JPH04252956A - タンパク質の測定方法、試薬及びキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はタンパク質の測定方法、
試薬及びキットに関するものである。更に詳しくは、Ａ
ＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、及びＡＰＰ７７０に共通な
配列を少なくともその一部に含むポリペプチド上の、異
なる抗原決定基を認識する２種類の抗体を用いたサンド
イッチＥＬＩＳＡ法による、アルツハイマー病アミロイ
ド前駆体蛋白及びその断片の免疫学的測定方法、試薬及
びキットに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、人口構成の高齢化に伴い、老人性
痴呆症をはじめとする、脳神経系の疾病が社会問題化し
つつある。これらの疾病の中には発症の原因や簡便な診
断法、治療法の確立されていない疾病も多く、その研究
開発が強く望まれている。このような病気には、アルツ
ハイマー型老人性痴呆症及びアルツハイマー病（以下こ
の２つを併せて、ＡＤと略す）が含まれる。ＡＤ患者の
脳には、老人斑アミロイドβ蛋白（以下老人斑アミロイ
ドと略す）を主要構成成分とする老人斑と呼ばれる構造
体が、正常人に比し、多く沈着することから老人斑アミ
ロイドとＡＤ発症の関係が注目されてきた。Ｋａｎｇら
により、老人斑アミロイドには前駆体（以下ＡＰＰと略
す）が存在すること（以下Ｋａｎｇらにより発見された
ＡＰＰをＡＰＰ６９５と略す）が報告され（Ｋａｎｇら
、Ｎａｔｕｒｅ　　３２５　　７３３−７３６　　１９
８７、特開昭６３−２２２６９３号公報参照）、さらに
本発明者らの研究等により、ＡＰＰには少なくとも３種
類（ＡＰＰ６９５に加えてＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７７
０）存在することが明らかになり（Ｐｏｎｔｅら、Ｎａ
ｔｕｒｅ　　３３１　　５２５−５２７　　１９８８、
Ｔａｎｚｉら、Ｎａｔｕｒｅ　　３３１　　５２８−５
３０　　１９８８、Ｋｉｔａｇｕｃｈｉら、Ｎａｔｕｒ
ｅ　　３３１５３０−５３２　　１９８８、欧州特許公
開番号０３０４０１３号公報、特許出願公表　　平２−
５０１７９６号公報、国際公開番号ＷＯ８９／０７６５
７）、ＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７７０にはＫｕｎｉｔｚ
型プロテアーゼインヒビターと高い相同性を有する領域
が存在すること、及び実際にプロテアーゼインヒジター
活性が存在することが明らかになった（図１）。更に７
１４アミノ酸からなるアルツハイマー病アミロイド前駆
体蛋白ＡＰＰ７１４（Ｇｏｌｄｅら、Ｎｅｕｒｏｎ　　
４　　２５３−２６７　　１９９０）、及び、老人斑ア
ミロイド部分はもたない、５６３アミノ酸からなるＡＰ
Ｐ５６３（ｄｅ　　Ｓａｕｖａｇｅら　　Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ２４５　　６５１−６５３　　１９８９）もマイナー
成分ながらその存在が知られている（図１）。ＡＤ患者
における老人斑アミロイドの脳内沈着を、脳内の代謝阻
害の結果と考えるならば、ＡＰＰの過剰発現が、ＡＤの
発症に何らかの役割をはたしている可能性が考えられる
。ＡＰＰ発現とＡＤの関連については、髄液中のＡＰＰ
６９５、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７０（この３者を併せ
て、全ＡＰＰと略す）の合計量が、ＡＤ患者で対照者に
比べ著しく増加しているという報告（Ｗｅｉｄｅｍａｎ
ｎら、Ｃｅｌｌ　　５７１１５−１２６　　１９８９）
があり、髄液をはじめとする体液中のアツルハイマー病
アミロイド前駆体蛋白量測定の診断価値が示唆されてい
る。しかしながら、彼らがＡＰＰの検出に用いた方法は
、ＡＰＰ６９５の全長を含む融合蛋白に対するモノクロ
ーナル抗体を用いたウェスタンブロッティング法である
。さらに、ＡＰＰのＮ末端部分（ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ
７５１、ＡＰＰ７７０に共通）に対応する合成ペプチド
に対するポリクローナル抗体を用いて、ウェスタンブロ
ッティング法で、ＡＤ患者髄液中のＡＰＰ６９５、ＡＰ
Ｐ７５１＋ＡＰＰ７７０及びその断片の量的な検討が行
われている（Ｐａｌｍｅｒｔら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　
　４０　　、１０２８−１０３４、１９９０）。ウ−ス
タンブロッティング法に於いては、被検体を濃縮、脱塩
、さらに界面活性剤や還元剤による変性処理等の操作を
行った後、電気泳動によりタンパク質の分離を行い、こ
れに対して抗原抗体反応を行わなければならない。その
ため操作が煩雑で、多数の検体について測定が困難であ
ること、被検試料に含まれるＡＰＰ以外の夾雑タンパク
の量によって検出感度が著しく左右されること等の点で
問題がある。また、ＡＰＰのＣ末端側（ＡＰＰ６９５、
７５１、７７０に共通な配列。ＡＰＰ６９５でいえば第
６６７−６７６残基）に対する抗体で、ラジオイムノア
ッセイ法（以下ＲＩＡと略す）によって、血清中のＡＰ
Ｐ濃度を検討したところ、ＡＤ／対照に有意差はなかっ
たとする報告もある（Ｒｕｍｂｌｅら、Ｎｅｗ　　Ｅｎ
ｇｌａｎｄ　　Ｊ．Ｍｅｄ．３２０、１４４６−１４５
２、１９８９）。　　髄液や血液等体液中に存在するＡ
ＰＰの殆どは、膜貫通領域よりＣ末端側の配列を有して
おらず（例えばＰａｌｍｅｒｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　　８６、６３３８−６３
４２、１９８９、Ｐａｌｍｅｒｔら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇ
ｙ　　４０、１０２８−１０３４、１９９０、Ｖａｎ　
　Ｎｏｓｔｒａｎｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　　２４８、７
４５−７４８、１９９０、Ｃｏｌｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７０、２８８
−２９５、１９９０など）、ＡＰＰの定量には、そのＣ
末端側の配列に対する抗体は適していない。これらの現
状に於いて、臨床現場でのＡＰＰの迅速な定量方法の確
立が求められていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、測
定操作及び試料の調製が簡便であるとともに、高感度に
、全ＡＰＰ（ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７
０）及びその断片を測定することのできる、測定方法、
試薬及びキットを提供することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】上記目的達成のため、本
発明者が鋭意研究を行った結果、全ＡＰＰ（ＡＰＰ６９
５、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７０）及びその断片の定量
方法として、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、又はＡＰＰ
７７０に共通な配列を少なくともその一部に含むポリペ
プチド上の、異なる抗原決定基を認識する２種類の抗体
を用いることによって可能となることを見出し、さらに
当該方法により、測定操作及び試料の調製が簡便である
とともに、高感度に、これらを定量できる試薬及びキッ
トを作成し、本発明を完成するに至った。

