WO2005080435A1 - モノクローナル抗体およびその利用 - Google Patents

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WO2005080435A1
WO2005080435A1 PCT/JP2004/013536 JP2004013536W WO2005080435A1 WO 2005080435 A1 WO2005080435 A1 WO 2005080435A1 JP 2004013536 W JP2004013536 W JP 2004013536W WO 2005080435 A1 WO2005080435 A1 WO 2005080435A1
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amyloid
antibody
peptide
antigen
monoclonal antibody
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PCT/JP2004/013536
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Haruyasu Yamaguchi
Noriaki Kinoshita
Masahiro Maeda
Yuko Horikoshi
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Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • G—PHYSICS
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    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
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    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
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    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Definitions

  • the present invention relates to a monoclonal antibody characterized by recognizing a terminal peptide of amyloid ⁇ and not recognizing amyloid ⁇ precursor protein, and a use thereof.
  • Amyloid ⁇ is amyloid ⁇ precursor protein (Amyloid
  • Precursor Protein is a peptide which is cleaved by j8-secretase and ⁇ -secretase and has 40 or 42 amino acids.
  • 8 is called amyloid (1-40)
  • amyloid j8 of 42 amino acids is called amyloid j8 (1-42).
  • the respective amino acid sequences are shown below.
  • Amyloid (1-40) (SEQ ID NO: 5): DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVG SNKGAIIGLMVGGVV
  • Amyloid (1-42) (SEQ ID NO: 6): DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVG SNKGAIIGLMVGGVVIA
  • 8 (1-40) is a peptide cleaved by the normal alternative pathway and is said to have low toxicity.
  • amyloid j8 (1-42) is insoluble, highly toxic, and is said to be one of the causes of Alzheimer's disease because it easily aggregates, fibrils and accumulates in the brain.
  • amyloid ⁇ antibody has been used for measurement of amyloid ⁇ (eg, Patent Document 1).
  • the amyloid j8 antibody described in Patent Document 1 had an epitope at 3-8 of the amino acid sequence of amyloid j8, the amyloid j8 measurement kit using this antibody completely retained the full length.
  • 8 (1-40) was detected, amyloid ⁇ precursor protein ( ⁇ ) was also detected.
  • a commercially available amyloid j8 antibody (6E10: Signet Laboratories, Inc) also recognizes APP. Was to do.
  • amyloid j8 antibody reacts not only with amyloid j8 but also with APP in normal cells, and thus has a high potential for causing side effects such as inflammation and has not been applied to clinical practice.
  • Patent Document 1 International Publication No. WO1994Z017197 pamphlet
  • a first object of the present invention is to provide an antibody which recognizes amyloid ⁇ and does not recognize ⁇ ⁇ .
  • a second object of the present invention is to provide a system capable of accurately measuring amyloid ⁇ (140) and amyloid
  • a third object of the present invention is to provide a therapeutic agent for Alzheimer's disease and the like containing the above antibody as an active ingredient.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the first problem, and as a result, by immunizing with a special peptide, an antibody that recognizes amyloid j8 and does not recognize APP was obtained. Was found to be possible.
  • amyloid j8 (1-40) and amyloid
  • the first invention of the present application provides a monoclonal antibody characterized by recognizing a terminal peptide of amyloid ⁇ and not recognizing amyloid ⁇ precursor protein.
  • the second invention of the present application is directed to a first reagent containing an antibody that recognizes a terminal peptide of amyloid ⁇ and does not recognize amyloid ⁇ precursor protein, and amyloid j8 (1-40) or amyloid
  • the third invention of the present application is directed to an antibody and amyloid ⁇ (1-40) or amyloid which recognizes the N-terminal peptide of amyloid j8 and does not recognize the amyloid ⁇ precursor protein in amyloid / 3 in the sample. It is intended to provide a method for measuring amyloid ⁇ , which comprises causing an antibody recognizing c- ⁇ (1-42) to act.
  • the fourth invention of the present application is directed to immunizing an animal with a conjugate of a terminal peptide of amyloid ⁇ and a biopolymer compound as a first antigen, and then immunizing the immunized animal with the first antigen.
  • a conjugate of a terminal peptide of amyloid ⁇ and a biopolymer compound is used as the second antigen, and the antibody is collected from the animal. It is intended to provide a method for producing the monoclonal antibody.
  • the fifth invention of the present application provides a therapeutic agent for Alzheimer's disease, comprising the monoclonal antibody as an active ingredient.
  • the sixth invention of the present application provides an amyloid ⁇ (1-40) or amyloid ⁇ (1-42) deposition inhibitor containing the monoclonal antibody as an active ingredient.
  • the seventh invention of the present application provides a method for treating Aluno-Ima disease, which comprises administering the monoclonal antibody.
  • the eighth invention of the present application provides a method for inhibiting deposition of amyloid ⁇ (140) or amyloid
  • the invention's effect comprises administering the monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibody of the present invention recognizes the terminal peptide of amyloid ⁇ and does not recognize the amyloid ⁇ precursor protein.
  • the above antibody inhibits deposition of amyloid ⁇ in the brain, so that it can be safely administered to the Alzheimer's disease. It will be possible to carry out the treatment of mam syndrome.
  • terminal antibody The monoclonal antibody of the present invention that recognizes the amyloid ⁇ terminal peptide and does not recognize the amyloid ⁇ precursor protein (hereinafter referred to as “terminal antibody”) is based on the prior art. It is difficult to obtain by immunizing an animal using the terminal peptide. This is because the amino acid sequence of amyloid j8 is completely identical to a part of the amyloid j8 precursor protein, so that it is difficult to obtain an antibody capable of distinguishing both.
  • an animal is immunized using a conjugate of the amyloid ⁇ -terminal peptide and a biopolymer compound as the first antigen, and then the immunization is performed.
  • the immunized animal is immunized with a conjugate of the ⁇ ⁇ -terminal peptide of amyloid ⁇ and the biopolymer compound, which is relatively shorter than the peptide used for the first antigen, as the second antigen, and the animal antibody is collected. It is necessary.
  • the terminal peptide of amyloid ⁇ used in the first antigen is a peptide from the terminal of the amino acid sequence of amyloid ⁇ (140) or amyloid ⁇ (1-42) (SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6).
  • 8 which is a peptide that also has continuous amino acid sequence power at the C-terminal side, especially the next amino acid sequence containing 116 of the amino acid sequence of amyloid j8 U, which is preferably a peptide represented by (a).
  • the peptide having the above amino acid sequence power can be obtained by various methods without particular limitation. For example, it may be synthesized by a method known in the art, or may be obtained by purchasing a synthetic product from Synpep Corporation and TANA Laboratories, USA.
  • the peptide having the amino acid sequence described above is then bound to a biopolymer compound, and this is used as a first antigen.
  • a biopolymer compound it is preferable to attach the cysteine (C) to the amino acid on the C-terminal side of the peptide, and bind the amino acid.
  • KLH Hemlock-
  • OVA ovalbumin
  • BSA ⁇ serum albumin
  • RSA ⁇ egret serum albumin
  • the binding between the peptide and the biopolymer compound can be performed, for example, by the mixed acid anhydride method (BF Elanger, et al .: J. Biol. Chem., 234 1090-1094 (1959)) or an activated ester. It can be carried out by a known method such as the method (AE KARU, et al .: J. Agric. Food Chem., 42, 301-309 (1994)).
  • the mixed acid anhydride used in the mixed acid anhydride method is obtained by subjecting the above peptide to a usual Schotten-Baumann reaction, and by reacting the peptide with a biopolymer compound, the desired peptide and the biological compound can be obtained. A conjugate with the polymer compound is created.
  • the haloformate used in the mixed acid anhydride method include methyl chloroformate, methyl bromoformate, ethyl ethyl chloroformate, ethyl bromoformate, and isobutyl chloroformate.
  • the ratio of the peptide, the haloformate and the polymer compound used in the method can be appropriately selected over a wide range.
  • the Schotten-Baumann reaction is performed in the presence of a basic conjugate, and the basic conjugate used in the reaction includes a compound commonly used in the Schotten-Baumann reaction, for example, Organic bases such as triethylamine, trimethylamine, pyridine, dimethyl-phosphorus, N-methylmorpholine, diazabicyclononene (DBN), diazabicycloundecene (DBU), diazabicyclo-octane (DABCO), potassium carbonate Inorganic bases such as sodium carbonate, sodium bicarbonate, sodium bicarbonate and the like can be used.
  • Organic bases such as triethylamine, trimethylamine, pyridine, dimethyl-phosphorus, N-methylmorpholine, diazabicyclononene (DBN), diazabicycloundecene (DBU), diazabicyclo-octane (DABCO), potassium carbonate
  • Inorganic bases such as sodium carbonate, sodium bicarbonate, sodium bicarbon
  • the above reaction is usually carried out at 20 ° C to 100 ° C, preferably 0 ° C to 50 ° C, and the reaction time is about 5 minutes to 10 hours, preferably 5 minutes to 2 hours.
  • the reaction between the obtained mixed acid anhydride and the biopolymer compound is usually performed at -20 ° C to 150 ° C, preferably at 0 ° C to 100 ° C, and the reaction time is 5 minutes to 10 hours. Degree, preferably 5 minutes to 5 hours.
  • the mixed acid anhydride method is generally performed in a solvent, but any solvent commonly used in the mixed acid anhydride method can be used as the solvent, and specifically, dichloromethane, chloroform, dichloroethane, etc.
  • Halogenated hydrocarbons aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene, xylene, etc., getyl ether, dioxane, tetrahydride
  • examples thereof include ethers such as furan and dimethoxyethane, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, and aprotic polar solvents such as N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, and hexamethylphosphoric triamide.
  • the activated ester method can be generally performed as follows. First, the above-mentioned peptide is dissolved in an organic solvent and reacted with N-hydroxysuccinimide in the presence of a coupling agent to produce N-hydroxysuccinimide-activated ester.
  • the coupling agent used in the reaction a usual coupling agent commonly used in a condensation reaction can be used, and examples thereof include dicyclohexylcarbodiimide, carbodiimidazole, and water-soluble carbodiimide.
  • the organic solvent for example, N, N-dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide, dioxane and the like can be used.
  • the molar ratio of the peptide used in the reaction to the coupling agent such as N-hydroxysuccinimide is preferably 1: 10-10: 1, most preferably 1: 1.
  • the reaction temperature is 0-50 ° C, preferably 22-27 ° C, and the reaction time is 5 minutes-24 hours, preferably 1-2 hours.
  • the reaction can be performed at a temperature not lower than the melting point and not higher than the boiling point.
  • the reaction solution is added to a solution in which the biopolymer compound is dissolved, and the reaction is performed.
  • the reaction temperature is 0-60 ° C, preferably 5-40 ° C, more preferably 22-27 ° C, and the reaction time is 5 minutes-24 hours, preferably 1-16 hours, more preferably 1-116 hours. 2 hours.
  • conjugate 1 The reaction product obtained by any of the above methods is purified by dialysis, a desalting column, or the like to obtain a conjugate of the peptide with the biopolymer compound (hereinafter, simply referred to as "conjugate 1"). V, sometimes).
  • the N-terminal peptide of amyloid which is used for the second antigen and is relatively shorter than the peptide used for the first antigen, is the same as the peptide used for the first antigen.
  • the peptide is relatively short in length, and is not particularly limited as long as it is a peptide. Is 3 to 11 amino acids, preferably 5 to 11 amino acids shorter than the peptide used for the antigen.
  • Such a peptide includes the amino acid sequence of 113 of amyloid j8.
