JPWO2005080435A1 - モノクローナル抗体およびその利用 - Google Patents

Abstract

アミロイドβを認識し、アミロイドβ前駆体蛋白を認識しない抗体およびその利用方法を提供すること。アミロイドβのＮ端ペプチドを認識し、かつアミロイドβ前駆体蛋白を認識しないことを特徴とするモノクローナル抗体およびこれを利用したアミロイドβの測定キット、アルツハイマー症の治療剤ならびにアルツハイマー症の治療方法。

Description

本発明は、アミロイドβのＮ端ペプチドを認識し、かつアミロイドβ前駆体蛋白を認識しないことを特徴とするモノクローナル抗体およびその利用に関する。

アミロイドβは、アミロイドβ前駆体蛋白（Amyloid
Precursor Protein：ＡＰＰ）からβ−セクレターゼおよびγ−セクレターゼにより切り出される、４０アミノ酸または４２アミノ酸からなるペプチドである。４０アミノ酸のアミロイドβをアミロイドβ（１−４０）といい、４２アミノ酸のアミロイドβをアミロイドβ（１−４２）という。以下にそれぞれのアミノ酸配列を示す。
アミロイドβ（１−４０）（配列番号５）：ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ
アミロイドβ（１−４２）（配列番号６）：ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ

このアミロイドβの内、アミロイドβ（１−４０）は、通常の代謝経路により切り出されるペプチドであり毒性が弱いと言われている。一方、アミロイドβ（１−４２）は不溶性であり、毒性が強く、また容易に凝集、繊維化し、脳内に蓄積するためアルツハイマー症を引き起こす原因の１つともいわれている。

従って、各アミロイドβペプチドを測定することは、アルツハイマー症の診断や、発症に関するメカニズム等を研究する上で非常に重要である。

これまで、アミロイドβの測定にはアミロイドβ抗体が利用されている（例えば、特許文献１）。しかしながら、前記特許文献１に記載のアミロイドβ抗体はアミロイドβのアミノ酸配列の３〜８にエピトープを有するものであったため、これを利用したアミロイドβ測定キットは完全に全長を保持したアミロイドβ（１−４２）あるいはアミロイドβ（１−４０）を検出するものの、アミロイドβ前駆体蛋白（ＡＰＰ）も検出するものであった。また、既に市販されているアミロイドβ抗体（６Ｅ１０：Signet Laboratories, Inc）もＡＰＰを認識するものであった。

また、アルツハイマー症の予防のために、アミロイドβの脳内への蓄積を抑制することが検討されている。しかしながら、これまでのアミロイドβ抗体はアミロイドβだけではなく正常細胞中のＡＰＰとも反応してしまうため、炎症等の副作用の原因となる可能性が高く、臨床へ応用されていなかった。

国際公開第ＷＯ１９９４／０１７１９７号パンフレット

従って、本発明の第１の課題は、アミロイドβを認識し、ＡＰＰを認識しない抗体を提供することである。

また、本発明の第２の課題は、上記抗体を利用して完全に全長を保持したアミロイドβ（１−４０）およびアミロイドβ（１−４２）を正確に測定できる系を提供することである。

さらに、本発明の第３の課題は、上記抗体を有効成分とするアルツハイマー症の治療剤等を提供することである。

本発明者らは、第１の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、特殊なペプチドで免疫を行うことで、アミロイドβを認識し、ＡＰＰを認識しない抗体が得られることを見出した。

また、第２の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、上記抗体を利用することで完全に全長を保持したアミロイドβ（１−４０）およびアミロイドβ（１−４２）（以下、これらを総称して「アミロイドβ」ということもある）を正確に測定できる系が構築できることを見出した。

さらに、第３の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、上記抗体がアミロイドβの沈着を阻害し、アルツハイマー症の治療に用いることができることを見出した。

すなわち、本願の第１の発明は、アミロイドβのＮ端ペプチドを認識し、かつアミロイドβ前駆体蛋白を認識しないことを特徴とするモノクローナル抗体を提供するものである。

本願の第２の発明は、アミロイドβのＮ端ペプチドを認識し、アミロイドβ前駆体蛋白を認識しない抗体を含む第１の試薬と、アミロイドβ（１−４０）またはアミロイドβ（１−４２）を認識する抗体を含む第２の試薬とを含むことを特徴とするアミロイドβの測定キットを提供するものである。

本願の第３の発明は、検体中のアミロイドβに、アミロイドβのＮ端ペプチドを認識し、アミロイドβ前駆体蛋白を認識しない抗体およびアミロイドβ（１−４０）またはアミロイドβ（１−４２）を認識する抗体を作用させることを特徴とするアミロイドβの測定方法を提供するものである。

本願の第４の発明は、アミロイドβのＮ端ペプチドと生体高分子化合物との結合物を第１の抗原として動物に免疫を行い、次いで、前記免疫を行った動物に前記第１の抗原で用いたペプチドよりも相対的に短いアミロイドβのＮ端ペプチドと生体高分子化合物との結合物を第２の抗原として免疫を行い、当該動物から抗体を採取することを特徴とする前記モノクローナル抗体の製造方法を提供するものである。

本願の第５の発明は、前記モノクローナル抗体を有効成分として含むアルツハイマー症の治療剤を提供するものである。

本願の第６の発明は、前記モノクローナル抗体を有効成分として含むアミロイドβ（１−４０）またはアミロイドβ（１−４２）の沈着阻害剤を提供するものである。

本願の第７の発明は、前記モノクローナル抗体を投与することを特徴とするアルツハイマー症の治療方法を提供するものである。

本願の第８の発明は、前記モノクローナル抗体を投与することを特徴とするアミロイドβ（１−４０）またはアミロイドβ（１−４２）の沈着阻害方法を提供するものである。

本発明のモノクローナル抗体は、アミロイドβのＮ端ペプチドを認識し、かつアミロイドβ前駆体蛋白を認識しないものである。

従って、上記抗体を利用することで、従来は困難であった、完全に全長を保持したアミロイドβ（１−４０）およびアミロイドβ（１−４２）を正確に測定することのできる系の構築が可能となる。