【０００５】以下、本発明について詳細に説明する。サ
ンドイッチＥＬＩＳＡ（ＥＬＩＳＡとはＥｎｚｙｍｅ　
　Ｌｉｎｋｅｄ　　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　　Ａ
ｓｓａｙの略）法による免疫学的測定方法とは、抗原上
の２つの異った抗体認識部位（これを抗原決定基という
）にそれぞれ結合する２種類の抗体を用いて抗原の有無
又はその量を測定する方法である本発明において用いら
れる全ＡＰＰの検出に用いられる２種類の抗体としては
、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、又はＡＰＰ７７０に共
通な配列を少なくともその一部に含むポリペプチド上の
、異なる抗原決定基を認識するものであれば特に限定は
なく、ＡＰＰ６９５や、ＡＰＰ６９５の膜貫通領域から
カルボキシル末端までを除去したＡＰＰ６９５誘導体、
或いは、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７０又はそれらの断片
に対する抗体でＡＰＰ６９５とも反応するポリクローナ
ル抗体やモノクローナル抗体等を挙げることができる。 例えば、本発明者らによって作成された、ＡＰＰ６９５
のＣ末端部分１０３アミノ酸（膜貫通領域及び細胞内部
分）が欠失したＡＰＰ６９５誘導体であるＡＰＰ５９２
（実施例参照）を免疫して得られた、ウラギ抗ＡＰＰ５
９２ポリクローナル抗体等及びマウス抗ＡＰＰ５９２モ
ノクローナル抗体等が挙げられる。モノクローナル抗体
の例としては、微工研菌寄第１１９４２号（ＦＥＲＭ　
　Ｐ−１１９４２，モノクローナル抗体１Ｂ２を産生す
る）、微工研菌寄第１１９４３号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１
１９４３，モノクローナル抗体３Ｂ２を産生する）、及
び微工研菌寄第１１９４４号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１１９
４４，モノクローナル抗体６Ａ３を産生する）のハイブ
リドーマが産生する抗体等が挙げられる。

【０００６】これらの抗体は完全な形の抗体のままで用
い得ることは勿論のこと、その本質的結合能が維持され
る抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、（Ｆａｂ′）
２　等として用いることもできる。本発明における被検
試料としては特に限定はないが、具体的には、髄液、血
液（血漿および血清）、尿等が挙げられる。また、脳等
の組織や細胞の抽出物を用いることもできる。

【０００７】本発明において用いられる不溶性担体とし
ては、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピ
レン、ポリエステル、フッ素樹脂、ガラス、金属及びこ
れらの組み合わせ等を例示することができる。また不溶
性担体の形状としては、例えばトレー状、球状、繊維状
、棒状、盤状、容器状、セル、試験管等の種々の形状で
本発明を実施することができる。多数の被検試料を同時
に測定できる点では、９６穴マイクロプレート等が好ま
しい。

【０００８】本発明に於いては第２抗体として用いられ
る抗体を直接、酵素や放射性同位元素或いはＦＩＴＣ等
の蛍光物質で標識してもよい。或いは、かかる第２抗体
に対する抗体を標識したものを第３抗体として用いても
よい。或いは、第２抗体を、ビオチン等のマーカー化合
物で標識し、このマーカー化合物に特異的に結合する物
質（ビオチンの場合、ストレプトアビジンやアビジン）
を、酵素や螢光色素、放射性同位元素等で標識したもの
を結合させるという方法も用いられる。

【０００９】本発明に於いては最終的な検出手段は特に
限定せず、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７０
に共通な配列を認識する１組の２種類の抗体として、そ
れぞれ異なる抗原決定基を認識する２種類の抗アルツハ
イマー病アミロイド前駆体蛋白抗体を用いることが要件
であり、かかる組み合わせにより認識固定される後の検
出手段は如何なるものでも構わない。しかしながら、本
発明に用いることができる代表的検出法を例示すると、
第２抗体を酵素、放射性同位元素、蛍光物質或いは他の
結合物質で標識してものを用いる検出方法となる。

【００１０】酵素を用いる検出方法では、酵素としては
、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、ホースラ
ディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホ
スファターゼ（ＡＰ）等があり、それぞれの酵素に対応
する比色基質、或いは蛍光基質を加え、比色計、または
螢光光度計を用いて生成物を定量する。上記酵素に対す
る代表的基質としては、β−Ｇａｌの基質として、ｏ−
ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（比色基質）、
４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（
蛍光基質）等、ＨＲＰの基質として、ｏ−フェニレンジ
アミン（比色基質）等、ＡＰの基質として、ｐ−ニトロ
フェニルリン酸（比色基質）等を挙げることができる。 放射性同位元素を用いる検出方法としては、１２５　−
Ｉ等で標識された第２抗体を用い、γ−ウェルカウンタ
ー等を用いて放射活性を測定する。また、第２抗体をビ
オチン標識し、更にアビジンで標識した酵素と反応させ
、以下酵素を用いる検出の場合と同様の反応を行って、
検出することも可能である。また蛍光物質を用いる方法
では、蛍光物質として、フルオレッセインイソチオシア
ネート（ＦＩＴＣ）等を例示することができる。これら
は例示したものに限らず、免疫学的測定方法に使用され
ているものであれば、他のものでも使用できる。

【００１１】本発明で用いる抗体を使用して、ＲＩＡを
組むことも可能である。ＲＩＡの１つの方法として、Ａ
ＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７０又はその断片
を、放射性同位元素で標識して標識抗原とし、これと試
料中の抗原（非標識抗原）とが、本発明で用いる抗体を
不溶性担体に結合したものに、競争的に結合させ、標識
抗原の結合の度合いで、試料中の抗原量を測定する方法
が挙げられる。即ち、試料中の抗原量が多ければ、不溶
性担体に結合した標識抗原は少なくなり、有利の標識抗
原が多くなる。試料中の抗原量が少なければ、その逆と
なる。また、ＲＩＡの他の方法として、先述した様に、
本発明で用いる第２抗体を放射性同位元素で標識し、試
料中の抗原と結合した標識抗体量を測定する方法も挙げ
られる。

【００１２】次に本発明による、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ
７５１、ＡＰＰ７７０を含む、全てのアルツハイマー病
アミロイド前駆体蛋白の測定方法について具体的に説明
する。ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７０に共
通な配列を認識する抗体（第１抗体）を適当な不溶性担
体、例えば９６穴ポリスチレン製マイクロプレートに固
定化する（以下これを“固定化抗体”という）。固定用
バッファーとしては、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリ
ウムバッファー（ｐＨ９．６）、或いはリン酸緩衝塩類
溶液（以下ＰＢＳ（−）と略する）等が用いられる。固
定は、４℃で一晩放置するのが一般的であるが、例えば
、室温で二時間程度静置することも可能である。このよ
うにして第１抗体を固定したマイクロプレートをＰＢＳ
（−）等によって洗浄する。次いで不溶性担体と、測定
しようとする試薬又は被検試料との非特異的結合を避け
るために、適当な物質、例えば１〜３％ウシ血清アルブ
ミンやスキムミルク／ＰＢＳ（−）溶液で、不溶性担体
の表面を被覆する。被覆は、３７℃や室温で２時間程度
、静置又はプレートミキサー等で攪拌しながら行うのが
一般的である。被覆後、再びマイクロプレートをＰＢＳ
（−）等で洗浄する。このようにして得られた、第１抗
体が固定化された不溶性担体を被検試料と一定時間及び
一定温度で接触させ反応させる。反応は４℃で一晩プレ
ートミキサー等で攪拌しながら行うのが一般的であるが
、室温や３７℃で１〜２時間程度行うことも可能である
。この間に固定化抗体（第１抗体）と被検試料中のＡＰ
Ｐ又はその断片が結合する。