  • a peptide represented by the following amino acid sequence (b) containing 115 of the amino acid sequence of amyloid j8 is preferred .
  • conjugate 2 a conjugate with a biopolymer compound (hereinafter sometimes simply referred to as “conjugate 2”) in the same manner as in preparing conjugate 1.
  • conjugate 1 and conjugate 2 obtained as described above as antigens
  • methods known in the art such as those described in the course of Seismic Chemistry Laboratory, Immunobiochemistry Research Method (edited by the Japanese Biochemical Society), etc. Can be used as appropriate.
  • conjugate 1 an animal is first immunized with conjugate 1 as a first antigen, and then conjugate 2 is immunized with the immunized animal. Immunization with the second antigen, and collecting the animal antibody.
  • the conjugate 1 is dissolved in a sodium phosphate buffer (hereinafter, referred to as "PBS"), and this is combined with Freund's complete adjuvant, incomplete adjuvant, or Millauban.
  • PBS sodium phosphate buffer
  • the animal is immunized by mixing with an adjuvant and using this as the first antigen.
  • the animal to be immunized can use any of those commonly used in the art. Examples thereof include mammals such as mice, rats, puppies, goats, and puppies.
  • the method of administration of the immunogen upon immunization may be any of subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, intradermal injection, and intramuscular injection, but subcutaneous injection or intraperitoneal injection is preferred. Immunization can be performed once or multiple times at appropriate intervals, preferably multiple times at one to five week intervals.
  • a second antigen is prepared from the animal immunized with the first antigen as described above using conjugate 2 in the same manner as the first antigen, and immunization is performed using the second antigen. Immunization can be performed once or multiple times at appropriate intervals, preferably multiple times at intervals of one to five weeks, similar to immunizing the first antigen.
  • the immune cells obtained from the immunized animal and myeloma cells were ligated according to a conventional method.
  • the monoclonal antibody to the N-terminus of amyloid j8 can be obtained by obtaining a hybridoma by fusing with the vesicle and collecting the antibody which is a culture medium of the hybridoma.
  • N-terminal antibody of the present invention thus obtained can be used as a reagent for an immunoassay or as a therapeutic agent for Alheimer's disease or the like.
  • HRP horseradish Peruokishidaze
  • an enzyme such as alkaline phosphatase, full O receptacle in iso Xia sulfonates, fluorescent substance rhodamine, 32 [rho, 125 radioactive substances such as iota, chemiluminescent substances
  • This is performed by binding the labeling substance of the above with the N-terminal antibody.
  • immobilization is performed by binding an N-terminal antibody to an appropriate solid phase.
  • the solid phase any of the solid phases commonly used in immunochemical assay methods can be used.
  • a plate such as a 96-well microtiter plate made of polystyrene or an amino-bonded microtiter plate can be used. And various beads.
  • a buffer containing the antibody may be added to the carrier and incubated.
  • the N-terminal antibody of the present invention can accurately measure amyloid j8 by combining it with an antibody that recognizes an antibody that recognizes amyloid / 3 (1-40) or amyloid / 3 (142). Use as a reagent with force S.
  • Antibodies that recognize amyloid / 3 (1-40) or amyloid / 3 (142) in combination with the N-terminal antibody of the present invention include, for example, amyloid j8 (1-40) or amyloid
  • an antibody that recognizes the C-terminal peptide of amyloid) 8 hereinafter, referred to as “C-terminal antibody” in terms of measurement accuracy.
  • the C-terminal antibody is not particularly limited as long as it identifies the C-terminal peptide of amyloid ⁇ (1-40) or amyloid ⁇ (1-42) to be measured. Antibodies that do not recognize amyloid
  • 8 (1-40) (hereinafter referred to as "C-terminal antibody 1”) is composed of amyloid (1-40) (SEQ ID NO: 5) from the C-terminal to the It can be obtained by a conventional method using a peptide (C-terminal peptide) consisting of an amino acid sequence continuous on the side as an antigen.
  • the C-terminal peptide used as the antigen also has an amino acid sequence power of 18-40 of amyloid
  • C-terminal antibody 2 a C-terminal antibody that recognizes amyloid (1-42) (hereinafter referred to as "C-terminal antibody 2”) is derived from the C-terminal to the N-terminal of amyloid ⁇ 8 (1-42) (SEQ ID NO: 6). It can be obtained by a conventional method using a peptide consisting of a continuous amino acid sequence on the side as an antigen. More specifically, the peptide used as an antigen is preferably a peptide having the amino acid sequence power of 18-42 of amyloid j8 (1-42), and in particular, it is composed of 38-42 of amyloid / 3 (1-42). The peptide represented by the amino acid sequence (d) of is preferred.
  • a conjugate of the above peptide and a biopolymer compound may be used as an antigen in the same manner as in the method for preparing the N-terminal antibody. It is preferable that the conjugate of the peptide and the biopolymer compound is attached to the N-terminal amino acid of the peptide by adding, for example, lysine 'cysteine (KC).
  • KC lysine 'cysteine
  • amyloid ⁇ (1-40) or amyloid ⁇ (1-42) as described above the following commercially available from Immune Biological Laboratories Co., Ltd. can also be used.
  • 8 (1-42) Accurately measure be able to.
  • Specific measurement methods include radioisotope immunoassay (RIA), ELISA (E. Engvall et al, (1980): Methods in EnzymoL, 70, 419-439), fluorescent antibody method, and plaque method.
  • Various methods (“hybridoma method and monoclonal antibody", stock method) have been used in general immunochemical assay methods such as spot method, agglutination method, Ouchterlony, immunochromatography method and the like. Meeting: Published by hR & D Planning, p. 30 p. 53, March 5, 1982).
  • step (A) an antibody that recognizes amyloid / 3 (140) or amyloid / 3 (142) is immobilized on a carrier, and then, in step (B), the antibody is immobilized on a solid phase.
  • the unmodified carrier surface is blocked by amyloid-independent, eg, protein.
  • step (C) a sample containing various concentrations of amyloid ⁇ is added thereto to generate a complex of amyloid ⁇ and the antibody, and then, in step (D), the labeled end antibody of the present invention is used.
  • step ( ⁇ ) a complex of amyloid ⁇ 8 and an antibody is bound thereto, and finally, in step ( ⁇ ), the amount of labeling is measured to determine the amount of amyloid j8 in the previously prepared calibration curve.
  • the antibody used in step (A) and step (D) can be measured in the reverse case, but an antibody that recognizes amyloid j8 (1-40) or amyloid
  • 8 (1-42) in the step (A) is not particularly limited. Any of those commonly used in the Hanagu immunochemical assay can be used. For example, a 96-well microtiter plate made of polystyrene or an amino group-bonded microtiter plate can be used.
  • a buffer containing the antibody may be added to a carrier and incubated. Known buffers can be used, for example, 10 mM PBS. The concentration of the above antibody in the buffer can be selected from a wide range of forces.
  • the blocking in the step (B) is performed by immobilizing the amyloid ⁇ in the sample to be added later on the carrier having the antibody immobilized in the step (A) irrespective of the antigen-antibody reaction.
  • the blocking agent for example, a commercially available blocking agent such as BS # or skim milk solution, or Block-Ace (Block-Ace: manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. (code No. UK-25B)) can be used.
  • Specific blocking is not limited, but, for example, an appropriate amount of Block Ace is added to the antigen-immobilized portion, incubated at about 4 ° C overnight, and then buffered. This is done by washing.
  • step (C) a sample containing amyloid ⁇ is brought into contact with an immobilized antibody, amyloid ⁇ is captured by the immobilized antibody, and the immobilized antibody and amyloid ⁇ are captured.
  • a complex with ⁇ is formed.
  • the conditions for forming this complex are not limited, but the reaction may be performed at about 4 ° C. to 37 ° C. for about 1 hour and overnight.
  • the carrier is preferably washed with a buffer to remove unreacted proteins and the like.
  • the buffer used for this reaction is preferably a composition of 10 mM PBS (pH 7.2) and 0.05% (v / v) Tween20.
  • step (D) a labeled antibody that recognizes another epitope of amyloid j8 captured by the immobilized antibody was added, and the immobilized antibody-amyloid-labeled antibody complex was added. Is formed.
  • the carrier is preferably washed with a buffer to remove unreacted proteins and the like.
  • the amount of the labeled antibody used in this step (D) is about 5,000 to 10,000 times the amount of the solid-phased antibody, and is preferably an amount diluted so that the final absorbance becomes 1.5 to 2.0.
  • a buffer solution can be used for the dilution, and the reaction conditions are not particularly limited. No. The above reaction binds the immobilized antibody amyloid) 8-labeled antibody complex. You can do it.
  • step (E) a chromogenic substrate solution that reacts with the labeling substance of the immobilized antibody amyloid ⁇ -labeled antibody complex is added, and the absorbance is measured. The quantity of 3 can be calculated.
  • peroxidase which is an enzyme
  • a labeled product of a labeled antibody for example, hydrogen peroxide and 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzine (hereinafter "TMB" t ⁇ , )
  • TMB 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzine
  • the color reaction can be performed by, but not limited to, adding a chromogenic substrate solution, reacting at about 25 ° C for about 30 minutes, and stopping the enzyme reaction by adding 12N sulfuric acid. . If TMB is used, color development is measured by absorbance at 450 nm.
  • alkaline phosphatase which is an enzyme
  • the color is developed using ⁇ -ditrophenyl phosphate as a substrate
  • the enzyme reaction is stopped by adding 2N NaOH, and the absorbance at 415 nm is measured. Is suitable.
  • the concentration of amyloid ⁇ in the sample can be calculated using a calibration curve prepared in advance based on the absorbance of the reaction solution to which a known concentration of amyloid ⁇ has been added.
  • 8 (1-42) are recognized. It is preferable to use a kit for measuring amyloid (hereinafter, referred to as the “kit of the present invention”), which comprises a second reagent containing an antibody to be tested.
  • the kit of the present invention can be prepared by a conventional method. Specifically, any of the N-terminal antibody of the present invention, an antibody that recognizes amyloid (1-40) or amyloid
  • 8 (1-42) which retains the full length in a sample such as plasma or serum, can be accurately measured by the measurement kit or the measurement method thus obtained. can do.
  • the N-terminal antibody of the present invention recognizes the ⁇ -terminal peptide of amyloid ⁇ and does not recognize the amyloid ⁇ precursor protein, it selectively binds to amyloid j8 and inhibits its deposition. be able to. Therefore, the N-terminal antibody of the present invention It can also be used as a therapeutic agent for a disease caused, preferably Alheimer's disease caused by accumulation of amyloid j8 in the brain.
  • the N-terminal antibody of the present invention when used as a therapeutic agent for alumno and imaginosis, the N-terminal antibody may be purified, if necessary, and formulated into a formulation by a conventional method.
  • the dosage form of the therapeutic agent for Alzheimer's disease is not particularly limited, and may be, for example, a liquid (injection). In preparing the preparation, carriers and carotenoids corresponding to these dosage forms can be used within a pharmaceutically acceptable range.
  • the dosage of the above therapeutic agent to a patient depends on the degree of the patient's symptoms, age, and the formulation of the preparation to be used, and depends on the antibody binding titer and the like. I just need to.
