CN103179981B - 安全和功能性的人源化抗β‑淀粉样蛋白抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在淀粉样变性的治疗中用于治疗和诊断性用途的安全和功能性抗体，淀粉样变性是与淀粉样蛋白有关的一组疾病和病症，如阿尔茨海默病。

Description

安全和功能性的人源化抗β-淀粉样蛋白抗体
本发明主张2010年7月30日提交的美国临时专利申请No.61/400,650的优先权，该专利以其全部内容并入本文作为参考。
1.引言
本发明涉及用于淀粉样变性的安全和功能性治疗的方法和组合物，淀粉样变性是一种与淀粉样蛋白有关的一组疾病和病症，如阿尔茨海默病。
2.背景技术
淀粉样变性不是单一的疾病实体，而是一组以被称为淀粉样蛋白的蜡状、淀粉样蛋白的胞外组织沉积为特征的不同的进行性疾病过程，所述沉积在一种或多种器官或身体系统中积累。随着淀粉样蛋白沉积的积累，它们开始干扰器官或身体系统的正常功能。至少有15种不同类型的淀粉样变性。其主要形式为无已知前兆的原发性淀粉样变性、在一些其他病况后的继发性淀粉样变性和遗传性淀粉样变性。
在慢性感染或炎性疾病（如肺结核、称为家族性地中海热的细菌感染、骨感染（骨髓炎）、类风湿性关节炎、小肠炎（肉芽肿性回肠炎）、何杰金病和麻疯病）期间发生继发性淀粉样变性。
淀粉样蛋白沉积包括淀粉样蛋白P（五边形）组分（AP，与正常血清淀粉样蛋白P（SAP）有关的糖蛋白）和硫酸化糖胺聚糖（GAG，结缔组织的复合碳水化合物）。占淀粉样蛋白材料约90%的淀粉样蛋白纤丝包括几种不同类型蛋白质中的一种。这些蛋白质能够折叠成所谓的“β-褶状”片状纤丝，它是对导致淀粉样蛋白独特染色性质的刚果红表现出结合位点的独特蛋白质构型。
多种老化疾病是基于淀粉样蛋白样蛋白质或与之有关的，并且部分地以有助于病理发生和疾病发展的淀粉样蛋白或淀粉样蛋白样材料的细胞外沉积的积累为特征。这些疾病包括（但不限于）神经障碍，如阿尔茨海默病（AD）、路易体痴呆症、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉样变性（荷兰型）；关岛型肌萎缩侧索硬化-帕金森综合征-痴呆复合征。基于淀粉样蛋白样蛋白质或与之有关的其他疾病为进行性核上麻痹、多发性硬化、海绵状脑病、帕金森氏病、HIV相关性痴呆病、ALS（肌萎缩性侧索硬化症）、 成年型糖尿病；老年性心脏淀粉样变性；内分泌肿瘤以及其他疾病，包括眼部病症，如黄斑变性。
尽管这些疾病的病理发生可以是多样的，但是它们的特征性沉积通常含有多种共有的分子成分。在显著的程度上，这可以归因于促炎途径的局部激活作用，其借此导致激活的补体组分、急性期反应物、免疫调节剂及其他炎性介体的同时沉积（McGeer等人,1994）。
阿尔茨海默病（AD）是神经障碍，其被认为主要是通过作为蛋白质异常沉积在脑中的累积的淀粉状斑所引起的。在受影响的个体的脑中所发现的最常见的淀粉样蛋白类型主要是由Aβ纤丝组成的。科学证据显示在斑中β-淀粉样蛋白的产生和积累的增加导致神经细胞死亡，这有助于AD的发生和发展。反过来，策略性脑区域中神经细胞的损失导致神经递质的减少和记忆损伤。主要负责斑块形成的蛋白质包括淀粉样蛋白前体蛋白（APP）和两种早老素（早老素I和早老素II）。在大多数细胞中通过酶β和γ分泌酶组成性表达和分解代谢的淀粉样蛋白前体蛋白（APP）的连续分解导致39至43位氨基酸Aβ肽的释放。APP的降解作用有可能提高它们在斑块中聚集的倾向。特别地，由于处于其C末端的两个极疏水性氨基酸残基，Aβ(1-42)片段具有较高的形成均聚物的倾向。因此，据信Aβ(1-42)片段主要参与并负责在AD中引起神经炎性斑块形成，并因此具有较高的病理潜能。
因此，需要在AD患者中预防淀粉状斑和/或已有弥散性斑形成的治疗剂。具体地，需要能够抵制所述疾病生理表现的试剂，所述生理表现如与淀粉样蛋白或淀粉样蛋白样肽的纤维的聚集有关的斑块形成。
对β-淀粉样蛋白的被动免疫已成为AD治疗性治疗的日益所期望的策略。已在转基因AD动物模型中证明了被动免疫的有效性，其中抗Ab疗法已显示降低了斑块负荷并逆转了行为缺陷。尽管克服了作为使用Ab的自动免疫风险的细胞毒性T细胞的超激活作用，但被动免疫仍具有Fg受体介导的小神经胶质细胞的过度激活和补体激活的风险，这可能有助于不适当的促炎反应和血管源性水肿。
已在（例如）2007年6月21日公开的WO 2007/068412；2008年5月22日公开的WO2008/060364；2007年6月21日公开的WO 2007/068412；2007年6月21日公开的WO 2007/068412；2007年6月21日公开的WO2007/068412；2007年6月21日公开的WO 2007/068412；2008年12月24日公开的WO 2008/156621；2008年12月24日公开的WO 2008/156621；2008年12月24日公开的WO 2008/156621（另外参见表2）中描述了抗淀粉样蛋白β抗体。
在使用抗β淀粉样蛋白抗体的淀粉样变性（如AD）患者的治疗期间所观察到的副作用包括炎症性副作用，如脑膜炎和脑膜脑炎，以及脑中的液体积累（脑水肿）。需要减少或消除与淀粉样变性有关的并发症的疗法。
3.发明内容
