステオカルシン、プロテアーゼなどにより分解された種
々のオステオカルシンフラグメントなど、様々な形態で
存在することが明らかになっている（J.Clin.Invest.7
7:1762(1986)）。しかしながら上述の従来法は、使用す
る抗体の特異性から判断して、活性なオステオカルシ
ン、脱カルボキシル化オステオカルシン、分解されたオ
ステオカルシンフラグメントなどの各々を区別して測定
することができないという欠点を有し、必ずしも満足で
きる方法ではなかった。
シンの存在形態は一様ではなく、活性なオステオカルシ
ン、１〜３個のＧｌａ残基が脱カルボキシル化されたオ
ステオカルシン、プロテアーゼなどにより分解された種
々のオステオカルシンフラグメントなど、様々な形態で
存在することが明らかになっている（J.Clin.Invest.7
7:1762(1986)）。しかしながら上述の従来法は、使用す
る抗体の特異性から判断して、活性なオステオカルシ
ン、脱カルボキシル化オステオカルシン、分解されたオ
ステオカルシンフラグメントなどの各々を区別して測定
することができないという欠点を有し、必ずしも満足で
きる方法ではなかった。
【０００６】このような従来法の欠点を克服するため、
ヒトオステオカルシンのＮ端部（１〜２０）およびＣ端
部（３６〜４９）のアミノ酸配列に対する二種類のモノ
クロ−ナル抗体を用いて分解されていないインタクトオ
ステオカルシンのみを特異的に測定する方法も報告され
ているが（ＷＯ９０／０９５８７）、この方法であって
も依然として活性なオステオカルシンと脱カルボキシル
化されたオステオカルシンとを区別して測定できないと
いう問題を有していた。
ヒトオステオカルシンのＮ端部（１〜２０）およびＣ端
部（３６〜４９）のアミノ酸配列に対する二種類のモノ
クロ−ナル抗体を用いて分解されていないインタクトオ
ステオカルシンのみを特異的に測定する方法も報告され
ているが（ＷＯ９０／０９５８７）、この方法であって
も依然として活性なオステオカルシンと脱カルボキシル
化されたオステオカルシンとを区別して測定できないと
いう問題を有していた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、脱カルボ
キシル化されていない活性なオステオカルシンのみを特
異的に測定する方法について種々研究を重ねた結果、ハ
イドロキシアパタイトを測定試薬として使用することに
より活性なオステオカルシンのみを特異的に測定できる
ことを見いだし、本発明を完成させた。したがって、本
発明は、ハイドロキシアパタイト、およびオステオカル
シン結合性物質を測定試薬として使用する、活性なオス
テオカルシンの測定法及び該測定法に使用するキットに
関するものである。以下、本発明を詳細に説明する。
キシル化されていない活性なオステオカルシンのみを特
異的に測定する方法について種々研究を重ねた結果、ハ
イドロキシアパタイトを測定試薬として使用することに
より活性なオステオカルシンのみを特異的に測定できる
ことを見いだし、本発明を完成させた。したがって、本
発明は、ハイドロキシアパタイト、およびオステオカル
シン結合性物質を測定試薬として使用する、活性なオス
テオカルシンの測定法及び該測定法に使用するキットに
関するものである。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】本発明方法で使用するハイドロキシアパタ
イト（別名、ヒドロキシアパタイトとも言う）の種類
は、特に制限されない。すなわち、タンパク質、ＤＮＡ
などの分離精製などに使用されている通常のものを使用
することができる。具体的には、ＤＮＡグレードバイオ
ゲルＨＴＰ（バイオラッド社製）等を例示することがで
きる。ハイドロキシアパタイトの形状も特に制限されな
い。微粒子状、粒状、管状、平板状などいずれの形態で
あっても使用することができ、必要によりその他の適当
な形状に適宜成型したものを使用してもかまわない。
イト（別名、ヒドロキシアパタイトとも言う）の種類
は、特に制限されない。すなわち、タンパク質、ＤＮＡ
などの分離精製などに使用されている通常のものを使用
することができる。具体的には、ＤＮＡグレードバイオ
ゲルＨＴＰ（バイオラッド社製）等を例示することがで
きる。ハイドロキシアパタイトの形状も特に制限されな
い。微粒子状、粒状、管状、平板状などいずれの形態で
あっても使用することができ、必要によりその他の適当
な形状に適宜成型したものを使用してもかまわない。
【０００９】本発明方法で使用するオステオカルシン結
合性物質は、オステオカルシンまたはそのフラグメント
に結合性を有するものであれば特に制限されない。具体
的には、抗オステオカルシン抗体またはコラーゲンを例
示することができる。抗オステオカルシン抗体は、抗血
清（ポリクロナル抗体）、モノクロ−ナル抗体のいずれ
であってもよく、抗体のクラス、親和性、特異性等には
制限されない。このような抗体は、ホルモン等の低分子
ポリペプチドに対する抗体の製造法として公知の方法を
適宜適用することにより容易に調製することができる。
また、市販の抗オステオカルシン抗体を使用してもよ
い。
合性物質は、オステオカルシンまたはそのフラグメント
に結合性を有するものであれば特に制限されない。具体
的には、抗オステオカルシン抗体またはコラーゲンを例
示することができる。抗オステオカルシン抗体は、抗血
清（ポリクロナル抗体）、モノクロ−ナル抗体のいずれ
であってもよく、抗体のクラス、親和性、特異性等には
制限されない。このような抗体は、ホルモン等の低分子
ポリペプチドに対する抗体の製造法として公知の方法を
適宜適用することにより容易に調製することができる。
また、市販の抗オステオカルシン抗体を使用してもよ
い。
【００１０】使用する抗体は抗体そのものであってもよ
いが、非特異的な吸着を防止する意味から抗体の活性フ
ラグメントを使用するのが好ましい。抗体の活性フラグ
メントは抗体の特徴を保持するもの（たとえば、Ｆ（ａ
ｂ’）2 、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどの各種フラグメント）
であればいずれのものであってもよい。これら活性フラ