  • the N-terminal antibody of the present invention is used as a therapeutic agent for Alzheimer's disease as described above, it is preferable to use the N-terminal antibody as a chimeric antibody or a humanized antibody by a conventional method. Preparation of chimeric and humanized antibodies is described in European Patent Publication
  • EP0125023 European Patent Publications EP0239400, EP045126, International Publication WO94 / 20632, PUBMED ID 15316127 (Protein Eng Des Sel. 2004
  • the thus obtained therapeutic agent for Alzheimer's disease of the present invention does not react with APP in normal cells, it is safe and less likely to cause side effects such as inflammation.
  • amyloid high- and C-terminal peptides were purified by HPLC chromatography and then purified by Synpep. Corporation and Tana Corporation
  • peptide (e) is a peptide obtained by adding cysteine (C) to the amino acid sequence of 116 amyloid
  • peptide (f) is the amino acid sequence of 115 amyloid ⁇
  • the peptide (g) is a peptide obtained by adding KC to the 35-40 amino acid sequence of amyloid ⁇ (1-40) (SEQ ID NO: 3).
  • h) is a peptide obtained by adding lysine 'cysteine (KC) to the amino acid sequence of amyloid ⁇ (1-42) at 38-42 (SEQ ID NO: 4).
  • a conjugate of each of the above peptides with thyroglobulin was prepared by the EMCS (N- (6-Maleimidocaproyloxy) -succinimide) method as follows.
  • the molar ratio of thyroglobulin, peptide, and EMCS was 1: 300: 400, respectively.
  • each peptide of Example 1 was dissolved in about 1 ml of distilled water.
  • a solution prepared by dissolving 5 mg of thyroglobulin in 1 ml of 0.01 M phosphate buffer (pH 7.0) and EMCS 80 ⁇ / ⁇ 1 dissolved in dimethylformamide were mixed to give the above molar equivalents, respectively.
  • EMCS complex solution was prepared. The complex solution was divided into four parts, and each peptide solution was subjected to the above-mentioned molar equivalent amount to obtain a conjugate solution of the peptide cross-linked by EMCS and cycloglobulin.
  • the conjugate solution was dialyzed using PBS, and the concentration was adjusted to 10 ⁇ & ⁇ 1 as the conjugate.
  • the conjugates of the above peptides and thyroglobulin thus obtained were used as antigens for immunization in the following Examples.
  • the conjugate of the peptide (g) obtained in Example 2 and thyroglobulin was used as an antigen for immunization, and 50 1 (50 / ⁇ ) of the conjugate solution was administered every week or every other week, and The mouse was immunized.
  • the antigen was mixed with Freund's complete adjuvant only for the first immunization, and from the second dose with Freund's incomplete adjuvant.
  • a fusion partner with the spleen monocyte cells of immunized mice and polyethylene glycol-mediated cell fusion, and select hybridomas by the method described in the literature (J. Immunol. 146: 3721—3728) did. Selection was performed by selecting cells that appeared to react with the immobilized peptide (g) but not to peptide (h).
  • Antibodies were produced from the cells selected as described above in a serum-free GIT medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) until 80% of the cells were killed. Next, the cells were removed from this medium by centrifugation (10,000 rpm, 15 min), the ammonium sulfate was saturated at 50%, the mixture was allowed to stand at 4 ° C, and the precipitate was centrifuged (l, l). OOOrpm, 30min). Furthermore, this precipitate was diluted twice to bind
  • FIG. 1 shows the results of Western blotting. It was confirmed that the monoclonal antibody 1A10 did not react with amyloid j8 (1-42) and amyloid
  • mice were immunized in the same manner as in Example 3. Immunized mouse splenic monocyte cells and a fusion partner, X63-Ag8-653, were subjected to polyethylene glycol-mediated cell fusion and purified by the method described in the literature (J. Immunol. 146: 3721-3728). Was selected. Selection was performed by selecting cells that appeared to react to the immobilized peptide (h) but not to the peptide).
  • 8 (1-40) was used using the 1C3 antibody.
  • 8 (1-43) peptides were immunoprecipitated according to standard methods (eg, "Basic Experimental Methods for Molecular Biology", Nankodo). went.
  • the 6E10 antibody (Signet Laboratories, Inc.) was used for detection by the final plot.
  • the results of the immunoprecipitation are shown in FIG.
  • the 1C3 antibody specifically recognizes amyloid ⁇ (1-42) and may not recognize amyloid j8 (1-40), amyloid
  • BALBZc mice were immunized using the conjugate of peptide (e) obtained in Example 2 and thyroglobulin as an immunizing antigen. After four immunizations, two further immunizations were performed using the conjugate of peptide (f) and thyroglobulin.
  • X63—Ag8—653 a fusion partner, with spleen monocytes from immunized mice was subjected to polyethylene glycol-mediated cell fusion, and hybridomas were selected by the method described in the literature (J. Immunol. 146: 3721—3728) did. Selection was performed by selecting cells that responded to the immobilized peptide (e) and peptide (f). [0095] The cells selected as described above were purified in the same manner as in Example 3 to obtain an antibody recognizing the amyloid / 3 N-terminal peptide. This antibody was named 82E1.
  • This supernatant contains the ⁇ C terminal fragment (/ 3 CTF) cleaved at the ⁇ site from amyloid ⁇ and ⁇ by APP, and amyloid ⁇ and ⁇ . Further, in order to compare with the conventional antibody, the same sample was used to perform stamp lotting on the 6E10 antibody (manufactured by Signet Laboratories, Inc), which is said to recognize the terminal peptide of amyloid j8.
  • the conjugate of the 82E1 antibody and HRP obtained in Example 7 was prepared as follows. Dissolve the required amount of HRP in distilled water, oxidize with NalO, and add to ImM acetate buffer pH 4.4.
  • the conjugate of the 82E1 antibody and HRP prepared in Example 6 was used as a labeled antibody.
  • Fig. 5 shows the results of a standard curve obtained by measuring each peptide of synthetic amyloid
  • . ⁇ in Fig. 5 shows the results of measurement of synthetic amyloid ⁇ (140) using the combination of the 1A10 antibody and the HRP-labeled 82E1 antibody
  • ⁇ in Fig. 5 shows the results of the combination of the 1C3 antibody and the HRP-labeled 82E1 antibody. This is the result of measurement of synthetic amyloid j8 (1-42). All showed good linearity in a concentration-dependent manner.
  • amyloid j8 (1-42) and amyloid j8 (X-42) in the brain were measured by ELISA (FIG. 9), and were significantly reduced in the mice to which 82E1 was administered (both decreased by 50% (both 50%)). Both p ⁇ 0.05)).
  • the antibody of the present invention that recognizes the N-terminal peptide of amyloid j8 recognizes amyloid / 3 and does not recognize amyloid ⁇ precursor protein.
  • amyloid ⁇ measurement kit using the above antibody is commercially available! Unlike the amyloid j8 measurement kit, amyloid j8 (1-42) or amyloid
  • the above-mentioned kit for measuring amyloid ⁇ may be used for amyloid ⁇ -associated Alzheimer's disease or the like. It can be used for diagnosis of the disease and research on the mechanism of the onset. As a specific example, a search for a / 3 secretase inhibitor can be performed.
  • the therapeutic agent for Alzheimer's disease using the above antibody inhibits amyloid ⁇ deposition, but does not react with amyloid ⁇ precursor protein present in normal cells, which causes side effects such as inflammation. Excellent with little potential.
  • FIG. 1 is a drawing showing the specificity of the 1A10 antibody by Western blotting.
  • FIG. 2 is a drawing showing the specificity of the 1C3 antibody by immunoprecipitation.
  • FIG. 3 is a drawing showing the specificity of the 82E1 antibody by western blotting ( ⁇ : 82 ⁇ 1 antibody, ⁇ : 6 ⁇ 10 antibody).
  • FIG. 4 is a drawing showing the specificity of the 82E1 antibody by western blotting ( ⁇ : 82 ⁇ 1 antibody, ⁇ : 6 ⁇ 10 antibody).
  • FIG. 5 is a drawing showing the results of a standard curve measured using the synthetic amyloid
  • FIG. 6 is a drawing showing the results of immunostaining of the left cerebral hemisphere (including the cortex and hippocampus) ( ⁇ : mouse administered with 82E1 antibody, B: control mouse).
  • FIG. 7 is a drawing showing the results of immunostaining of the left cerebral hemisphere (basal nucleus) (A: mouse administered with 82E1 antibody, B: control mouse).