【００１３】次いでＰＢＳ（−）等で洗った後、適当な
標識物質、例えば、β−ガラクトシダーゼ、ホースラデ
ィッシュパーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ
等の酵素や、１２５　−Ｉ等の放射性同位元素で標識化
したＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、及びＡＰＰ７７０に
共通の配列を認識する抗体（第２抗体）の溶液を、不溶
性担体上の固定化抗体に結合したＡＰＰ又はその断片と
一定時間及び一定温度例えば、４℃で一晩、或いは室温
で１〜２時間接触させ第２抗体と反応させる。これを再
び、ＰＢＳ（−）等で洗い、次いで不溶性担体上に存在
する第２抗体に標識された標識物質の量を測定する。酵
素を用いる検出方法では、酵素としては、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、ホースラディッシュパー
オキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファターゼ（
ＡＰ）等があり、それぞれの酵素に対応する比色基質、
或いは蛍光基質を加え、比色計、または蛍光光度計を用
いて生成物を定量する。上記酵素に対する代表的基質と
しては、β−Ｇａｌの基質として、ｏ−ニトロフェニル
−β−Ｄ−ガラクトシド（比色基質）、４−メチルウン
ベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（蛍光基質）等、
ＨＲＰの基質として、ｏ−フェニレンジアミン（比色基
質）等、ＡＰの基質として、ｐ−ニトロフェニルリン酸
（比色基質）等を挙げることができる。放射性同位元素
を用いる検出方法としては、１２５　−Ｉ等で標識され
た第２抗体を用い、γ−ウェルカウンター等を用いて放
射活性を測定する。またアビジンのビオチンに対する高
親和性を利用して、第２抗体をビオチン標識し、更にア
ビジンやストレプトアビジンで標識した酵素とを反応さ
せ、以下酵素を用いる検出の場合と同様の反応を行って
、検出することも可能である。一方、被検試料の代わり
に種々の濃度の標準品、例えば組換えＤＮＡ法により産
生した、精製アルツハイマー病アミロイド前駆体蛋白又
はその断片、或いは標準となる髄液や血液、尿などを用
いて標準検量線を作製し、これと、被検試料の測定値を
対比させ、被検試料中の全アルツハイマー病アミロイド
前駆体蛋白の量を算出し、定量することができる。

【００１４】本発明に於ける測定試薬は、それぞれ異な
る抗原決定基を認識する２種類の抗全ＡＰＰ抗体の、一
方を不溶性担体に結合した第１抗体と他方の第２抗体と
により構成される。また、この試薬を能率よく、且つ簡
便に利用するために、これら抗体以外に種々の補助剤を
含めてキットを形成することができる。係る補助剤とし
ては、たとえば、検量線作製用標準品、試薬を溶解させ
るための溶解剤、不溶化担体を洗浄するために使用され
る洗浄剤、抗体の標識物質として酵素を使用した場合、
酵素活性を測定するための基質、その反応停止剤等の免
疫学的測定試薬のキットとして通常使用されるものが挙
げられる。

【００１５】

【実施例】以下に実施例により本発明を詳述するが、本
発明は該実施例によって限定されるものではない。

【００１６】

【実施例１】　　抗原、アッセイ用タンパク及び抗体の
作成 〔工程１〕　　ＡＰＰの調製 （ｉ）ＡＰＰ５９２の調製 ＡＰＰ６９５のＣ末端側１０３アミノ酸を欠失させた蛋
白である５９２アミノ酸（シグナルペプチドを含む）か
ら成るＡＰＰ５９２（図２）は、欧州特許公開番号０３
０４０１３号実施例１に記載の方法で得たヒト老人斑ア
ミロイド前駆体ＡＰＰ６９５ｃＤＮＡから出発して、上
述欧州特許公開番号０３０４０１３号実施例５に記載の
方法でサル腎臓由来のＣＯＳ−１細胞で産生させ培養上
清中へ分泌させ、精製した。以下詳述する。

【００１７】欧州特許公開番号０３０４０１３号実施例
５工程２記載のプラスミドｐＳＶＭＴ５９２をＣＯＳ−
１細胞に導入した。即ち、ｐＳＶＭＴ５９２　　２０μ
ｇを、１×１０６　個のＣＯＳ−１細胞に対し、ショ糖
含有ＰＢＳ（２７２ｍＭショ糖、７ｍＭリン酸ナトリウ
ム（ｐＨ７．４）１ｍＭＭｇＣｌ２　）中で、バイオラ
ッド社のジーンパルサーＴＭを用い、電圧４００Ｖ、キ
ャパシター８μＦ、１．０〜１．３ｍ秒で、３０秒の間
隔をおいて２回電気パルスを与えることにより導入を行
った。 導入後の細胞を、１０％ウシ胎児血清（以下ＦＣＳと略
す）を含むダルベッコの変法最小基本培地中で３７℃、
５％ＣＯ２　の条件下で２４時間培養後、ダルベッコの
リン酸緩衝塩類溶液（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋不含）（以下
ＰＢＳ（−）と略す）で洗浄し、ＦＣＳを除いた後、Ｆ
ＣＳを含まない培地に交換し、以後４８時間毎に培地を
交換し、計３回培養上清を回収した。更に導入を３０回
行い、計９００ｍｌの培養上清を得た。

【００１８】ついで、プラスミド導入ＣＯＳ−１細胞の
培養上清に対し終濃度２ｍＭになるようμｍ（ｐ−アミ
ジノフェニル）メタンスルホニルフルオリド塩酸塩（和
光純薬工業株式会社）を添加し、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ
ＴＭ３０（アミコン社）を用いて濃縮を行いさらに同装
置中で２０ｍＭＴｒｉｓ−塩酸（ｐＨ８．０）にバッフ
ァー交換を行った。次に、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅカラム（ファルマシア社）を用い、上記試料をアプラ
イし、２０ｍＭＴｒｉｓ−塩酸（ｐＨ８．０）、ＮａＣ
ｌ勾配０−１Ｍの条件でカラムクロマトグラフィーを行
った。クロマトグラフィーの各画分について、後述する
ように本発明参考例２において大腸菌で発現させたＡＰ
Ｐ１９−３７９　（ＺＫＸ）に対して作成したウサギ抗
ＡＰＰ１９−３７９　抗血清を用いた固相ＥＬＩＳＡを
行い、ＡＰＰ溶出位置を固定した。（ＺＫＸは、ＡＰＰ
７７０中のＮ末端から１９番目のアミノ酸残基から３７
９番目のアミノ残基までを含むポリペプチドとβ−ガラ
クトシダーゼとの融合タンパクであり、大腸菌中に発現
させ、６Ｍ尿素による可溶化を行い精製した。（精製法
は参考例２に詳述した。）ＺＫＸは、ＡＰＰ７７０、Ａ
ＰＰ７５１、ＡＰＰ６９５に共通な配列のほかに、プロ
テアーゼインヒビター部分及びＡＰＰ７７０に特異的な
配列を含むが、ＡＰＰの膜貫通領域からｃ末端までの配
列は含まない）。ＡＰＰ５９２は、０．３−０．４ＭＮ
ａＣｌで溶出された。ＥＬＩＳＡ陽性画分をセントリコ
ンＴＭ３０（アミコン社）を用いて濃縮し、さらに同装
置中で５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）にバッ
ファー交換した。