また、上記抗体はアミロイドβの脳内への沈着を阻害するので、安全にアルツハイマー症の治療を行うことが可能となる。

本発明のアミロイドβのＮ端ペプチドを認識し、かつアミロイドβ前駆体蛋白を認識しないモノクローナル抗体（以下、これを「Ｎ端抗体」という）は、従来技術に基づきアミロイドβのＮ端ペプチドを用いて動物に免疫をしても得ることは難しい。それはアミロイドβのアミノ酸配列がアミロイドβ前駆体蛋白の一部と完全に同一であるため、両者を識別しうる抗体が得られにくいからである。

従って、本発明のＮ端抗体を得るには、アミロイドβのＮ端ペプチドと生体高分子化合物との結合物を第１の抗原として動物に免疫を行い、次いで、前記免疫を行った動物に前記第１の抗原で用いたペプチドよりも相対的に短いアミロイドβのＮ末端ペプチドと生体高分子化合物との結合物を第２の抗原として免疫を行い、当該動物から抗体を採取することが必要となる。

上記の第１の抗原および第２の抗原を用いた本発明のＮ端抗体の作製方法を以下に説明する。

第１の抗原で用いられるアミロイドβのＮ端ペプチドは、アミロイドβ（１−４０）あるいはアミロイドβ（１−４２）のアミノ酸配列（配列番号５あるいは配列番号６）のＮ末端からＣ末端側に連続したアミノ酸配列からなるペプチドであり、アミロイドβの１〜２８のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、特にアミロイドβのアミノ酸配列の１〜１６を含む次のアミノ酸配列（ａ）で示されるペプチドが好ましい。

（ａ）ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫ（配列番号１）

上記アミノ酸配列からなるペプチドは、特に限定されることなく種々の方法で得ることができる。例えば、当業界で公知の方法により合成してもよいし、シンペップ社（Synpep Corporation）およびタナ社（TANA Laboratories, USA）等から合成品を購入することもできる。

上記のアミノ酸配列からなるペプチドは、次に生体高分子化合物と結合させ、これを第１の抗原とする。この場合には上記ペプチドのＣ末端側のアミノ酸にシスティン（Ｃ）を付けて結合させることが好ましい。

上記ペプチドに結合させる生体高分子化合物の例としては、スカシ貝のヘモシアニン（以下「ＫＬＨ」という）、卵白アルブミン（以下、「ＯＶＡ」という）、ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）、ウサギ血清アルブミン（以下「ＲＳＡ」という）、サイログロブリン等が挙げられ、このうちＫＬＨおよびサイログリブリンがより好ましい。

上記ペプチドと生体高分子化合物との結合は、例えば、混合酸無水物法（B. F. Er langer, et al. :J. Biol. Chem., 234 1090-1094(1959)）または活性化エステル法（A.
E. KARU, et al. :J. Agric. Food Chem., 42, 301-309(1994)）等の公知の方法によって行うことができる。

混合酸無水物法において用いられる混合酸無水物は、上記ペプチドを通常のショッテン−バウマン反応に付すことにより得られ、これを生体高分子化合物と反応させることにより目的とするペプチドと生体高分子化合物との結合物が作成される。この混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げられる。当該方法におけるペプチドとハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得る。

なお、ショッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われるが、当該反応に用いられる塩基性化合物としては、ショッテン−バウマン反応に慣用の化合物、例えば、トリエチルアミン、トリメチルアミン、ピリジン、ジメチルアニリン、Ｎ−メチルモルホリン、ジアザビシクロノネン（ＤＢＮ）、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）、ジアザビシクロオクタン（ＤＡＢＣＯ）等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等を使用することができる。

また上記反応は、通常、−２０℃から１００℃、好ましくは０℃から５０℃において行われ、反応時間は５分から１０時間程度、好ましくは５分から２時間である。

得られた混合酸無水物と生体高分子化合物との反応は、通常−２０℃から１５０℃、好ましくは０℃から１００℃において行われ、反応時間は５分から１０時間程度、好ましくは５分から５時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われるが、溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。

一方、活性化エステル法は、一般に以下のように行うことができる。まず、上記ペプチドを有機溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド活性化エステルを生成する。

当該反応に用いられるカップリング剤としては、縮合反応に慣用されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、水溶性カルボジイミド等が挙げられる。また、有機溶媒としては、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するペプチドとＮ−ヒドロキシコハク酸イミド等のカップリング剤のモル比は好ましくは１：１０〜１０：１、最も好ましくは１：１である。反応温度は、０〜５０℃、好ましくは２２〜２７℃で、反応時間は５分〜２４時間、好ましくは１〜２時間である。反応温度は各々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。

カップリング反応後、反応液を生体高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば生体高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基と上記ペプチドのカルボキシル基の間に酸アミド結合が生成される。反応温度は、０〜６０℃、好ましくは５〜４０℃、より好ましくは２２〜２７℃で、反応時間は５分〜２４時間、好ましくは１〜１６時間、より好ましくは１〜２時間である。

上記いずれかの方法により得られた反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製することにより、上記ペプチドと生体高分子化合物との結合物（以下、単に「結合物１」ということがある）を得ることができる。

一方、第２の抗原で用いられる、前記第１の抗原で用いたペプチドよりも相対的に短いアミロイドβのＮ端ペプチドとは、前記第１の抗原で用いたペプチドと同様に、アミロイドβのアミノ酸配列のＮ末端からＣ末端側に連続したアミノ酸配列からなるペプチドであって、そのペプチドの長さが相対的に短いペプチドであれば特に制限されないが、第１の抗原で用いたペプチドよりも３〜１１アミノ酸、好ましくは５〜１１アミノ酸短いペプチドである。この様なペプチドとしては、アミロイドβの１〜１３のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、アミロイドβの１〜１１のアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましく、特にアミロイドβのアミノ酸配列の１〜５を含む次のアミノ酸配列（ｂ）で示されるペプチドが好ましい。