  • FIG. 8 is a drawing showing the deposition of amyloid j8 (1-40) and amyloid
  • FIG. 9 is a drawing showing the results of measuring amyloid

Abstract

　アミロイドβを認識し、アミロイドβ前駆体蛋白を認識しない抗体およびその利用方法を提供すること。 　アミロイドβのＮ端ペプチドを認識し、かつアミロイドβ前駆体蛋白を認識しないことを特徴とするモノクローナル抗体およびこれを利用したアミロイドβの測定キット、アルツハイマー症の治療剤ならびにアルツハイマー症の治療方法。  

Description

明 細 書
モノクローナル抗体およびその利用
技術分野
[0001] 本発明は、アミロイド βの Ν端ペプチドを認識し、かつアミロイド β前駆体蛋白を認 識しな 、ことを特徴とするモノクローナル抗体およびその利用に関する。
背景技術
[0002] アミロイド βは、アミロイド β前駆体蛋白（Amyloid
Precursor Protein: APP)から j8—セクレターゼおよび γ—セクレターゼにより切り出さ れる、 40アミノ酸または 42アミノ酸力もなるペプチドである。 40アミノ酸のアミロイド |8 をアミロイド (1— 40)といい、 42アミノ酸のアミロイド j8をアミロイド j8 (1— 42)という。 以下にそれぞれのアミノ酸配列を示す。
アミロイド (1-40) (配列番号 5)： DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVG SNKGAIIGLMVGGVV
アミロイド (1-42) (配列番号 6)： DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVG SNKGAIIGLMVGGVVIA
[0003] このアミロイド |8の内、アミロイド |8 (1-40)は、通常の代 f経路により切り出される ペプチドであり毒性が弱いと言われている。一方、アミロイド j8 (1— 42)は不溶性であ り、毒性が強ぐまた容易に凝集、繊維化し、脳内に蓄積するためアルツハイマー症 を引き起こす原因の 1つともいわれている。
[0004] 従って、各アミロイド βペプチドを測定することは、アルッノヽイマ一症の診断や、発 症に関するメカニズム等を研究する上で非常に重要である。
[0005] これまで、アミロイド βの測定にはアミロイド β抗体が利用されて 、る（例えば、特許 文献 1)。し力しながら、前記特許文献 1に記載のアミロイド j8抗体はアミロイド j8のァ ミノ酸配列の 3— 8にェピトープを有するものであったため、これを利用したアミロイド j8測定キットは完全に全長を保持したアミロイド j8 (1— 42)あるいはアミロイド |8 (1-4 0)を検出するものの、アミロイド β前駆体蛋白（ΑΡΡ)も検出するものであった。また、 既に市販されているアミロイド j8抗体（6E10 : Signet Laboratories, Inc)も APPを認識 するものであった。
[0006] また、アルツハイマー症の予防のために、アミロイド 13の脳内への蓄積を抑制するこ とが検討されている。しかしながら、これまでのアミロイド j8抗体はアミロイド j8だけで はなく正常細胞中の APPとも反応してしまうため、炎症等の副作用の原因となる可能 性が高ぐ臨床へ応用されていな力つた。
[0007] 特許文献 1：国際公開第 WO1994Z017197号パンフレット
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 従って、本発明の第 1の課題は、アミロイド βを認識し、 ΑΡΡを認識しな ヽ抗体を提 供することである。
[0009] また、本発明の第 2の課題は、上記抗体を利用して完全に全長を保持したアミロイ ド β (1 40)およびアミロイド |8 (1— 42)を正確に測定できる系を提供することである
[0010] さらに、本発明の第 3の課題は、上記抗体を有効成分とするアルツハイマー症の治 療剤等を提供することである。
課題を解決するための手段
[0011] 本発明者らは、第 1の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、特殊なぺプ チドで免疫を行うことで、アミロイド j8を認識し、 APPを認識しない抗体が得られること を見出した。
[0012] また、第 2の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、上記抗体を利用するこ とで完全に全長を保持したアミロイド j8 (1— 40)およびアミロイド |8 (1-42) (以下、こ れらを総称して「アミロイド j8」ということもある）を正確に測定できる系が構築できるこ とを見出した。
[0013] さらに、第 3の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、上記抗体がアミロイド
βの沈着を阻害し、アルツハイマー症の治療に用いることができることを見出した。
[0014] すなわち、本願の第 1の発明は、アミロイド βの Ν端ペプチドを認識し、かつアミロイ ド β前駆体蛋白を認識しな ヽことを特徴とするモノクローナル抗体を提供するもので ある。 [0015] 本願の第 2の発明は、アミロイド βの Ν端ペプチドを認識し、アミロイド β前駆体蛋 白を認識しない抗体を含む第 1の試薬と、アミロイド j8 (1— 40)またはアミロイド |8 (1- 42)を認識する抗体を含む第 2の試薬とを含むことを特徴とするアミロイド βの測定キ ットを提供するものである。
[0016] 本願の第 3の発明は、検体中のアミロイド /3に、アミロイド j8の N端ペプチドを認識し 、アミロイド β前駆体蛋白を認識しな 、抗体およびアミロイド β ( 1-40)またはアミロイ ド β (1-42)を認識する抗体を作用させることを特徴とするアミロイド βの測定方法を 提供するものである。
[0017] 本願の第 4の発明は、アミロイド βの Ν端ペプチドと生体高分子化合物との結合物 を第 1の抗原として動物に免疫を行い、次いで、前記免疫を行った動物に前記第 1の 抗原で用いたペプチドよりも相対的に短 、アミロイド βの Ν端ペプチドと生体高分子 化合物との結合物を第 2の抗原として免疫を行い、当該動物から抗体を採取すること を特徴とする前記モノクローナル抗体の製造方法を提供するものである。
[0018] 本願の第 5の発明は、前記モノクローナル抗体を有効成分として含むアルッハイマ 一症の治療剤を提供するものである。
[0019] 本願の第 6の発明は、前記モノクローナル抗体を有効成分として含むアミロイド β ( 1-40)またはアミロイド β (1-42)の沈着阻害剤を提供するものである。
[0020] 本願の第 7の発明は、前記モノクローナル抗体を投与することを特徴とするアルッ ノ、イマ一症の治療方法を提供するものである。
[0021] 本願の第 8の発明は、前記モノクローナル抗体を投与することを特徴とするアミロイ ド β (1 40)またはアミロイド |8 (1— 42)の沈着阻害方法を提供するものである。 発明の効果
[0022] 本発明のモノクローナル抗体は、アミロイド βの Ν端ペプチドを認識し、かつアミロイ ド β前駆体蛋白を認識しな ヽものである。
[0023] 従って、上記抗体を利用することで、従来は困難であった、完全に全長を保持した アミロイド (1— 40)およびアミロイド |8 (1— 42)を正確に測定することのできる系の構 築が可能となる。
[0024] また、上記抗体はアミロイド βの脳内への沈着を阻害するので、安全にァルツハイ マー症の治療を行うことが可能となる。
発明を実施するための最良の形態
[0025] 本発明のアミロイド βの Ν端ペプチドを認識し、かつアミロイド β前駆体蛋白を認識 しないモノクローナル抗体 (以下、これを「Ν端抗体」という）は、従来技術に基づきァ ミロイド j8の Ν端ペプチドを用いて動物に免疫をしても得ることは難しい。それはアミ ロイド j8のアミノ酸配列がアミロイド j8前駆体蛋白の一部と完全に同一であるため、両 者を識別しうる抗体が得られにく 、からである。
[0026] 従って、本発明の N端抗体を得るには、アミロイド βの Ν端ペプチドと生体高分子 化合物との結合物を第 1の抗原として動物に免疫を行い、次いで、前記免疫を行つ た動物に前記第 1の抗原で用いたペプチドよりも相対的に短いアミロイド βの Ν末端 ペプチドと生体高分子化合物との結合物を第 2の抗原として免疫を行い、当該動物 力 抗体を採取することが必要となる。
[0027] 上記の第 1の抗原および第 2の抗原を用いた本発明の Ν端抗体の作製方法を以下 に説明する。
[0028] 第 1の抗原で用いられるアミロイド βの Ν端ペプチドは、アミロイド β (1 40)あるい はアミロイド β (1-42)のアミノ酸配列（配列番号 5あるいは配列番号 6)の Ν末端から C末端側に連続したアミノ酸配列力もなるペプチドであり、アミロイド |8の 1一 28のアミ ノ酸配列からなるペプチドが好ましぐ特にアミロイド j8のアミノ酸配列の 1一 16を含 む次のアミノ酸配列（a)で示されるペプチドが好ま U、。
[0029] (a) DAEFRHDSGYEVHHQK (配列番号 1)
[0030] 上記アミノ酸配列力もなるペプチドは、特に限定されることなく種々の方法で得るこ とができる。例えば、当業界で公知の方法により合成してもよいし、シンぺップ社（ Synpep Corporation)およびタナ社（TANA Laboratories, USA)等から合成品を購入 することちでさる。
[0031] 上記のアミノ酸配列力 なるペプチドは、次に生体高分子化合物と結合させ、これ を第 1の抗原とする。この場合には上記ペプチドの C末端側のアミノ酸にシスティン（ C)を付けて結合させることが好ま 、。
[0032] 上記ペプチドに結合させる生体高分子化合物の例としては、スカシ貝のへモシァ- ン（以下「KLH」という）、卵白アルブミン（以下、「OVA」という）、ゥシ血清アルブミン（ 以下「BSA」という）、ゥサギ血清アルブミン（以下「RSA」という）、サイログロブリン等 が挙げられ、このうち KLHおよびサイログリブリンがより好ましい。
[0033] 上記ペプチドと生体高分子化合物との結合は、例えば、混合酸無水物法 (B. F. Er langer, et al.： J. Biol. Chem., 234 1090- 1094(1959))または活性化エステル法 (A. E. KARU, et al.： J. Agric. Food Chem., 42, 301- 309(1994))等の公知の方法によつ て行うことができる。
[0034] 混合酸無水物法において用いられる混合酸無水物は、上記ペプチドを通常のショ ッテン バウマン反応に付すことにより得られ、これを生体高分子化合物と反応させる ことにより目的とするペプチドと生体高分子化合物との結合物が作成される。この混 合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロ口蟻酸メチ ル、ブロモ蟻酸メチル、クロ口蟻酸ェチル、ブロモ蟻酸ェチル、クロ口蟻酸イソブチル 等が挙げられる。当該方法におけるペプチドとハロ蟻酸エステルと高分子化合物の 使用割合は、広い範囲力 適宜選択され得る。
[0035] なお、ショッテン-バウマン反応は塩基性ィ匕合物の存在下に行われるが、当該反応 に用いられる塩基性ィ匕合物としては、ショッテン-バウマン反応に慣用の化合物、例 えば、トリエチルァミン、トリメチルァミン、ピリジン、ジメチルァ-リン、 N メチルモルホ リン、ジァザビシクロノネン（DBN)、ジァザビシクロウンデセン（DBU)、ジァザビシク 口オクタン (DABCO)等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素力リウ ム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等を使用することができる。
[0036] また上記反応は、通常、 20°Cから 100°C、好ましくは 0°Cから 50°Cにおいて行わ れ、反応時間は 5分から 10時間程度、好ましくは 5分から 2時間である。
[0037] 得られた混合酸無水物と生体高分子化合物との反応は、通常- 20°Cから 150°C、 好ましくは 0°Cから 100°Cにおいて行われ、反応時間は 5分から 10時間程度、好まし くは 5分から 5時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われるが、溶媒とし ては、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能であり、具体的に はジクロロメタン、クロ口ホルム、ジクロロェタン等のハロゲン化炭化水素、ベンゼン、ト ルェン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジェチルエーテル、ジォキサン、テトラヒド 口フラン、ジメトキシェタン等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸ェチル等のエステル類 、 N, N—ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、へキサメチルリン酸トリアミド等 の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。
[0038] 一方、活性ィ匕エステル法は、一般に以下のように行うことができる。まず、上記ぺプ チドを有機溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にて N—ヒドロキシコハク酸イミドと 反応させ、 N-ヒドロキシコハク酸イミド活性ィ匕エステルを生成する。
[0039] 当該反応に用いられるカップリング剤としては、縮合反応に慣用されている通常の カップリング剤を使用でき、例えば、ジシクロへキシルカルボジイミド、カルボ-ルジィ ミダゾール、水溶性カルポジイミド等が挙げられる。また、有機溶媒としては、例えば N, N—ジメチルホルムアミド（DMF)、ジメチルスルホキシド、ジォキサン等が使用で きる。反応に使用するペプチドと N—ヒドロキシコハク酸イミド等のカップリング剤のモ ル比は好ましくは 1： 10— 10 : 1、最も好ましくは 1： 1である。反応温度は、 0— 50°C、 好ましくは 22— 27°Cで、反応時間は 5分一 24時間、好ましくは 1一 2時間である。反 応温度は各々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。