【００１９】次に、ヘパリンカラムを用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーを行った。即ち、ＤＥＡＥ−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ファルマシア社）による部分
精製画分をヘパリン−５ＰＷカラム（東ソー株式会社）
にアプライし、ＮａＣｌ勾配０−２Ｍの条件でクロマト
グラフィーを行った。クロマトグラフィーの各画分につ
いて同様にウサギ抗ＡＰＰ１９−３７９　（ＺＫＸ）抗
血清を用いた固相ＥＬＩＳＡを行い、ＡＰＰ５９２溶出
位置を同定した。ＡＰＰ５９２は１．０−１．２ＭＮａ
Ｃｌで溶出した。ＥＬＩＳＡ陽性画分をセントリコンＴ
Ｍ３０（アミコン社）を用いて濃縮後、２０ｍＭＴｒｉ
ｓ−塩酸（ｐＨ８．０）にバッファー交換した。これら
を７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、Ｃｏｏｍａｓｓｉ
ｅ染色を行い、純度及び分子量の確認を行った。ｐＳＶ
ＭＴ５９２を導入したＣＯＳ−１細胞培養上清から、上
記操作を行うことにより得られたタンパクは、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ上でややブロードな単一バンドであり、見かけ
の分子量は９４．５ｋＤａと決定された。更に、この蛋
白のＮ末端のアミノ酸配列を、アブライド社気相シーケ
ンサーで解析したところ、ＡＰＰ６９５のうちシグナル
ペプチド（Ｎ末端から１７アミノ酸）が除去された、Ａ
ＰＰ６９５のＮ末端から１８番目のＬｅｕから３３番目
のＧｌｎまでのアミノ酸配列（ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７
７０にも共通）が確認された。こうして、精製ＡＰＰ５
９２が得られた。 （ｉｉ）　　ＡＰＰ６４８及びＡＰＰ６６７の調製ＡＰ
Ｐ７５１、ＡＰＰ７７０各々のＣ末端側１０３アミノ酸
を欠失させた蛋白である、６４８アミノ酸（シグナルペ
プチドを含む）から成るＡＰＰ６４８（図２）、及び、
６６７アミノ酸（シグナルペプチドを含む）から成るＡ
ＰＰ６６７（図２）は、欧州特許公開番号０３０４０１
３号実施例５工程２記載のプラスミドｐＳＶＭＴ６６７
、およびｐＳＶＭＴ６４８を、本実施例工程１（ｉ）と
同様にして、ＣＯＳ−１細胞への導入、培養上清の回収
、精製を行った。精製に際しては、クロマトグラフィー
の各フラクションの確認に、ウサギ抗ＡＰＰ１９−５７
９　抗血清の他に、ＡＰＰ６６７については、特開平２
−１３８９９５号公報の実施例９で得たモノクローナル
抗体ＡＤＪ５−３−７（微工研菌寄第１０３８８号）も
用いた。さらに、ＡＰＰ６６７及びＡＰＰ６４８につい
ては、そのトリプシン阻害活性も確認手段の一つとし、
この両者共強い阻害活性を示すことを確認した。 （阻害活性測定は、欧州特許公開番号０３０４０１３号
実施例に記載のｓＰＩのトリプシン阻害活性測定方法に
準じて行った）。精製したＡＰＰ６４８、ＡＰＰ６６７
の分子量は、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで、それぞ
れ１００、５ｋＤａ、１０５．５ｋＤａであった。 〔工程２〕　　抗ＡＰＰ抗体の作製 〔工程２−１〕　　抗ＡＰＰモノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマ３Ｂ２及び６Ａ３の作製 （ｉ）　　マウスの感作 ハイブリドーマ作成のための抗原は、以下のようにして
調製した。本実施例工程１（ｉ）で得た精製ＡＰＰ５９
２をＰＢＳ（−）に溶かし、ＬａｅｍｍｌｉのＳＤＳ−
ＰＡＧＥサンプルバッファー（Ｌａｅｍｍｌｉ　　Ｕ．
Ｋ．Ｎａｔｕｒｅ２２７　　６８０−６８５（１９７０
））中で１００℃、３分間煮沸後、４倍容のアセトンを
加え、−２０℃で１時間冷却を行い、９０００回転２０
分間の遠心操作を行った。こうして過剰量のＳＤＳを除
去し、沈査よりＳＤＳ変性ＡＰＰ５９２を回収し、これ
をハイブリドーマ作成のための抗原として用いた。免疫
は２０μｇのＳＤＳ変性ＡＰＰ５９２を５００μｌのＰ
ＢＳ（−）に溶かしたものをそれぞれ３匹の６週齢のＢ
ａｌｂ／ｃ雌マウスの皮下にフロイントの完全アジュバ
ントと共に注射し、以後２週間の間隔で合計３回の免疫
を行った。さらに、１週間の間隔で２回皮下注射を行っ
た。

【００２０】免疫の過程で抗原に対する血清の抗体価の
上昇を単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエン
ティフィク　　富山朔二著）に従って、固相ＥＬＩＳＡ
法により確認した。 （ｉｉ）　　細胞融合 単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフ
ィク　　富山朔二著）に従って細胞融合を行った。即ち
、血清の抗体価の最も高かったマウスに２００μｌのＰ
ＢＳ（−）に溶かした２５μｇのＳＤＳ変性ＡＰＰ５９
２を尾静脈より注射し、ブーストした。その３日後に、
脾細胞を無菌的に取り出し、ステンレスメッシュで単細
胞にほぐし、脾細胞の１／５量の８−アザグアニン耐性
骨髄細胞腫株Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３細胞（株式会
社　　免疫生物研究所より入手）と、ＭｅｄｉａＩ培地
（株式会社　　免疫生物研究所）を混合し、遠沈後、細
胞のペレットに５０％ＰＥＧ１５００（ベーリンガー社
製）を加え、融合操作を行った。

