JPH09271392A - 抗ヒト心筋トロポニンｔモノクローナル抗体 - Google Patents
抗ヒト心筋トロポニンｔモノクローナル抗体Info
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- JPH09271392A JPH09271392A JP8086932A JP8693296A JPH09271392A JP H09271392 A JPH09271392 A JP H09271392A JP 8086932 A JP8086932 A JP 8086932A JP 8693296 A JP8693296 A JP 8693296A JP H09271392 A JPH09271392 A JP H09271392A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ヒト心筋トロポニンＴに特異的に反応するモノ
クローナル抗体を提供すること。 【解決手段】モノクロ−ナル抗体の認識するヒト心筋ト
ロポニンＴのエピト−プがＰｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖ
ａｌ−Ｐｒｏのアミノ酸配列を含む抗ヒト心筋トロポニ
ンＴモノクロ−ナル抗体。
クローナル抗体を提供すること。 【解決手段】モノクロ−ナル抗体の認識するヒト心筋ト
ロポニンＴのエピト−プがＰｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖ
ａｌ−Ｐｒｏのアミノ酸配列を含む抗ヒト心筋トロポニ
ンＴモノクロ−ナル抗体。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規な抗ヒト心筋トロポ
ニンＴモノクロ−ナル抗体であり、これを用いヒト血清
もしくは血漿検体中のヒト心筋トロポニンＴ濃度を精度
良く測定するための心筋傷害疾患の診断に有用な免疫学
的測定法の利用に関する。
ニンＴモノクロ−ナル抗体であり、これを用いヒト血清
もしくは血漿検体中のヒト心筋トロポニンＴ濃度を精度
良く測定するための心筋傷害疾患の診断に有用な免疫学
的測定法の利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】抗体を用いた診断や治療に関する研究
は、ミルステインらによるモノクロ−ナル抗体の作製法
（Kohler,G.amd Milstein,C.;Nature.256,496,1975)の
開発により進歩した。江橋らによりトロポニンの分離精
製法（Ebashi,S.,Kodama,A.;J.Biochem.58,107,1965,Eb
ashi,S.,Kodama,A.;J.Biochem.64,465,1968.）が確立さ
れ、心筋梗塞とトロポニンＩとの関係において、ヒト心
筋トロポニンＩの免疫学的測定法が検討された(Cummin
s,B.,Cummins,P.;J.Mol.Cell.Cardiol.19,999,198
7.）。しかし、心筋梗塞の診断においてトロポニンＩの
血中存続時間が短く診断的価値が低い問題点があった。
その後、トロポニンＴによる診断法が開発（Katus,H.
A.,et al.;J.Mol.Cell.Cardiol.21,1349,1989.）された
が、固相抗体としてヒト心筋トロポニンＴを特異的に認
識するモノクロ−ナル抗体を用い、検知可能な信号を発
することのできる標識物を結合させた標識抗体はヒト骨
格筋トロポニンＴとの交差反応性があるモノクロ−ナル
抗体を使用しているために、慢性腎疾患患者、糖尿病患
者等の血清では、心機能が正常であるにも関わらず健常
人の測定値より高値を示し心筋梗塞の診断に対する特異
性が低く正確な診断ができない問題点があった（Bhayan
a,V.,et al.Clin.Chem.41,312,1995）。
は、ミルステインらによるモノクロ−ナル抗体の作製法
（Kohler,G.amd Milstein,C.;Nature.256,496,1975)の
開発により進歩した。江橋らによりトロポニンの分離精
製法（Ebashi,S.,Kodama,A.;J.Biochem.58,107,1965,Eb
ashi,S.,Kodama,A.;J.Biochem.64,465,1968.）が確立さ
れ、心筋梗塞とトロポニンＩとの関係において、ヒト心
筋トロポニンＩの免疫学的測定法が検討された(Cummin
s,B.,Cummins,P.;J.Mol.Cell.Cardiol.19,999,198
7.）。しかし、心筋梗塞の診断においてトロポニンＩの
血中存続時間が短く診断的価値が低い問題点があった。
その後、トロポニンＴによる診断法が開発（Katus,H.
