JPH07140142A - γ−カルボキシグルタミン酸残基を含有するタンパク質の測定法およびキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 γ−カルボキシグルタミン酸残基（Ｇｌａ残
基）を含有するタンパク質の簡便な測定法及びこの方法
に使用するキットを提供することを目的とする。 【構成】 下記の工程からなるγ−カルボキシグルタミ
ン酸残基を含有するタンパク質の測定法及び該方法に使
用するキットに関するものである。 （１）γ−カルボキシグルタミン酸残基を含有するタン
パク質を含むもしくはそのことが疑われるサンプルに、
γ−カルボキシグルタミン酸残基を含有するタンパク質
に対する標識化抗体、カルシウム、およびリン酸とを添
加、反応させる工程 （２）反応液を可溶相と不溶相とに分離する工程 （３）不溶相中の標識量を測定する工程

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、γ−カルボキシグルタ
ミン酸残基（Ｇｌａ残基）を含有するタンパク質の測定
法及びこの方法に使用するキットに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、プロスロンビン（prothrombi
n）、オステオカルシン（osteocalcin）、マトリクス・
グラ・プロテイン（matrix Gla protein）などのような
Ｇｌａ残基を含有するタンパク質が生体内に存在するこ
とはよく知られていることである。

【０００３】たとえば、オステオカルシン〔別名；bone
Gla protein（ＢＧＰ）〕は骨芽細胞が産生する非コラ
ーゲン性タンパク質であり、１９７５年には Hauschka
らによりニワトリから、１９７８年にはPrice らにより
ウシからそれぞれ精製されている。ＢＧＰの分子中には
３つのＧｌａ残基（Ｎ末端から数えて１７位、２１位お
よび２４位に存在する）と１つのＳ−Ｓ結合が存在し
（Haemostasis, 16:258,(1986)）、この３つのＧｌａ残
基がカルシウムイオンとの結合に重要な役割を演じてい
るものと考えられている（Biochemistry, 21:2538,(198
2)）。すなわち、全てのＧｌａ残基が脱カルボキシル化
されるとカルシウムイオンへの結合力はほぼ完全に消失
するとされている（J Biol.Chem. 254:431(1979)）。

【０００４】検体中のオステオカルシンを測定する方法
としては、抗ウシオステオカルシン抗体を利用したＲＩ
Ａ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:2234(1980)）、ヒトオ
ステオカルシンのＣ末端部（３７〜４９）に対する抗体
を用いる方法（Bone,6:9(1985)、 Calcif.Tissue Int.,
39:310(1986)）、ウシとヒトのオステオカルシンの共通
アミノ酸配列を利用し、２種類の抗ウシオステオカルシ
ンモノクロ−ナル抗体を用いたサンドイッチ法（J.Immu
nol.Meth.94:19(1986)、特開昭６２−３１８５６４号、
特開昭６３ー２０９５９６号、特開平１ー１６０４９３
号）などが報告されている。

【０００５】検体中のオステオカルシンの存在形態は一
様ではなく、活性なオステオカルシン、１〜３個のＧｌ
ａ残基が脱カルボキシル化されたオステオカルシン、プ
ロテアーゼなどにより分解された種々のオステオカルシ
ンフラグメントなど、様々な形態で存在することが明ら
かになっている（J.Clin.Invest.77:1762(1986)）。し
かしながら上述の従来法は、使用する抗体の特異性など
から判断して、活性なオステオカルシン、脱カルボキシ
ル化オステオカルシン、分解されたオステオカルシンフ
ラグメントなどの各々を区別して測定することができな
いという欠点を有し、必ずしも満足できる方法ではなか
った。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】このような従来法の欠
点を克服するため、ヒトオステオカルシンのＮ端部（１
〜２０）およびＣ端部（３６〜４９）のアミノ酸配列に
対する二種類のモノクロ−ナル抗体を用いて分解されて
いないインタクトオステオカルシンのみを特異的に測定
する方法（ＷＯ９０／０９５８７）、Ｇｌａ残基を含む
オステオカルシンに特異的なモノクローナル抗体を使用
してＧｌａ残基を含むオステオカルシンのみを特異的に
測定する方法（特開平２ー２４２６９６号公報）などの
改良法も報告されている。