[0040] カップリング反応後、反応液を生体高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させ ると、例えば生体高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基と上記 ペプチドのカルボキシル基の間に酸アミド結合が生成される。反応温度は、 0— 60°C 、好ましくは 5— 40°C、より好ましくは 22— 27°Cで、反応時間は 5分一 24時間、好ま しくは 1一 16時間、より好ましくは 1一 2時間である。
[0041] 上記いずれかの方法により得られた反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製す ることにより、上記ペプチドと生体高分子化合物との結合物（以下、単に「結合物 1」と V、うことがある）を得ることができる。
[0042] 一方、第 2の抗原で用いられる、前記第 1の抗原で用いたペプチドよりも相対的に 短いアミロイド の N端ペプチドとは、前記第 1の抗原で用いたペプチドと同様に、ァ ミロイド βのアミノ酸配列の Ν末端力 C末端側に連続したアミノ酸配列からなるぺプ チドであって、そのペプチドの長さが相対的に短!、ペプチドであれば特に制限され ないが、第 1の抗原で用いたペプチドよりも 3— 11アミノ酸、好ましくは 5— 11アミノ酸 短いペプチドである。この様なペプチドとしては、アミロイド j8の 1一 13のアミノ酸配列 力もなるペプチドが好ましぐアミロイド j8の 1一 11のアミノ酸配列からなるペプチドが より好ましぐ特にアミロイド j8のアミノ酸配列の 1一 5を含む次のアミノ酸配列（b)で示 されるペプチドが好ましい。
[0043] (b) DAEFR (配列番号 2)
[0044] 上記ペプチドは、結合物 1を作成するのと同様の方法で生体高分子化合物との結 合物（以下、単に「結合物 2」 、うことがある）を作製することができる。
[0045] 次に、上記のようにして得られた結合物 1および結合物 2を抗原とし、これを用いる N端抗体の製造方法について説明する。なお、抗体の調製にあたっては、抗原とし て結合物 1および結合物 2を用いる以外は、公知の方法、例えば続生化学実験講座 、免疫生化学研究法（日本生化学会編)等に記載の方法を適宜利用することができ る。
[0046] 上記結合物を使用して本発明の N端抗体を作製するには、まず結合物 1を第 1の 抗原として動物に免疫を行い、次いで、前記免疫を行った動物に結合物 2を第 2の 抗原として免疫を行 、、当該動物力 抗体を採取すれば良 、。
[0047] 具体的な免疫方法としては、まず、結合物 1をリン酸ナトリウム緩衝液 (以下、「PBS 」という）に溶解し、これとフロイント完全アジュバントまたは不完全アジュバント、ある いはミヨゥバン等の補助剤と混合し、これを第 1の抗原として動物を免疫する。
[0048] 免疫される動物としては当該分野で常用されたものをいずれも使用できる力 例え ば、マウス、ラット、ゥサギ、ャギ、ゥマ等の哺乳動物を挙げることができる。また、免疫 の際の免疫原の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉 内注射のいずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は、 1回ま たは適当な間隔で複数回、好ましくは 1週間ないし 5週間の間隔で複数回行うことが できる。
[0049] 次いで、上記のように第 1の抗原で免疫を行った動物に、第 1の抗原と同様に結合 物 2を用いて第 2の抗原を作製し、これにより免疫を行う。免疫は、第 1の抗原を免役 するのと同様に、 1回または適当な間隔で複数回、好ましくは 1週間ないし 5週間の間 隔で複数回行うことができる。
[0050] 最後に、常法に従い、上記の免疫を行った動物から得た免疫細胞と、ミエローマ細 胞とを融合させてハイプリドーマを得、当該ハイプリドーマの培養物力 抗体を採取 することによってアミロイド j8の N端に対するモノクローナル抗体を得ることができる。
[0051] 斯くして得られる本発明の N端抗体は、免疫学的測定法の試薬としてあるいはアル ッハイマー症等の治療剤として使用できる。
[0052] 免疫学的測定法の試薬として使用するには、必要により標識ないし固相化すること が好ましい。
[0053] このうち標識は、西洋わさびペルォキシダーゼ（HRP)、アルカリフォスファターゼ等 の酵素、フルォレセインイソシァネート、ローダミン等の蛍光物質、 32ρ、 125ι等の放射 性物質、化学発光物質等の標識物質と N端抗体とを結合させることにより行われる。 また、固相化は適切な固相に N端抗体を結合させることにより行われる。固相として は、免疫化学的測定法において慣用される固相の何れをも使用することができ、例 えば、ポリスチレン製の 96穴マイクロタイタープレート、アミノ基結合型のマイクロタイ タープレート等のプレートや、各種のビーズ類が挙げられる。 N端抗体を固相化させ るには、例えば、抗体を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベーションすればよい
[0054] 本発明の N端抗体は、特にアミロイド /3 (1-40)またはアミロイド /3 (1 42)を認識 する抗体を認識する抗体と組合わせることにより、アミロイド j8を正確に測定すること 力 Sでさる試薬として使用でさる。
[0055] 本発明の N端抗体と組合わされるアミロイド /3 (1-40)またはアミロイド /3 (1 42)を 認識する抗体としては、例えば、アミロイド j8 (1— 40)またはアミロイド |8 (1— 42)のァ ミノ酸配列の一部または全部を抗原として、常法により得ることができるポリクローナ ル抗体やモノクローナル抗体が利用できる。本発明においては、これらの抗体の中 でも、特にアミロイド )8の C端ペプチドを認識する抗体 (以下、「C端抗体」という）を使 用することが、測定の正確さから好ましい。
[0056] 上記 C端抗体は、測定対象とするアミロイド β (1-40)またはアミロイド β (1-42)の C端ペプチドを識別する抗体であれば特に制限されないが、測定対象とするアミロイ ド β (1 40)またはアミロイド |8 (1— 42)以外のアミロイド |8 (1— 43)等を認識しない 抗体が好ましい。 [0057] 具体的にアミロイド |8 (1— 40)を認識する C端抗体 (以下、「C端抗体 1」という）は、 アミロイド (1-40) (配列番号 5)の C末端から Ν末端側に連続したアミノ酸配列から なるペプチド (C端ペプチド)を抗原として、常法により得ることができる。より具体的に 抗原とする C端ペプチドは、アミロイド |8 (1— 40)の 18— 40のアミノ酸配列力もなるぺ プチドが好ましぐ特にアミロイド j8 (1— 40)の 35— 40からなる次のアミノ酸配列（c) で示されるペプチドが好まし 、。
[0058] (c) MVGGW (配列番号 3)
[0059] 同様に、アミロイド (1-42)を認識する C端抗体 (以下、「C端抗体 2」という）は、ァ ミロイド ι8 (1-42) (配列番号 6)の C末端から N末端側に連続したアミノ酸配列からな るペプチドを抗原として、常法により得ることができる。より具体的に抗原とするぺプチ ドは、アミロイド j8 (1— 42)の 18— 42のアミノ酸配列力もなるペプチドが好ましぐ特 にアミロイド /3 (1-42)の 38— 42からなる次のアミノ酸配列（d)で示されるペプチドが 好ましい。
[0060] (d) GWIA (配列番号 4)
[0061] また、上記ペプチドを用いて C端抗体を作製する場合、抗原として前記 N端抗体の 作製方法と同様に、上記ペプチドと生体高分子化合物との結合物を利用しても良い 。この上記ペプチドと生体高分子化合物との結合物は、上記ペプチドの N末端側の アミノ酸に、例えばリジン'システィン (KC)を付けて結合させることが好ましい。
[0062] 上記のようなアミロイド β (1-40)またはアミロイド β (1-42)を認識する抗体として は株式会社免疫生物研究所力 市販されている下記のものを利用することもできる。
Anti-Human Amyloid β (35-40)
(1A10) Mouse IgG MoAb (製品番号： 10047)
Anti-Human Amyloid β (1-40)
Rabbit IgG Affinity Purify (製品番号： 18δ80)
Anti-Human Amyloid β (1-42)
Rabbit IgG Affinity Purify (製品番号： 18δ82)
[0063] 本発明の N端抗体とアミロイド β (1-40)またはアミロイド β (1-42)を認識する抗 体とを利用すればアミロイド j8 (1— 40)またはアミロイド |8 (1— 42)を正確に測定する ことができる。具体的な測定方法としては、放射性同位元素免疫測定法 (RIA法)、 E LISA法（E. Engvall et al, (1980): Methods in EnzymoL, 70, 419- 439)、蛍光抗体 法、プラーク法、スポット法、凝集法、ォクタ口-一（Ouchterlony)、ィムノクロマト法 等の、一般の免疫化学的測定法にぉ 、て使用されて 、る種々の方法（「ハイブリドー マ法とモノクローナル抗体」、株式会ネ: hR&Dプランニング発行、第 30頁 第 53頁、 昭和 57年 3月 5日）が挙げられる。
[0064] これらの測定方法は種々の観点力 適宜選択することができるが、感度、簡便性等 の点からは ELISA法が好ましい。より具体的な、アミロイド j8の測定について、 ELIS A法の一つであるサンドイッチ法を例にとってその手順を説明すれば次の通りである
[0065] まず、工程 (A)として、アミロイド /3 ( 1 40)またはアミロイド /3 ( 1 42)を認識する抗 体を担体に固相化し、次いで、工程 (B)として、抗体が固相化されていない担体表面 をアミロイド と無関係な、例えばタンパク質により、ブロッキングする。更に、工程 (C )として、これに各種濃度のアミロイド βを含む検体を加え、アミロイド βと抗体との複 合体を生成させた後、工程 (D)として、標識した本発明の Ν端抗体を加え、これにァ ミロイド ι8と抗体との複合体を結合させ、最後に工程 (Ε)として、標識量を測定するこ とにより、予め作成した検量線力 検体中のアミロイド j8の量を決定することができる 。なお、工程 (A)と工程 (D)に用いる抗体は逆の場合でも測定が可能であるが、アミ ロイド j8 (1— 40)またはアミロイド |8 (1— 42)を認識する抗体を固相化した方が検出感 度の点力も好ましい。
[0066] 具体的に工程 (A)において、アミロイド |8 (1— 40)またはアミロイド |8 (1— 42)を認 識する抗体を固相化するために用いられる担体としては、特別な制限はなぐ免疫化 学的測定法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリス チレン製の 96穴マイクロタイタープレートあるいは、アミノ基結合型のマイクロタイター プレートが挙げられる。また、上記抗体を固相化させるには、例えば、上記抗体を含 む緩衝液を担体上に加え、インキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のも のが使用でき、例えば 10mMの PBSを挙げることができる。緩衝液中の上記抗体の 濃度は広い範囲力も選択できる力 通常 0.01— 100 gZml程度、好ましくは 0.1— 20 gZmlが適している。また、担体として 96ゥエルのマイクロタイタープレートを使 用する場合には、 300 1Zゥ ル以下で 20— 150 1Zゥ ル程度が望ましい。更 に、インキュベーションの条件にも特に制限はないが、通常 4°C程度で一晩のインキ ュベーシヨンが適して 、る。
[0067] また、工程 (B)のブロッキングは、工程 (A)で抗体を固相化した担体にお!、て、後 に添加する検体中のアミロイド βが抗原抗体反応とは無関係に吸着される部分が存 在する場合があるので、それを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤としては、例えば、 BS Αやスキムミルク溶液や、ブロックエース（Block— Ace：大日本製薬製（コード No.UK -25B) )等の市販のブロッキング剤を使用することができる。具体的なブロッキングは 、限定されるわけではないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブロックエースを適 量カ卩え、約 4°Cで、一晩のインキュベーションをした後、緩衝液で洗浄することにより 行われる。
[0068] 更に、工程 (C)にお ヽて、アミロイド βを含む検体を固相化した抗体と接触させ、こ の固相化した抗体でアミロイド βを捕捉し、固相化した抗体とアミロイド βとの複合体 を生成させる。この複合体を生成させるための条件は限定されるわけではないが、 4 °C一 37°C程度で約 1時間一 1晩の反応を行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体 を洗浄し、未反応のタンパク質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩 衝液としては、 10mMの PBS (pH7.2)および 0.05% (v/v)の Tween20の組成の ものが好ましい。
[0069] また更に、工程 (D)において、固相化した抗体に捕捉されたアミロイド j8の別のェ ピトープを認識する、標識抗体を加え、固相化した抗体-アミロイド —標識抗体の複 合体を形成させる。この反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応のタンパク質 等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、前記したものが使 用される。この工程 (D)において使用される標識抗体の量は、固相化した抗体に対 して約 5,000— 10,000倍、好ましくは最終吸光度が 1.5— 2.0となるように希釈され た量である。希釈には緩衝液を用いることができ、反応条件は特に限定されるわけで はないが、 4°C一 37°C程度で約 1時間行い、反応後、緩衝液で洗浄することが好まし い。以上の反応により、固相化した抗体 アミロイド )8—標識抗体の複合体を結合す ることがでさる。