A.,et al.;J.Mol.Cell.Cardiol.21,1349,1989.）された
が、固相抗体としてヒト心筋トロポニンＴを特異的に認
識するモノクロ−ナル抗体を用い、検知可能な信号を発
することのできる標識物を結合させた標識抗体はヒト骨
格筋トロポニンＴとの交差反応性があるモノクロ−ナル
抗体を使用しているために、慢性腎疾患患者、糖尿病患
者等の血清では、心機能が正常であるにも関わらず健常
人の測定値より高値を示し心筋梗塞の診断に対する特異
性が低く正確な診断ができない問題点があった（Bhayan
a,V.,et al.Clin.Chem.41,312,1995）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規なヒト
心筋トロポニンＴを特異的に認識する抗ヒト心筋トロポ
ニンＴモノクロ−ナル抗体を提供することを課題とす
る。さらに該モノクローナル抗体によりヒト血清または
血漿検体中のヒト心筋トロポニンＴの正確な測定法を提
供することを課題とする。
心筋トロポニンＴを特異的に認識する抗ヒト心筋トロポ
ニンＴモノクロ−ナル抗体を提供することを課題とす
る。さらに該モノクローナル抗体によりヒト血清または
血漿検体中のヒト心筋トロポニンＴの正確な測定法を提
供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記課題は、モノクロ−
ナル抗体の認識するヒト心筋トロポニンＴのエピト−プ
がＰｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏのアミノ酸
配列を含む抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体
によって解決される。また、ヒト心筋トロポニンＴに特
異的に結合し、ヒト骨格筋トロポニンＴに対する交差反
応性が免疫学的測定技術によって検知できない上記抗ヒ
ト心筋トロポニンＴモノクロ−ナル抗体により解決され
る。さらに、検知可能な信号を発することができる標識
物質に結合され、前記標識物質が酵素物質もしくは蛍光
物質である上記モノクロ−ナル抗体によっても解決され
る。また、マウスハイブリド−マ細胞系である受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１５５２７のハイブリド−マによって産
生される上記抗ヒト心筋トロポニンＴモノクロ−ナル抗
体によっても解決される。さらに上述したいずれかの抗
ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体を用いた溶液
中のトロポニンＴ測定のための免疫測定法によっても解
決される。
ナル抗体の認識するヒト心筋トロポニンＴのエピト−プ
がＰｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏのアミノ酸
配列を含む抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体
によって解決される。また、ヒト心筋トロポニンＴに特
異的に結合し、ヒト骨格筋トロポニンＴに対する交差反
応性が免疫学的測定技術によって検知できない上記抗ヒ
ト心筋トロポニンＴモノクロ−ナル抗体により解決され
る。さらに、検知可能な信号を発することができる標識
物質に結合され、前記標識物質が酵素物質もしくは蛍光
物質である上記モノクロ−ナル抗体によっても解決され
る。また、マウスハイブリド−マ細胞系である受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１５５２７のハイブリド−マによって産
生される上記抗ヒト心筋トロポニンＴモノクロ−ナル抗
体によっても解決される。さらに上述したいずれかの抗
ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体を用いた溶液
中のトロポニンＴ測定のための免疫測定法によっても解
決される。
【０００５】
【作用】本発明によれば、モノクロ−ナル抗体の認識す
るヒト心筋トロポニンＴのエピト−プがＰｒｏ−Ａｓｎ
−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏのアミノ酸配列であり、ヒト
心筋トロポニンＴに特異的に結合し、骨格筋トロポニン
Ｔに対する交差反応性が免疫学的測定技術によって検知
できない抗ヒト心筋トロポニンＴモノクロ−ナル抗体を
標識抗体として使用することにより、ヒト骨格筋トロポ
ニンＴとの交差反応性が無いために心筋傷害患者検体中
の心筋トロポニンＴを精度良く測定することができる。
るヒト心筋トロポニンＴのエピト−プがＰｒｏ−Ａｓｎ
−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏのアミノ酸配列であり、ヒト
心筋トロポニンＴに特異的に結合し、骨格筋トロポニン
Ｔに対する交差反応性が免疫学的測定技術によって検知
できない抗ヒト心筋トロポニンＴモノクロ−ナル抗体を
標識抗体として使用することにより、ヒト骨格筋トロポ
ニンＴとの交差反応性が無いために心筋傷害患者検体中
の心筋トロポニンＴを精度良く測定することができる。
【０００６】
【実施例】以下に、本発明の抗ヒト心筋トロポニンＴモ
ノクロ−ナル抗体を作製し、該モノクローナル抗体の評
価を行った。 １）スクリーニングに用いるハイブリドーマの作製 ＢＡＬＢ／Ｃマウス、雌、６週齢に１週〜４週間おき
に、ヒト心筋トロポニンＴ25μg〜50μgおよびフロイン