【０００７】しかしながら、このような改良法であって
も依然としてＧｌａ残基を含むオステオカルシンと脱カ
ルボキシル化されたオステオカルシンとを区別して測定
できなかったり、Ｇｌａ残基を含むオステオカルシンに
特異的なモノクローナル抗体の調製が極めて困難である
などの種々の問題を有し、誰でも簡単に実施できるよう
な満足しうる方法には必ずしもなり得なかった。従っ
て、本発明の目的は、極めて簡便な方法にてオステオカ
ルシンに代表されるＧｌａ残基を含有するタンパク質を
特異的に測定する方法を提供するものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】ＢＧＰはカルシウムイオ
ン（Ｃａイオン）と結合することが知られており、ＢＧ
ＰとＣａイオンとの結合にはＧｌａ残基が必要であるこ
とがPrice らによって報告されている（J.Biol.Chem.25
4,431-436,1979）。本発明者は、上記知見を基に、Ｇｌ
ａ残基を含有するタンパク質の特異的な測定法について
種々検討した結果、Ｇｌａ残基を有するＢＧＰ、Ｃａイ
オン及びリン酸イオンとを混合するとＢＧＰはＣａイオ
ンと結合したままリン酸カルシウムの沈澱に取り込ま
れ、一方、Ｇｌａ残基を有しないＢＧＰはリン酸カルシ
ウムの沈澱に取り込まれることはないことを見いだし
た。さらに、標識した抗ＢＧＰ抗体を反応させることに
よりリン酸カルシウムの沈澱の標識量を測定することが
でき、もってＧｌａ残基を有するＢＧＰのみを特異的に
測定することが可能であることを見いだし、本発明を完
成させた。

【０００９】従って、本発明は、下記の工程からなるＧ
ｌａ残基を含有するタンパク質の測定法に関するもので
ある。 （１）Ｇｌａ残基を含有するタンパク質を含むもしくは
そのことが疑われるサンプルに、Ｇｌａ酸残基を含有す
るタンパク質に対する標識化抗体、カルシウム、および
リン酸とを添加、反応させる工程 （２）反応液を可溶相と不溶相とに分離する工程 （３）不溶相中の標識量を測定する工程 また、本発明は、下記の試薬から構成される、Ｇｌａ残
基を含有するタンパク質の測定するために使用するキッ
トに関するものである。 （１）Ｇｌａ残基を含有するタンパク質に対する標識化
抗体 （２）カルシウム （３）リン酸

【００１０】以下、本発明について詳述する。本発明に
おいて測定目的とするタンパク質はＧｌａ残基を含有す
るものであり、その種類は特に限定されない。具体的に
は、プロスロンビン、オステオカルシン、マトリクス・
グラ・プロテインなどを例示することができる。なお、
以下の説明においては、しばしばオステオカルシンを例
に挙げ説明するが、オステオカルシンと他のＧｌａ残基
を含有するタンパク質とが容易置換物であることからし
て本発明がオステオカルシンに限定されるものではない
ことは本発明の骨子からして明らかである。

【００１１】本発明の測定法に供するサンプルは、Ｇｌ
ａ残基を含有するタンパク質を含有するものであれば特
に限定されず、たとえば、血液、血清、随液、尿、体液
などが例示される。サンプルは、必要により希釈または
濃縮して測定に使用する。本発明の測定法に使用する抗
体は、Ｇｌａ残基を含有するタンパク質もしくはＧｌａ
残基がＧｌｕ残基に置換されたタンパク質中の一部のア
ミノ酸配列に特異的に結合するものであれば特に限定さ
れない。たとえば、オステオカルシンの末端部（Ｃ末、
Ｎ末）、中央部などの任意の箇所に特異的なものであれ
ばよい。このような抗体は、たとえば、Proc. Natl. Ac
ad. Sci.,77,2234-2238(1980)、Proc. Natl. Acad. Sc
i.,81,2868-2872(1984)、Bone,6,9-13(1985)、Ann.Bio
l.Clin.,43,755-766(1985)、特開昭６３ー２０９５９６
号、特開平１ー１６０４９３号、ＷＯ９０／０９５８
７、特開平３ー７５５６４号などの文献に記載の方法に
より調製することができる。