本发明所述的新型组合物和方法为淀粉样变性如阿尔茨海默病（AD）的被动免疫疗法提供了更安全的治疗性替代选择。本发明部分基于以下发现：与先前已知的Aβ单克隆抗体（mAb）治疗剂相比，抗Aβ抗体具有有效的中和能力和降低的效应子功能，其降低Aβ毒性并同时避免了有害的副作用。尤其是，发明人发现被称为MABT的IgG4同种型的人源化抗Aβ单克隆抗体（mAb）能降低小神经胶质细胞的Fcγ-受体介导的过度激活的风险并且避免补体激活。MABT与多种形式的Aβ1-42和Aβ1-40高亲合力结合，保护不受Aβ1-42寡聚体诱导的细胞毒性，调节小神经胶质细胞对神经毒性Aβ的体外和体内吸收。当与含有相同抗原结合可变结构域并且对Aβ具有相同结合亲和力的人IgG1野生型亚型相比时，MABT表现出小神经胶质细胞中降低的胁迫激活的p38有丝分裂原激活的蛋白激酶（p38MAPK）的激活作用，并且诱导促炎介体的较少释放。
本发明还部分基于小神经胶质细胞中p38MAP激酶对AD中抗Aβ抗体介导的神经保护的激活的意外作用。通常认为p38MAP激酶活性是促炎性的并因此将认为会有助于淀粉样变性（如AD）的病原性炎症状态。然而，出人意料的是，小神经胶质细胞中的中间体p38MAP激酶的激活有助于抗Aβ抗体介导的神经保护而不会产生病原性炎症状态。
本文提供了用于淀粉样变性的安全治疗和/或预防的方法和组合物，所述淀粉样变性包括，但不限于阿尔茨海默病。淀粉样变性包括但不限于神经障碍，如阿尔茨海默病（AD）、路易体痴呆症、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉样变性（荷兰型）、关岛型肌萎缩侧索硬化-帕金森综合征-痴呆复合征（the Guam Parkinson-Dementia complex）以及基于淀粉样蛋白样蛋白质或与之有关的其他疾病，如进行性核上麻痹、多发性硬化、海绵状脑病、帕金森氏病、HIV相关性痴呆病、ALS（肌萎缩性侧索硬化症）、成年型糖尿病、老年性心脏淀粉样变性、内分泌肿瘤和其他疾病，其包括眼部病症，如黄斑变性、皮层视觉障碍、青光眼、视神经玻璃疣、视神经病、视神经炎、白内障、眼部淀粉样变性和角膜网状营养不良。
尤其是，本文提供了具有已被选择或修饰以触发小神经胶质细胞中p38MAP激酶的中间体激活的效应区的抗Aβ抗体。本文还提供了用于淀粉样变性（包括但不限于阿尔茨海默病）的治疗和预防的方法，其中选择了 剂量和/或给药方案从而使得p38MAP激酶在小神经胶质细胞中以中等水平激活。在具体的实施方式中，安全和功能性的抗Aβ抗体具有IgG4抗体的效应区。在某些更具体的实施方式中，安全和功能性的抗Aβ抗体具有IgG4抗体的CH2区。在某些具体的实施方式中，p38MAP激酶激活作用的中等水平是高于仅有毒性β-淀粉样蛋白寡聚体的p38MAP激酶激活作用水平但低于IgG1抗Aβ抗体与毒性β-淀粉样蛋白寡聚体共同的p38MAP激酶激活作用水平的水平。在某些实施方式中，修饰抗Aβ抗体的效应区从而降低了其效应子功能。在某些实施方式中，所述修饰可以是导致氨基酸取代和/或缺失的任何遗传变化。
进一步提供了用于改善抗Aβ抗体安全性的方法。在一种实施方式中，提供了改善非IgG4抗Aβ抗体的安全性的方法，包括用来源于IgG4抗体的恒定区替代所述非IgG4抗Aβ抗体的恒定区。在另一种实施方式中，提供了改善非IgG4抗Aβ抗体的安全性的方法，包括用来源于非IgG1抗体的恒定区替代所述非IgG4抗体的恒定区。一种具体的实施方式中，用于改善非IgG4抗β-淀粉样蛋白抗体的安全性的方法是用于改善IgG1抗Aβ抗体的安全性。
本文还提供了基于细胞培养物的测定系统，以测试抗Aβ抗体治疗和/或预防淀粉样变性（包括但不限于阿尔茨海默病）的安全性和功能性。在某些实施方式中，将小神经胶质细胞与毒性β-淀粉样蛋白寡聚体和测试抗Aβ抗体一起培育。小神经胶质细胞中抗Aβ抗体介导的β淀粉样蛋白的吸收表明了所述抗体在例如介导β淀粉样蛋白的清除中的功能性。小神经胶质细胞中抗Aβ抗体介导的p38 MAP激酶激活作用的中等水平表明抗体是功能性的和安全的。在某些实施方式中，p38 MAP激酶激活作用的中等水平是高于仅有毒性β-淀粉样蛋白寡聚体的p38 MAP激酶激活作用水平但低于具有野生型（即，未修饰的IgG1恒定区）的效应子功能水平的IgG1抗Aβ抗体的p38 MAP激酶激活作用水平的水平。这种基于细胞培养物的测定系统可以用于测试抗Aβ抗体保护神经元不受Aβ的神经毒性影响的能力。另外，这种基于细胞培养物的测定系统可以用于测试抗Aβ抗体以中等水平触发p38 MAP激酶激活作用的能力。
在某些实施方式中，所述基于细胞培养物的测定系统还包括神经元。神经元与毒性β-淀粉样蛋白寡聚体、测试抗Aβ抗体和小神经胶质细胞的共培育的存活率表明了测试抗Aβ抗体的功能性。
在某些实施方式中，所述基于细胞培养物的测定系统是原代皮层细胞培养物。所述原代皮层细胞培养物与毒性β-淀粉样蛋白寡聚体和测试抗Aβ抗体一起培育。小神经胶质细胞中抗Aβ抗体介导的β淀粉样蛋白的吸收表 明了抗体在（例如）介导β淀粉样蛋白清除中的功能性。小神经胶质细胞中抗Aβ抗体介导的p38 MAP激酶的中等水平的激活作用表明了抗体的功能性和安全性。