グメントの調製は、精製抗体をパパイン、ペプシン、ト
リプシンなどのプロテアーゼを用いて限定分解する方法
など公知の方法を適用して行うことができる（たとえば
「免疫生化学研究法（続生化学実験講座５）」、日本生
化学会編、８９頁（１９８６年）参照）。
いが、非特異的な吸着を防止する意味から抗体の活性フ
ラグメントを使用するのが好ましい。抗体の活性フラグ
メントは抗体の特徴を保持するもの（たとえば、Ｆ（ａ
ｂ’）2 、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどの各種フラグメント）
であればいずれのものであってもよい。これら活性フラ
グメントの調製は、精製抗体をパパイン、ペプシン、ト
リプシンなどのプロテアーゼを用いて限定分解する方法
など公知の方法を適用して行うことができる（たとえば
「免疫生化学研究法（続生化学実験講座５）」、日本生
化学会編、８９頁（１９８６年）参照）。
【００１１】コラーゲンは、オステオカルシンに結合性
を有するものであれば、特にその種類に制限されない。
すなわち、上記特徴を有する限り、どの型のコラーゲン
でもよく、その中でも特に、骨、象牙などの硬組織から
調製されたＩ型コラーゲンが好ましい。コラーゲンの調
製は常法［コラーゲン実験法、第２１〜５０頁（１９８
５年講談社発行）等参照）］により実施することができ
る。また、本発明の測定法においては市販のコラーゲン
を使用してもよく、たとえば、コラーゲンタイプＩ溶液
（和光純薬社製）等を例示することができる。
を有するものであれば、特にその種類に制限されない。
すなわち、上記特徴を有する限り、どの型のコラーゲン
でもよく、その中でも特に、骨、象牙などの硬組織から
調製されたＩ型コラーゲンが好ましい。コラーゲンの調
製は常法［コラーゲン実験法、第２１〜５０頁（１９８
５年講談社発行）等参照）］により実施することができ
る。また、本発明の測定法においては市販のコラーゲン
を使用してもよく、たとえば、コラーゲンタイプＩ溶液
（和光純薬社製）等を例示することができる。
【００１２】本発明の測定法はハイドロシキアパタイト
とオステオカルシン結合性物質を測定試薬として使用す
ることを特徴としており、その測定様式には制限されな
い。反応様式による分類として、競合反応法と非競合反
応法が知られており、本発明においてはいずれの方法も
採用できるが、特に非競合反応法が好ましい。検出方法
による分類として、抗原抗体反応の結果を直接検出する
非標識法（ネフェロメトリーなど）と、なんらかのマー
カーを使用して検出する標識法が知られているが、本発
明では標識法が好ましい。ＢＦ分離を行う必要のあるヘ
テロジニアス法と必要のないホモジニアス法が知られて
おり、本発明ではヘテロジニアス法が好ましい。これら
公知の一般法の中から本発明の測定法の目的に適合する
方法を適宜選択すればよい。なお、一般的方法の詳細に
ついては、たとえば以下の文献に詳細に記載されてい
る。
とオステオカルシン結合性物質を測定試薬として使用す
ることを特徴としており、その測定様式には制限されな
い。反応様式による分類として、競合反応法と非競合反
応法が知られており、本発明においてはいずれの方法も
採用できるが、特に非競合反応法が好ましい。検出方法
による分類として、抗原抗体反応の結果を直接検出する
非標識法（ネフェロメトリーなど）と、なんらかのマー
カーを使用して検出する標識法が知られているが、本発
明では標識法が好ましい。ＢＦ分離を行う必要のあるヘ
テロジニアス法と必要のないホモジニアス法が知られて
おり、本発明ではヘテロジニアス法が好ましい。これら
公知の一般法の中から本発明の測定法の目的に適合する
方法を適宜選択すればよい。なお、一般的方法の詳細に
ついては、たとえば以下の文献に詳細に記載されてい
る。
【００１３】入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」
（（株）講談社、昭和５４年５月１日発行） 石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（（株）
医学書院、１９８２年１２月１５日発行） 臨床病理 臨時増刊 特集第５３号「臨床検査のため
のイムノアッセイ−技術と応用−」（臨床病理刊行会、
１９８３年発行） 「バイオテクノロジー事典」（（株）シーエムシー、
１９８６年１０月９日発行） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.70」（Immunochemical
techniques (Part A)） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.73」（Immunochemical
techniques (Part B)） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.74」（Immunochemical
techniques (Part C)） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.84」（Immunochemical
techniques (Part D:Selected Immunoassay)） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.92」（Immunochemical
techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and Gene
ral Immunoassay Methods)） ［〜はアカデミックプレス社発行］
（（株）講談社、昭和５４年５月１日発行） 石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（（株）
医学書院、１９８２年１２月１５日発行） 臨床病理 臨時増刊 特集第５３号「臨床検査のため
のイムノアッセイ−技術と応用−」（臨床病理刊行会、
１９８３年発行） 「バイオテクノロジー事典」（（株）シーエムシー、
１９８６年１０月９日発行） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.70」（Immunochemical