【００１２】抗体の標識化は常法によって行うこうとが
できる。すなわち、使用する抗体は抗体そのものであっ
てもよいが、非特異的な吸着を防止する意味から抗体の
活性フラグメントを使用するのが好ましい。抗体の活性
フラグメントは、抗体の特徴を保持するもの〔たとえ
ば、Ｆ（ａｂ’）₂、 Ｆａｂ’、Ｆａｂなどの各種フラ
グメント〕であればいずれのものであってもよい。これ
ら活性フラグメントの調製は、精製抗体をパパイン、ペ
プシン、トリプシンなどのプロテアーゼを用いて限定分
解する方法など公知の方法を適用して行うことができる
（たとえば「免疫生化学研究法（続生化学実験講座
５）」、日本生化学会編、８９頁（１９８６年）参
照）。

【００１３】抗体に結合させる標識剤としては、放射性
同位体（たとえば³²Ｐ、³Ｈ、 ¹⁴Ｃ、¹²⁵Ｉなど ）、酵
素（たとえばβ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、モノ
アミンオキシダーゼなど）、補酵素・補欠分子族（たと
えば、ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘムな
ど）、フルオレセイン誘導体（たとえば、フルオレセイ
ンイソチオシアネート、フルオレセインチオフルバミル
など）、ローダミン誘導体（たとえば、テトラメチルロ
ーダミンＢイソチオシアネートなど）、ウムベリフェロ
ンおよび１−アニリノ−８−ナフタレンスルホン酸など
の蛍光色素、ルミノ−ル誘導体（たとえば、ルミノー
ル、イソルミノール、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ
−エチルイソルミノールなど）などを用いることができ
る。抗体またはその活性フラグメントと標識剤との結合
は、成書〔たとえば、「続生化学実験講座５免疫生化学
研究法」（株）東京化学同人、（１９８６年発行）第１
０２〜１１２頁〕に記載されているような公知の方法か
ら適宜選択して実施すればよい。

【００１４】本発明で使用するカルシウムとしては、水
性の反応液中でカルシウムイオン（Ｃａイオン）を放出
することのできる水溶性のカルシウム化合物であれば特
に限定されない。具体的には、ハロゲン化物、硝酸塩、
酢酸塩などを例示することができる。カルシウムの反応
系での濃度は、０．１〜１０００ｍＭ、好ましくは１〜
５００ｍＭ、さらに好ましくは１〜３００ｍＭである。
また、リン酸としては、水性の反応液中でリン酸イオン
（Ｐイオン）を放出することのできるものであれば特に
限定されない。具体的には、オルトリン酸及び水溶性の
リン酸塩を例示することができる。リン酸の反応系での
濃度は、０．１〜１０００ｍＭ、好ましくは１〜５００
ｍＭ，さらに好ましくは１〜３００ｍＭである。カルシ
ウム及びリン酸の各濃度の最適の組み合わせは、小規模
試験により決定することができ、例えば、オステオカル
シンを反応系に添加（例えば、１００ｎｇ／ｍｌ程度）
した時のＢ／Ｔとそれを添加しない時のＢ／Ｔの差が１
０％以上、好ましくは１５％以上になるようにカルシウ
ムとリン酸の使用量を適宜決定すれば良い。なお、本発
明においては、リン酸を反応時の緩衝液（例えば、リン
酸緩衝液など）として併用してもかまわない。