（ｂ）ＤＡＥＦＲ（配列番号２）

上記ペプチドは、結合物１を作成するのと同様の方法で生体高分子化合物との結合物（以下、単に「結合物２」ということがある）を作製することができる。

次に、上記のようにして得られた結合物１および結合物２を抗原とし、これを用いるＮ端抗体の製造方法について説明する。なお、抗体の調製にあたっては、抗原として結合物１および結合物２を用いる以外は、公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究法（日本生化学会編）等に記載の方法を適宜利用することができる。

上記結合物を使用して本発明のＮ端抗体を作製するには、まず結合物１を第１の抗原として動物に免疫を行い、次いで、前記免疫を行った動物に結合物２を第２の抗原として免疫を行い、当該動物から抗体を採取すれば良い。

具体的な免疫方法としては、まず、結合物１をリン酸ナトリウム緩衝液（以下、「ＰＢＳ」という）に溶解し、これとフロイント完全アジュバントまたは不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤と混合し、これを第１の抗原として動物を免疫する。

免疫される動物としては当該分野で常用されたものをいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等の哺乳動物を挙げることができる。また、免疫の際の免疫原の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は、１回または適当な間隔で複数回、好ましくは１週間ないし５週間の間隔で複数回行うことができる。

次いで、上記のように第１の抗原で免疫を行った動物に、第１の抗原と同様に結合物２を用いて第２の抗原を作製し、これにより免疫を行う。免疫は、第１の抗原を免役するのと同様に、１回または適当な間隔で複数回、好ましくは１週間ないし５週間の間隔で複数回行うことができる。

最後に、常法に従い、上記の免疫を行った動物から得た免疫細胞と、ミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取することによってアミロイドβのＮ端に対するモノクローナル抗体を得ることができる。

斯くして得られる本発明のＮ端抗体は、免疫学的測定法の試薬としてあるいはアルツハイマー症等の治療剤として使用できる。

免疫学的測定法の試薬として使用するには、必要により標識ないし固相化することが好ましい。

このうち標識は、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、^３２Ｐ、^１２５Ｉ等の放射性物質、化学発光物質等の標識物質とＮ端抗体とを結合させることにより行われる。また、固相化は適切な固相にＮ端抗体を結合させることにより行われる。固相としては、免疫化学的測定法において慣用される固相の何れをも使用することができ、例えば、ポリスチレン製の９６穴マイクロタイタープレート、アミノ基結合型のマイクロタイタープレート等のプレートや、各種のビーズ類が挙げられる。Ｎ端抗体を固相化させるには、例えば、抗体を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベーションすればよい。

本発明のＮ端抗体は、特にアミロイドβ（１−４０）またはアミロイドβ（１−４２）を認識する抗体を認識する抗体と組合わせることにより、アミロイドβを正確に測定することができる試薬として使用できる。

本発明のＮ端抗体と組合わされるアミロイドβ（１−４０）またはアミロイドβ（１−４２）を認識する抗体としては、例えば、アミロイドβ（１−４０）またはアミロイドβ（１−４２）のアミノ酸配列の一部または全部を抗原として、常法により得ることができるポリクローナル抗体やモノクローナル抗体が利用できる。本発明においては、これらの抗体の中でも、特にアミロイドβのＣ端ペプチドを認識する抗体（以下、「Ｃ端抗体」という）を使用することが、測定の正確さから好ましい。

上記Ｃ端抗体は、測定対象とするアミロイドβ（１−４０）またはアミロイドβ（１−４２）のＣ端ペプチドを識別する抗体であれば特に制限されないが、測定対象とするアミロイドβ（１−４０）またはアミロイドβ（１−４２）以外のアミロイドβ（１−４３）等を認識しない抗体が好ましい。

具体的にアミロイドβ（１−４０）を認識するＣ端抗体（以下、「Ｃ端抗体１」という）は、アミロイドβ（１−４０）（配列番号５）のＣ末端からＮ末端側に連続したアミノ酸配列からなるペプチド（Ｃ端ペプチド）を抗原として、常法により得ることができる。より具体的に抗原とするＣ端ペプチドは、アミロイドβ（１−４０）の１８〜４０のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、特にアミロイドβ（１−４０）の３５〜４０からなる次のアミノ酸配列（ｃ）で示されるペプチドが好ましい。

（ｃ）ＭＶＧＧＶＶ（配列番号３）

同様に、アミロイドβ（１−４２）を認識するＣ端抗体（以下、「Ｃ端抗体２」という）は、アミロイドβ（１−４２）（配列番号６）のＣ末端からＮ末端側に連続したアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として、常法により得ることができる。より具体的に抗原とするペプチドは、アミロイドβ（１−４２）の１８〜４２のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、特にアミロイドβ（１−４２）の３８〜４２からなる次のアミノ酸配列（ｄ）で示されるペプチドが好ましい。

（ｄ）ＧＶＶＩＡ（配列番号４）

また、上記ペプチドを用いてＣ端抗体を作製する場合、抗原として前記Ｎ端抗体の作製方法と同様に、上記ペプチドと生体高分子化合物との結合物を利用しても良い。この上記ペプチドと生体高分子化合物との結合物は、上記ペプチドのＮ末端側のアミノ酸に、例えばリジン・システィン（ＫＣ）を付けて結合させることが好ましい。

上記のようなアミロイドβ（１−４０）またはアミロイドβ（１−４２）を認識する抗体としては株式会社免疫生物研究所から市販されている下記のものを利用することもできる。
Anti-Human Amyloidβ(35-40)
(1A10) Mouse IgG MoAb（製品番号：10047）
Anti-Human Amyloidβ(1-40)
Rabbit IgG Affinity Purify（製品番号：18580）
Anti-Human Amyloidβ(1-42)
Rabbit IgG Affinity Purify（製品番号：18582）