【００２１】その後、融合細胞を遠心して上清を吸引除
去した後、３０％ＦＣＳ入りＨＡＴ培地を加え、９６穴
マイクロプレート１１枚にまいた。融合後、約２週間で
約９５０ウェルからコロニーが生育し、これらの培養上
清についてＳＤＳ変性ＡＰＰ５９２をスクリーニング用
抗原とした固相ＥＬＩＳＡを行い、抗原と強く反応する
クローンを得、限界希釈法によるクローニングを３回繰
り返した。３回のクローニングにより安定した抗体産生
を示す２つのクローンを３Ｂ２及び６Ａ３と各々命名し
、これを平成３年１月１０日付けで微生物工業技術研究
所に寄託した。（３Ｂ２の受託番号は、微工研菌寄第１
１９４３号、および、６Ａ３のそれは微工研菌寄第１１
９４４号）。これらのハイブリドーマが産生するモノク
ローナル抗体３Ｂ２及び６Ａ３の反応性を本実施例工程
１（ｉ）及び（ｉｉ）で作成した、ＡＰＰ６６７、ＡＰ
Ｐ６４８、ＡＰＰ５９２に対して検討したところ、後述
するように、ＳＤＳ変性、非変性何れの条件でもこれら
３種のＡＰＰ誘導体と強く反応した。即ち、これらのモ
ノクローナル抗体は、ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１、Ａ
ＰＰ６９５の何れをも認識できることがわかった。 〔工程２−２〕　　抗ＡＰＰモノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマ１Ｂ２の作製 （ｉ）マウスの感作 後述本発明参考例２で得たＺＫＸを、上述の実施例１工
程２−１（ｉ）記載の方法で変性させた。このＳＤＳ変
性ＺＫＸ　　２０μｇを５００μｌのＰＢＳ（−）に溶
かしたものをそれぞれ４匹の６週齢のＢａｌｂ／ｃ雌マ
ウスの皮下にフロイントの完全アジュバントと共に注射
し、２週間後に同様の免疫を行った。さらに、２週間の
間隔で、ＳＤＳ変性ＺＫＸの免疫を、フロイントの不完
全アジュバントを用いて６回行った。その２週間ののち
ＳＤＳ変性ＺＫＸ　　２０μｇを静注した。約１カ月後
、今度は２０μｇのＳＤＳ変性ＡＰＰ５９２をフロイン
トの完全アジュバントと共に皮下に注射し、さらに、１
週間後同様にしてＡＰＰ５９２による免疫を行った。

【００２２】免疫の過程で抗原に対する血清の抗体価の
上昇を本実施例工程２−１と同様にして、固相ＥＬＩＳ
Ａ法により確認した。 （ｉｉ）　　細胞融合 血清の抗体価の最も高かったマウスに２００μｌのＰＢ
Ｓ（−）に溶かした２５μｇのＳＤＳ変性ＡＰＰ５９２
を尾静脈より注射し、ブーストとした。これ以降の操作
は、本実施例工程２−１（ｉｉ）と同様に行い、ＡＰＰ
５９２と強く反応するクローンを得、限界希釈法による
クローニングを３回繰り返した。３回のクローニングに
より安定した抗体産生を示すクローンを１Ｂ２と命名し
、これを平成３年１月１０日付けで微生物工業技術研究
所に寄託した（微工研菌寄第１１９４２号）。このハイ
ブリドーマが産生するモノクローナル抗体１Ｂ２の反応
性を本実施例工程１（ｉ）及び（ｉｉ）で作成した、Ａ
ＰＰ６６７、ＡＰＰ６４８、ＡＰＰ５９２に対して検討
したところ、後述するように、ＳＤＳ変性、非変性何れ
の条件でもこれら３種のＡＰＰ誘導体と強く反応した。

【００２３】即ち、モノクローナル抗体１Ｂ２は、ＡＰ
Ｐ７７０、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ６９５の何れをも認識
できることがわかった。 〔工程３〕　　モノクローナル抗体の特徴づけ（ｉ）免
疫グロブリンのクラス及びサブクラスの決定モノクロー
ナル抗体１Ｂ２、３Ｂ２、６Ａ３の免疫グロブリンのク
ラス及びサブクラスアイソタイピングキット（アマーシ
ャム社）を使用して決定した。その結果、１Ｂ２につい
てはＩｇＧ２ｂ、Ｌ鎖はκ、３Ｂ２についてはＩｇＧ２
ｂ、Ｌ鎖はκ、６Ａ３についてはＩｇＧ２ａ、Ｌ鎖はκ
、と決定された。 （ｉｉ）　　特異性の決定 上記モノクローナル抗体の特異性を以下に示す試験によ
り決定した。

【００２４】各種ＡＰＰ（ＡＰＰ６６７、ＡＰＰ６４８
、ＡＰＰ５９２）を用い、非変性及びＳＤＳ−変性処理
を行い、通常の固相ＥＬＩＳＡ法を用いて判定を行った
。一次抗体として上記モノクローナル抗体を、２μｇ／
ｍｌのＩｇＧ濃度で加え、二次抗体はβ−ガラクトシダ
ーゼ標識ヒツジＦ（ａｂ′）２　抗マウスＩｇ（アマー
シャム社）を用い、基質は４−メチルワンベリフェリル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを用い、３０分間酵素反
応を行った後、蛍光リーダーＦＣＡ（ＰＡＮＤＥＸ社）
を用いて蛍光強度を測定した。その結果を表１に示す。

【００２５】本発明によるモノクローナル抗体、１Ｂ２
、３Ｂ２、６Ａ３は、いずれも、３種のＡＰＰ（ＡＰＰ
６６７、ＡＰＰ６４８及びＡＰＰ５９２）のすべてを、
強く認識した。ネガティブコントロールとして、ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）との反応性も検討したが、これ
ら３つのモノクローナル抗体はＢＳＡとは全く反応しな
かった。 〔工程４〕　　腹水化モノクローナル抗体からのＩｇＧ
の精製 大量のモノクローナル抗体を得るため工程２で得た１Ｂ
２、３Ｂ２、６Ａ３の各ハイブリドーマ１×１０７　個
を、ＭｅｄｉａＩ培地（株式会社　　免疫生物研究所）
０．５ｍｌに浮遊させ、予め１週間前に腹腔内に０．５
ｍｌのプリスタン（アルドリッチ社）投与しておいたＢ
ａｌｂ／ｃマウスの腹腔に注射した。約２週間で腹部の
肥大が認められ、腹腔切開により腹水を採取した。各ハ
イブリドーマにつき７匹のマウスを処理し、各々約１０
ｍｌずつの腹水を得た。得られた各ハイブリドーマ由来
腹水５ｍｌずつを、アフィプレップＴＭプロテインＡカ
ートリッジ（バイオラッド社）を用いて精製を行った。 精製はバイオラッド社発行の添付ブロトコールに従った
。 １Ｂ２クローンから７．９ｍｇ、３Ｂ２クローンから４
．８ｍｇ、６Ａ３クローンか３．３ｍｇの精製ＩｇＧが
得られた。 〔工程５〕　　抗ＡＰＰ５９２抗血清の作製、及び抗Ａ
ＰＰ５９２ＩｇＧの精製 （ｉ）抗ＡＰＰ５９２抗血清の作製 本実施例工程１（ｉ）と同様の方法で得られたＡＰＰ５
９２を免疫して抗血清を得た。即ち、上述の工程２記載
の方法でＳＤＳ変性ＡＰＰ５９２を作成し、２００μｇ
のＳＤＳ変性ＡＰＰ５９２を１ｍｌのＰＢＳ（−）に溶
かしたものを、日本白色ウサギの背中の皮下にフロイン
ト完全アジュバントと共に注射し、以後２週間の間隔で
フロイントの不完全アジュバントと共に合計６回の免疫
を行った。血清中の抗体価は、非変性及びＳＤＳ変性の
ＡＰＰ５９２（２５ｎｇ／ウェル）を抗原とする固相Ｅ
ＬＩＳＡによって行った。最終的に得られた抗血清の力
価は、対照（抗原無しのウェル）の２倍以上の発色を示
す抗血清の希釈度で示すと、非変性ＡＰＰ５９２に対し
て３２０００倍、ＳＤＳ変性ＡＰＰ５９２に対して６４
０００倍であり、ＡＰＰ６６７、ＡＰＰ６４８に対して
もほぼ同等の力価を示した。即ち、この抗ＡＰＰ５９２
抗血清は、ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ６９５
をすべて同程度に認識できることがわかった。 （ｉｉ）　　抗ＡＰＰ５９２ＩｇＧの精製本実施例工程
５（ｉ）で得た抗ＡＰＰ５９２抗血清２０ｍｌを５６℃
にて３０分インキュベートして非働化させた後、等量の
ＰＢＳ（−）を加えて希釈し、４℃で１００％飽和硫安
溶液（予め０．１Ｎアンモニア溶液にてｐＨ６．５に調
整したもの）を最終濃度３３％飽和になる様攪拌しなが
ら徐々に加えた。加え終わってから更に１２時間攪拌を
続けた後、３０００×ｇで３０分間冷却遠心した。得ら
れた沈澱を５０％飽和硫安溶液に懸濁し、再び冷却遠心
して沈澱を得た。沈澱を１０ｍｌの１０ｍＭリン酸ナト
リウムバッファー（ｐＨ８．０）に溶解し、透析チュー
ブにつめて５Ｌの同バッファーに対して３回透析を行っ
た。得られる透析試料を、予め１０ｍＭリン酸ナトリウ
ムバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化させたＤＥＡＥ−
セルロースカラム（ＤＥ５２、ワットマン社）にアプラ
イし、同バッファーで溶出させた。素通り画分を集め、
セントリブレップＴＭ３０（アミコン社）で濃縮し、１
１．７ｍｇの部分精製抗ＡＰＰ５９２を得た。部分精製
抗体をアフィプレップＴＭプロテインＡカートリッジ（
バイオラッド社）を用い、バイオラッド社発行添付プロ
トコールに従って、更に精製を行い、精製抗ＡＰＰ５９
２ＩｇＧ１５．７ｍｇを得た。 〔工程６〕　　抗体のビオチン化 本実施例工程４及び工程５で得た１Ｂ２、３Ｂ２及び６
Ａ３精製モノクローナル抗体及び抗ＡＰＰ５９２抗体各
２ｍｇを用い、免疫実験操作法（第９巻、３５３９−３
５４９　　１９８２　　日本免疫学会編）に従って抗体
のピオチン化を行った。予め０．１ＭＮａＨＣＯ３　溶
液に対して透析、バッファー交換を行い、濃度を１ｍｇ
／ｍｌに調整しておいた精製１Ｂ２、３Ｂ２、６Ａ３、
及び抗ＡＰＰ５９２抗体に、１ｍｇ／ｍｌの濃度に調整
したＮＨＳ−ピオチン（Ｎ−ヒドロキシサクシニミド−
ビオチン、ピアス社）のジメチルスルホキシド溶液２８
０μｌを加え、室温で４時間静かに攪拌した。次に、４
℃で３ＬのＰＢＳ（−）に対して４回の透析を行い、ビ
オチン標識１Ｂ２、３Ｂ２、６Ａ３及び抗ＡＰＰ５９２
抗体を得た。