techniques (Part A)） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.73」（Immunochemical
techniques (Part B)） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.74」（Immunochemical
techniques (Part C)） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.84」（Immunochemical
techniques (Part D:Selected Immunoassay)） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.92」（Immunochemical
techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and Gene
ral Immunoassay Methods)） ［〜はアカデミックプレス社発行］
【００１４】このような公知の測定法の中でも、ハイド
ロキシアパタイト、オステオカルシンおよび標識された
オステオカルシン結合性物質の三元複合体を形成させ、
該三元複合体中の標識量またはそれ以外の標識量を測定
することからなる、いわゆるサンドイッチ法を好適な方
法として例示することができる。サンドイッチ法の三元
複合体の形成におけるハイドロキシアパタイト、オステ
オカルシンおよび標識されたオステオカルシン結合性物
質の反応順序は、特に制限されない。すなわち、ハイド
ロキシアパタイトおよびオステオカルシン（検体中また
は標準液中）を反応させ、必要により生成した二元複合
体とその他のものを遠心分離、洗浄などの個液分離手段
で分離後、標識されたオステオカルシン結合性物質を反
応させてもよく、またその逆であってもよい。さらに、
ハイドロキシアパタイト、オステオカルシン（検体中ま
たは標準液中）および標識されたオステオカルシン結合
性物質を同時に反応させてもよい。
ロキシアパタイト、オステオカルシンおよび標識された
オステオカルシン結合性物質の三元複合体を形成させ、
該三元複合体中の標識量またはそれ以外の標識量を測定
することからなる、いわゆるサンドイッチ法を好適な方
法として例示することができる。サンドイッチ法の三元
複合体の形成におけるハイドロキシアパタイト、オステ
オカルシンおよび標識されたオステオカルシン結合性物
質の反応順序は、特に制限されない。すなわち、ハイド
ロキシアパタイトおよびオステオカルシン（検体中また
は標準液中）を反応させ、必要により生成した二元複合
体とその他のものを遠心分離、洗浄などの個液分離手段
で分離後、標識されたオステオカルシン結合性物質を反
応させてもよく、またその逆であってもよい。さらに、
ハイドロキシアパタイト、オステオカルシン（検体中ま
たは標準液中）および標識されたオステオカルシン結合
性物質を同時に反応させてもよい。
【００１５】オステオカルシン結合性物質を標識するた
めの標識剤としては、放射性同位体（たとえば 38Ｐ、3
Ｈ、5Ｃ、125Ｉなど）、酵素（たとえばβ−ガラクトシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アル
コールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼなど）、
補酵素・補欠分子族（たとえば、ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴ
Ｐ、ビオチン、ヘムなど）、フルオレセイン誘導体（た
とえば、フルオレセインイソチオシアネート、フルオレ
セインチオフルバミルなど）、ローダミン誘導体（たと
えば、テトラメチルローダミンＢイソチオシアネートな
ど）、ウムベリフェロンおよび１−アニリノ−８−ナフ
タレンスルホン酸などの蛍光色素、ルミノ−ル誘導体
（たとえば、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−（６−
アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノールなど）な
どを例示することができる。標識化方法としては、成書
〔たとえば、「続生化学実験講座５ 免疫生化学研究
法」（株）東京化学同人、（１９８６年発行）第１０２
〜１１２頁〕に記載されている公知の方法から適宜選択
すればよい。
めの標識剤としては、放射性同位体（たとえば 38Ｐ、3
Ｈ、5Ｃ、125Ｉなど）、酵素（たとえばβ−ガラクトシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アル
コールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼなど）、
補酵素・補欠分子族（たとえば、ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴ
Ｐ、ビオチン、ヘムなど）、フルオレセイン誘導体（た
とえば、フルオレセインイソチオシアネート、フルオレ
セインチオフルバミルなど）、ローダミン誘導体（たと
えば、テトラメチルローダミンＢイソチオシアネートな
ど）、ウムベリフェロンおよび１−アニリノ−８−ナフ
タレンスルホン酸などの蛍光色素、ルミノ−ル誘導体
（たとえば、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−（６−
アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノールなど）な
どを例示することができる。標識化方法としては、成書
〔たとえば、「続生化学実験講座５ 免疫生化学研究
法」（株）東京化学同人、（１９８６年発行）第１０２
〜１１２頁〕に記載されている公知の方法から適宜選択
すればよい。
【００１６】ハイドロキシアパタイトを使用する本発明
方法は、特定の測定条件下で行うことが肝要である。す
なわち、ハイドロキシアパタイトの結晶が安定して存在