本発明のＮ端抗体とアミロイドβ（１−４０）またはアミロイドβ（１−４２）を認識する抗体とを利用すればアミロイドβ（１−４０）またはアミロイドβ（１−４２）を正確に測定することができる。具体的な測定方法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（E. Engvall et al., (1980): Methods in Enzymol., 70, 419-439）、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）、イムノクロマト法等の、一般の免疫化学的測定法において使用されている種々の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプランニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５日）が挙げられる。

これらの測定方法は種々の観点から適宜選択することができるが、感度、簡便性等の点からはＥＬＩＳＡ法が好ましい。より具体的な、アミロイドβの測定について、ＥＬＩＳＡ法の一つであるサンドイッチ法を例にとってその手順を説明すれば次の通りである。

まず、工程（Ａ）として、アミロイドβ（１−４０）またはアミロイドβ（１−４２）を認識する抗体を担体に固相化し、次いで、工程（Ｂ）として、抗体が固相化されていない担体表面をアミロイドβと無関係な、例えばタンパク質により、ブロッキングする。更に、工程（Ｃ）として、これに各種濃度のアミロイドβを含む検体を加え、アミロイドβと抗体との複合体を生成させた後、工程（Ｄ）として、標識した本発明のＮ端抗体を加え、これにアミロイドβと抗体との複合体を結合させ、最後に工程（Ｅ）として、標識量を測定することにより、予め作成した検量線から検体中のアミロイドβの量を決定することができる。なお、工程（Ａ）と工程（Ｄ）に用いる抗体は逆の場合でも測定が可能であるが、アミロイドβ（１−４０）またはアミロイドβ（１−４２）を認識する抗体を固相化した方が検出感度の点から好ましい。

具体的に工程（Ａ）において、アミロイドβ（１−４０）またはアミロイドβ（１−４２）を認識する抗体を固相化するために用いられる担体としては、特別な制限はなく、免疫化学的測定法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン製の９６穴マイクロタイタープレートあるいは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートが挙げられる。また、上記抗体を固相化させるには、例えば、上記抗体を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例えば１０ｍＭのＰＢＳを挙げることができる。緩衝液中の上記抗体の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０.０１〜１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０.１〜２０μｇ／ｍｌが適している。また、担体として９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で２０〜１５０μｌ／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩のインキュベーションが適している。

また、工程（Ｂ）のブロッキングは、工程（Ａ）で抗体を固相化した担体において、後に添加する検体中のアミロイドβが抗原抗体反応とは無関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤としては、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液や、ブロックエース（Ｂｌｏｃｋ−Ａｃｅ：大日本製薬製（コードＮｏ.ＵＫ−２５Ｂ））等の市販のブロッキング剤を使用することができる。具体的なブロッキングは、限定されるわけではないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブロックエースを適量加え、約４℃で、一晩のインキュベーションをした後、緩衝液で洗浄することにより行われる。

更に、工程（Ｃ）において、アミロイドβを含む検体を固相化した抗体と接触させ、この固相化した抗体でアミロイドβを捕捉し、固相化した抗体とアミロイドβとの複合体を生成させる。この複合体を生成させるための条件は限定されるわけではないが、４℃〜３７℃程度で約１時間〜１晩の反応を行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応のタンパク質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７.２）および０.０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０の組成のものが好ましい。

また更に、工程（Ｄ）において、固相化した抗体に捕捉されたアミロイドβの別のエピトープを認識する、標識抗体を加え、固相化した抗体−アミロイドβ−標識抗体の複合体を形成させる。この反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応のタンパク質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、前記したものが使用される。この工程（Ｄ）において使用される標識抗体の量は、固相化した抗体に対して約５,０００〜１０,０００倍、好ましくは最終吸光度が１.５〜２.０となるように希釈された量である。希釈には緩衝液を用いることができ、反応条件は特に限定されるわけではないが、４℃〜３７℃程度で約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄することが好ましい。以上の反応により、固相化した抗体−アミロイドβ−標識抗体の複合体を結合することができる。

最後に工程（Ｅ）において、固相化した抗体−アミロイドβ−標識抗体の複合体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線からアミロイドβの量を算出することができる。

標識抗体の標識物として、酵素であるペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素と３,３',５,５'−テトラメチルベンジン（以下「ＴＭＢ」という）を含む発色基質溶液を使用することができる。発色反応は、限定されるわけではないが、発色基質溶液を加え約２５℃で約３０分間反応させた後、１〜２Ｎの硫酸を加えて酵素反応を停止させことにより行うことができる。ＴＭＢを使用する場合、発色は４５０ｎｍの吸光度により測定する。一方、標識物として、酵素であるアルカリホスファターゼを使用する場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。なお、既知の濃度のアミロイドβを添加した反応液の吸光度により予め作成しておいた検量線を用いて、検体中のアミロイドβの濃度を算出できる。

上記で説明したアミロイドβの測定方法を実施するには、本発明のＮ端抗体を含む第１の試薬と、アミロイドβ（１−４０）またはアミロイドβ（１−４２）を認識する抗体を含む第２の試薬とを含有することを特徴とするアミロイドβの測定キット（以下、「本発明キット」という）を利用することが好ましい。

なお、本発明キットは常法により作製することができる。具体的には、本発明のＮ端抗体、アミロイドβ（１−４０）またはアミロイドβ（１−４２）を認識する抗体のいずれかを標識抗体とし、他に、希釈用緩衝液、標準物質、基質用緩衝液、停止液、洗浄液等を組み合わせればよい。

斯くして得られる測定キットや測定方法により、血漿、血清等の検体中の完全に全長を保持したアミロイドβ（１−４０）またはアミロイドβ（１−４２）を正確に測定することができる。

また、本発明のＮ端抗体はアミロイドβのＮ端ペプチドを認識し、かつアミロイドβ前駆体蛋白を認識しないものであるので、アミロイドβに選択的に結合し、その沈着を阻害することができる。従って、本発明のＮ端抗体はアミロイドβ蓄積することにより引き起こされる疾患、好ましくはアミロイドβが脳内に蓄積することにより発症するアルツハイマー症の治療剤としても利用することができる。