トアジュバントで腹腔内に数回免疫し、さらに融合３日
前にヒト心筋トロポニンＴ １０μｇをマウス尾静脈投
与により最終免疫した。融合は免疫したマウス脾細胞と
マウス骨髄腫細胞SP2/0を５：１の割合で混合し、RPMI1
640-10％ FBSにて遠心洗浄２回行った。さらに、融合緩
衝液にて遠心洗浄２回行い、脾細胞２.５×１０7個あた
り融合緩衝液 400μlに浮遊した後、融合チャンバ−
（FTC-02:SHIMADZU）の電極間に注入し室温で５分間静
置した。Somatic Hybridizer SSH-2（SHIMADZU）を用い
て電気融合を行い（＜交流高周波電界＞周波数：１MH
z、電圧：40Ｖ、印加時間：30ｓ、＜直流パルス電界＞
パルス幅：40μｓ、電圧：230Ｖ（電界強度：2.3 KV/c
m）、パルス回数：１回）、室温１０分静置後電極間よ
り融合細胞をRPMI1640-10% FBSに回収し、さらに37℃、
５％ ＣＯ2 ３０分静置した。その後、1000rpm、10分、
４℃の遠心により細胞回収し、細胞をIL-6 10U/m添加 R
PMI1640-10%FBSに浮遊後96ウェル細胞培養プレートに10
0μlづつ分注した。37℃、５％ ＣＯ2 培養器で７〜１
０日培養した。
ノクロ−ナル抗体を作製し、該モノクローナル抗体の評
価を行った。 １）スクリーニングに用いるハイブリドーマの作製 ＢＡＬＢ／Ｃマウス、雌、６週齢に１週〜４週間おき
に、ヒト心筋トロポニンＴ25μg〜50μgおよびフロイン
トアジュバントで腹腔内に数回免疫し、さらに融合３日
前にヒト心筋トロポニンＴ １０μｇをマウス尾静脈投
与により最終免疫した。融合は免疫したマウス脾細胞と
マウス骨髄腫細胞SP2/0を５：１の割合で混合し、RPMI1
640-10％ FBSにて遠心洗浄２回行った。さらに、融合緩
衝液にて遠心洗浄２回行い、脾細胞２.５×１０7個あた
り融合緩衝液 400μlに浮遊した後、融合チャンバ−
（FTC-02:SHIMADZU）の電極間に注入し室温で５分間静
置した。Somatic Hybridizer SSH-2（SHIMADZU）を用い
て電気融合を行い（＜交流高周波電界＞周波数：１MH
z、電圧：40Ｖ、印加時間：30ｓ、＜直流パルス電界＞
パルス幅：40μｓ、電圧：230Ｖ（電界強度：2.3 KV/c
m）、パルス回数：１回）、室温１０分静置後電極間よ
り融合細胞をRPMI1640-10% FBSに回収し、さらに37℃、
５％ ＣＯ2 ３０分静置した。その後、1000rpm、10分、
４℃の遠心により細胞回収し、細胞をIL-6 10U/m添加 R
PMI1640-10%FBSに浮遊後96ウェル細胞培養プレートに10
0μlづつ分注した。37℃、５％ ＣＯ2 培養器で７〜１
０日培養した。
【０００７】２）抗ヒト心筋トロポニンＴモノクロ−ナ
ル抗体産生ハイブリド−マのスクリ−ニング ハイブリドーマ第一次スクリーニングとしてヒト心筋ト
ロポニンＴを固相化したプレ−トを用いて抗ヒト心筋ト
ロポニンＴを認識する抗体を産生しているハイブリド−
マを選定した。第一次スクリ−ニングで選定した抗体を
用いて第二次スクリーニングとしてヒト骨格筋トロポニ
ンＴを認識しない抗体を産生しているハイブリド−マを
選定した。ＥＬＩＳＡ法はヒト心筋トロポニンＴまた
は、ヒト骨格筋トロポニンＴをPBSにて500ng/mlに調製
し、NUNC-IMMUNO PLATE II（商品名）F96 マイクロプレ
−ト（Nunc社製、カタログ番号442404）（以下単にプレ
−トと称す）に100μlづつ分注し、４℃、一晩、コーテ
ィングした。さらに、PBS-25％ BlockAce（商品名、大
日本製薬(株)製、カタログ番号UK-B25）を200μlづつ分
注し室温で２時間ブロッキングした。このＥＩＡプレ−
トにPBS-10％ BlockAceを50μlづつ分注しさらにハイブ
リドーマ培養上清を50μl加えた後、室温で60分反応さ
せた。PBSTで洗浄３回行った後2000倍希釈したPOD標識
抗マウスIgG F(ab')2 （Cappel社製、カタログ番号5556
7）を100μlづつ加え室温２時間反応させ、再度PBSTを
用いてＥＩＡプレ−トを３回洗浄した。その後TMB液を1
00μlづつ加え室温15分発色させ、１Ｍ Ｈ3ＰＯ4 を50
μlづつ分注し発色停止した後、415 nm吸光度で測定す
ることにより、ヒト心筋トロポニンＴ特異抗体のスクリ
ーニングを行った。
ル抗体産生ハイブリド−マのスクリ−ニング ハイブリドーマ第一次スクリーニングとしてヒト心筋ト
ロポニンＴを固相化したプレ−トを用いて抗ヒト心筋ト
ロポニンＴを認識する抗体を産生しているハイブリド−
マを選定した。第一次スクリ−ニングで選定した抗体を
用いて第二次スクリーニングとしてヒト骨格筋トロポニ
ンＴを認識しない抗体を産生しているハイブリド−マを
選定した。ＥＬＩＳＡ法はヒト心筋トロポニンＴまた
は、ヒト骨格筋トロポニンＴをPBSにて500ng/mlに調製
し、NUNC-IMMUNO PLATE II（商品名）F96 マイクロプレ
−ト（Nunc社製、カタログ番号442404）（以下単にプレ
−トと称す）に100μlづつ分注し、４℃、一晩、コーテ
ィングした。さらに、PBS-25％ BlockAce（商品名、大
日本製薬(株)製、カタログ番号UK-B25）を200μlづつ分
注し室温で２時間ブロッキングした。このＥＩＡプレ−
トにPBS-10％ BlockAceを50μlづつ分注しさらにハイブ
リドーマ培養上清を50μl加えた後、室温で60分反応さ