するのはｐＨ５以上であり、また、低イオン強度条件下
ではタンパク質、ペプチドなどを非特異的に結合し、イ
オン強度の上昇とともにそれらを遊離させる性質を有す
るからである。したがって、本発明方法では、特にｐ
Ｈ、イオン強度およびタンパク質濃度の各条件を下記の
範囲内から測定方法に対応した好適な条件を適宜選定
し、それを測定条件として採用することが重要である。
なお、反応液中のイオン強度を正確に算出するのは極め
て煩雑であるため、本発明の方法では反応液中の塩化物
の濃度をイオン強度とみなして実施しており、下記のイ
オン強度も塩化物の濃度で表している。
方法は、特定の測定条件下で行うことが肝要である。す
なわち、ハイドロキシアパタイトの結晶が安定して存在
するのはｐＨ５以上であり、また、低イオン強度条件下
ではタンパク質、ペプチドなどを非特異的に結合し、イ
オン強度の上昇とともにそれらを遊離させる性質を有す
るからである。したがって、本発明方法では、特にｐ
Ｈ、イオン強度およびタンパク質濃度の各条件を下記の
範囲内から測定方法に対応した好適な条件を適宜選定
し、それを測定条件として採用することが重要である。
なお、反応液中のイオン強度を正確に算出するのは極め
て煩雑であるため、本発明の方法では反応液中の塩化物
の濃度をイオン強度とみなして実施しており、下記のイ
オン強度も塩化物の濃度で表している。
【００１７】ｐＨ条件：５〜１０、好ましくは６〜９、
さらに好ましくは７〜８ イオン強度条件：０．０１〜０．５Ｍ、好ましくは０．
１〜０．４Ｍ、さらに好ましくは０．２５〜０．３５Ｍ タンパク質濃度条件：０．１〜５％（Ｗ／Ｖ）、好まし
くは０．１〜３％、さらに好ましくは０．５〜２％ ｐＨ条件は、従来公知の各種緩衝液を使用することによ
り特定のｐＨに維持することができる。イオン強度の調
整には、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の各種塩化物
を使用することができる。また、タンパク質としてはウ
シ血清アルブミン、ウシ血清グロブリン、ヒト血清アル
ブミン、ウサギ血清アルブミン等の動物血液由来のタン
パク質、ゼラチンなどの免疫測定においてブロッキング
剤として常用されているものを使用することができる。
ハイドロキシアパタイト、オステオカルシンおよび／ま
たはオステオカルシン結合性物質の反応は０〜５０℃の
温度条件下１〜３０時間程度反応させることにより完了
させることができる。
さらに好ましくは７〜８ イオン強度条件：０．０１〜０．５Ｍ、好ましくは０．
１〜０．４Ｍ、さらに好ましくは０．２５〜０．３５Ｍ タンパク質濃度条件：０．１〜５％（Ｗ／Ｖ）、好まし
くは０．１〜３％、さらに好ましくは０．５〜２％ ｐＨ条件は、従来公知の各種緩衝液を使用することによ
り特定のｐＨに維持することができる。イオン強度の調
整には、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の各種塩化物
を使用することができる。また、タンパク質としてはウ
シ血清アルブミン、ウシ血清グロブリン、ヒト血清アル
ブミン、ウサギ血清アルブミン等の動物血液由来のタン
パク質、ゼラチンなどの免疫測定においてブロッキング
剤として常用されているものを使用することができる。
ハイドロキシアパタイト、オステオカルシンおよび／ま
たはオステオカルシン結合性物質の反応は０〜５０℃の
温度条件下１〜３０時間程度反応させることにより完了
させることができる。
【００１８】本発明のキットは、ハイドロキシアパタイ
トおよびオステオカルシン結合性物質を構成試薬として
包含することを特徴とするものであり、キットの他の試
薬構成は採用した測定法によって適宜変更されうる。た
とえば、上記サンドイッチ法の場合、例えば下記の試薬
から構成される。 ハイドロキシアパタイト 標識化オステオカルシン結合性物質 既知濃度のオステオカルシン溶液
トおよびオステオカルシン結合性物質を構成試薬として
包含することを特徴とするものであり、キットの他の試
薬構成は採用した測定法によって適宜変更されうる。た
とえば、上記サンドイッチ法の場合、例えば下記の試薬
から構成される。 ハイドロキシアパタイト 標識化オステオカルシン結合性物質 既知濃度のオステオカルシン溶液
【００１９】
【発明の効果】本発明方法は、活性なオステオカルシン
を特異的に測定することができ、骨疾患の診断に有用な
ものである。
を特異的に測定することができ、骨疾患の診断に有用な
ものである。
【００２０】
【実施例】以下、実施例により、本発明を具体的に説明
する。 実施例１：ハイドロキシアパタイトとモノクローナル抗
オステオカルシン抗体による活性なオステオカルシンの
測定 （１）モノクローナル抗オステオカルシン抗体の作製 ヒト・オステオカルシンのＣ端末部から１５アミノ酸残
基に相当する合成ペプチド（ ＮＨ2−ＹＬＹＱＷＬＧＡ
ＰＶＰＹＰＤＰ−ＣＯＯＨ）とウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）を用い、通常のマレイミド法〔日本免疫実験操作
法ＸＩ（日本免疫学会、昭和５７年発行）第３５２９〜
３５３４頁）〕にて該合成ペプチドとＢＳＡの複合体を
調製した。
する。 実施例１：ハイドロキシアパタイトとモノクローナル抗
オステオカルシン抗体による活性なオステオカルシンの
測定 （１）モノクローナル抗オステオカルシン抗体の作製 ヒト・オステオカルシンのＣ端末部から１５アミノ酸残
基に相当する合成ペプチド（ ＮＨ2−ＹＬＹＱＷＬＧＡ
ＰＶＰＹＰＤＰ−ＣＯＯＨ）とウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）を用い、通常のマレイミド法〔日本免疫実験操作
法ＸＩ（日本免疫学会、昭和５７年発行）第３５２９〜
３５３４頁）〕にて該合成ペプチドとＢＳＡの複合体を
調製した。
【００２１】この複合体１０〜１００μｇをフロイント
完全アジュバントとともにＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、６
週齢）の腹腔内に投与後、２〜４週間間隔で同様に追加
免疫を行った。適当な時期に採血して抗体価を測定し、