本発明のＮ端抗体をアルツハイマー症の治療剤として利用する場合には、Ｎ端抗体を必要により精製し、常法により製剤化すればよい。このアルツハイマー症の治療剤の剤形は特に制限されないが、例えば液剤（注射剤）とすることができる。また、製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これらの剤形に応じた担体や添加剤を使用することができる。

また、上記治療剤の患者への投与量は、患者の症状の程度、年齢や使用する製剤の剤型あるいは抗体の結合力価等により異なるので、それらを考慮して決定すればよい。

なお、本発明のＮ端抗体を上記のようにアルツハイマー症の治療剤に用いる場合には、Ｎ端抗体を常法によりキメラ抗体やヒト化抗体としたものを用いることが好ましい。キメラ抗体やヒト化抗体の作製は、欧州特許公開公報
ＥＰ０１２５０２３、欧州特許公開公報ＥＰ０２３９４００、ＥＰ０４５１２６、国際公開公報ＷＯ９４／２０６３２、ＰＵＢＭＥＤ ＩＤ １５３１６１２７（Protein Eng Des Sel. 2004 May;17(5):481-489. Epub 2004 Aug 17）、９６５３４９４（Ann
Oncol. 1998 May;9(5):527-34.）、１３５００８８（Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 May
15;89(10):4285-9.）等を参照することにより行うことができる。

斯くして得られる本発明のアルツハイマー症の治療剤は正常細胞中のＡＰＰと反応しないので、炎症等の副作用の原因となる可能性が低く、安全なものとなる。

以下、実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約されるものではない。また当業者は、本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができるが、それらも本発明の技術的範囲に含まれる。

実 施 例 １
アミロイドβのＮ端ペプチドおよびＣ端ペプチドの入手：
アミロイドβのＮ端ペプチドおよびＣ端ペプチドは、ＨＰＬＣクロマトグラフィー精製した状態の品をシンペップ社（Ｓｙｎｐｅｐ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびタナ社（ＴＡＮＡ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, ＵＳＡ）より購入した。それらのペプチドのアミノ酸配列は、下記の（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）および（ｈ）に示す通りである。なお、ペプチド（ｅ）はアミロイドβの１〜１６のアミノ酸配列（配列番号１）にシスティン（Ｃ）を付けたペプチドであり、ペプチド（ｆ）はアミロイドβの１〜５のアミノ酸配列（配列番号２）にＣを付けたペプチドであり、ペプチド（ｇ）はアミロイドβ（１−４０）の３５〜４０のアミノ酸配列（配列番号３）にＫＣを付けたペプチドであり、ペプチド（ｈ）はアミロイドβ（１−４２）の３８〜４２のアミノ酸配列（配列番号４）にリジン・システイン（ＫＣ）を付けたペプチドである。

（ｅ）ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＣ
（ｆ）ＤＡＥＦＲＣ
（ｇ）ＫＣＭＶＧＧＶＶ
（ｈ）ＫＣＧＶＶＩＡ

実 施 例 ２
免疫用抗原の作製：
上記の各ペプチドとサイログロブリンとの結合物をＥＭＣＳ（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）法により、以下のようにして作成した。なお、結合物を作るにあたり、サイログロブリンとペプチドとＥＭＣＳのモル比をそれぞれ１：３００：４００とした。

まず、実施例１の各ペプチド４ｍｇを、それぞれ約１ｍｌの蒸留水に溶解した。一方、１ｍｌの０.０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７.０）に５ｍｇのサイログロブリンを溶解したものと、ジメチルホルムアミドで溶解したＥＭＣＳ８０μｇ／μｌとをそれぞれ上述モル相当量になるように混合し、サイログロブリン−ＥＭＣＳ複合体溶液を作成した。この複合体溶液を４つに分け、その各々にそれぞれのペプチド溶液を上述モル相当量加えることにより、ＥＭＣＳで架橋されたペプチドとサイクログロブリンとの結合物溶液を作成した。

この結合物溶液を、ＰＢＳを用いて透析し、結合物として１０μｇ／μｌになるように濃度調製した。このようにして得られた上記の各ペプチドとサイログロブリンとの結合物を免疫用抗原として以下の実施例に用いた。

実 施 例 ３
アミロイドβ（１−４０）のＣ端ペプチドを認識する抗体の作製：
免疫用抗原として、実施例２において得られたペプチド（ｇ）とサイログロブリンとの結合物を用い、１週間、または２週間おきに結合物溶液の５０μｌ（５０μｇ）を投与し、マウスを免疫化した。抗原は初回免疫のみにフロイント完全アジュバントと混和し、二回目からはフロイント不完全アジュバントと混和した。免疫化されたマウスの脾単球細胞と融合パートナー、Ｘ６３−Ａｇ８−６５３をポリエチレングリコール仲介細胞融合に付し、文献（Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. １４６：３７２１−３７２８）に述べた方法によりハイブリドーマを選択した。選択は、固定化されたペプチド（ｇ）に反応し、ペプチド（ｈ）には反応しないように見える細胞を選択することにより行った。

上記のようにして選択した細胞を無血清培地のＧＩＴ培地（和光純薬工業株式会社製）で細胞の８０％が死滅するまで抗体を産生させた。次いでこの培地から遠心（１,０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）により細胞を取り除いた後、硫酸アンモニウムを５０％飽和状態にして４℃で一晩静置し、沈殿を遠心（１,０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）により回収した。更にこの沈殿を２倍に希釈したｂｉｎｄｉｎｇ
ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡＭＡＰＳ ＩＩｋｉｔ製）に溶解させた後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ａｍｅｒｓｈａｍ製）にＩｇＧを吸着させた。その後、ＰＢＳ透析を一晩行って抗体を精製し、アミロイドβ（１−４０）のＣ端ペプチドを認識する抗体を得た。そしてこの抗体を１Ａ１０と名付けた。