本文还提供了用于淀粉样变性的治疗和/或预防的功能性抗体，所述淀粉样变性包括但不限于阿尔茨海默病。在某些实施方式中，与Aβ结合的非IgG4人源化抗体的可变区与人IgG4抗体的恒定区结合。在其他实施方式中，与Aβ结合的IgG1人源化抗体的可变区与人IgG4抗体的恒定区结合。在某些实施方式中，用人IgG4抗体的CH2区替代与Aβ结合的非IgG4人源化抗体的CH2区。在其他实施方式中，用人IgG4抗体的CH2区替代与Aβ结合的IgG1人源化抗体的CH2区。在某些实施方式中，所述恒定区的恒定区来源于IgG1抗体，其中修饰所述IgG1抗体的恒定区从而使得所述修饰的恒定区具有降低或消除的效应子功能。
在其他实施方式中，提供了治疗和/或预防淀粉样变性（包括但不限于阿尔茨海默病）的方法，其中将IgG1抗Aβ抗体与抗炎剂联合给药从而使p38 MAP激酶在小神经胶质细胞中以中等水平被激活。在某些具体的实施方式中，p38MAP激酶激活作用的中等水平是高于仅有毒性β-淀粉样蛋白寡聚体的p38MAP激酶激活作用的水平但低于在仅存在寡聚体而无抗炎剂的情况下具有正常水平的效应子功能的IgG1抗Aβ抗体的p38MAP激酶激活作用的水平的水平。
3.1术语
如本文所使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”是可互换的并且定义以表示由氨基酸通过肽键连接的生物分子。
如本文所使用的，术语“一个”和“所述”定义以表示“一个或多个”并且除非在不适合的情况下，否则包含复数。
术语“淀粉样变性”是指由淀粉样蛋白或淀粉样蛋白样蛋白质所引起的或与之有关的一组疾病和病症，并且其包括但不限于由处于单体、纤丝或聚合物状态的或所述三种状态的任意组合的淀粉样蛋白样蛋白质的存在或活性所引起的疾病和病症，其包括通过淀粉状斑所引起的。这些疾病包括但不限于继发性淀粉样变性和年龄有关的淀粉样变性，如疾病，其包括但不限于神经障碍，如阿尔茨海默病（AD），以认知性记忆能力丧失为特征的疾病或病况，例如轻度认知障碍（MCI）、路易体痴呆症、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉样变性（荷兰型）、关岛型帕金森综合征-痴呆-肌萎缩侧索硬化复合征和基于淀粉样蛋白样蛋白质或与之有关的其他疾病，如进行性核上麻痹、多发性硬化、海绵状脑病、帕金森氏病、HIV相关性痴呆病、ALS（肌萎缩性侧索硬化症）、包涵体肌炎（IBM）、成年型糖尿病、 内分泌肿瘤和老年性心脏淀粉样变性；和多种眼部疾病，其包括黄斑变性、脉络膜小疣相关性视神经病和由于β-淀粉样蛋白沉积的白内障。
如本文所使用的，术语“检测”表示使用用于检测生物分子的已知技术（如免疫化学或组织学方法）并且是指定性或定量确定研究中生物分子的存在或浓度。
“淀粉样蛋白β”、“Aβ”或“β-淀粉样蛋白”是本领域承认的术语并且是指淀粉样蛋白β蛋白和肽及其修饰、片段和任何功能等价物，其可以通过淀粉样蛋白前体蛋白（APP）的蛋白水解破裂产生并且包括涉及淀粉样蛋白病理学或与之有关的那些APP片段，其包括（但不限于）Aβ1-38、Aβ1-39、Aβ1-40、Aβ1-41、Aβ1-42和Aβ1-43。
如上所述的淀粉样蛋白β肽的结构和序列对于本领域的技术人员是公知的并且在例如Glenner和Wong,Biochem Biophys Res Comm129,885-890(1984)中描述了产生所述肽或从脑和其他组织中提取它们的方法。此外，淀粉样蛋白β肽还是以多种形式可商购的。
术语“分离的”表示不含至少一些与其天然存在的组分的生物分子。
如本文所使用的，术语“抗体”是本领域承认的术语并且应理解为表示与已知抗原结合的分子或分子的活性片段，并且与术语“免疫球蛋白”或“免疫球蛋白分子”和免疫球蛋白分子的免疫活性部分（即，含有特异性结合抗原的结合位点的免疫球蛋白部分）可互换使用。免疫球蛋白是包含基本上由免疫球蛋白κ和λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及种种免疫球蛋白可变区基因所编码的一个或多个多肽的蛋白质。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，其反过来分别定义了免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。还已知重链的亚型。例如，人中的IgG重链可以是任何IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型。
如本文所使用的，与抗体有关的“特异性结合”表示抗体以比对结构不同的抗原更大的亲合力与其靶标抗原结合。
已知典型的免疫球蛋白结构单元包含四聚物。每个四聚物由相同的两对多肽链组成，每对具有一条“轻”链（约25kD）和一条“重”链（约50-70kD）。每条链的N末端定义了主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链（VL）和可变重链（VH）分别表示轻链和重链的这些部分。
抗体作为全长的完整抗体存在或者作为通过用多种肽酶或化学试剂酶切消化所产生的多个良好鉴定的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶酶切消化铰链区中二硫键以下的抗体以产生f(ab')2，即本身是通过二硫键结合到VH-CH1上的轻链的Fab的二聚物。可以在温和条件下还原f(ab')2以断裂 铰链区中的二硫键，借此将f(ab')2二聚物转化为Fab'单体。Fab'单体主要是具有部分铰链区的Fab片段（有关其他抗体片段更详细的描述，参见，Fundamental Immunology,W.E.Paul编著，Raven Press,N.Y.(1993)）。尽管就完整抗体的酶切消化而言定义了多种抗体片段，但是本领域的技术人员将理解可以通过化学方法或通过使用重组DNA方法从头合成任意多种抗体片段。因此，如本文所使用的术语抗体还包括通过完整抗体的修饰所产生的或从头合成的抗体片段或者通过使用重组DNA方法获得的抗体和片段。