【００１５】本発明の測定法における第１工程は、Ｇｌ
ａ残基を含有するタンパク質を含むもしくはそのことが
疑われるサンプルに、Ｇｌａ酸残基を含有するタンパク
質に対する標識化抗体、カルシウム、およびリン酸とを
添加、反応させる工程である。反応は、上記各試薬を適
当な緩衝液中でｐＨ５〜１０、好ましくは６〜９、温度
０〜５０℃、好ましくは０〜１０℃の条件下で１〜５０
時間程度反応させることにより実施することができる。
また、反応中の非特異的吸着を抑制する目的で、ウシ血
清アルブミン、ウシ血清グロブリン、ヒト血清アルブミ
ン、ウサギ血清アルブミン等の動物血液由来のタンパク
質、ゼラチンなどの免疫測定においてブロッキング剤と
して常用されているものを０．１〜１０％（Ｗ／Ｖ）程
度反応液中に添加してもかまわない。さらに、Ｇｌａ残
基を含有するタンパク質のリン酸カルシウムの沈澱への
取り込みを加速、安定化させるために塩化ナトリウム、
塩化カリウム等の各種塩化物を０．０１〜１Ｍ程度反応
液中に添加してもよい。

【００１６】本発明の第２工程は、反応液を可溶相と不
溶相とに分離する工程である。分離方法としては、遠心
分離、膜処理、デカンテーションなどの通常の固液分離
手段を採用することができる。分離条件も溶液相と不溶
相とを分離できる条件であればよく、たとえば分離方法
として遠心分離を採用した場合、１０００〜５０００ｒ
ｐｍで１〜３０分間程度遠心させる条件内から適宜選択
することができる。なお、第２工程は、第１工程と同じ
温度条件下で行うのが好ましい。

【００１７】本発明の第３工程は、不溶相中の標識量を
測定する工程である。標識量の測定は、採用した標識物
質に応じて公知の方法を採用すればよい。たとえば、標
識物質として放射性同位体を使用した場合、ガンマーカ
ンター、液体シンチレーションカウンターなどを用いて
不溶相中の標識量を測定すればよい。また、第３工程を
行う前に第２工程で得られた不溶相を適当な洗浄液で洗
浄後、第２工程を再度繰り返し行うことにより、より再
現性の高いデータを得ることができる。なお、この際に
使用する洗浄液としては、前記濃度範囲のカルシウムと
リン酸を含有するものを使用するのが好ましい。

【００１８】上記測定法に使用するキットとしては、本
発明の測定法を実施しうるものであれば特定されるもの
ではないが、たとえば下記の試薬から構成されるものが
例示される。 （１）Ｇｌａ残基を含有するタンパク質に対する標識化
抗体 （２）カルシウム （３）リン酸 上記キットにおいて、標識剤、抗体、カルシウム、リン
酸は前記説明した通りであり、これをキットに添付でき
るような形態に常法により適宜変更すればよい。

【００１９】

【発明の効果】本発明方法は、従来法に比較してより簡
便な方法によりＧｌａ残基を含有するタンパク質を特異
的に測定することができる。

【００２０】

【実施例】以下、オステオカルシンを例に挙げ、本発明
を具体的に説明する。 実施例１ １）ＢＧＰの精製 Price らの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 14
47, 1976）によりウシの組織からＢＧＰを抽出、精製し
た。また、ＢＧＰのＧｌａ残基の decarboxylation は
Priceらの方法（J. Biol. Chem. 254, 431-436, 1979）
により行った。 ２）モノクローナル抗オステオカルシン抗体の作製 ヒト・オステオカルシンのＣ端末部から１５アミノ酸残
基に相当する合成ペプチド（ ＮＨ₂−ＹＬＹＱＷＬＧＡ
ＰＶＰＹＰＤＰ−ＣＯＯＨ）とウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）を用い、通常のマレイミド法〔日本免疫実験操作
法ＸＩ（日本免疫学会、昭和５７年発行）第３５２９〜
３５３４頁）〕にて該合成ペプチドとＢＳＡの複合体を
調製した。