せた。PBSTで洗浄３回行った後2000倍希釈したPOD標識
抗マウスIgG F(ab')2 （Cappel社製、カタログ番号5556
7）を100μlづつ加え室温２時間反応させ、再度PBSTを
用いてＥＩＡプレ−トを３回洗浄した。その後TMB液を1
00μlづつ加え室温15分発色させ、１Ｍ Ｈ3ＰＯ4 を50
μlづつ分注し発色停止した後、415 nm吸光度で測定す
ることにより、ヒト心筋トロポニンＴ特異抗体のスクリ
ーニングを行った。
【０００８】３）抗ヒト心筋トロポニンＴＩｇＧ抗体産
生ハイブリド−マのスクリ−ニング ヒト心筋トロポニンＴをPBSにて500ng/mlに調製し、プ
レ−ト１ウエルに100μl分注し４℃で一晩コーティング
した後、PBS-25％ BlockAceを１ウエルに200μl分注し
室温で２時間ブロッキングを行いＥＩＡプレ−トを作製
した。ハイブリド−マ培養上清100μlをＥＩＡプレ−ト
に加え室温で60分反応させ、PBSTで洗浄を３回行いPOD
標識抗マウスIgG F(ab')2(×2000希釈）または、POD標
識抗マウスIgM (μ chain)（Cappel社製、カタログ番号
55568）（×2000希釈）を100 μl加え室温で120分反応
させた。PBSTで洗浄を３回行い、TMB 液を100μl加え室
温で15分発色した後、１Ｍ Ｈ3ＰＯ4 を50μl分注し発
色停止し、415 nmの吸光度を測定することにより、ヒト
心筋トロポニンＴと強く反応するがヒト骨格筋トロポニ
ンＴとも交差反応するＩｇＧ抗体のスクリーニングを行
った。
生ハイブリド−マのスクリ−ニング ヒト心筋トロポニンＴをPBSにて500ng/mlに調製し、プ
レ−ト１ウエルに100μl分注し４℃で一晩コーティング
した後、PBS-25％ BlockAceを１ウエルに200μl分注し
室温で２時間ブロッキングを行いＥＩＡプレ−トを作製
した。ハイブリド−マ培養上清100μlをＥＩＡプレ−ト
に加え室温で60分反応させ、PBSTで洗浄を３回行いPOD
標識抗マウスIgG F(ab')2(×2000希釈）または、POD標
識抗マウスIgM (μ chain)（Cappel社製、カタログ番号
55568）（×2000希釈）を100 μl加え室温で120分反応
させた。PBSTで洗浄を３回行い、TMB 液を100μl加え室
温で15分発色した後、１Ｍ Ｈ3ＰＯ4 を50μl分注し発
色停止し、415 nmの吸光度を測定することにより、ヒト
心筋トロポニンＴと強く反応するがヒト骨格筋トロポニ
ンＴとも交差反応するＩｇＧ抗体のスクリーニングを行
った。
【０００９】４）ヒト心筋トロポニンＴ測定系に用いる
抗体の選定 上記２）で得たヒト心筋トロポニンＴ特異抗体及び上記
３）で得たヒト骨格筋トロポニンＴと交差反応する抗体
を用いて、サンドイッチイムノアッセイの測定法で血清
中ヒト心筋トロポニンＴを感度よく特異的に測定できる
抗体の組合せを選定した。選定に使用した抗体は、ハイ
ブリド−マ培養上清中の抗体をProteinGを用いて精製
し、固相抗体はそのまま使用した。標識抗体としてNHS-
LC-Biotin(PIERCE社製、カタログ番号21335)を用いて精
製抗体にBiotinを結合させ作製した。固相抗体をPBSに
て10μg/mlに調製し、プレ−ト１ウエルに100μl分注し
４℃で一晩コーティングした後、PBS-25％ BlockAceを
１ウエルに200μl分注し室温で２時間ブロッキングを行
いＥＩＡプレ−トを作製した。反応用緩衝液100μlと正
常血清に精製トロポニンＴを添加して調整した0,1,2,4,
8,16ng/mlのトロポニンＴ添加血清20μlをＥＩＡプレ−
トに加え室温で60分反応させた後、PBSTで洗浄を５回行
い2μg/mlに調製したBiotin標識抗体を100 μl加え室温
で30分反応させた。PBSTで５回洗浄を行い、5μg/mlに
調製したPOD標識Streptavidin(VECTER:No.SA-5004)を10
0 μl加え室温で5分反応させた後、PBSTで洗浄を５回行
った。TMB 液を100μl加え室温で15分発色した後、１Ｍ
Ｈ3ＰＯ4 を50μl分注し発色停止し、415 nmの吸光度
を測定した。未標識抗体とBiotin標識抗体を用いて組合
せを検討した結果、固相抗体には抗ヒト心筋トロポニン
Ｔと強く反応しヒト骨格筋トロポニンＴに対して交差反
応性が≦１０％のモノクロ−ナル抗体を、標識抗体には
ヒト心筋トロポニンＴ特異抗体をサンドイッチイムノア
ッセイに用いることにより感度及び特異性の良好な組合
せを見いだした。
抗体の選定 上記２）で得たヒト心筋トロポニンＴ特異抗体及び上記
３）で得たヒト骨格筋トロポニンＴと交差反応する抗体
を用いて、サンドイッチイムノアッセイの測定法で血清
中ヒト心筋トロポニンＴを感度よく特異的に測定できる
抗体の組合せを選定した。選定に使用した抗体は、ハイ
ブリド−マ培養上清中の抗体をProteinGを用いて精製
し、固相抗体はそのまま使用した。標識抗体としてNHS-
LC-Biotin(PIERCE社製、カタログ番号21335)を用いて精
製抗体にBiotinを結合させ作製した。固相抗体をPBSに
て10μg/mlに調製し、プレ−ト１ウエルに100μl分注し
４℃で一晩コーティングした後、PBS-25％ BlockAceを
１ウエルに200μl分注し室温で２時間ブロッキングを行
いＥＩＡプレ−トを作製した。反応用緩衝液100μlと正
常血清に精製トロポニンＴを添加して調整した0,1,2,4,
8,16ng/mlのトロポニンＴ添加血清20μlをＥＩＡプレ−