术语“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、猴源化抗体、人抗体和人源化抗体及它们的其活性片段。与已知抗原结合的分子的活性片段的实例包括分离的轻和重链、Fab、Fab/c、Fv、Fab'和f(ab')2片段，其包括Fab免疫球蛋白表达文库中的产物和如上所述的任何抗体和片段的表位结合片段。可以通过多种技术获得这些活性片段。例如，可以用酶（如胃蛋白酶）切割单克隆抗体并进行HPLC凝胶过滤。然后，可以收集含有Fab片段的适合部分并通过膜过滤等浓缩。有关抗体活性片段分离的一般技术的进一步说明，参见，例如，Khaw,B.A.等人,J.Nucl.Med.23:1011-1019(1982)；Rousseaux等人,MethodsEnzymology,121:663-69,Academic Press,1986。
重组制备的抗体可以是常规全长抗体、已知来源于蛋白水解酶切消化的活性抗体片段、独特的活性抗体片段（如Fv或单链Fv（scFv））、结构域缺失抗体等。Fv抗体的大小为约50kd并且包含轻链和重链的可变区。单链Fv（“scFv”）多肽是共价连接的VH::VL杂二聚物，其可以由包含直接连接或通过肽编码接头连接的VH-和VL-编码序列的核酸所表达。参见Huston等人,(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883。多种结构用于将天然聚集的但化学分离的轻和重多肽链从抗体V区转化为将折叠成与抗原结合位点的结构基本类似的三维结构的scFv分子。参见，例如，美国专利No.5,091,513、5,132,405和4,956,778。
结合位点是指参与抗原结合的抗体分子的部分。通过重链（“H”）和轻链（“L”）的氨基末端可变（“V”）区的氨基酸残基形成了抗原结合位点。抗体可变区包括三种称为“高变区”或“互补决定区”（CDR）的高度分歧的延伸，其插入到被称为“框架区”（FR）的更保守的侧翼延伸之间。在抗体分子中，轻链的三种高变区（LCDR1、LCDR2和LCDR3）和重链的三种高变区（HCDR1、HCDR2和HCDR3）在三维空间中彼此相对布置以形成抗原结合面或口袋。因此，抗体结合位点代表组成抗体CDR的氨基酸和组成结合位点口袋的任何框架残基。
可以使用本领域中熟知的方法确定组成结合位点的特定抗体中氨基酸残基的类型。例如，可以将抗体CDR鉴别为最初由Kabat等人所定义的高变区（参见，"Sequences ofProteins of Immunological Interest,"E.Kabat等人,U.S.Department of Health andHuman Services;Johnson,G and Wu,TT(2001)Kabat Database and its applications:future directions.Nucleic Acids Research,29:205-206;http://immuno.bme.nwa.edu）。还可以将CDR的位置鉴别为最初由Chothia等人所描述的结构性环结构（参见，Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196,901(1987),Chothia等人,Nature342,877(1989)和Tramontano等人,J.Mol.Biol.215,175(1990)）。其他方法包括作为Kabat和Chothia之间的折中的“AbM定义法（AbM definition）”并且它是使用牛津分子AbM抗体模型软件（Oxford Molecular's AbM antibody modeling software，现为Accelrys）获得的，或者Macallum等人（“Antibody-antigen interactions:contact analysis and bindingsite topography,”J Mol Biol.1996 Oct 11;262(5):732-45）的CDR“接触定义法（contact definition）”。
嵌合抗体是其中所述抗体的一个或多个区域来自于来源于第一生物种的抗体并且所述抗体的一个或多个区域来自于来源于第二不同生物种的抗体那些抗体。在一种实施方式中，嵌合抗体是包括来自灵长类免疫球蛋白的区域的抗体。通常应理解用于人临床使用的嵌合抗体具有来自非人动物（例如，啮齿动物）的可变区和来自人抗体的恒定区。相反，人源化抗体使用来自非人抗体的CDR和来自人抗体的大部分或全部可变框架区和全部恒定区。通常应理解人嵌合抗体具有来自啮齿动物抗体的可变区。典型的人嵌合抗体具有人重链恒定区和人轻链恒定区以及来源于啮齿动物抗体的重链和轻链可变区。嵌合抗体可以包括对人恒定区的天然氨基酸序列和天然啮齿动物可变区序列的一些改变。可以通过本领域中公知的方法（包括CDR接枝法）制备嵌合和人源化抗体（参见，例如，美国专利No.5,843,708；6,180,370；5，693762；5,585,089；5,530,101）、链更替策略（参见，例如，美国专利No.5,565,332；Rader等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)95:8910-8915）、分子模型策略（美国专利No.5,639,641）等。