[0070] 最後に工程 (E)にお 、て、固相化した抗体 アミロイド β 標識抗体の複合体の標 識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線から アミロイド /3の量を算出することができる。
[0071] 標識抗体の標識物として、酵素であるペルォキシダーゼを使用する場合には、例 えば、過酸化水素と 3,3', 5,5'—テトラメチルベンジン（以下「TMB」 t\、う）を含む発 色基質溶液を使用することができる。発色反応は、限定されるわけではないが、発色 基質溶液を加え約 25°Cで約 30分間反応させた後、 1一 2Nの硫酸を加えて酵素反 応を停止させことにより行うことができる。 TMBを使用する場合、発色は 450nmの吸 光度により測定する。一方、標識物として、酵素であるアルカリホスファターゼを使用 する場合には、 ρ—二トロフエ-ルリン酸を基質として発色させ、 2Nの NaOHを加えて 酵素反応を止め、 415nmでの吸光度を測定する方法が適している。なお、既知の濃 度のアミロイド βを添加した反応液の吸光度により予め作成しておいた検量線を用い て、検体中のアミロイド βの濃度を算出できる。
[0072] 上記で説明したアミロイド βの測定方法を実施するには、本発明の Ν端抗体を含む 第 1の試薬と、アミロイド j8 (1— 40)またはアミロイド |8 (1— 42)を認識する抗体を含む 第 2の試薬とを含有することを特徴とするアミロイド の測定キット (以下、「本発明キッ ト」 t 、う）を利用することが好ま U、。
[0073] なお、本発明キットは常法により作製することができる。具体的には、本発明の N端 抗体、アミロイド (1— 40)またはアミロイド |8 (1— 42)を認識する抗体のいずれかを 標識抗体とし、他に、希釈用緩衝液、標準物質、基質用緩衝液、停止液、洗浄液等 を組み合わせればよい。
[0074] 斯くして得られる測定キットや測定方法により、血漿、血清等の検体中の完全に全 長を保持したアミロイド j8 (1— 40)またはアミロイド |8 (1— 42)を正確に測定することが できる。
[0075] また、本発明の N端抗体はアミロイド βの Ν端ペプチドを認識し、かつアミロイド β 前駆体蛋白を認識しないものであるので、アミロイド j8に選択的に結合し、その沈着 を阻害することができる。従って、本発明の N端抗体はアミロイド 蓄積することにより 引き起こされる疾患、好ましくはアミロイド j8が脳内に蓄積することにより発症するアル ッハイマー症の治療剤としても利用することができる。
[0076] 本発明の N端抗体をアルッノ、イマ一症の治療剤として利用する場合には、 N端抗 体を必要により精製し、常法により製剤化すればよい。このアルツハイマー症の治療 剤の剤形は特に制限されないが、例えば液剤（注射剤）とすることができる。また、製 剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これらの剤形に応じた担体や添カロ 剤を使用することができる。
[0077] また、上記治療剤の患者への投与量は、患者の症状の程度、年齢や使用する製剤 の剤型ある 、は抗体の結合力価等により異なるので、それらを考慮して決定すれば よい。
[0078] なお、本発明の N端抗体を上記のようにアルツハイマー症の治療剤に用いる場合 には、 N端抗体を常法によりキメラ抗体やヒト化抗体としたものを用いることが好ましい 。キメラ抗体やヒト化抗体の作製は、欧州特許公開公報
EP0125023,欧州特許公開公報 EP0239400、 EP045126、国際公開公報 WO 94/20632, PUBMED ID 15316127 (Protein Eng Des Sel. 2004
May;17(5):481-489. Epub 2004 Aug 17)、 9653494 (Ann
Oncol. 1998 May;9(5):527— 34.)、 1350088 (Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 May 15;89(10):4285-9.)等を参照することにより行うことができる。
[0079] 斯くして得られる本発明のアルッノヽイマ一症の治療剤は正常細胞中の APPと反応 しないので、炎症等の副作用の原因となる可能性が低ぐ安全なものとなる。
実施例
[0080] 以下、実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明する力 本発明はこれらにより何 ら制約されるものではない。また当業者は、本明細書の記載に基づいて容易に本発 明に修飾、変更を加えることができるが、それらも本発明の技術的範囲に含まれる。
[0081] 実施例 1
アミロイド βの Ν端ペプチドおよび C端ペプチドの入手：
アミロイド の Ν端ペプチドおよび C端ペプチドは、 HPLCクロマトグラフィー精製し た状態の品をシンぺップ社（Synpep Corporation)およびタナ社 (TANA
Laboratories, USA)より購入した。それらのペプチドのアミノ酸配列は、下記の ） 、（f)、 （g)および (h)に示す通りである。なお、ペプチド（e)はアミロイド |8の 1一 16の アミノ酸配列（配列番号 1)にシスティン (C)を付けたペプチドであり、ペプチド (f)は アミロイド βの 1一 5のアミノ酸配列（配列番号 2)に Cを付けたペプチドであり、ぺプチ ド（g)はアミロイド β (1-40)の 35— 40のアミノ酸配列（配列番号 3)に KCを付けたぺ プチドであり、ペプチド（h)はアミロイド β (1-42)の 38— 42のアミノ酸配列（配列番 号 4)にリジン'システィン (KC)を付けたペプチドである。
[0082] (e) DAEFRHDSGYEVHHQKC
(f) DAEFRC
(g) KCMVGGVV
(h) KCGWIA
[0083] 実施例 2
免疫用抗原の作製：
上記の各ぺプチドとサィログロブリンとの結合物をEMCS (N—（6—Maleimidocap royloxy)—succinimide)法により、以下のようにして作成した。なお、結合物を作る にあたり、サイログロブリンとペプチドと EMCSのモル比をそれぞれ 1： 300 :400とし た。
[0084] まず、実施例 1の各ペプチド 4mgを、それぞれ約 lmlの蒸留水に溶解した。一方、 lmlの 0.01Mリン酸バッファー（pH7.0)に 5mgのサイログロブリンを溶解したものと、 ジメチルホルムアミドで溶解した EMCS80 μ / μ 1とをそれぞれ上述モル相当量に なるように混合し、サイログロブリン- EMCS複合体溶液を作成した。この複合体溶液 を 4つ〖こ分け、その各々にそれぞれのペプチド溶液を上述モル相当量カ卩えることによ り、 EMCSで架橋されたペプチドとサイクログロブリンとの結合物溶液を作成した。
[0085] この結合物溶液を、 PBSを用いて透析し、結合物として 10 μ & μ 1になるように濃 度調製した。このようにして得られた上記の各ペプチドとサイログロブリンとの結合物 を免疫用抗原として以下の実施例に用いた。
[0086] 実施例 3 アミロイド β (1-40)の C端ペプチドを認識する抗体の作製：
免疫用抗原として、実施例 2において得られたペプチド (g)とサイログロブリンとの結 合物を用い、 1週間、または 2週間おきに結合物溶液の 50 1 (50 /^)を投与し、マ ウスを免疫化した。抗原は初回免疫のみにフロイント完全アジュバントと混和し、二回 目からはフロイント不完全アジュバントと混和した。免疫化されたマウスの脾単球細胞 と融合パートナー、 X63— Ag8— 653をポリエチレングリコール仲介細胞融合に付し、 文献 (J. Immunol. 146 : 3721— 3728)に述べた方法によりハイプリドーマを選択し た。選択は、固定ィ匕されたペプチド (g)に反応し、ペプチド (h)には反応しないように 見える細胞を選択することにより行った。
[0087] 上記のようにして選択した細胞を無血清培地の GIT培地 (和光純薬工業株式会社 製)で細胞の 80%が死滅するまで抗体を産生させた。次 、でこの培地から遠心（1,0 OOrpm、 15min)により細胞を取り除いた後、硫酸アンモ-ゥムを 50%飽和状態にし て 4°Cでー晚静置し、沈殿を遠心（l,OOOrpm、 30min)により回収した。更にこの沈 殿を 2倍に希釈した binding
buffer (Protein AMAPS Ilkit製）に溶解させた後、 Protein Aカラム（Pharmacia Amersham製）に IgGを吸着させた。その後、 PBS透析を一晩行って抗体を精製 し、アミロイド (1— 40)の C端ペプチドを認識する抗体を得た。そしてこの抗体を 1A 10と名付けた。
[0088] 実施例 4
ウェスタンブロッテイングによる 1 A10抗体の特異性の確認：
次に、実施例 3で得られた 1A10抗体がアミロイド |8 (1-40)の C端ペプチドを認識 することを確認するために、 1A10抗体を用いてアミロイド |8 (1— 40)、アミロイド |8 (1 42)およびアミロイド |8 (1— 43)の各ペプチドに対し、常法 (例えば、「分子生物学 基礎実験法」、南江堂）に従いウェスタンブロッテイングを行った。
[0089] ウェスタンブロッテイングの結果を図 1に示した。モノクローナル抗体 1A10は、アミ ロイド j8 (1— 42)およびアミロイド |8 (1-43)には反応せず、アミロイド j8 (1— 40)のみ を認識することが確認できた。
[0090] 実施例 5 アミロイド β ( 1-42)の C端ペプチドを認識する抗体の作製：
免疫用抗原として、実施例 2において得られたペプチド (h)とサイログロブリンとの 結合物を用い、実施例 3と同様の手法に従い、マウスを免疫化した。免疫化されたマ ウスの脾単球細胞と融合パートナー、 X63— Ag8— 653をポリエチレングリコール仲介 細胞融合に付し、文献 (J. Immunol. 146 : 3721— 3728)に述べた方法によりノヽィ プリドーマを選択した。選択は、固定化されたペプチド (h)に反応し、ペプチド ）に は反応しないように見える細胞を選択することにより行った。
[0091] 上記のようにして選択した細胞を実施例 3と同様に精製し、アミロイド /3 ( 1-42) ( C 端ペプチドを認識する抗体を得た。そしてこの抗体を 1C3と名付けた。
[0092] 実施例 6
免疫沈降法による 1C3抗体の反応性の確認：
次に、実施例 5で得られた 1C3抗体がアミロイド |8 ( 1-42)の C端ペプチドを認識す ることを確認するために、 1C3抗体を用いてアミロイド |8 ( 1— 40)、アミロイド |8 ( 1-41 )、アミロイド ( 1— 42)およびアミロイド |8 ( 1— 43)の各ペプチドに対し、常法 (例えば 、「分子生物学基礎実験法」、南江堂）に従い免疫沈降を行った。最終のプロットによ る検出には 6E10抗体（Signet Laboratories, Inc製）を用いた。
[0093] 免疫沈降の結果を図 2に示した。 1C3抗体は、アミロイド β ( 1-42)を特異的に認 識し、アミロイド j8 ( 1— 40)、アミロイド |8 ( 1— 41)およびアミロイド |8 ( 1— 43)を認識し ないことが確認できた。
[0094] 実施例 7
アミロイド βの Ν端ペプチドを認識する抗体の作製：
免疫用抗原として、実施例 2において得られたペプチド (e)とサイログロブリンとの結 合物を用い、 BALBZcマウスを免疫化した。 4回免疫を行った後、さらにペプチド (f )とサイログロブリンとの結合物を用い 2回免疫を行った。免疫化されたマウスの脾単 球細胞と融合パートナー、 X63— Ag8— 653をポリエチレングリコール仲介細胞融合 に付し、文献 (J. Immunol. 146 : 3721— 3728)に述べた方法によりノヽイブリドーマ を選択した。選択は、固定化されたペプチド (e)およびペプチド (f)へ反応する細胞 を選択することにより行った。 [0095] 上記のようにして選択した細胞を実施例 3と同様に精製し、アミロイド /3の N端ぺプ チドを認識する抗体を得た。そしてこの抗体を 82E1と名付けた。
[0096] 実施例 8
ウェスタンブロッテイングによる 82E1抗体の特異性の確認：
次に、実施例 7で得られた 82E1抗体がアミロイド |8の N端ペプチドを認識すること を確認するために、 82E1抗体を用いてアミロイド |8 (1— 40)、アミロイド |8 (2— 40)お よびアミロイド (3— 40)の各ペプチドに対し、常法 (例えば、「分子生物学基礎実験 法」、南江堂）に従いウェスタンブロッテイングを行った。また、比較としてアミロイド j8 前駆体蛋白（ΑΡΡ)を強制発現させたチャイニーズノ、ムスター細胞を、 1%の Triton を含む緩衝液でホモジナイズし、遠心後の上清をサンプルとして同様にウェスタンブ ロッテイングを行った。この上清には、 APPにカ卩え、アミロイド βおよび ΑΡΡから β部 位により切断された β Cターミナルフラグメント（ /3 CTF)が含まれる。さらに、従来の 抗体と比較するために、上記同一サンプルを用いて、アミロイド j8の Ν端ペプチドを 認識するといわれている 6E10抗体（Signet Laboratories, Inc製）についてもゥェ スタンプロッテイングをおこなった。
[0097] ウェスタンブロッテイングの結果を図 3、図 4に示した。図 3より 82E1抗体は、アミ口 イド β (2— 40)およびアミロイド |8 (3-40)には反応せず、アミロイド j8 (1— 40)のみを 認識することが確認できた。一方、 6E10抗体は、アミロイド |8 (1-40)には反応せず 、アミロイド (2— 40)およびアミロイド |8 (3— 40)を認識することが確認できた。また、 図 4より、モノクローナル抗体 82E1は、 ΑΡΡには反応せず、アミロイド βおよび β CT Fのみを認識することが確認できた。一方、 6E10抗体は、 ΑΡΡを認識することが確 認できた。
[0098] 実施例 9
アミロイド βの Ν端ペプチドを認識する抗体 (82E1抗体）と HRPとの結合物 の作製：
実施例 7で得られた 82E1抗体と HRPとの結合物は以下のように作製した。必要量 の HRPを蒸留水に溶かし、 NalOで酸化させた後、 pH4.4の ImM酢酸緩衝液に一
4
晚透析した。また、 82E1抗体の 2mgも pH9.5の 0.1M炭酸緩衝液にー晚透析した。 これらの透析した 82E1抗体と HRPを抗体 lmgに対して HRPが 0.4mgになるように 混合し、室温で 2時間反応させた。次いで、これに NaBHを加え氷中で 2時間反応さ
4