抗体価が充分に上昇していることを確認した後、５〜５
０μｇの上記複合体を静脈内投与した。静脈内投与３日
後にマウスの脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗
浄した。一方、マウスミエローマＰ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．
１（Ｐ3Ｕ1）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９７）をＲＰＭ
Ｉ１６４０培地で洗浄し、上記脾細胞とＰ3Ｕ1を１０：
１で混合した後、遠心分離して得たペレットに５０％ポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）１０００含有ＲＰＭＩ
１６４０培地１ｍｌを徐々に加えて細胞融合を行った。
さらに、ＲＰＭＩ１６４０培地を加えて１０ｍｌとし、
遠心分離して得たペレットを１０％ウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地にＰ3Ｕ1として３×１０
4 個／０．１ｍｌとなるように懸濁させ、この懸濁液を
９６ウェルマイクロプレート（塩化ポリビニール製）に
各ウェル０．１ｍｌずつ分注した。
完全アジュバントとともにＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、６
週齢）の腹腔内に投与後、２〜４週間間隔で同様に追加
免疫を行った。適当な時期に採血して抗体価を測定し、
抗体価が充分に上昇していることを確認した後、５〜５
０μｇの上記複合体を静脈内投与した。静脈内投与３日
後にマウスの脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗
浄した。一方、マウスミエローマＰ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．
１（Ｐ3Ｕ1）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９７）をＲＰＭ
Ｉ１６４０培地で洗浄し、上記脾細胞とＰ3Ｕ1を１０：
１で混合した後、遠心分離して得たペレットに５０％ポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）１０００含有ＲＰＭＩ
１６４０培地１ｍｌを徐々に加えて細胞融合を行った。
さらに、ＲＰＭＩ１６４０培地を加えて１０ｍｌとし、
遠心分離して得たペレットを１０％ウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地にＰ3Ｕ1として３×１０
4 個／０．１ｍｌとなるように懸濁させ、この懸濁液を
９６ウェルマイクロプレート（塩化ポリビニール製）に
各ウェル０．１ｍｌずつ分注した。
【００２２】１日後、ＨＡＴ培地を０．１ｍｌ添加し、
その後３〜４日ごとに培地の半分量を新しいＨＡＴ培地
で交換した。融合から７〜１４日目に培養上清を採取
し、上記合成ペプチドに対するモノクローナル抗体を酵
素免疫測定法によりスクリーニングした。すなわち、合
成ペプチドをコートし、３％ゼラチンでブロッキング処
理を施した９６ウェルマイクロプレートに培養上清５０
μｌ添加後、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（ベクター
社製）溶液５０μｌを加えて室温で１時間反応させた。
反応後、ＰＢＳで３回洗浄し、アビジンＤ−ペルオキシ
ダーゼ（ベクター社製）溶液５０μｌを加えて室温で３
０分反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、基質溶液［４−
アミノアンチピリン（０．２５ｍｇ／ｍｌ）、フェノー
ル（０．２５ｍｇ／ｍｌ）、０．４２５Ｍ過酸化水素含
有］２００μｌを加え、室温で反応させた後、９６ウェ
ルマイクロプレートフォトメーターを用いて各ウェルの
５５０ｎｍにおける吸光度を測定し、合成ペプチドに特
異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを選別した。
その後３〜４日ごとに培地の半分量を新しいＨＡＴ培地
で交換した。融合から７〜１４日目に培養上清を採取
し、上記合成ペプチドに対するモノクローナル抗体を酵
素免疫測定法によりスクリーニングした。すなわち、合
成ペプチドをコートし、３％ゼラチンでブロッキング処
理を施した９６ウェルマイクロプレートに培養上清５０
μｌ添加後、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（ベクター
社製）溶液５０μｌを加えて室温で１時間反応させた。
反応後、ＰＢＳで３回洗浄し、アビジンＤ−ペルオキシ
ダーゼ（ベクター社製）溶液５０μｌを加えて室温で３
０分反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、基質溶液［４−
アミノアンチピリン（０．２５ｍｇ／ｍｌ）、フェノー
ル（０．２５ｍｇ／ｍｌ）、０．４２５Ｍ過酸化水素含
有］２００μｌを加え、室温で反応させた後、９６ウェ
ルマイクロプレートフォトメーターを用いて各ウェルの
５５０ｎｍにおける吸光度を測定し、合成ペプチドに特
異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを選別した。
【００２３】このようにして選別した各ハイブリドーマ
は限界希釈法によりクローニングし、上記合成ペプチド
に対する抗体を産生するハイブリドーマ８株（１Ｃ９、
２Ｄ６、２Ｈ１、５Ｃ６、６Ａ５、８Ｂ７、８Ａ８、１
０Ｅ１）を樹立した。樹立したハイブリドーマの培養上
清を、合成ペプチドをコートし、３％ゼラチンでブロッ
キング処理を施してある９６ウェルマイクロプレートに
添加後、ＭｏｎｏＡｂ−ＩＤ ＥＩＡキット（Ｚｙｍｅ
ｄ社製）を用いて各々のモノクローナル抗体のアイソタ
イプを調べた。その結果を表１に示す。
は限界希釈法によりクローニングし、上記合成ペプチド
に対する抗体を産生するハイブリドーマ８株（１Ｃ９、
２Ｄ６、２Ｈ１、５Ｃ６、６Ａ５、８Ｂ７、８Ａ８、１