トに加え室温で60分反応させた後、PBSTで洗浄を５回行
い2μg/mlに調製したBiotin標識抗体を100 μl加え室温
で30分反応させた。PBSTで５回洗浄を行い、5μg/mlに
調製したPOD標識Streptavidin(VECTER:No.SA-5004)を10
0 μl加え室温で5分反応させた後、PBSTで洗浄を５回行
った。TMB 液を100μl加え室温で15分発色した後、１Ｍ
Ｈ3ＰＯ4 を50μl分注し発色停止し、415 nmの吸光度
を測定した。未標識抗体とBiotin標識抗体を用いて組合
せを検討した結果、固相抗体には抗ヒト心筋トロポニン
Ｔと強く反応しヒト骨格筋トロポニンＴに対して交差反
応性が≦１０％のモノクロ−ナル抗体を、標識抗体には
ヒト心筋トロポニンＴ特異抗体をサンドイッチイムノア
ッセイに用いることにより感度及び特異性の良好な組合
せを見いだした。
【００１０】５）抗ヒト心筋トロポニンＴ特異抗体のエ
ピト−プ解析 上記２）の方法によって得られたハイブリドーマのひと
つであるＴＤ−ＴｎＴ８Ｆ２（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１５５２７）から産生される抗ヒト心筋トロポニンＴモ
ノクローナル抗体（８Ｆ２）のエピトープ解析を行っ
た。エピトープスキャニングキット（カイロン社）を用
いて、ポリスチレン製ピン上に、ヒト心筋トロポニンＴ
のアミノ酸配列（Laurence M.,et al.FEBS LETTERS,32
8,139,1993）を10merのペプチドを３アミノ酸ステップ
ずつ、または、8merのペプチドを１アミノ酸ステップず
つオーバーラップするよう合成した。PBS-25％ BlockAc
e 300μlを分注したマイクロプレートのウェルに上記ピ
ンを入れ、60分ブロッキングした。ブロッキング後のピ
ンをPOD標識8F2抗体2〜5μg/mlを入れたトレイ中で室温
30分反応させた。その後、PBSTで洗浄を５回行った後、
ABTS発色液150μlを分注したマイクロプレートのウェル
にピンを入れ発色させた。発色終了後ピンを取り出し、
マイクロプレートのウェルの吸光度（405 nm）を測定し
た。発色の見られたピンのポジションからエピトープを
特定した（図１）。抗ヒト心筋トロポニンＴ特異抗体
（８Ｆ２）の認識するエピト−プ領域は、Ｎ末端から６
９〜８１番のＳｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ
−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−
Ｐｒｏ−Ａｓｐであり、特にＰｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅと強く反応す
ることが判明した。ヒト骨格筋トロポニンＴの６９〜８
１番のアミノ酸配列はＰｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−
Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕであり、ヒト心筋トロポニンＴ
と６アミノ酸が異なっているため他の領域に比べ相同性
が低い領域であることから、ヒト心筋トロポニンＴの特
異領域であると考えられる。また、これらの抗体は少な
くともアミノ酸配列７２〜７６のＰｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｅ
ｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏの領域を認識する抗体であり、この
領域を認識する抗体は抗ヒト心筋トロポニンＴに対し
て）の特異性が高いことが示された。
ピト−プ解析 上記２）の方法によって得られたハイブリドーマのひと
つであるＴＤ−ＴｎＴ８Ｆ２（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１５５２７）から産生される抗ヒト心筋トロポニンＴモ
ノクローナル抗体（８Ｆ２）のエピトープ解析を行っ
た。エピトープスキャニングキット（カイロン社）を用
いて、ポリスチレン製ピン上に、ヒト心筋トロポニンＴ
のアミノ酸配列（Laurence M.,et al.FEBS LETTERS,32
8,139,1993）を10merのペプチドを３アミノ酸ステップ
ずつ、または、8merのペプチドを１アミノ酸ステップず
つオーバーラップするよう合成した。PBS-25％ BlockAc
e 300μlを分注したマイクロプレートのウェルに上記ピ
ンを入れ、60分ブロッキングした。ブロッキング後のピ
ンをPOD標識8F2抗体2〜5μg/mlを入れたトレイ中で室温
30分反応させた。その後、PBSTで洗浄を５回行った後、
ABTS発色液150μlを分注したマイクロプレートのウェル
にピンを入れ発色させた。発色終了後ピンを取り出し、
マイクロプレートのウェルの吸光度（405 nm）を測定し
た。発色の見られたピンのポジションからエピトープを
特定した（図１）。抗ヒト心筋トロポニンＴ特異抗体
（８Ｆ２）の認識するエピト−プ領域は、Ｎ末端から６
９〜８１番のＳｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ
−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−
Ｐｒｏ−Ａｓｐであり、特にＰｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅと強く反応す