せた後 PBSにー晚透析した。更に、この反応物をゲル濾過し、 82E1抗体と HRPと の結合物を作製した。
[0099] 実施例 10
サンドイッチ ELISA法の構築：
上記実施例で得られた抗体を用いたサンドイッチ ELISA法の構築は以下のように して行った。まず、 20 /^ 1111の1八10抗体ぁるぃは1じ3抗体を100 1ずっ96 611 の ELISA用プレートにカ卩えた。次いで、これを 4°Cでー晚反応させた後、 1%BSAZ PBS/NaN溶液にてブロッキングを行い、サンドイッチ ELISA用プレートとした。ま
3
た、実施例 6で作成した 82E1抗体と HRPとの結合物を標識抗体とした。
[0100] 上記 ELISAプレートと標識抗体を用いて合成アミロイド |8 (1— 40)あるいは合成ァ ミロイド β (1-42)の各ペプチドを用いて測定を行った標準曲線の結果を図 5に示す 。図 5中の Αは、 1A10抗体と HRP標識 82E1抗体との組み合わせで合成アミロイド β (1 40)を測定した結果であり、図 5中の Βは、 1C3抗体と HRP標識 82E1抗体と の組み合わせで合成アミロイド j8 (1— 42)を測定した結果である。いずれも濃度依存 的に良好な直線性を示した。
[0101] 実施例 11
アミロイド ι8沈着阻害試験：
16ヶ月齢のアミロイド前駆体蛋白（APP)を発現する Tg2576遺伝子組換えマウス（ n= 3)に、実施例 7で得られた 82E1抗体を PBSを用いて lmgZmlに調整したもの を、毎週 1度、 lOmgZKg (マウス体重）の割合で、腹腔投与した。また、コントロール として PBSのみを同様に投与した（n= 2)。 82E1抗体または PBSを 12回（約 3ヶ月 間）投与したマウスを、屠殺し、左大脳半球を 4%の緩衝ィ匕ホルムアルデヒド溶液で 固定後、ノラフィン包埋した。次いで、ノラフィン包埋したものから 5 mの連続切片 を作製し、アミロイド j8 (1-40)およびアミロイド |8 (1-42)ポリクローナル抗体 (共に 株式会社免疫生物研究所製:製品番号 18580、 18582)を使って免疫染色した。そ の結果を図 6および図 7に示した。 [0102] また、切片を皮質力も 10枚、海馬から 5枚を選び、顕微鏡用デジタルカメラとシンプ ル PCIソフトウェア（Compix, Inc. Imaging Systems, USA)を使ってイメージ解 祈した。アミロイド j8 (1— 40)およびアミロイド |8 (1— 42)の沈着は全領域中の免疫染 色陽性領域の割合 (％)で示した。その結果を図 8に示した。
[0103] 更に、 pH7.6の 0.05Mトリス塩酸緩衝生理食塩水（TBS)不溶性アミロイド βを右 前頭部 (脳の 1Z4)から 6Μグァ-ジン塩酸で抽出し、実施例 10で作製したサンドィ ツチ ELISA系でアミロイド j8 (1— 42)およびヒューマンアミロイド j8 (1— 42)測定キット (株式会社免疫生物研究所製:製品番号 17711)でアミロイド j8 (x-42)を測定した 。抽出方法は文献 (M.
Morishima-Kawashima, et al., Am. J. Pathol, 157 (2000) 2093- 2099.)記載の方法に 従った。その結果を図 9に示した。
[0104] アミロイド β (1-42)の免疫染色像よりコントロールと比較して、 82E1を投与したマ ウス脳では老人斑の数が少な力つた（図 6)。また、皮質や海馬と比較してアミロイド j8 沈着の遅い基底核では 82E1を投与したマウスにおいては、コントロールと比較して 明らかに老人斑の数が少なかった（図 7)。この減少はイメージアナライザーでも確認 できた（図 8)。アミロイド |8沈着は 82E1を投与したマウスでアミロイド |8 (1-40) (皮 質で 30%の減少、海馬で 40%の減少（共に p< 0.05)。）、アミロイド |8 (1-42) (皮 質で 43%の減少（p< 0.01)、海馬で 40%の減少（p< 0.05)。）の両方が有意に減 少していた。更に、脳中のアミロイド j8 (1— 42)およびアミロイド j8 (X— 42)を ELISA で測定した結果（図 9)、 82E1を投与したマウスで有意に減少していた（共に 50%の 減少（共に p< 0.05) )。
産業上の利用可能性
[0105] 本発明のアミロイド j8の N端ペプチドを認識する抗体は、アミロイド /3を認識し、力 つアミロイド β前駆体蛋白を認識しな 、ものである。
[0106] 従って、上記抗体を利用したアミロイド β測定キットは、これまで市販されて!、るアミ ロイド j8測定キットと異なり、完全長を有するアミロイド j8 (1— 42)あるいはアミロイド |8
(1-40)を正確に測定することができる。
[0107] また、上記のアミロイド β測定キットは、アミロイド βが関連するアルッノヽイマ一症等 の診断や、発症に関するメカニズム等の研究に利用することができる。具体的な一例 を挙げれば /3セクレターゼ阻害剤の検索を行うことができる。
[0108] さらに、上記抗体を利用したアルツハイマー症の治療剤は、アミロイド βの沈着を阻 害するが、正常細胞中に存在するアミロイド β前駆体蛋白には反応しないため炎症 等の副作用の原因となる可能性が少ない優れたものである。
図面の簡単な説明
[0109] [図 1]図 1は、ウェスタンブロッテイングによる 1A10抗体の特異性を示す図面である。
[図 2]図 2は、免疫沈降による 1C3抗体の特異性を示す図面である。
[図 3]図 3は、ウェスタンブロッテイングによる 82E1抗体の特異性を示す図面である（ Α: 82Ε1抗体、 Β : 6Ε10抗体）。
[図 4]図 4は、ウェスタンブロッテイングによる 82E1抗体の特異性を示す図面である（ Α: 82Ε1抗体、 Β : 6Ε10抗体）。
[図 5]図 5は、実施例 10で作製した ELISAキットで合成アミロイド |8を用いて測定を おこなった標準曲線の結果を示す図面である (A: 1A10抗体と HRP標識 82E1抗体 との組み合わせで合成アミロイド j8 (1— 40)を測定した結果、 B : 1C3抗体と HRP標 識 82E1抗体との組み合わせで合成アミロイド β (1-42)を測定した結果)。
[図 6]図 6は、左大脳半球 (皮質と海馬を含む)の免疫染色の結果を示す図面である（ Α： 82E1抗体を投与したマウス、 B：コントロールマウス）。
[図 7]図 7は、左大脳半球 (基底核)の免疫染色の結果を示す図面である (A: 82E1 抗体を投与したマウス、 B :コントロールマウス）。
[図 8]図 8は、切片中のアミロイド j8 (1— 40)およびアミロイド |8 (1— 42)の沈着を全領 域中の免疫染色陽性領域の割合 (％)で示した図面である。
[図 9]図 9は、脳中のアミロイド |8 (1— 42)およびアミロイド |8 (X— 42)を ELISAで測定 した結果を示す図面である。

Claims

請求の範囲
[1] アミロイド βの Ν端ペプチドを認識し、かつアミロイド β前駆体蛋白を認識しな!ヽこと を特徴とするモノクローナル抗体。
[2] アミロイド βの Ν端ペプチド力 次のアミノ酸配列（a)で示されるペプチドである請求 項第 1項記載のモノクローナル抗体。
(a) DAEFRHDSGYEVHHQK (配列番号 1)
[3] アミロイド βの Ν端ペプチド力 次のアミノ酸配列 (b)で示されるペプチドである請求 項第 1項記載のモノクローナル抗体。
(b) DAEFR (配列番号 2)
[4] アミロイド βの Ν端ペプチドと生体高分子化合物との結合物を第 1の抗原として動 物に免疫を行い、次いで、前記免疫を行った動物に前記第 1の抗原で用いたぺプチ ドよりも相対的に短いアミロイド βの Ν端ペプチドと生体高分子化合物との結合物を 第 2の抗原として免疫を行い、当該動物から抗体を採取することにより得られる請求 項第 1項記載のモノクローナル抗体。
[5] アミノ酸配列 (a)で示されるペプチドと生体高分子化合物との結合物を第 1の抗原 として動物に免疫を行い、次いで、前記免疫を行った動物にアミノ酸配列 (b)で示さ れるペプチドと生体高分子化合物との結合物を第 2の抗原として免疫を行い、当該 動物から抗体を採取することにより得られる請求項第 1項記載のモノクローナル抗体
(a) DAEFRHDSGYEVHHQK (配列番号 1)
(b) DAEFR (配列番号 2)
[6] キメラ抗体である請求項第 1項な 、し第 5項の何れかの項記載のモノクローナル抗 体。
[7] ヒト化抗体である請求項第 1項な 、し第 5項の何れかの項記載のモノクローナル抗 体。
[8] アミロイド βの Ν端ペプチドを認識し、アミロイド β前駆体蛋白を認識しな！、抗体を 含む第 1の試薬と、アミロイド j8 (1— 40)またはアミロイド |8 (1— 42)を認識する抗体を 含む第 2の試薬とを含むことを特徴とするアミロイド βの測定キット。
[9] アミロイド β (1-40)またはアミロイド β (1-42)を認識する抗体が、アミロイド β (DC 端ペプチドを認識する抗体である請求項第 8項記載のアミロイド βの測定キット。
[10] アミロイド βの C端ペプチドが、次のアミノ酸配列（c)で示されるペプチドである請求 項第 8項記載のアミロイド βの測定キット。
(c) MVGGW (配列番号 3)
[11] アミロイド β (1-40)を測定するものである請求項第 10項記載のアミロイド βの測定 やット。
[12] アミロイド βの C端ペプチドが、次のアミノ酸配列（d)で示されるペプチドである請求 項第 8項記載のアミロイド βの測定キット。
(d) GWIA (配列番号 4)
[13] アミロイド β (1-42)を測定するものである請求項第 12項記載のアミロイド βの測定 やット。
[14] 検体中のアミロイド /3に、アミロイド j8の N端ペプチドを認識し、アミロイド /3前駆体 蛋白を認識しない抗体およびアミロイド j8 (1— 40)またはアミロイド |8 (1— 42)を認識 する抗体を作用させることを特徴とするアミロイド βの測定方法。
[15] アミロイド β (1-40)またはアミロイド β (1-42)を認識する抗体が、アミロイド β (DC 端ペプチドを認識する抗体である請求項第 14項記載のアミロイド βの測定方法。
[16] アミロイド βの Ν端ペプチドと生体高分子化合物との結合物を第 1の抗原として動 物に免疫を行い、次いで、前記免疫を行った動物に前記第 1の抗原で用いたぺプチ ドよりも相対的に短いアミロイド βの Ν末端ペプチドと生体高分子化合物との結合物 を第 2の抗原として免疫を行い、当該動物から抗体を採取することを特徴とする請求 項第 1項記載のモノクローナル抗体の製造方法。
[17] 請求項第 1項な 、し第 7項の何れかの項記載のモノクローナル抗体を有効成分とし て含むアルツハイマー症の治療剤。
[18] 請求項第 1項な 、し第 7項の何れかの項記載のモノクローナル抗体を有効成分とし て含むアミロイド j8 (1— 40)またはアミロイド |8 (1— 42)の沈着阻害剤。
[19] 請求項第 1項な 、し第 7項の何れかの項記載のモノクローナル抗体を投与すること を特徴とするアルツハイマー症の治療方法。 請求項第 1項ないし第 7項の何れかの項記載のモノクローナル抗体を投与すること を特徴とするアミロイド j8 (1— 40)またはアミロイド |8 (1— 42)の沈着阻害方法。
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Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008104580A1 (en) 2007-03-01 2008-09-04 Probiodrug Ag New use of glutaminyl cyclase inhibitors
US7732162B2 (en) 2003-05-05 2010-06-08 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase for treating neurodegenerative diseases
WO2011029920A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Probiodrug Ag Heterocylcic derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
WO2011045945A1 (ja) 2009-10-16 2011-04-21 国立大学法人京都大学 アミロイドβのターン構造を認識する抗体
WO2011107530A2 (en) 2010-03-03 2011-09-09 Probiodrug Ag Novel inhibitors
WO2011110613A1 (en) 2010-03-10 2011-09-15 Probiodrug Ag Heterocyclic inhibitors of glutaminyl cyclase (qc, ec 2.3.2.5)
WO2011131748A2 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Probiodrug Ag Novel inhibitors
WO2012123563A1 (en) 2011-03-16 2012-09-20 Probiodrug Ag Benz imidazole derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
WO2014136443A1 (ja) * 2013-03-08 2014-09-12 パナソニックヘルスケア株式会社 抗Ａβ４２モノクローナル抗体
EP2865670A1 (en) 2007-04-18 2015-04-29 Probiodrug AG Thiourea derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
EP3461819A1 (en) 2017-09-29 2019-04-03 Probiodrug AG Inhibitors of glutaminyl cyclase

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
WO2007022015A1 (en) * 2005-08-12 2007-02-22 Georgetown University Methods to evaluate amyloid beta-lowering agents using wild-type mice