对于两条或更多条链抗体来说，如本文所使用的“人源化抗体”是其中至少一条链是人源化的抗体。人源化抗体链具有其中一个或多个框架区为人的可变区。单链的人源化抗体是其中所述链具有其中一个或多个框架区为人的可变区的抗体。人源化抗体链的可变区的非人部分或其片段来源于非人来源，具体地，非人抗体，通常为啮齿动物来源的。非人来源对人源化抗体的作用通常以至少一个CDR区的形式提供，所述CDR区布置在来源 于一个（或多个）人免疫球蛋白的框架区之间。另外，可以改变框架支持残基（frameworksupport residue）以保持结合亲合力。
“人源化抗体”还可以包含恒定区（例如，对于轻链来说至少一个恒定区或其部分，和在一些实施方式中，对于重链来说三个恒定区）。如果存在，人源化抗体的恒定区通常为人来源的。获得人源化抗体的方法对于本领域的技术人员来说是公知的。（参见，例如，Queen等人,Proc.Natl Acad SciUSA,86:10029-10032(1989)，Hodgson等人,Bio/Technology,9:421(1991)）。还可以通过能够在大型动物（例如，兔和小鼠）中产生亲合力成熟的人样多克隆抗体的新型基因工程方法获得人源化抗体。参见，例如，美国专利No.6,632,976。
如本文所使用的，术语“恒定区”或缩写“CR”是指免疫球蛋白的恒定区基因。所述恒定区基因编码赋予效应子功能的抗体分子部分。用人恒定区取代嵌合人抗体和人源化抗体，通常非人（例，鼠类）恒定区。本文提到的嵌合或人源化抗体的恒定区通常来源于人免疫球蛋白。重链恒定区可以选自以下五种同种型中的任一种：α、δ、ε、γ或μ。另外，各种亚型的重链（如IgG的重链亚型）负责不同的效应子功能并因此通过选择所需的重链恒定区可以产生具有所需效应子功能的抗体。可以在本发明的范围内使用的恒定区为γ1（IgG1），具体地，γ1（IgG1）同种型、γ3（IgG3）并且特别是γ4（IgG4）的Fc区，所述轻链恒定区可以是κ或λ型，优选κ型。在一种实施方式中，所述轻链恒定区是人κ恒定链（Heiter等人,(1980)Cell22:197-207）并且恒定重链是人IgG4恒定链。
术语“单克隆抗体”在本领域中也是公知的，并且是指作为单个克隆抗体产生细胞的产物的抗体。通常通过将常规的短寿命的产生抗体的B细胞融合至快速生长细胞（如癌细胞（有时称为“永生”细胞））来制备单克隆抗体。所得的杂交细胞或杂交瘤快速增殖，从而获得了产生抗体的克隆。
出于本发明的目的，“单克隆抗体”还应理解为包含通过尚未达到完全单克隆性的母本克隆所产生的抗体。
根据本发明所述的抗体可以是免疫球蛋白或抗体，其将理解为其每个结合位点都是相同的（如果为多价），或者作为另外一种选择，可以是双重特异性抗体或多重特异性抗体。
“双重特异性”或“双功能抗体”是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂交抗体。可以通过多种方法（包括杂交瘤融合或Fab'片段连接）产生双重特异性抗体。参见，例如，Songsivilai & Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)；Kostelny等人,J.Immunol.148,1547-1553(1992)。“多重特异性”或“多功能抗体”是具有两对以上不同的重链/轻链对和 两个以上不同的结合位点的人工杂交抗体。可以使用与双重特异性抗体相同的多种方法产生多重特异性抗体。
术语“片段”是指包含比完整或完全抗体或抗体链更少的氨基酸残基的抗体或抗体链部分。可以通过完整或完全抗体或抗体链的化学或酶促处理获得片段。还可以通过重组方法获得片段。示例性片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc和/或Fv片段。术语“抗原结合片段”是指结合抗原或与完整抗体（即它们所来源的完整抗体）竞争抗原结合（即特异性结合）的免疫球蛋白或抗体的多肽片段。可以通过重组DNA技术，或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学切割产生结合片段。结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc、Fv、单链和单链抗体。
“片段”还是指包含另一个多肽的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基、至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列的肽或多肽。在具体的实施方式中，多肽片段保留了所述多肽的至少一种功能。
术语“抗原”是指可以结合至抗体的实体（entity）或其片段。免疫原是指可以在生物（具体地，动物，更具体地，哺乳动物，包括人）中引起免疫应答的抗原。术语抗原包括被称为抗原决定簇的区域或表示负责抗原性的抗原部分（其是接触的或者其在支持所述抗原中所存在的接触中起显著作用）的表位。