ることが判明した。ヒト骨格筋トロポニンＴの６９〜８
１番のアミノ酸配列はＰｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−
Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕであり、ヒト心筋トロポニンＴ
と６アミノ酸が異なっているため他の領域に比べ相同性
が低い領域であることから、ヒト心筋トロポニンＴの特
異領域であると考えられる。また、これらの抗体は少な
くともアミノ酸配列７２〜７６のＰｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｅ
ｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏの領域を認識する抗体であり、この
領域を認識する抗体は抗ヒト心筋トロポニンＴに対し
て）の特異性が高いことが示された。
【００１１】６）トロポニンＴ測定のための酵素免疫測
定法 抗ヒト心筋トロポニンＴ特異抗体（８Ｆ２）に通常のペ
ルオキシダ−ゼ（ＰＯＤ）などの酵素標識物質を公知の
方法により標識した。また、固相に用いる抗体として抗
ヒト心筋トロポニンＴと強く反応し、また骨格筋トロポ
ニンＴに対して交差反応性が≦１０％のモノクロ−ナル
抗体を用いる。固相としての担体にはプラスチック製プ
レ−トなどを用い、固相担体に骨格筋トロポニンＴに対
して交差反応性が≦１０％のモノクローナル抗体を固相
化し、そこに反応用緩衝液を１００μl／ウエル加え、
標準曲線試料として１６、８、４、２、１、0.5、0.25n
g/mlのトロポニンＴを２０μl／ウエル添加し、また患
者試料も同様に２０μl／ウエル添加し１８〜３０℃で
１時間反応させた。PBSTで５回洗浄し、ＰＯＤ標識した
抗ヒト心筋トロポニンＴ特異抗体（８Ｆ２）を１００μ
l／ウエル加え１８〜３０℃で３０分間反応させ、PBST
で５回洗浄した。次に、ＰＯＤ発色基質溶液を１００μ
l／ウエル加え、４９２ｎｍでの吸光度を測定した。得
られた標準曲線（図２）から、患者試料のトロポニンＴ
濃度を測定する。本測定法の標準曲線はヒト心筋トロポ
ニンＴ ０〜16ng/mlまで正確に測定するために十分な直
線性を有しており、患者試料中のヒト心筋トロポニンＴ
の測定に使用可能であると考えられた。
定法 抗ヒト心筋トロポニンＴ特異抗体（８Ｆ２）に通常のペ
ルオキシダ−ゼ（ＰＯＤ）などの酵素標識物質を公知の
方法により標識した。また、固相に用いる抗体として抗
ヒト心筋トロポニンＴと強く反応し、また骨格筋トロポ
ニンＴに対して交差反応性が≦１０％のモノクロ−ナル
抗体を用いる。固相としての担体にはプラスチック製プ
レ−トなどを用い、固相担体に骨格筋トロポニンＴに対
して交差反応性が≦１０％のモノクローナル抗体を固相
化し、そこに反応用緩衝液を１００μl／ウエル加え、
標準曲線試料として１６、８、４、２、１、0.5、0.25n
g/mlのトロポニンＴを２０μl／ウエル添加し、また患
者試料も同様に２０μl／ウエル添加し１８〜３０℃で
１時間反応させた。PBSTで５回洗浄し、ＰＯＤ標識した
抗ヒト心筋トロポニンＴ特異抗体（８Ｆ２）を１００μ
l／ウエル加え１８〜３０℃で３０分間反応させ、PBST
で５回洗浄した。次に、ＰＯＤ発色基質溶液を１００μ
l／ウエル加え、４９２ｎｍでの吸光度を測定した。得
られた標準曲線（図２）から、患者試料のトロポニンＴ
濃度を測定する。本測定法の標準曲線はヒト心筋トロポ
ニンＴ ０〜16ng/mlまで正確に測定するために十分な直
線性を有しており、患者試料中のヒト心筋トロポニンＴ
の測定に使用可能であると考えられた。
【００１２】７）心機能の正常な慢性腎疾患患者および
糖尿病患者の測定値 正常腎機能の糖尿病患者（１４例）、腎機能障害を伴う
糖尿病患者（１９例）、慢性腎炎患者（１１例）、慢性
透析患者（８例）の合計５２例の患者試料を測定し、従
来技術の測定法（エンチムンテスト トロポニンＴ（ベ
ーリンガー・マンハイム社製）では４／５２（７.７
％）がカットオフ値（0.25ng/ml）より高値を示した
が、本発明の測定法では０／５２（０.０％）となりカ
ットオフ値より高値を示した検体は無かった（表１）。
以上のことから本発明の測定法は、従来法に比較し慢性
腎疾患患者および糖尿病患者検体測定時においても正確
な測定が可能となり、本発明の測定法は測定精度の高い
診断法であることが証明された。
糖尿病患者の測定値 正常腎機能の糖尿病患者（１４例）、腎機能障害を伴う
糖尿病患者（１９例）、慢性腎炎患者（１１例）、慢性
透析患者（８例）の合計５２例の患者試料を測定し、従
来技術の測定法（エンチムンテスト トロポニンＴ（ベ
ーリンガー・マンハイム社製）では４／５２（７.７
％）がカットオフ値（0.25ng/ml）より高値を示した
が、本発明の測定法では０／５２（０.０％）となりカ
ットオフ値より高値を示した検体は無かった（表１）。
以上のことから本発明の測定法は、従来法に比較し慢性
腎疾患患者および糖尿病患者検体測定時においても正確
な測定が可能となり、本発明の測定法は測定精度の高い
診断法であることが証明された。
【００１３】 (表１)心機能正常慢性腎疾患患者及び糖尿病患者の血清中トロポニンＴ陽性率 本測定法 従来測定法 正常腎機能の糖尿病 0/14(0%) 0/14(0%) 腎機能障害を伴う糖尿病 0/19(0%) 1/19(5%) 慢性腎炎 0/11(0%) 1/11(9%) 慢性透析患者 0/8(0%) 2/8(25%) 合 計 0/52(0%) 4/52(7.7%)