【００２６】

【実施例２】　　抗ＡＰＰ５９２抗体と抗ＡＰＰ５９２
の組み合わせによる２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ実施
例１の工程５（ｉ）で得た精製抗ＡＰＰ５９２抗体を５
μｇ／ｍｌの濃度で０．１Ｍ炭酸ナトリウム−炭酸水素
ナトリウムバッファー（ｐＨ９．６）に溶解し、９６穴
マイクロプレートに１ウェルあたり５０μｌずつ加え、
室温で２時間静置した。プレートをＰＢＳ（−）で３回
洗浄の後、１％ウシ血清アルブミン（シグマ社）を含む
ＰＢＳ（−）を加え、３７℃で２時間被覆した。次に、
０．１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（−）中で希
釈した精製ＡＰＰ６６７標準液（２〜２０００ｎｇ／ｍ
ｌ）を加え、攪拌しながら室温で１時間処理を行った。 次に、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（−
）でプレートを３回洗浄した後、実施例１の工程６で得
たビオチン標識した精製抗ＡＰＰ５９２　　ＩｇＧを１
μｇ／ｍｌの濃度で５０μｌずつ各ウェルに加え、攪拌
しながら室温で１時間反応を行った。０．０５％のＴｗ
ｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、β
−ガラクトシダーゼ標識アビジンＤ（ベクター社）を加
え、更に攪拌しながら室温で１時間反応させた。０．０
５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（−）で５回洗浄
の後、２ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　を含むＰＢＳ（−）中に
溶かした４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド（１ｍｇ／ｍｌ）を加え、室温で３０分反
応させた後、ＦＣＡ（ＰＡＮＤＥＸ社）で蛍光強度を測
定した。結果は図３に示す様に検出限界が約０．３ｎｇ
／ウェルであった。

【００２７】

【実施例３】　　１Ｂ２モノクローナル抗体と抗ＡＰＰ
５９２抗体の組み合わせによる２抗体サンドイッチＥＬ
ＩＳＡ 実施例２と同様の方法を用いて１Ｂ２モノクローナル抗
体と抗ＡＰＰ５９２抗体の組み合わせによる２抗体サン
ドイッチＥＬＩＳＡの検討を行った。結果は図４に示す
様に検出限界が約５ｎｇ／ウェルであった。

【００２８】

【実施例４】　　３Ｂ２モノクローナル抗体と抗ＡＰＰ
５９２抗体の組み合わせによる２抗体サンドイッチＥＬ
ＩＳＡ 実施例２と同様の方法を用いて３Ｂ２モノクローナル抗
体と抗ＡＰＰ５９２抗体の組み合わせによる２抗体サン
ドイッチＥＬＩＳＡの検討を行った。結果は図５に示す
様に検出限界が約５ｎｇ／ウェルであった。

【００２９】

【実施例５】　　６Ｂ３モノクローナル抗体と抗ＡＰＰ
５９２抗体の組み合わせによる２抗体サンドイッチＥＬ
ＩＳＡ 実施例２と同様の方法を用いて６Ｂ３モノクローナル抗
体と抗ＡＰＰ５９２抗体の組み合わせによる２抗体サン
ドイッチＥＬＩＳＡの検討を行った。

【００３０】結果は図６に示す様に検出限界が約３ｎｇ
／ウェルであった。

【００３１】

【参考例１】　　抗ＡＰＰ５９２抗体を用いたＲＩＡ（
ラジオイムノアッセイ）法によるＡＰＰ６６７の検出（
ｉ）バッファー １５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、０．１％ゼラチン（バイオラ
ッド社）及び０．０２％ＮａＮ３　を含む５０ｍＭリン
酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）を調製し、バッ
ファーＡとした。

【００３２】（ｉｉ）　　１２５Ｉ−ＡＰＰ６６７の調
製実施例１工程１（ｉｉ）で得た精製ＡＰＰ６６７をボ
ルトン−ハンター法（Ｂｏｌｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｊ．１３３、５２９−５３９、１９７３）によって　
１２５Ｉ標識し、　１２５Ｉ−ＡＰＰ６６７を得た。 （ｉｉｉ）　ＡＰＰ６６７標準液の調製実施例１工程１
（ｉｉ）で得た精製ＡＰＰ６６７を２０ｍＭ　　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、バッファーＡで希
釈し、種々の濃度のＡＰＰ６６７標準液を作成した。 （ｉｖ）　　ＡＰＰ６６７のＲＩＡ ＡＰＰ６６７標準液１００μｌをバッファーＡで１μｇ
／ｍｌの濃度に調製した精製抗ＡＰＰ５９２抗体（実施
例１工程５（ｉ））溶液２００μｌ、　１２５Ｉ−標識
ＡＰＰ６６７のバッファーＡ溶液１００μｌ（１０００
０ｃｐｍ）、及びバッファーＡ２００μｌを加えて混和
後、４℃、１８時間インキュベートした。デキストラン
−炭素液（デキストランＴ−７０（フナコシ薬品株式会
社）、０．００２５％溶液と活性炭Ｎｏｒｉｔ　　Ａ（
シグマ社）０．２５％液で等量混合した液）２００μｌ
を添加して、４℃で１８時間静置後、２，５００×ｇで
２０分間遠心分離し、上清の放射能をガンマウェルカウ
ンターにて測定した。測定限界は約１０ｎｇ／アッセイ
であった。