【００２１】この複合体１０〜１００μｇをフロイント
完全アジュバントとともにＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、６
週齢）の腹腔内に投与後、２〜４週間間隔で同様に追加
免疫を行った。適当な時期に採血して抗体価を測定し、
抗体価が充分に上昇していることを確認した後、５〜５
０μｇの上記複合体を静脈内投与した。静脈内投与３日
後にマウスの脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗
浄した。 一方、マウスミエローマＰ３Ｘ６３Ａｇ８
Ｕ．１（Ｐ₃Ｕ₁）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９７）をＲ
ＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、上記脾細胞とＰ₃Ｕ₁を１
０：１で混合した後、遠心分離して得たペレットに５０
％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１０００含有ＲＰ
ＭＩ１６４０培地１ｍｌを徐々に加えて細胞融合を行っ
た。さらに、ＲＰＭＩ１６４０培地を加えて１０ｍｌと
し、遠心分離して得たペレットを１０％ウシ胎児血清
（ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地にＰ₃Ｕ₁として３
×１０⁴ 個／０．１ｍｌとなるように懸濁させ、この懸
濁液を９６ウェルマイクロプレート（塩化ポリビニール
製）に各ウェル０．１ｍｌずつ分注した。

【００２２】１日後、ＨＡＴ培地を０．１ｍｌ添加し、
その後３〜４日ごとに培地の半分量を新しいＨＡＴ培地
で交換した。融合から７〜１４日目に培養上清を採取
し、上記合成ペプチドに対するモノクローナル抗体を酵
素免疫測定法によりスクリーニングした。すなわち、合
成ペプチドをコートし、３％ゼラチンでブロッキング処
理を施した９６ウェルマイクロプレートに培養上清５０
μｌ添加後、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（ベクター
社製）溶液５０μｌを加えて室温で１時間反応させた。
反応後、ＰＢＳで３回洗浄し、アビジンＤ−ペルオキシ
ダーゼ（ベクター社製）溶液５０μｌを加えて室温で３
０分反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、基質溶液［４−
アミノアンチピリン（０．２５ｍｇ／ｍｌ）、フェノー
ル（０．２５ｍｇ／ｍｌ）、０．４２５Ｍ過酸化水素含
有］２００μｌを加え、室温で反応させた後、９６ウェ
ルマイクロプレートフォトメーターを用いて各ウェルの
５５０ｎｍにおける吸光度を測定し、合成ペプチドに特
異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを選別した。

【００２３】このようにして選別した各ハイブリドーマ
は限界希釈法によりクローニングし、上記合成ペプチド
に対する抗体を産生するハイブリドーマ８株（１Ｃ９、
２Ｄ６、２Ｈ１、５Ｃ６、６Ａ５、８Ｂ７、８Ａ８、１
０Ｅ１）を樹立した。樹立したハイブリドーマの培養上
清を、合成ペプチドをコートし、３％ゼラチンでブロッ
キング処理を施してある９６ウェルマイクロプレートに
添加後、ＭｏｎｏＡｂ−ＩＤ ＥＩＡキット（Ｚｙｍｅ
ｄ社製）を用いて各々のモノクローナル抗体のアイソタ
イプを調べた。その結果を表１に示す。

【００２４】

【表１】

【００２５】次に、樹立した各ハイブリドーマを培養し
て細胞を増加させ、あらかじめプリスタンを腹腔内に投
与して１ヶ月位たったマウスの腹腔内へ１匹当り１〜５
×１０⁶ 細胞を投与した。１０〜２０日後マウス１匹
当り約１０ｍｌの腹水を採取した。得られた腹水を３Ｍ
ＮａＣｌ含有１．５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．９）
と１：１で混合し、プロテインＡ−セファロースＣＬ−
４Ｂ（ファルマシア製）を充填したカラムに添加し、同
緩衝液で洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０
〜４．０）にて溶出後、ＰＢＳに透析することにより精
製抗体を得た。