如本文所使用的，术语“可溶的”表示在水溶液中部分或完全溶解的能力。
还如本文所使用的，术语“免疫原性的”是指引起针对免疫原抗原的抗体、T细胞及其他反应性免疫细胞的产生的物质。
如本文所使用的术语免疫原性是指当施用于受体时，抗原引起免疫应答（体液或细胞）的能力的量度。当个体针对所施用的本发明的免疫原性组合物产生足够的抗体、T细胞及其他反应性免疫细胞以缓解或减轻待治疗病症时，发生免疫应答。
具有“降低的免疫原性”的人源化抗体是指相对于亲本抗体（例如，鼠抗体）表现出降低的免疫原性的人源化抗体。
“基本保留了亲本抗体的结合性能”的人源化抗体是指保留了特异性结合用于产生该人源化抗体的亲本抗体所识别的抗原的能力的人源化抗体。在一些实施方式中，人源化抗体将显示出与亲本抗体相同或基本相同的抗原结合亲和力（affinity）和亲合力（avidity）。在某些实施方式中，抗体的亲和力将不小于亲本抗体亲和力的10%，不小于亲本抗体亲和力的约30%或不小于亲本抗体亲和力的50%。用于测定抗原结合亲和力的方法在本领域中是公知的并且包括半最大结合测定、竞争测定和斯卡查德分析。在本专利申请中描述了适合的抗原结合测定。
如本文所使用的，“保守变化”是指基本上构象或抗原性中性的变化，从而与天然蛋白质相比，分别在突变体多肽的三级结构中产生最小的变化或在突变体多肽的抗原决定簇中产生最小的变化。当提及本发明所述的抗体和抗体片段时，保守变化是指不会使所述抗体不能与本主题受体结合的氨基酸取代。本领域那些技术人员将能够预测在维持作为构象和抗原性中性的较高概率的同时可以做出的氨基酸取代。例如，在Berzofsky,(1985)Science229:932940和Bowie等人,(1990)Science247:13061310中提供了这种指导。需要考虑的影响维持构象和抗原性中性的概率的因素包括（但不限于）：（a）疏水性氨基酸的取代不太可能影响抗原性，这是因为疏水性残基更可能位于蛋白质内部；（b）生理化学相似的氨基酸的取代不太可能影响构象，这是因为取代的氨基酸在结构上模拟天然氨基酸；（c）进化保守序列的改变可能会不利地影响构象，因为这种保守表明氨基酸序列可以具有功能重要性。本领域的技术人员将能够使用熟知的测定评价蛋白质构象的变化，如，但不限于，微量补体结合法（Wasserman等人,(1961)J.Immunol.87:290295；Levine等人,(1967)Meth.Enzymol.11:928936）和使用构象依赖性单克隆抗体的结合研究（Lewis等人,(1983)Biochem.22:948954）。
术语“治疗功能性的量”是指当向人或动物给药时，足以在所述人或动物中导致产生治疗效果的抗体的量。本领域的技术人员按照常规程序能够容易地确定功能性的量。
如本文所使用的，术语“治疗”和“预防”是指在受试者中由于预防剂或治疗剂的施用所导致的病症的一种或多种症状的复发或发生的预防。
在抗β淀粉样蛋白抗体的情况下，“安全和功能性的量”是指当施用给阿尔茨海默病患者时，抗β淀粉样蛋白抗体的量在该患者中减少或预防新的淀粉状斑的形成，减少该患者中淀粉状斑的负荷和/或减少或预防该患者认知能力的恶化或改善该患者的认知能力，并且其中未观察到副作用，如炎症副作用，例如，脑膜炎和脑膜脑炎，并且未观察到脑中的液体积累（脑 水肿）或者其中任何副作用均未严重到必须中断患者治疗的程度。在某些实施方式中，相对于未处理的对照，新的淀粉状斑的形成减少了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%。在某些实施方式中，相对于未处理的对照，淀粉状斑的负荷减少了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%。在某些实施方式中，相对于未处理的对照，所述患者认知能力的恶化减少了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%。在某些实施方式中，相对于未处理的对照，所述患者的认知能力改善了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%。
术语“非IgG1抗体”是指具有以下同种型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM之一的任何恒定区的抗体，除了非IgG1抗体不具有保留其野生型效应子功能的IgG1恒定区。在具体的实施方式中，非IgG1抗体是IgG4抗体。在其他具体的实施方式中，非IgG1抗体具有来源于已突变从而使所得抗体的效应子功能相对于野生型IgG1抗体降低或消除的IgG1抗体的恒定区。
在p38MAP激酶激活作用的情况下，术语“中等水平”是指高于在不存在人源化非IgG1抗β淀粉样蛋白抗体的情况下的p38MAP激酶激活作用水平但低于在存在相同浓度的IgG1抗β淀粉样蛋白抗体的情况下的p38MAP激酶激活作用水平的p38MAP激酶激活作用水平，所述IgG1抗β淀粉样蛋白抗体以与人源化非IgG1抗β淀粉样蛋白抗体相同的Kd与β淀粉样蛋白结合。
4.附图说明
本专利或专利申请文件包含至少一幅彩图。通过索取并付出必要的费用，办公室将提供带有彩图的本专利或专利申请公开的副本。