【００３３】

【実施例６】　　全ＡＰＰ検出用キットの作製第１抗体
として抗ＡＰＰ５９２抗体、第２抗体としてビオチン標
識−抗ＡＰＰ５９２抗体、標準ＡＰＰとして精製ＡＰＰ
６６７、標識検出試薬としてβ−ガラクトシダーゼ標識
−ストレプトアビジン、４−メチルウンベリフェリル−
β−Ｄ−ガラクトビラノシド、基質溶解剤としてジメチ
ルスルホキシド、バッファーとしてＰＢＳ（−）、洗浄
剤としてＴｗｅｅｎ−２０、酵素反応用バッファーとし
て１ｍＭＭｇＣｌ２　含有ＰＢＳ（−）、被覆剤として
ウシ血清アルブミンを用い、全ＡＰＰ検出キットを作製
した（表２）。このキットを用いて全ＡＰＰの検出を行
った。

【００３４】粉末ＰＢＳ（−）（日水製薬株式会社）９
．６ｇを精製水に溶解し、１１のＰＢＳ（−）溶液とし
た。洗浄剤としてＴｗｅｅｎ−２０を用いて０．０５％
Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（−）溶液を調製し
た。被覆剤としてウシ血清アルブミン１ｇを１００ｍｌ
のＰＢＳ（−）に溶解し、１％ウシ血清アルブミン溶液
とした。

【００３５】第１抗体は抗ＡＰＰ５９２抗体１ｍｇを１
ｍｌのＰＢＳ（−）に溶解したものを２００倍濃縮液と
して調製した。第２抗体はビオチン標識−抗体ＡＰＰ５
９２抗体１ｍｇを１ｍｌのＰＢＳ（−）に溶解したもの
を１０００倍濃縮液として調製した。β−ガラクトシダ
ーゼ標識−ストレプトアビジン１ｍｇを１ｍｌのＰＢＳ
（−）に溶解したものを１０００倍濃縮液として調製し
た。

【００３６】β−ガラクトシダーゼの基質として４−メ
チルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド１
０ｍｇを１００μｌのジメチルスルホキシドに溶解した
ものを５００倍濃縮液として用時調製した。標準ＡＰＰ
（精製ＡＰＰ６６７　　１０μｇ及び１０ｍｇのウシ血
清アルブミンを含むＰＢＳ（−）溶液１ｍｌの凍結乾燥
品）は１ｍｌの精製水に溶解した。

【００３７】各調製した試薬で、実施例２に準じて全Ａ
ＰＰの検出を実施し、同様の結果を得た。

【００３８】

【実施例７】　　本キットを用いたヒト髄液中の全ＡＰ
Ｐの定量 ２名のアルツハイマー病患者から得られた髄液を検体と
して、本発明実施例６記載のキットを用いて、髄液中の
全ＡＰＰを定量した。方法は実施例２に準じた。結果は
、８８２ｎｇ／ｍｌ及び１０２１ｎｇ／ｍｌであった。

【００３９】

【参考例２】　　免疫用抗原ＺＫＸタンパク及び抗ＺＫ
Ｘ抗体の作成 ［工程１］　　免疫用抗原ＺＫＸの調製まず、βーガラ
クトシダーゼの一部分と、ＡＰＰ７７０のＮ末端から数
えて１９番目残基から３７９番目残基までの断片との融
合蛋白であるＺＫＸの産生について述べる。

【００４０】［工程１−１］発現プラスミド　　ｐＥＸ
−ＺＫＸの構築 発現用ベクターｐＥＸ２（ベーリンガー・マンハイム山
之内社）を　制限酵素Ｂｓｕ３６Ｉ（ＭｓｔＩＩ）及び
ＳａｌＩで切断し、直鎖状ベクターＤＮＡ断片を得た。 一方、欧州特許出願８８１１３２８３．１号（公開番号
０３０４０１３号、対応の日本出願は特願昭６３−２０
１９９８号）の実施例１に記載のプラスミドｐＧＢＰ２
（ＡＴＣＣ−６７５０２）をＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで切
断し、アガロースゲル電気泳動によりＡＰＰ７７０のＮ
末端側約３６０残基をコードするＤＮＡ断片を、フナコ
シ社製ジーン・クリーン・キットを用いて単離した。さ
らに配列表記載の６つの合成リンカー、１、２，３，４
、５、６（これらのリンカーをアニールさせると図７に
示したようにＭｓｔＩＩ切断末端とＫｐｎＩ切断末端を
有し、ｐＥＸ２のＭｓｔＩＩサイトに結合してもフレー
ムはずれずに連続するアミノ酸をコードする）をアプラ
イドバイオシステムズ社ＤＮＡ合成機３８０Ａを用いて
合成し、さきに得られた２つのＤＮＡ断片とともにＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて連結せしめた。図７にこの概要
を示す。

【００４１】該反応物を、マニアティスらの実験書に記
載されている方法に従って調製した大腸菌ＰＯＰ２１３
６株（ベーリンガー・マンハイム山之内社）コンピテン
トセルに加え、形質転換せしめた。アンピシリン耐性形
質転換コロニー６個を選び、各プラスミドを抽出し、Ｂ
ａｍＨＩで切断し解析したところ、すべて目的とするプ
ラスミドを有していた。得られたプラスミドをｐＥＸ−
ＺＫＸと命名した。本プラスミドは、ラムダ・ファージ
由来のＰＲ　プロモーターの制御により、βガラクトシ
ダーゼのＮ末端約１５０アミノ酸とＡＰＰ７７０のＮ末
端から数えて１９番目残基から３７９番目残基までの配
列を含む融合タンパクＺＫＸを発現しうる。ＺＫＸは、
ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ６９５に共通な配
列の一部のほかに、プロテアーゼインヒビター部分及び
ＡＰＰＰ７７０特異的な配列を含むが、ＡＰＰの膜貫通
領域からＣ末端までの配列は含まない。

【００４２】［工程１−２］　　融合タンパクの生産参
考例２工程１−１で得たプラスミドｐＥＸ−ＺＫＸを保
持する大腸菌ＰＯＰ２１３６／ｐＥＸ−ＺＫＸを、５０
μｇ／ｍｌのアンピシリン含有Ｌ培地で、３０℃一晩培
養せしめた。本培養液１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌアンピ
シリン含有Ｌ培地５０ｍｌに添加し、３０℃にて３時間
培養した後、４２℃の恒温培養槽に移し、さらに３時間
培養した。４２℃において、ラムダ・ファージＰＲ　プ
ロモーターのリプレッサーは不活化され、ＰＲ　プロモ
ーターが作動することによって、目的とする融合タンパ
クが生産される。