実 施 例 ４
ウエスタンブロッティングによる１Ａ１０抗体の特異性の確認：
次に、実施例３で得られた１Ａ１０抗体がアミロイドβ（１−４０）のＣ端ペプチドを認識することを確認するために、１Ａ１０抗体を用いてアミロイドβ（１−４０）、アミロイドβ（１−４２）およびアミロイドβ（１−４３）の各ペプチドに対し、常法（例えば、「分子生物学基礎実験法」、南江堂）に従いウエスタンブロッティングを行った。

ウエスタンブロッティングの結果を図１に示した。モノクローナル抗体１Ａ１０は、アミロイドβ（１−４２）およびアミロイドβ（１−４３）には反応せず、アミロイドβ（１−４０）のみを認識することが確認できた。

実 施 例 ５
アミロイドβ（１−４２）のＣ端ペプチドを認識する抗体の作製：
免疫用抗原として、実施例２において得られたペプチド（ｈ）とサイログロブリンとの結合物を用い、実施例３と同様の手法に従い、マウスを免疫化した。免疫化されたマウスの脾単球細胞と融合パートナー、Ｘ６３−Ａｇ８−６５３をポリエチレングリコール仲介細胞融合に付し、文献（Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. １４６：３７２１−３７２８）に述べた方法によりハイブリドーマを選択した。選択は、固定化されたペプチド（ｈ）に反応し、ペプチド（ｇ）には反応しないように見える細胞を選択することにより行った。

上記のようにして選択した細胞を実施例３と同様に精製し、アミロイドβ（１−４２）のＣ端ペプチドを認識する抗体を得た。そしてこの抗体を１Ｃ３と名付けた。

実 施 例 ６
免疫沈降法による１Ｃ３抗体の反応性の確認：
次に、実施例５で得られた１Ｃ３抗体がアミロイドβ（１−４２）のＣ端ペプチドを認識することを確認するために、１Ｃ３抗体を用いてアミロイドβ（１−４０）、アミロイドβ（１−４１）、アミロイドβ（１−４２）およびアミロイドβ（１−４３）の各ペプチドに対し、常法（例えば、「分子生物学基礎実験法」、南江堂）に従い免疫沈降を行った。最終のブロットによる検出には６Ｅ１０抗体（Ｓｉｇｎｅｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｉｎｃ製）を用いた。

免疫沈降の結果を図２に示した。１Ｃ３抗体は、アミロイドβ（１−４２）を特異的に認識し、アミロイドβ（１−４０）、アミロイドβ（１−４１）およびアミロイドβ（１−４３）を認識しないことが確認できた。

実 施 例 ７
アミロイドβのＮ端ペプチドを認識する抗体の作製：
免疫用抗原として、実施例２において得られたペプチド（ｅ）とサイログロブリンとの結合物を用い、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。４回免疫を行った後、さらにペプチド（ｆ）とサイログロブリンとの結合物を用い２回免疫を行った。免疫化されたマウスの脾単球細胞と融合パートナー、Ｘ６３−Ａｇ８−６５３をポリエチレングリコール仲介細胞融合に付し、文献（Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. １４６：３７２１−３７２８）に述べた方法によりハイブリドーマを選択した。選択は、固定化されたペプチド（ｅ）およびペプチド（ｆ）へ反応する細胞を選択することにより行った。

上記のようにして選択した細胞を実施例３と同様に精製し、アミロイドβのＮ端ペプチドを認識する抗体を得た。そしてこの抗体を８２Ｅ１と名付けた。

実 施 例 ８
ウエスタンブロッティングによる８２Ｅ１抗体の特異性の確認：
次に、実施例７で得られた８２Ｅ１抗体がアミロイドβのＮ端ペプチドを認識することを確認するために、８２Ｅ１抗体を用いてアミロイドβ（１−４０）、アミロイドβ（２−４０）およびアミロイドβ（３−４０）の各ペプチドに対し、常法（例えば、「分子生物学基礎実験法」、南江堂）に従いウエスタンブロッティングを行った。また、比較としてアミロイドβ前駆体蛋白（ＡＰＰ）を強制発現させたチャイニーズハムスター細胞を、１％のＴｒｉｔｏｎを含む緩衝液でホモジナイズし、遠心後の上清をサンプルとして同様にウエスタンブロッティングを行った。この上清には、ＡＰＰに加え、アミロイドβおよびＡＰＰからβ部位により切断されたβＣターミナルフラグメント（βＣＴＦ）が含まれる。さらに、従来の抗体と比較するために、上記同一サンプルを用いて、アミロイドβのＮ端ペプチドを認識するといわれている６Ｅ１０抗体（Ｓｉｇｎｅｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｉｎｃ製）についてもウエスタンブロッティングをおこなった。

ウエスタンブロッティングの結果を図３、図４に示した。図３より８２Ｅ１抗体は、アミロイドβ（２−４０）およびアミロイドβ（３−４０）には反応せず、アミロイドβ（１−４０）のみを認識することが確認できた。一方、６Ｅ１０抗体は、アミロイドβ（１−４０）には反応せず、アミロイドβ（２−４０）およびアミロイドβ（３−４０）を認識することが確認できた。また、図４より、モノクローナル抗体８２Ｅ１は、ＡＰＰには反応せず、アミロイドβおよびβＣＴＦのみを認識することが確認できた。一方、６Ｅ１０抗体は、ＡＰＰを認識することが確認できた。

実 施 例 ９
アミロイドβのＮ端ペプチドを認識する抗体（８２Ｅ１抗体）とＨＲＰとの結合物
の作製：
実施例７で得られた８２Ｅ１抗体とＨＲＰとの結合物は以下のように作製した。必要量のＨＲＰを蒸留水に溶かし、ＮａＩＯ_４で酸化させた後、ｐＨ４.４の１ｍＭ酢酸緩衝液に一晩透析した。また、８２Ｅ１抗体の２ｍｇもｐＨ９.５の０.１Ｍ炭酸緩衝液に一晩透析した。これらの透析した８２Ｅ１抗体とＨＲＰを抗体１ｍｇに対してＨＲＰが０.４ｍｇになるように混合し、室温で２時間反応させた。次いで、これにＮａＢＨ_４を加え氷中で２時間反応させた後ＰＢＳに一晩透析した。更に、この反応物をゲル濾過し、８２Ｅ１抗体とＨＲＰとの結合物を作製した。