０Ｅ１）を樹立した。樹立したハイブリドーマの培養上
清を、合成ペプチドをコートし、３％ゼラチンでブロッ
キング処理を施してある９６ウェルマイクロプレートに
添加後、ＭｏｎｏＡｂ−ＩＤ ＥＩＡキット（Ｚｙｍｅ
ｄ社製）を用いて各々のモノクローナル抗体のアイソタ
イプを調べた。その結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】次に、樹立した各ハイブリドーマを培養し
て細胞を増加させ、あらかじめプリスタンを腹腔内に投
与して１ヶ月位たったマウスの腹腔内へ１匹当り１〜５
×１０6 細胞を投与した。１０〜２０日後マウス１匹当
り約１０ｍｌの腹水を採取した。得られた腹水を３Ｍ
ＮａＣｌ含有１．５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．９）と
１：１で混合し、プロテインＡ−セファロースＣＬ−４
Ｂ（ファルマシア製）を充填したカラムに添加し、同緩
衝液で洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０〜
４．０）にて溶出後、ＰＢＳに透析することにより精製
抗体を得た。
て細胞を増加させ、あらかじめプリスタンを腹腔内に投
与して１ヶ月位たったマウスの腹腔内へ１匹当り１〜５
×１０6 細胞を投与した。１０〜２０日後マウス１匹当
り約１０ｍｌの腹水を採取した。得られた腹水を３Ｍ
ＮａＣｌ含有１．５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．９）と
１：１で混合し、プロテインＡ−セファロースＣＬ−４
Ｂ（ファルマシア製）を充填したカラムに添加し、同緩
衝液で洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０〜
４．０）にて溶出後、ＰＢＳに透析することにより精製
抗体を得た。
【００２６】（２）標識化抗体（［125Ｉ］化抗体）の
作製 ２Ｄ６のハイブリドーマから得られる抗体（２Ｄ６抗
体）をクロラミンＴ法により沃素化した。すなわち、２
Ｄ６抗体５０μｌ（８４μｇ）に［125 Ｉ］Ｎａ１８．
５Ｍｂｑ加えて混合し、クロラミンＴ１０μｌ（５ｍｇ
／ｍｌ）加え、３０秒間混合後、直ちにピロ亜硫酸ナト
リウム５０μｌ（３ｍｇ／ｍｌ）およびヨウ化カリ５０
μｌ（５ｍｇ／ｍｌ）を加えてさらに混合した。混合
後、セファデックスＧ−２５（１０×３００ｍｍ）カラ
ムに反応液をアプライして未反応［125Ｉ］Ｎａと［125
Ｉ］化抗体を分離し、［125Ｉ］化抗体の濃度が５０,０
００ｃｐｍ／１００μｌになるように０．３Ｍ ＫＣｌ
および１％ＢＳＡ含有０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）を用いて希釈し、これをアッセイ用リガンドと
して用いた。
作製 ２Ｄ６のハイブリドーマから得られる抗体（２Ｄ６抗
体）をクロラミンＴ法により沃素化した。すなわち、２
Ｄ６抗体５０μｌ（８４μｇ）に［125 Ｉ］Ｎａ１８．
５Ｍｂｑ加えて混合し、クロラミンＴ１０μｌ（５ｍｇ
／ｍｌ）加え、３０秒間混合後、直ちにピロ亜硫酸ナト
リウム５０μｌ（３ｍｇ／ｍｌ）およびヨウ化カリ５０
μｌ（５ｍｇ／ｍｌ）を加えてさらに混合した。混合
後、セファデックスＧ−２５（１０×３００ｍｍ）カラ
ムに反応液をアプライして未反応［125Ｉ］Ｎａと［125
Ｉ］化抗体を分離し、［125Ｉ］化抗体の濃度が５０,０
００ｃｐｍ／１００μｌになるように０．３Ｍ ＫＣｌ
および１％ＢＳＡ含有０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）を用いて希釈し、これをアッセイ用リガンドと
して用いた。
【００２７】（３）ハイドロキシアパタイトスラリ−の
調製 ハイドロキシアパタイト６ｇを０．３Ｍ ＫＣｌおよび
１％ＢＳＡ含有０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
１００ｍｌに懸濁し、４℃で一夜膨潤させた。翌日上清
を捨て、上記リン酸緩衝液を用いてハイドロキシアパタ
イトの濃度が３５％（Ｗ／Ｖ）になるように再懸濁し、
使用するまで４℃に保存した。
調製 ハイドロキシアパタイト６ｇを０．３Ｍ ＫＣｌおよび
１％ＢＳＡ含有０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
１００ｍｌに懸濁し、４℃で一夜膨潤させた。翌日上清
を捨て、上記リン酸緩衝液を用いてハイドロキシアパタ
イトの濃度が３５％（Ｗ／Ｖ）になるように再懸濁し、
使用するまで４℃に保存した。
【００２８】（４）検体の調製 ビタミンＫＩ、活性型ビタミンＤ（１，２５（ＯＨ）2
Ｄ3）及び／またはワ−ファリン存在下、ヒト海綿骨を
ＤＭＥＭ培地で培養し、培養上清を検体とした。すなわ
ち、海綿骨を切断後、コラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍｌ）お
よびＤＮＡｓｅ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を含むカルシウム
およびマグネシウムフリーＰＢＳで３７℃、２時間イン
キュベートし、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭで洗浄後、骨
片から外生する細胞を採取した（JOURNAL OF BONE AND
MINERAL RESEARCH,6:45,1991）。得られた細胞のプライ
マリーカルチャーを０．００３％プロナーゼ含有カルシ
ウムおよびマグネシウムフリーＰＢＳを用いて２回パッ
セージさせ、２ｘ１０4個の細胞を２４穴プレートの各
ウエルに蒔き、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭを用いて一週
間プレ培養し、さらに二酸化炭素インキュベーターを用
い、下記の条件下で３０℃、４８時間ＤＭＥＭ培地で培
養し、得られた培養上清を検体とした。
Ｄ3）及び／またはワ−ファリン存在下、ヒト海綿骨を
ＤＭＥＭ培地で培養し、培養上清を検体とした。すなわ