【００４３】該培養液を遠心分離し菌体を集め、菌体の
一部を、レムリーの方法［Ｌａｅｍｍｌｉ　　Ｕ．Ｋ．
、Ｎａｔｕｒｅ　　２２７　　６８０−６８５　　（１
９７０）］に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッフ
ァー中で煮沸後、１０％ポリアクリルアミドゲルを用い
てＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。 泳動後、ゲルをクマシー染色した結果、分子量約５８ｋ
Ｄａの目的とする融合タンパクが存在することが確認さ
れた。以下、この部分βガラクトシダーゼ・部分ＡＰＰ
７７０融合タンパクをＺＫＸと略す。 ［工程１−３］ＺＫＸの部分精製 参考例２工程１−２と同様にして、大腸菌ＰＯＰ２１３
６／ｐＥＸ−ＺＫＸを培養し、２００ｍｌの培養液から
菌体を回収した。該培養菌体を、４０ｍｌの４Ｍ尿素を
含む２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）バッファーに懸
濁し、菌体を超音波破壊した。菌体破壊物を遠心分離（
１００００×ｇ、１０分間）し、沈澱物を回収した。 次いでこの沈澱物を２０ｍｌの８Ｍ尿素を含む２０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．０）バッファーに再懸濁し、超音
波処理により沈澱を分散せしめた。遠心分離（１０００
０×ｇ、１０分間）後上清を回収した。以上の操作によ
り、４Ｍ尿素で可溶な大腸菌タンパク、および８Ｍ尿素
に不溶な大腸菌タンパクが除去され、ＺＫＸの部分精製
液が得られた。この部分精製液の一部をＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法で解析したところ、全タン
パク質のうち５０％以上が目的融合タンパクＺＫＸであ
った。ＺＫＸのトリプシン阻害活性を、欧州特許公開番
号０３０４０１３号実施例に記載のｓＰＩのトリプシン
阻害活性測定方法に準じて測定したところ強い阻害活性
を示した。

【００４４】

【表１】

【００４５】

【表２】

【００４６】

【発明の効果】本発明の測定方法、試薬及びキットを用
いることにより、アルツハイマー病アミロイド前駆体蛋
白及びその断片が簡便に且つ、高感度に検出、定量する
ことが可能となり、アルツハイマー病の診断方法、試薬
及び診断キットとして有用である。また、アルツハイマ
ー病アミロイド前駆体蛋白を用いる研究の場に於ける研
究試薬としても有用である。

【００４７】

【配列表】

【００４８】 配列番号：１ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：リンカー１ 配列 ＴＧＡＧＧＣＣＧＡＴ　ＡＣＴＧＣＴＧＴＣＧ　ＴＣＣ
ＣＣＴＣＡＡＡ　ＣＴＧＧＣＡＧＡＴ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　３９

【００４９
】 配列番号：２ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：リンカー２ 配列 ＧＣＡＣＧＧＴＴＡＣ　ＧＡＴＧＣＧＣＣＣＡ　ＴＧＴ
ＡＣＡＣＣＡＡ　ＣＧＴＡＡＣＣＴＡＴ　ＣＣ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　４２

【００５０
】 配列番号：３ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：リンカー３ 配列 ＣＡＴＴＡＣＧＧＴＣ　ＡＡＴＣＣＧＣＣＧＴ　ＴＴＧ
ＴＴＣＣＣＡＣ　ＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧ　ＡＧＣＴＣＧ
ＧＴＡＣ　　　　　　　　　　　　　　５０

【００５１
】 配列番号：４ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：リンカー４ 配列 ＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧ　ＧＡＴＣＣＣＧＴＧＧ　ＧＡＡ
ＣＡＡＡＣＧＧ　ＣＧＧＡＴＴＧＡＣＣ　ＧＴ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　４２

【００５２
】 配列番号：５ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：リンカー５ 配列 ＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧ　ＧＴＴＡＣＧＴＴＧＧ　ＴＧＴ
ＡＣＡＴＧＧＧ　ＣＧＣＡＴＣＧＴＡＡ　ＣＣ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　４２

【００５３
】 配列番号：６ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：リンカー６ 配列 ＧＴＧＣＡＴＣＴＧＣ　ＣＡＧＴＴＴＧＡＧＧ　ＧＧＡ
ＣＧＡＣＧＡＣ　ＡＧＴＡＴＣＧＧＣＣ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０

【図面の簡単な説明】

【図１】アルツハイマー病アミロイド前駆体蛋白ＡＰＰ
６９５、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７１４、
ＡＰＰ５６３の模式図であ。ｂからｆの黒く塗りつぶし
た部分はプロテアーゼインヒビター活性を有する５６ア
ミノ酸から成る領域、点々部分はＡＰＰ７７０に固有の
１９アミノ酸から成る領域、斜線部は脳に沈着する老人
斑アミロイド部分を示す。ａはＡＰＰのうち脳に沈着す
るアミロイドβ蛋白部分（影をつけた部分）との膜貫通
領域を示す。ＡＰＰ５６３はβ蛋白部分をもたない。

【図２】分泌型ＡＰＰ（ＡＰＰ６６７、ＡＰＰ６４８、
ＡＰＰ５９２）の構造を示す模式図である。図中の数字
は各ＡＰＰのＮ末端から数えたアミノ酸残基の番号を示
す。

【図３】抗ＡＰＰ５９２抗体と抗ＡＰＰ５９２抗体の組
み合わせによる２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ

【図４】
１Ｂ２モノクローナル抗体と抗ＡＰＰ５９２抗体の組み
合わせによる２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ

【図５】３
Ｂ２モノクローナル抗体と抗ＡＰＰ５９２抗体の組み合
わせによる２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ

【図６】６Ｂ
３モノクローナル抗体と抗ＡＰＰ５９２抗体の組み合わ
せによる２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ

【図７】β−ガ
ラクトシダーゼの一部分とＡＰＰ７７０の部分タンパク
との融合タンパクであるＺＫＸの発現プラスミド作成の
模式図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　アルツハイマー病アミロイド前駆体蛋
   白ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、及びＡＰＰ７７０に共
   通な配列を少なくともその一部に含むポリペプチド上の
   、異なる抗原決定基を認識する２種類の抗体の、一方を
   不溶性担体に結合して第１抗体とし、他方を第２抗体と
   して用いることを特徴とする２抗体サンドイッチＥＬＩ
   ＳＡ法によるＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、及びＡＰＰ
   ７７０を含むアルツハイマー病アミロイド前駆体蛋白又
   はその断片の免疫学的測定方法。
2. 【請求項２】　　アルツハイマー病アミロイド前駆体蛋
   白ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、及びＡＰＰ７７０に共
   通な配列を少なくともその一部に含むポリペプチド上の
   、異なる抗原決定基を認識する２種類の抗体のうち、一
   方を不溶性担体に結合した第１次試薬と、もう一方の抗
   体である第２次試薬とから成るアルツハイマー病アミロ
   イド前駆体蛋白又はその断片の測定試薬。
3. 【請求項３】　　請求項２記載の測定試薬を構成要素の
   一部とするＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、及びＡＰＰ７
   ７０を含むアルツハイマー病アミロイド前駆体蛋白又は
   その断片の測定キット。