【００１４】慢性腎疾患患者および糖尿病患者は罹病期
間が長期になるにつれ心疾患も併発する頻度が高くなる
ことが知られている。心疾患を評価する検査法として、
生理学的検査では心電図検査、心エコ−検査、生化学検
査ではミオグロビン、ＣＫ−ＭＢ、トロポニンＴ検査等
がある。特に生化学検査であるトロポニンＴは、心筋障
害を高感度に検査できるマ−カ−であるために良く利用
されている。しかし、従来法では慢性腎疾患患者および
糖尿病患者で心機能が正常であるにも関わらずトロポニ
ンＴ測定値がカットオフ値よりも高値を示す検体がある
ことから正確な診断ができないという問題点があった
が、本発明のモノクローナル抗体を用いることにより正
確な診断が可能となると考えられた。
間が長期になるにつれ心疾患も併発する頻度が高くなる
ことが知られている。心疾患を評価する検査法として、
生理学的検査では心電図検査、心エコ−検査、生化学検
査ではミオグロビン、ＣＫ−ＭＢ、トロポニンＴ検査等
がある。特に生化学検査であるトロポニンＴは、心筋障
害を高感度に検査できるマ−カ−であるために良く利用
されている。しかし、従来法では慢性腎疾患患者および
糖尿病患者で心機能が正常であるにも関わらずトロポニ
ンＴ測定値がカットオフ値よりも高値を示す検体がある
ことから正確な診断ができないという問題点があった
が、本発明のモノクローナル抗体を用いることにより正
確な診断が可能となると考えられた。
【００１５】８）骨格筋トロポニンＴ共存の影響 骨格筋トロポニンＴ０〜５００ng/ml存在下での心筋ト
ロポニンＴの添加回収試験を行ったところ、本測定法は
骨格筋トロポニンＴの影響を受けることなく、心筋トロ
ポニンＴの回収率は８５〜１００％と良好な結果であっ
た（図３）。本測定法は、筋挫滅症、筋融解症などの筋
疾患において血中骨格筋トロポニンＴ濃度が高値の時に
おいても、骨格筋トロポニンＴの影響を受けることなく
ヒト心筋トロポニンＴが正確に測定できると思われた。
ロポニンＴの添加回収試験を行ったところ、本測定法は
骨格筋トロポニンＴの影響を受けることなく、心筋トロ
ポニンＴの回収率は８５〜１００％と良好な結果であっ
た（図３）。本測定法は、筋挫滅症、筋融解症などの筋
疾患において血中骨格筋トロポニンＴ濃度が高値の時に
おいても、骨格筋トロポニンＴの影響を受けることなく
ヒト心筋トロポニンＴが正確に測定できると思われた。
【００１６】
【発明の効果】本発明によれば、骨格筋トロポニンＴの
影響を受けずまた、心機能の正常な慢性腎疾患患者およ
び糖尿病患者の測定においても正確な測定が提供でき
る。本測定法は測定精度が高く、心筋梗塞の判定におい
て特異性の高い診断が可能となった。また、検体を血漿
とした場合でも添加したヘパリンの影響を受けないので
精度の高い正確な測定を行うことができる。
影響を受けずまた、心機能の正常な慢性腎疾患患者およ
び糖尿病患者の測定においても正確な測定が提供でき
る。本測定法は測定精度が高く、心筋梗塞の判定におい
て特異性の高い診断が可能となった。また、検体を血漿
とした場合でも添加したヘパリンの影響を受けないので
精度の高い正確な測定を行うことができる。
【００１７】
配列番号：１ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド
【００１８】配列番号：２ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド
【００１９】配列番号：３ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Phe Met Pro Asn Leu Val Pro Pro Lys Ile Pro Asp 5 10
【図１】図１は本発明の実施例中、５）のエピト−プ解
析の結果を示す図である。
析の結果を示す図である。
【図２】図２は本発明の実施例中、６）の標準曲線を示
す図である。
す図である。
【図３】図３は本発明の実施例中、８）の骨格筋トロポ
ニンＴ共存の影響を示す図である。
ニンＴ共存の影響を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (8)
- 【請求項１】モノクロ−ナル抗体の認識するヒト心筋ト
ロポニンＴのエピト−プがＰｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖ
ａｌ−Ｐｒｏのアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗
ヒト心筋トロポニンＴモノクロ−ナル抗体。 - 【請求項２】ヒト心筋トロポニンＴに特異的に結合し、
ヒト骨格筋トロポニンＴに対する交差反応性が免疫学的
測定技術によって検知できない請求項１記載の抗ヒト心
筋トロポニンＴモノクロ−ナル抗体。 - 【請求項３】マウスハイブリド−マ細胞系により産生さ
れる請求項１または２記載の抗ヒト心筋トロポニンＴモ
ノクロ−ナル抗体。 - 【請求項４】前記ハイブリド−マは、ＴＤ−ＴｎＴ８Ｆ
２（受託番号ＦＥＲＭＰ−１５５２７）のものである請
求項１〜３のいずれかに記載の抗ヒト心筋トロポニンＴ
モノクロ−ナル抗体。 - 【請求項５】検知可能な信号を発することができる標識
物質に結合された請求項１〜４のいずれかに記載の抗ヒ
ト心筋トロポニンＴモノクロ−ナル抗体。 - 【請求項６】前記標識物質が酵素物質である請求項５記
載の抗ヒト心筋トロポニンＴモノクロ−ナル抗体。 - 【請求項７】前記標識物質が蛍光物質である請求項５記