ち、海綿骨を切断後、コラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍｌ）お
よびＤＮＡｓｅ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を含むカルシウム
およびマグネシウムフリーＰＢＳで３７℃、２時間イン
キュベートし、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭで洗浄後、骨
片から外生する細胞を採取した（JOURNAL OF BONE AND
MINERAL RESEARCH,6:45,1991）。得られた細胞のプライ
マリーカルチャーを０．００３％プロナーゼ含有カルシ
ウムおよびマグネシウムフリーＰＢＳを用いて２回パッ
セージさせ、２ｘ１０4個の細胞を２４穴プレートの各
ウエルに蒔き、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭを用いて一週
間プレ培養し、さらに二酸化炭素インキュベーターを用
い、下記の条件下で３０℃、４８時間ＤＭＥＭ培地で培
養し、得られた培養上清を検体とした。
【００２９】 検体１〜４：ビタミンＫＩ １μｌ／ｍｌ 検体５〜８：ビタミンＫＩ １μｌ／ｍｌ １，２５（ＯＨ）2Ｄ3 １０ー8Ｍ 検体９〜１２：ワーファリン １μｌ／ｍｌ 検体１３〜１６：ワーファリン １μｌ／ｍｌ １，２５（ＯＨ）2Ｄ3 １０ー8Ｍ
【００３０】（５）オステオカルシンの測定 方法Ａ：抗ウシオステオカルシン抗体（ポリクロ−ナル
抗体）を利用したＲＩＡキット（オステオカルシン測定
キット「ヤマサ」：ヤマサ醤油社製）を用いてト−タル
のオステオカルシン量を測定した。 方法Ｂ（本発明方法）：５ｍＭＣａＣｌ2 溶液（ｐＨ
７．４，０．３Ｍ ＫＣｌおよび１％ＢＳＡ含有）と
０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４，０．３Ｍ ＫＣ
ｌおよび１％ＢＳＡ含有）の１：１混合液（１：１緩衝
液）５００μｌを３５％ハイドロキシアパタイトスラリ
−１００μｌに加えて混合後、３０００ｒｐｍで５分間
遠心し、上清を除去した。次に、標準液または検体１０
０μｌ、アッセイ用リガンド１００μｌおよび１：１緩
衝液２００μｌを加えて混合後、４℃で一夜インキュベ
−ションした。翌日、反応液を３０００ｒｐｍで５分間
遠心後、上清を除去し、１：１緩衝液２ｍｌで２回遠心
洗浄し、得れた沈澱の放射線量をカウントした。
抗体）を利用したＲＩＡキット（オステオカルシン測定
キット「ヤマサ」：ヤマサ醤油社製）を用いてト−タル
のオステオカルシン量を測定した。 方法Ｂ（本発明方法）：５ｍＭＣａＣｌ2 溶液（ｐＨ
７．４，０．３Ｍ ＫＣｌおよび１％ＢＳＡ含有）と
０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４，０．３Ｍ ＫＣ
ｌおよび１％ＢＳＡ含有）の１：１混合液（１：１緩衝
液）５００μｌを３５％ハイドロキシアパタイトスラリ
−１００μｌに加えて混合後、３０００ｒｐｍで５分間
遠心し、上清を除去した。次に、標準液または検体１０
０μｌ、アッセイ用リガンド１００μｌおよび１：１緩
衝液２００μｌを加えて混合後、４℃で一夜インキュベ
−ションした。翌日、反応液を３０００ｒｐｍで５分間
遠心後、上清を除去し、１：１緩衝液２ｍｌで２回遠心
洗浄し、得れた沈澱の放射線量をカウントした。
【００３１】（６）結果 既知濃度の標準液を用いて標準曲線を作成した時の結果
を図１及び表２に示す。
を図１及び表２に示す。
【００３２】
【表２】
【００３３】次に、検体試料を上記方法Ａ及びＢで測定
した結果を下記表３に示す。
した結果を下記表３に示す。
【００３４】
【表３】
【００３５】ビタミンＫＩ（ＶＫＩ）と１,２５（Ｏ
Ｈ）2Ｄ3（ＶＤ3）を添加してヒト海面骨細胞を培養す
ることにより培養上清中に活性なオステオカルシンが分
泌されることが知られており（J.Biol.Chem.260:13398,
1985）、方法ＡおよびＢのいずれの方法でも活性なオス
テオカルシンを測定することができた。一方、ワ−ファ
リンはビタミンＫＩ依存性の反応であるγ−カルボキシ
化反応を阻害するため、ワ−ファリンを添加して培養す
ると不活性な脱カルボキシル化オステオカルシンのみが
分泌されることが知られている（J.Biol.Chem.260:1339
8,1985）。このため、ワ−ファリンと１，２５（ＯＨ）
2Ｄ3を添加して培養して得られた培養上清のオステオカ
ルシンは、不活性な脱カルボキシル化オステオカルシン
オステオカルシンであり、方法Ａではそれを測定できた
ものの、方法Ｂ（本発明方法）では測定することができ
なかった。したがって、本発明方法は活性なオステオカ
ルシンのみを特異的に測定できることを確認した。
Ｈ）2Ｄ3（ＶＤ3）を添加してヒト海面骨細胞を培養す
ることにより培養上清中に活性なオステオカルシンが分
泌されることが知られており（J.Biol.Chem.260:13398,
1985）、方法ＡおよびＢのいずれの方法でも活性なオス
テオカルシンを測定することができた。一方、ワ−ファ
リンはビタミンＫＩ依存性の反応であるγ−カルボキシ
化反応を阻害するため、ワ−ファリンを添加して培養す
ると不活性な脱カルボキシル化オステオカルシンのみが
分泌されることが知られている（J.Biol.Chem.260:1339
8,1985）。このため、ワ−ファリンと１，２５（ＯＨ）
2Ｄ3を添加して培養して得られた培養上清のオステオカ
ルシンは、不活性な脱カルボキシル化オステオカルシン
オステオカルシンであり、方法Ａではそれを測定できた
ものの、方法Ｂ（本発明方法）では測定することができ
なかった。したがって、本発明方法は活性なオステオカ
ルシンのみを特異的に測定できることを確認した。
【００３６】実施例２：ハイドロキシアパタイトとコラ
−ゲンによる活性なオステオカルシンの測定 タイプＩコラ−ゲン（和光純薬製）をクロラミンＴ法に
より沃素化し、［125Ｉ］化コラ−ゲンを得た。以下、
実施例１と同様の試薬を用い、下記の手順により血清試
料中の活性なオステオカルシンを測定することができ
る。