【００２６】３）標識化抗体（［¹²⁵Ｉ］化抗体）の作
製 ２Ｄ６のハイブリドーマから得られる抗体（２Ｄ６抗
体）をクロラミンＴ法により沃素化した。すなわち、２
Ｄ６抗体４０μｌ（５０μｇ）に［¹²⁵ Ｉ］Ｎａ１４．
８Ｍｂｑ加えて混合し、クロラミンＴ２０μｌ（３ｍｇ
／ｍｌ）加え、１５秒間混合後、直ちにピロ亜硫酸ナト
リウム４０μｌ（５ｍｇ／ｍｌ）およびヨウ化カリウム
２０μｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えてさらに混合した。
混合後、セファデックスＧ−２５（１０×５０ｍｍ）カ
ラムに反応液をアプライして未反応［ ¹²⁵Ｉ］Ｎａと
［¹²⁵Ｉ］化抗体を分離し、［¹²⁵Ｉ］化抗体の濃度が７
０,０００ｃｐｍ／１００μｌになるように０．３Ｍ
ＫＣｌ、０．０５％アジ化ナトリウムおよび１％ＢＳＡ
含有０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて希
釈し、これをアッセイ用標識抗体として用いた。

【００２７】４）試薬及び測定手順 試薬； ＢＧＰまたは脱カルボキシル化ＢＧＰ溶液〔１％ＢＳ
Ａ、０．３Ｍ ＫＣｌ及び０．０５％アジ化ナトリウム
含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて０−
１００ｎｇ／ｍｌの濃度に調製したもの〕 ……各０．
１ｍｌ¹²⁵ Ｉ標識化抗ＢＧＰモノクローナル抗体（２Ｄ６）
溶液 …… ０．１ｍｌ カルシウム溶液〔２０ｍＭ ＣａＣｌ₂， ０．３Ｍ
ＫＣｌ及び０．０５％アジ化ナトリウム含有（ｐＨ７．
４）〕 …… ０．１ｍｌ リン酸溶液〔５％ＢＳＡ，０．３Ｍ ＫＣｌ及び０．
０５％アジ化ナトリウム含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）〕 …… ０．１ｍｌ

【００２８】測定手順； (1)〜の溶液を混合し、４℃で一晩反応させる。 (2)４℃で３０００ｒｐｍ、５分間遠心する。 (3)上清を除去後、洗浄液〔２．５ｍＭ ＣａＣｌ₂，
０．３Ｍ ＫＣｌ及び０．０５％アジ化ナトリウム含有
２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕を加える。 (4)４℃で３０００ｒｐｍ、５分間遠心する。 (5)上清を除去後、放射活性を測定する。 ５）測定結果 図１に示すように、本発明方法ではＧｌａ残基を有する
ＢＧＰのみ特異的に測定できることが確認された。

【００２９】実施例２ 実施例１で使用した試薬を応用して下記の試薬を構成成
分とするキットを調製した。このキットは実施例１と同
じ測定手順にてサンプル中のＢＧＰを測定することがで
きる。なお、下記キットにおいては本発明キットの必須
成分であるリン酸は緩衝液の形で使用されている。 試薬Ａ（標準抗原）；１％ＢＳＡ、０．３Ｍ ＫＣｌ、
及び０．０５％アジ化ナトリウム含有５０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．４）を用いてＢＧＰを０−１００ｎｇ／
ｍｌの濃度に調製したもの 試薬Ｂ（標識化抗体）；¹²⁵Ｉ標識化抗ＢＧＰモノクロ
ーナル抗体（２Ｄ６）溶液 試薬Ｃ（カルシウム）；２０ｍＭ ＣａＣｌ₂， ０．３
Ｍ ＫＣｌ及び０．０５％アジ化ナトリウム含有５０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４） 試薬Ｄ（リン酸溶液）；５％ＢＳＡ，０．３Ｍ ＫＣｌ
及び０．０５％アジ化ナトリウム含有５０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．４） 試薬Ｅ（洗浄液）；２．５ｍＭ ＣａＣｌ₂， ０．３Ｍ
ＫＣｌ及び０．０５％アジ化ナトリウム含有２５ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）