DK1954718T3 (en) 2005-11-30 2014-12-15 Abbvie Inc Anti-A-globulomer antibodies antigenbindingsgrupper thereof, corresponding hybridomas, nucleic acids, vectors, host cells, methods for producing said antibodies,
EP1976877B2 (en) 2005-11-30 2016-10-05 AbbVie Inc. Monoclonal antibodies against amyloid beta protein and uses thereof
MX358175B (es) * 2005-12-12 2018-08-08 Ac Immune Sa Anticuerpos monoclonales especificos 1-42 beta con propiedades terapeuticas.
WO2008011348A2 (en) * 2006-07-14 2008-01-24 Ac Immune S.A. Humanized antibody against amyloid beta
US20080234311A1 (en) * 2006-11-08 2008-09-25 Jinhe Li IMMUNOASSAY FOR DETECTION AND QUANTIFICATION OF AMYLOID-beta PEPTIDES
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
EP2486928A1 (en) * 2007-02-27 2012-08-15 Abbott GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
US8613923B2 (en) 2007-06-12 2013-12-24 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US8048420B2 (en) 2007-06-12 2011-11-01 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
EP2170389B1 (en) * 2007-06-12 2014-10-29 AC Immune S.A. Humanized antibodies to amyloid beta
SG178809A1 (en) * 2007-10-05 2012-03-29 Genentech Inc Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases
EP2205631B1 (en) * 2007-10-05 2016-11-23 Genentech, Inc. Methods and compositions for diagnosis and treatment of amyloidosis
CA2701793C (en) * 2007-10-05 2017-04-25 Genentech, Inc. Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
GB0720912D0 (en) 2007-10-25 2007-12-05 Univ Cardiff Monoclonal Anitbody for APP
CA2774134A1 (en) * 2009-09-18 2011-03-24 Probiodrug Ag Novel assay for the detection of amyloid beta peptides
CA2796339C (en) 2010-04-15 2020-03-31 Abbott Laboratories Amyloid-beta binding proteins
US9176151B2 (en) * 2010-07-14 2015-11-03 Acumen Pharmaceuticals, Inc. Antibodies, kit and method for detecting amyloid beta oligomers
CN103179981B (zh) 2010-07-30 2017-02-08 Ac免疫有限公司 安全和功能性的人源化抗β‑淀粉样蛋白抗体
US9062101B2 (en) 2010-08-14 2015-06-23 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
EP2511296A1 (en) 2011-04-12 2012-10-17 Araclón Biotech, S. L. Antibody, kit and method for determination of amyloid peptides
JP2014521089A (ja) 2011-07-13 2014-08-25 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション 液体試料中のアミロイドベータオリゴマーの検出方法およびその使用
CA2888322A1 (en) * 2012-10-15 2014-04-24 Medimmune Limited Antibodies to amyloid beta
AU2014305658A1 (en) 2013-08-05 2016-02-11 St. Vincent's Institute Of Medical Research An antibody therapy for amyloid beta disease
TW202300517A (zh) 2021-03-12 2023-01-01 美商美國禮來大藥廠 抗類澱粉β抗體及其用途
WO2022251048A1 (en) 2021-05-24 2022-12-01 Eli Lilly And Company Anti-amyloid beta antibodies and uses thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000072876A2 (en) 1999-06-01 2000-12-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
EP0420081A1 (en) * 1989-09-26 1991-04-03 Takeda Chemical Industries, Ltd. Monoclonal antibody against an acidic FGF protein, its production and use
EP0683234B2 (en) 1993-01-25 2007-06-06 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibody against beta-amyloid or their derivative and use thereof
ATE256751T1 (de) 1993-03-11 2004-01-15 Chemo Sero Therapeut Res Inst Monoklonaler anti-hiv antikörper
US8173127B2 (en) * 1997-04-09 2012-05-08 Intellect Neurosciences, Inc. Specific antibodies to amyloid beta peptide, pharmaceutical compositions and methods of use thereof
JP2003516929A (ja) * 2000-06-01 2003-05-20 ニユーララブ・リミテツド アミロイド形成性疾患の予防および治療
CA2882022A1 (en) * 2003-09-11 2005-03-24 Walter Newman Monoclonal antibodies against hmgb1

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000072876A2 (en) 1999-06-01 2000-12-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Immunobiochemical Research Method in the Sequel Biochemical Experiment Lecture", JAPANESE BIOCHEMICAL SOCIETY
AKIRA TAMAOKA ET AL: "Alzheimer-byo no Kotai Ryoho.", GENDAI IRYO., vol. 34, no. 1, 2002, pages 237 - 244, XP002995629 *
JANUS C. ET AL: "A beta peptide immunization reduces behavioural impairment and plaques in a medel of Alzheimer's disease.", NATURE., vol. 408, no. 6815, December 2000 (2000-12-01), pages 979 - 982, XP002969677 *
JOHNSON-WOOD, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 94, 1997, pages 1550 - 1555
MATHEWS P.M. ET AL: "Alzheimer's Disease-related Overexpression of the Cation-dependent Mannose 6-Phosphate Receptor Increases a Secretion. Role for Altered Lysosomal Hydrolase Distribution in Amyloidogenesis.", J.BIOL.CHEM., vol. 277, February 2002 (2002-02-01), pages 5299 - 5307, XP002995628 *
MATHEWS P.M. ET AL: "Calpain activity regulates the cell surface distribution of amyloid precursor protein. Inhibition of clapains enhances endosomal generation of beta-cleaved C-terminal APP fragments.", J.BIOL.CHEM., vol. 277, no. 39, 27 September 2002 (2002-09-27), pages 36415 - 36424, XP002995626 *
See also references of EP1717250A4 *
VANDERMEEREN M. ET AL: "The functional gamma-secretase inhibitor prevents production of amyloid beta 1-34 in human and murine cell lines.", NEUROSC.LETT., vol. 315, no. 3, 27 November 2001 (2001-11-27), pages 145 - 148, XP002995627 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7732162B2 (en) 2003-05-05 2010-06-08 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase for treating neurodegenerative diseases
US8809010B2 (en) 2003-05-05 2014-08-19 Probiodrug Ag Method for prophylactic treatment of alzheimer's disease using inhibitors of glutaminyl cyclase and glutamate cyclases
EP2481408A2 (en) 2007-03-01 2012-08-01 Probiodrug AG New use of glutaminyl cyclase inhibitors
WO2008104580A1 (en) 2007-03-01 2008-09-04 Probiodrug Ag New use of glutaminyl cyclase inhibitors
EP2865670A1 (en) 2007-04-18 2015-04-29 Probiodrug AG Thiourea derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
WO2011029920A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Probiodrug Ag Heterocylcic derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
WO2011045945A1 (ja) 2009-10-16 2011-04-21 国立大学法人京都大学 アミロイドβのターン構造を認識する抗体
WO2011107530A2 (en) 2010-03-03 2011-09-09 Probiodrug Ag Novel inhibitors
WO2011110613A1 (en) 2010-03-10 2011-09-15 Probiodrug Ag Heterocyclic inhibitors of glutaminyl cyclase (qc, ec 2.3.2.5)
WO2011131748A2 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Probiodrug Ag Novel inhibitors
WO2012123563A1 (en) 2011-03-16 2012-09-20 Probiodrug Ag Benz imidazole derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
WO2014136443A1 (ja) * 2013-03-08 2014-09-12 パナソニックヘルスケア株式会社 抗Ａβ４２モノクローナル抗体
EP3461819A1 (en) 2017-09-29 2019-04-03 Probiodrug AG Inhibitors of glutaminyl cyclase

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