実 施 例 １０
サンドイッチＥＬＩＳＡ法の構築：
上記実施例で得られた抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法の構築は以下のようにして行った。まず、２０μｇ／ｍｌの１Ａ１０抗体あるいは１Ｃ３抗体を１００μｌずつ９６ｗｅｌｌのＥＬＩＳＡ用プレートに加えた。次いで、これを４℃で一晩反応させた後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＮａＮ_３溶液にてブロッキングを行い、サンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートとした。また、実施例６で作成した８２Ｅ１抗体とＨＲＰとの結合物を標識抗体とした。

上記ＥＬＩＳＡプレートと標識抗体を用いて合成アミロイドβ（１−４０）あるいは合成アミロイドβ（１−４２）の各ペプチドを用いて測定を行った標準曲線の結果を図５に示す。図５中のＡは、１Ａ１０抗体とＨＲＰ標識８２Ｅ１抗体との組み合わせで合成アミロイドβ（１−４０）を測定した結果であり、図５中のＢは、１Ｃ３抗体とＨＲＰ標識８２Ｅ１抗体との組み合わせで合成アミロイドβ（１−４２）を測定した結果である。いずれも濃度依存的に良好な直線性を示した。

実 施 例 １１
アミロイドβ沈着阻害試験：
１６ヶ月齢のアミロイド前駆体蛋白（ＡＰＰ）を発現するＴｇ２５７６遺伝子組換えマウス（ｎ＝３）に、実施例７で得られた８２Ｅ１抗体をＰＢＳを用いて１ｍｇ／ｍｌに調整したものを、毎週１度、１０ｍｇ／Ｋｇ（マウス体重）の割合で、腹腔投与した。また、コントロールとしてＰＢＳのみを同様に投与した（ｎ＝２）。８２Ｅ１抗体またはＰＢＳを１２回（約３ヶ月間）投与したマウスを、屠殺し、左大脳半球を４％の緩衝化ホルムアルデヒド溶液で固定後、パラフィン包埋した。次いで、パラフィン包埋したものから５μｍの連続切片を作製し、アミロイドβ（１−４０）およびアミロイドβ（１−４２）ポリクローナル抗体（共に株式会社免疫生物研究所製：製品番号１８５８０、１８５８２）を使って免疫染色した。その結果を図６および図７に示した。

また、切片を皮質から１０枚、海馬から５枚を選び、顕微鏡用デジタルカメラとシンプルＰＣＩソフトウエア（Ｃｏｍｐｉｘ, Ｉｎｃ． Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ＵＳＡ）を使ってイメージ解析した。アミロイドβ（１−４０）およびアミロイドβ（１−４２）の沈着は全領域中の免疫染色陽性領域の割合（％）で示した。その結果を図８に示した。

更に、ｐＨ７.６の０.０５Ｍトリス塩酸緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）不溶性アミロイドβを右前頭部（脳の１／４）から６Ｍグアニジン塩酸で抽出し、実施例１０で作製したサンドイッチＥＬＩＳＡ系でアミロイドβ（１−４２）およびヒューマンアミロイドβ（１−４２）測定キット（株式会社免疫生物研究所製：製品番号１７７１１）でアミロイドβ（ｘ−４２）を測定した。抽出方法は文献（M.
Morishima-Kawashima, et al., Am. J. Pathol., 157 (2000) 2093-2099.）記載の方法に従った。その結果を図９に示した。

アミロイドβ（１−４２）の免疫染色像よりコントロールと比較して、８２Ｅ１を投与したマウス脳では老人斑の数が少なかった（図６）。また、皮質や海馬と比較してアミロイドβ沈着の遅い基底核では８２Ｅ１を投与したマウスにおいては、コントロールと比較して明らかに老人斑の数が少なかった（図７）。この減少はイメージアナライザーでも確認できた（図８）。アミロイドβ沈着は８２Ｅ１を投与したマウスでアミロイドβ（１−４０）（皮質で３０％の減少、海馬で４０％の減少（共にｐ＜０.０５）。）、アミロイドβ（１−４２）（皮質で４３％の減少（ｐ＜０.０１）、海馬で４０％の減少（ｐ＜０.０５）。）の両方が有意に減少していた。更に、脳中のアミロイドβ（１−４２）およびアミロイドβ（ｘ−４２）をＥＬＩＳＡで測定した結果（図９）、８２Ｅ１を投与したマウスで有意に減少していた（共に５０％の減少（共にｐ＜０.０５））。

本発明のアミロイドβのＮ端ペプチドを認識する抗体は、アミロイドβを認識し、かつアミロイドβ前駆体蛋白を認識しないものである。

従って、上記抗体を利用したアミロイドβ測定キットは、これまで市販されているアミロイドβ測定キットと異なり、完全長を有するアミロイドβ（１−４２）あるいはアミロイドβ（１−４０）を正確に測定することができる。

また、上記のアミロイドβ測定キットは、アミロイドβが関連するアルツハイマー症等の診断や、発症に関するメカニズム等の研究に利用することができる。具体的な一例を挙げればβセクレターゼ阻害剤の検索を行うことができる。

さらに、上記抗体を利用したアルツハイマー症の治療剤は、アミロイドβの沈着を阻害するが、正常細胞中に存在するアミロイドβ前駆体蛋白には反応しないため炎症等の副作用の原因となる可能性が少ない優れたものである。