图1提供了对应于实施例6.1和6.2中所述的实验的图和免疫组织化学图片。抗AβMABT单克隆抗体以高亲合力与不同的Aβ肽结合并且具有抗聚集体性能。将Aβ ELISA用于比较与人和鼠Aβ1-42和人Aβ1-40结合的mMABT（A）和MABT（B）。还测试了MABT与不同的Aβ1-42组装状态（C）的结合。MABT结合存在于来自转基因APP小鼠的脑切片（D上半部分）和人AD颞叶神经皮层切片（D下半部分）中的Aβ斑。通过MABT阻止Aβ1-42聚集并且掩饰预先形成的Aβ1-42聚集物的能力显示了体外功能性。在ThT基测定中使用10:1的摩尔比（Aβ1-42比单克隆抗体）证明了Aβ1-42聚集的抑制和预先形成的Aβ1-42聚集物的解聚（E）。作为对照，使用了具有N-末端表位的抗AβIgG单克隆抗体。结果显示了三个独立实验 的平均值（±SD）。*P<0.05，**P<0.01。还在Aβ1-42自组装测定中测试了MABT，一旦与多聚体Aβ组装物结合，则所述测定不依赖于ThT荧光，如方法中所述（F）。显示了两个测定的平均值（±SEM）。
图2提供了对应于实施例6.3中所述的实验的图和免疫组织化学图片。MABT抑制原代混合皮层培养中Aβ1-42寡聚体的细胞毒性。用具有或不具有100μg/mL MABT或IgG对照单克隆抗体的2.5μM或5μM Aβ1-42寡聚体处理来自P1大鼠的混合皮层细胞。如方法一节中所述，使用MTT测定确定细胞存活力。显示了五个独立实验的平均值（±SEM）。*P<0.05，**P<0.01。在类似的测定（但以测量ATP产生作为代谢活性的标志物）中，用具有或不具有200μg/mL MABT的10μM Aβ1-42寡聚体处理细胞（B）。结果显示了两个独立测定的平均值（±SEM）。通过形态分析测试了延长的Aβ1-42寡聚体处理后的神经毒性（C）。用具有或不具有50μg/mLMABT的10μM Aβ1-42寡聚体处理如上的细胞4天，然后用TuJ1和DAPI染色。
图3提供了对应于实施例6.4中所述的实验的图和免疫组织化学图片。抗AβIgG4单克隆抗体降低了Aβ1-42寡聚体与轴突的结合。将来自P1大鼠的混合的皮层细胞用具有或不具有100μg/mL MABT或IgG对照的2μMAβ1-42寡聚体处理30分钟（已显示）或18小时（未示出）。附图从左至右显示了：使用缓冲对照、Aβ1-42寡聚体以及Aβ1-42寡聚体结合MABT的处理（A）。将DAPI用于标记细胞核；将抗神经元特异性微管蛋白的抗体TuJ1用于标记神经元；并且将抗Aβ抗体（克隆6E10）用于标记β-淀粉样蛋白。底端行显示了所有三种标志物，而顶行仅显示Aβ和DAPI。两幅插图显示了Aβ1-42寡聚体与轴突（左）的结合以及MABT单克隆抗体对这种结合的抑制（右）。示出了30分钟处理和18小时处理的荧光定量测量（B）。显示了两个实验的平均结果（±SEM）。用HyLite Fluor-488标记的Aβ1-42验证了MABT抑制Aβ1-42与轴突的结合。除了使用了用HyLiteFluor-488标记的Aβ1-42以外，如对（A）所述的，处理了来自P1大鼠的皮层培养（C）。在上半部分显示了Aβ1-42标记的样品，而在下半部分显示了DAPI染色的样品。示出了一个代表性实验。用所示出的两个独立实验的平均值（±SD）定量Aβ1-42荧光（D）。如方法（C）中所述的，通过在胰蛋白酶消化的细胞上对Aβ1-42进行ELISA测定了Aβ1-42的胞内累积。显示了三个实验的平均结果（±SEM）。一旦用MABT处理，Aβ142寡聚体似乎被与小神经胶质细胞类似的细胞吸收，如（F）中所示。将DAPI用于标记细胞核；并且将抗Aβ抗体用于标记β-淀粉样蛋白。
图4提供了对应于实施例6.5中所述的实验的图和共聚焦图片。一旦MABT处理，通过FcR介导的机制，将Aβ1-42寡聚体吸收到小神经胶质细 胞中。将共聚焦图片用于显示与MABT复合的Aβ1-42寡聚体被吸收到小神经胶质细胞中。DAPI用于标记细胞核以显示小神经胶质细胞本身；并且将抗Aβ抗体用于标记Aβ1-42寡聚体（A）。从通过Z堆叠（Z-stacks）呈现的立体图像中获得了顶端-至-远端的切片。如在实施例部分中材料和方法下所述的，对标记了Aβ（外周）并且用DAPI染色（中心）的混合皮层细胞进行了共聚焦成像。鉴别了小神经胶质细胞并通过代表胞内位置的一系列共聚焦堆叠对小神经胶质细胞扫描最大荧光强度（B），并且定量了高于最小阈值的荧光信号的总面积（C）。该图上的每个标记代表单个细胞内染色的Aβ的总面积。对于每个处理条件，分析了最少20个细胞。使用单向ANOVA并随后通过图基（Tukey）事后多重比较来比较数据。显示了平均值（±SEM）。验证了小神经胶质细胞（Iba1+）作为吸收与MABT复合的Aβ1-42的细胞类型。将Iba1用作小神经胶质细胞的标志物，将HyLiteFluor-488标记的Aβ1-42用于显示Aβ1-42A，并且将DAPI用于显示细胞核。显示了Iba1和Aβ1-42的共定位。通过不同IgG单克隆抗体的Aβ1-42寡聚体内化与FcγR结合相关。在结合测定中验证了与FcγRIIIa-V158的差异结合（E）。抗Aβ单克隆抗体需要FcγR结合对Aβ1-42寡聚体毒性具有完全的保护作用。用具有或不具有MABT、MABT-IgG1-D265A、MABT-IgG1或IgG1对照mAb的Aβ142寡聚体处理来自P1大鼠的混合的皮层细胞。该图显示了与Aβ1-42寡聚体处理的细胞相比得自5个独立实验的细胞存活率的平均值（±SEM）%增加。使用单向ANOVA并随后通过图基（Tukey）事后多重比较来进行统计分析。