【００３０】実施例３ 実施例１に記載した測定系において、反応系でのリン酸
の最終濃度を３７．５〜２６２．５ｍＭまで、カルシウ
ムの最終濃度を５〜１２５ｍＭまでそれぞれ変化させ、
２種類の濃度のＢＧＰ溶液（０ｎｇ／ｍｌ及び１００ｍ
ｇ／ｍｌ）を用いてそれぞれのＢ／Ｔを測定した。その
結果、図２に示されているように、リン酸及びカルシウ
ムの各濃度が増加するに従い、バックグラウンド（０ｎ
ｇ／ｍｌのＢＧＰ溶液を用いたときのＢ／Ｔ）が高くな
る傾向を示した。また、ＢＧＰを感度よく測定するため
には、２種類の濃度のＢＧＰ溶液（０ｎｇ／ｍｌ及び１
００ｍｇ／ｍｌ）を用いて測定した時のそれぞれのＢ／
Ｔの差が大きいことが重要であり、その点からカルシウ
ムは１〜５０ｍＭ、リン酸は１〜２６０ｍＭで用いるの
が好都合であることが確認された。

【００３１】実施例４ ２％ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地を用いてヒトＰＧ３１４５細
胞（４ｘ１０⁴ 個／ウエル）を培養し、６日後に下記の
薬物を添加し、さらに４日間培養して得られた培養上清
をサンプルとした。 （サンプルごとの添加薬物） Ｇｌａ型ＢＧＰコントロール：無添加 Ｇｌａ型ＢＧＰサンプル：１，２５（ＯＨ）₂ビタミン
Ｄ₃ １０ｎＭ Ｇｌｕ型ＢＧＰコントロール：ワーファリン １μｇ／
ｍｌ Ｇｌｕ型ＢＧＰサンプル：１，２５（ＯＨ）₂ビタミン
Ｄ₃ １０ｎＭ 及びワーファリン １μｇ／ｍｌ

【００３２】それぞれのサンプルを実施例１の方法とＢ
ＧＰキット「ヤマサ」を用いて測定する２種類の方法で
定量した。実施例１の方法で測定した値をＧｌａ型ＢＧ
Ｐ量とし、ＢＧＰキット「ヤマサ」を用いて測定した値
をトータルＢＧＰ量とした。その結果を表２に示す。表
２から明らかなように、本発明方法がＧｌａ型ＢＧＰを
特異的に測定できることが確認された。

【００３３】

【表２】

【００３４】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明方法によるＢＧＰおよび脱カル
ボキシ化ＢＧＰの測定結果を示したものである。

【図２】図２は、本発明方法におけるリン酸とカルシウ
ムの各濃度の測定上の影響を検討した結果を示したもの
である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の工程からなるγ−カルボキシグル
   タミン酸残基を含有するタンパク質の測定法。 （１）γ−カルボキシグルタミン酸残基を含有するタン
   パク質を含むもしくはそのことが疑われるサンプルに、
   γ−カルボキシグルタミン酸残基を含有するタンパク質
   に対する標識化抗体、カルシウム、およびリン酸とを添
   加、反応させる工程 （２）反応液を可溶相と不溶相とに分離する工程 （３）不溶相中の標識量を測定する工程
2. 【請求項２】 γ−カルボキシグルタミン酸残基を含有
   するタンパク質がオステオカルシンである、請求項１記
   載の測定法。
3. 【請求項３】 リン酸が緩衝液の形態である、請求項１
   記載の測定法。
4. 【請求項４】 下記の試薬から構成される、γ−カルボ
   キシグルタミン酸残基を含有するタンパク質の測定する
   ために使用するキット。 （１）γ−カルボキシグルタミン酸残基を含有するタン
   パク質に対する標識化抗体 （２）カルシウム （３）リン酸
5. 【請求項５】 γ−カルボキシグルタミン酸残基を含有
   するタンパク質がオステオカルシンである、請求項４記
   載のキット。
6. 【請求項６】 リン酸が緩衝液の形態である、請求項４
   記載のキット。