載の抗ヒト心筋トロポニンＴモノクロ−ナル抗体。 - 【請求項８】請求項１〜７のいずれかに記載の抗ヒト心
筋トロポニンＴモノクローナル抗体を用いた溶液中のト
ロポニンＴ測定のための免疫測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8086932A JPH09271392A (ja) | 1996-04-09 | 1996-04-09 | 抗ヒト心筋トロポニンｔモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8086932A JPH09271392A (ja) | 1996-04-09 | 1996-04-09 | 抗ヒト心筋トロポニンｔモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09271392A true JPH09271392A (ja) | 1997-10-21 |
Family
ID=13900649
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8086932A Pending JPH09271392A (ja) | 1996-04-09 | 1996-04-09 | 抗ヒト心筋トロポニンｔモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09271392A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109705216A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-05-03 | 河北省科学院生物研究所 | 一种抗牛骨骼肌肌钙蛋白i单克隆抗体及其应用 |
| CN109810191A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-05-28 | 河北省科学院生物研究所 | 一种抗羊骨骼肌肌钙蛋白i单克隆抗体及其应用 |
| CN111735965A (zh) * | 2020-07-02 | 2020-10-02 | 北京美联泰科生物技术有限公司 | 心肌肌钙蛋白i检测试剂和制备方法以及心肌肌钙蛋白i检测试剂盒 |
| JP2020180974A (ja) * | 2006-04-04 | 2020-11-05 | ノビラックス，エルエルシー | トロポニンの分析のための高感度のシステムおよび方法 |
| CN112067823A (zh) * | 2020-09-14 | 2020-12-11 | 华南农业大学 | 一种鸡心肌肌钙蛋白i双抗体夹心elisa检测方法的建立 |
| CN113402608A (zh) * | 2021-06-24 | 2021-09-17 | 河北省科学院生物研究所 | 一种杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体与应用 |
-
1996
- 1996-04-09 JP JP8086932A patent/JPH09271392A/ja active Pending
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020180974A (ja) * | 2006-04-04 | 2020-11-05 | ノビラックス，エルエルシー | トロポニンの分析のための高感度のシステムおよび方法 |
| CN109705216A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-05-03 | 河北省科学院生物研究所 | 一种抗牛骨骼肌肌钙蛋白i单克隆抗体及其应用 |
| CN109810191A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-05-28 | 河北省科学院生物研究所 | 一种抗羊骨骼肌肌钙蛋白i单克隆抗体及其应用 |
| CN109810191B (zh) * | 2018-12-28 | 2021-09-07 | 河北省科学院生物研究所 | 一种抗羊骨骼肌肌钙蛋白i单克隆抗体及其应用 |
| CN109705216B (zh) * | 2018-12-28 | 2021-09-07 | 河北省科学院生物研究所 | 一种抗牛骨骼肌肌钙蛋白i单克隆抗体及其应用 |
| CN111735965A (zh) * | 2020-07-02 | 2020-10-02 | 北京美联泰科生物技术有限公司 | 心肌肌钙蛋白i检测试剂和制备方法以及心肌肌钙蛋白i检测试剂盒 |
| CN111735965B (zh) * | 2020-07-02 | 2023-07-25 | 北京美联泰科生物技术有限公司 | 心肌肌钙蛋白i检测试剂和制备方法以及心肌肌钙蛋白i检测试剂盒 |
| CN112067823A (zh) * | 2020-09-14 | 2020-12-11 | 华南农业大学 | 一种鸡心肌肌钙蛋白i双抗体夹心elisa检测方法的建立 |
| CN113402608A (zh) * | 2021-06-24 | 2021-09-17 | 河北省科学院生物研究所 | 一种杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体与应用 |
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