−ゲンによる活性なオステオカルシンの測定 タイプＩコラ−ゲン（和光純薬製）をクロラミンＴ法に
より沃素化し、［125Ｉ］化コラ−ゲンを得た。以下、
実施例１と同様の試薬を用い、下記の手順により血清試
料中の活性なオステオカルシンを測定することができ
る。
【００３７】実施例３：ハイドロキシアパタイト、コラ
−ゲンおよびモノクロ−ナル抗コラーゲン抗体による活
性なオステオカルシンの測定 モノクロ−ナル抗コラーゲン抗体クロラミンＴ法により
沃素化し、［125 Ｉ］化モノクロ−ナル抗コラーゲン抗
体を得た。以下、実施例１と同様の試薬を用い、下記の
手順により血清試料中の活性なオステオカルシンを測定
することができる。
−ゲンおよびモノクロ−ナル抗コラーゲン抗体による活
性なオステオカルシンの測定 モノクロ−ナル抗コラーゲン抗体クロラミンＴ法により
沃素化し、［125 Ｉ］化モノクロ−ナル抗コラーゲン抗
体を得た。以下、実施例１と同様の試薬を用い、下記の
手順により血清試料中の活性なオステオカルシンを測定
することができる。
【００３８】実施例４：ハイドロキシアパタイトおよび
モノクロ−ナル抗オステオカルシン抗体による活性なオ
ステオカルシンの測定 オステオカルシンのＮ端部分を認識するモノクローナル
抗オステオカルシン抗体、オステオカルシンのＣ端部分
を認識するモノクローナル抗オステオカルシン抗体、ハ
イドロキシアパタイトおよび［125 Ｉ］化抗マウスＩｇ
Ｇウサギ抗体を用い、下記の手順により血清試料中の活
性なオステオカルシンを測定することができる。この方
法は、１分子のオステオカルシンに２分子の［125 Ｉ］
化抗マウスＩｇＧウサギ抗体が反応するので、より高感
度にオステオカルシンを測定することが可能である。
モノクロ−ナル抗オステオカルシン抗体による活性なオ
ステオカルシンの測定 オステオカルシンのＮ端部分を認識するモノクローナル
抗オステオカルシン抗体、オステオカルシンのＣ端部分
を認識するモノクローナル抗オステオカルシン抗体、ハ
イドロキシアパタイトおよび［125 Ｉ］化抗マウスＩｇ
Ｇウサギ抗体を用い、下記の手順により血清試料中の活
性なオステオカルシンを測定することができる。この方
法は、１分子のオステオカルシンに２分子の［125 Ｉ］
化抗マウスＩｇＧウサギ抗体が反応するので、より高感
度にオステオカルシンを測定することが可能である。
【００３９】
【００４０】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明方法で作成した標準曲線であ
る。
る。
Claims (7)
- 【請求項１】 ハイドロキシアパタイト、およびオステ
オカルシンまたはそのフラグメントに結合性を有する物
質を測定試薬として使用する、活性なオステオカルシン
の測定法。 - 【請求項２】 ハイドロキシアパタイト、オステオカル
シンおよび標識されたオステオカルシンまたはそのフラ
グメントに結合性を有する物質の三元複合体を形成さ
せ、該三元複合体中の標識量またはそれ以外の標識量を
測定することからなる、請求項１記載の測定法。 - 【請求項３】 オステオカルシンまたはそのフラグメン
トに結合性を有する物質が抗オステオカルシン抗体であ
る、請求項１記載の測定法。 - 【請求項４】 オステオカルシンまたはそのフラグメン
トに結合性を有する物質がコラーゲンである、請求項１
記載の測定法。 - 【請求項５】 ハイドロキシアパタイト、およびオステ
オカルシンまたはそのフラグメントに結合性を有する物
質を構成試薬として包含する、活性なオステオカルシン
を測定するためのキット。 - 【請求項６】 オステオカルシンまたはそのフラグメン
トに結合性を有する物質が抗オステオカルシン抗体であ
る、請求項５記載のキット。 - 【請求項７】 オステオカルシンまたはそのフラグメン
トに結合性を有する物質がコラーゲンである、請求項５
記載のキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21498293A JPH0755804A (ja) | 1993-08-06 | 1993-08-06 | 活性なオステオカルシンの測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21498293A JPH0755804A (ja) | 1993-08-06 | 1993-08-06 | 活性なオステオカルシンの測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0755804A true JPH0755804A (ja) | 1995-03-03 |
Family
ID=16664758
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21498293A Pending JPH0755804A (ja) | 1993-08-06 | 1993-08-06 | 活性なオステオカルシンの測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0755804A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112162099A (zh) * | 2020-09-28 | 2021-01-01 | 安徽大千生物工程有限公司 | 基于胶乳增强免疫比浊法测定n-mid的试剂盒及其制备方法 |
| CN113125752A (zh) * | 2021-04-15 | 2021-07-16 | 江苏优尼泰克生物科技有限公司 | 用于n-mid骨钙素检测的组合物及应用和磁微球电化学发光免疫检测试剂盒与检测方法 |
-
1993
- 1993-08-06 JP JP21498293A patent/JPH0755804A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112162099A (zh) * | 2020-09-28 | 2021-01-01 | 安徽大千生物工程有限公司 | 基于胶乳增强免疫比浊法测定n-mid的试剂盒及其制备方法 |
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