図１は、ウエスタンブロッティングによる１Ａ１０抗体の特異性を示す図面である。 図２は、免疫沈降による１Ｃ３抗体の特異性を示す図面である。 図３は、ウエスタンブロッティングによる８２Ｅ１抗体の特異性を示す図面である（Ａ：８２Ｅ１抗体、Ｂ：６Ｅ１０抗体）。 図４は、ウエスタンブロッティングによる８２Ｅ１抗体の特異性を示す図面である（Ａ：８２Ｅ１抗体、Ｂ：６Ｅ１０抗体）。 図５は、実施例１０で作製したＥＬＩＳＡキットで合成アミロイドβを用いて測定をおこなった標準曲線の結果を示す図面である（Ａ：１Ａ１０抗体とＨＲＰ標識８２Ｅ１抗体との組み合わせで合成アミロイドβ（１−４０）を測定した結果、Ｂ：１Ｃ３抗体とＨＲＰ標識８２Ｅ１抗体との組み合わせで合成アミロイドβ（１−４２）を測定した結果）。 図６は、左大脳半球（皮質と海馬を含む）の免疫染色の結果を示す図面である（Ａ：８２Ｅ１抗体を投与したマウス、Ｂ：コントロールマウス）。 図７は、左大脳半球（基底核）の免疫染色の結果を示す図面である（Ａ：８２Ｅ１抗体を投与したマウス、Ｂ：コントロールマウス）。 図８は、切片中のアミロイドβ（１−４０）およびアミロイドβ（１−４２）の沈着を全領域中の免疫染色陽性領域の割合（％）で示した図面である。 図９は、脳中のアミロイドβ（１−４２）およびアミロイドβ（ｘ−４２）をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図面である。

Claims (20)

1. アミロイドβのＮ端ペプチドを認識し、かつアミロイドβ前駆体蛋白を認識しないことを特徴とするモノクローナル抗体。
2. アミロイドβのＮ端ペプチドが、次のアミノ酸配列（ａ）で示されるペプチドである請求項第１項記載のモノクローナル抗体。
   （ａ）ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫ（配列番号１）
3. アミロイドβのＮ端ペプチドが、次のアミノ酸配列（ｂ）で示されるペプチドである請求項第１項記載のモノクローナル抗体。
   （ｂ）ＤＡＥＦＲ（配列番号２）
4. アミロイドβのＮ端ペプチドと生体高分子化合物との結合物を第１の抗原として動物に免疫を行い、次いで、前記免疫を行った動物に前記第１の抗原で用いたペプチドよりも相対的に短いアミロイドβのＮ端ペプチドと生体高分子化合物との結合物を第２の抗原として免疫を行い、当該動物から抗体を採取することにより得られる請求項第１項記載のモノクローナル抗体。
5. アミノ酸配列（ａ）で示されるペプチドと生体高分子化合物との結合物を第１の抗原として動物に免疫を行い、次いで、前記免疫を行った動物にアミノ酸配列（ｂ）で示されるペプチドと生体高分子化合物との結合物を第２の抗原として免疫を行い、当該動物から抗体を採取することにより得られる請求項第１項記載のモノクローナル抗体。
   （ａ）ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫ（配列番号１）
   （ｂ）ＤＡＥＦＲ（配列番号２）
6. キメラ抗体である請求項第１項ないし第５項の何れかの項記載のモノクローナル抗体。
7. ヒト化抗体である請求項第１項ないし第５項の何れかの項記載のモノクローナル抗体。
8. アミロイドβのＮ端ペプチドを認識し、アミロイドβ前駆体蛋白を認識しない抗体を含む第１の試薬と、アミロイドβ（１−４０）またはアミロイドβ（１−４２）を認識する抗体を含む第２の試薬とを含むことを特徴とするアミロイドβの測定キット。
9. アミロイドβ（１−４０）またはアミロイドβ（１−４２）を認識する抗体が、アミロイドβのＣ端ペプチドを認識する抗体である請求項第８項記載のアミロイドβの測定キット。
10. アミロイドβのＣ端ペプチドが、次のアミノ酸配列（ｃ）で示されるペプチドである請求項第８項記載のアミロイドβの測定キット。
    （ｃ）ＭＶＧＧＶＶ（配列番号３）
11. アミロイドβ（１−４０）を測定するものである請求項第１０項記載のアミロイドβの測定キット。
12. アミロイドβのＣ端ペプチドが、次のアミノ酸配列（ｄ）で示されるペプチドである請求項第８項記載のアミロイドβの測定キット。
    （ｄ）ＧＶＶＩＡ（配列番号４）
13. アミロイドβ（１−４２）を測定するものである請求項第１２項記載のアミロイドβの測定キット。
14. 検体中のアミロイドβに、アミロイドβのＮ端ペプチドを認識し、アミロイドβ前駆体蛋白を認識しない抗体およびアミロイドβ（１−４０）またはアミロイドβ（１−４２）を認識する抗体を作用させることを特徴とするアミロイドβの測定方法。
15. アミロイドβ（１−４０）またはアミロイドβ（１−４２）を認識する抗体が、アミロイドβのＣ端ペプチドを認識する抗体である請求項第１４項記載のアミロイドβの測定方法。
16. アミロイドβのＮ端ペプチドと生体高分子化合物との結合物を第１の抗原として動物に免疫を行い、次いで、前記免疫を行った動物に前記第１の抗原で用いたペプチドよりも相対的に短いアミロイドβのＮ末端ペプチドと生体高分子化合物との結合物を第２の抗原として免疫を行い、当該動物から抗体を採取することを特徴とする請求項第１項記載のモノクローナル抗体の製造方法。
17. 請求項第１項ないし第７項の何れかの項記載のモノクローナル抗体を有効成分として含むアルツハイマー症の治療剤。
18. 請求項第１項ないし第７項の何れかの項記載のモノクローナル抗体を有効成分として含むアミロイドβ（１−４０）またはアミロイドβ（１−４２）の沈着阻害剤。
19. 請求項第１項ないし第７項の何れかの項記載のモノクローナル抗体を投与することを特徴とするアルツハイマー症の治療方法。
20. 請求項第１項ないし第７項の何れかの項記載のモノクローナル抗体を投与することを特徴とするアミロイドβ（１−４０）またはアミロイドβ（１−４２）の沈着阻害方法。