图5提供了对应于实施例6.6中所述的实验的图和免疫组织化学图片。当与Aβ1-42寡聚体复合时，与对于Aβ1-42寡聚体处理的小神经胶质细胞所显示的相比，用野生型主链加入IgG1显著提高了p38激活作用。将来自P1大鼠的混合的皮层细胞用具有或不具有100μg/mL MABT、MABT-IgG1-D265A或MABT-IgG1野生型的10μM Aβ1-42寡聚体处理30分钟。将未与Aβ结合的IgG1单克隆抗体用作对照。如方法（A）中所述，用磷酸特异性ELISA测量p38MAPK的活性。显示了4个独立实验的平均值（±SEM）。使用单向ANOVA并随后通过图基（Tukey）事后多重比较来进行统计分析。使用与单克隆抗体复合的Aβ1-42寡聚体的p38MAPK的激活作用对小神经胶质细胞特异（B）。如上所述处理细胞，然后用Iba1（小神经胶质细胞）和用DAPI（细胞核）对磷酸p38MAPK染色。附图从左至右显示了：使用缓冲对照、Aβ1-42寡聚体和具有MABT的Aβ1-42寡聚体的处理。右侧插图中显示了磷酸p38MAPK和Iba1的共定位。将来自CX3CR1-GFP小鼠的纯化的小神经胶质细胞用于验证小神经胶质细胞特异 性p38活性（C）。在上半部分中显示了仅对磷酸p38的染色，而在下半部分中显示了对CX3CR1-GFP信号（小神经胶质细胞）连同磷酸p38一起的染色。对于MABT对Aβ1-42寡聚体毒性的完全保护作用来说需要p38MAPK活性。在存在或不存在1μM SB239063（p38特异性抑制剂）的情况下，仅用10μMAβ1-42寡聚体或使用10μM Aβ1-42寡聚体连同100μg/ml MABT或MABT-IgG1-D265A处理来自P1大鼠的混合的皮层细胞（D）。24h后，实施了使用MTT读数的细胞毒性测定。显示了4个实验的平均值（±SEM）。使用单向ANOVA并随后通过图基（Tukey）事后多重比较来进行统计分析。
图6提供了对应于实施例6.6中所述的实验的图。IgG1对FcγRs的高亲合力使其对降低通过小神经胶质细胞的Aβ1-42介导的促炎释放不太有效。处理24小时后，测量了通过富集的小神经胶质细胞的TNFα释放（参见方法）。示出了3个独立实验的平均值（±SEM）。使用单向ANOVA并随后通过图基（Tukey）事后多重比较来进行统计分析。
图7提供了对应于实施例6.1中所述的实验的图。在APP小鼠模型中出现了降低的斑负荷和改善的非空间记忆。在使用mMABT（小鼠MABT单克隆抗体）的慢性被动免疫后，在APP/PS1双重转基因小鼠中测量了百分比斑负荷（A）和平均斑个数（B）将注射PBS的动物用作对照（PBS）。将硫磺素S（ThS）用于对致密的斑染色（参见方法）。施用mMABT两次后，在单一转基因hAPP突变小鼠中证明了功能性（C）。使用新型物体识别测试（参见方法）研究了作为对回忆的量度的认知指数（RI）将注射PBS的动物用作对照（PBS）。该图上的每个圆圈表示单一小鼠。显示了平均值（±SD），*P<0.01。
图8提供了对应于实施例6.1中所述的实验的免疫印迹。神经毒性Aβ1-42是低分子量和高分子量的寡聚体的混合物。制备了神经毒性Aβ1-42寡聚体（参见方法）并用于测定单克隆抗体处理对Aβ1-42寡聚体介导的神经毒性的影响的体外实验。将Aβ1-42寡聚体在SDS/PAGE4-12%梯度凝胶上测试，转移到硝化纤维素膜上，并用抗Aβ抗体（克隆6E10）印迹。
图9提供了对应于实施例6.2中所述的实验的图。针对MABT的中间域抑制Aβ1-42与ApoE4的相互作用。使用ELISA评价抗AβN末端（克隆6E10和WO2）、C末端（克隆G2-11）或中间域（MABT）单克隆抗体对Aβ1-42与重组人ApoE4结合的影响。显示了无IgG单克隆抗体的信号抑制百分比。
图10提供了对应于实施例6.5中所述的实验的图和免疫组织化学图片。当与IgG1野生型相比时，交联的MABT IgG4单克隆抗体具有降低的结合 活性。交联的抗AβIgG1野生型以与阳性非Aβ结合IgG1对照类似的活性与所有FcRγ受体结合。与MABT-AβIgG1和非Aβ结合IgG1阳性对照相比，MABT和MABT-IgG1-D265A与全部FcγRs的结合均显著降低。这些发现与对于人IgG4抗体（Gessner等人,1998）和具有D265A突变的IgG1抗体（Shields等人,2001）的发表数据一致。
图11提供了用抗β淀粉样蛋白抗体处理的APP/PS1小鼠中的Aβ斑的体内图像。MABT的全身剂量施用体内调节了各个淀粉状斑。用腹膜内注射的甲氧基-X04标记APP/PS1动物中的淀粉状斑，通过体内双光子显微镜显像并追踪多个星期（A）。将斑体积随时间的相对变化作为从初始成像期开始的成倍增加来作图（B）。平均来说，在MABT全身剂量施用后各个斑的体积减小（X斑块，2只动物）。
4.1序列说明
SEQ ID NO:1MABT人源化重链可变区的氨基酸序列（CDR1）
SEQ ID NO:2MABT人源化重链可变区的氨基酸序列（CDR2）
SEQ ID NO:3MABT人源化重链可变区的氨基酸序列（CDR3）
SEQ ID NO:4MABT人源化轻链可变区的氨基酸序列（CDR1）
SEQ ID NO:5MABT人源化轻链可变区的氨基酸序列（CDR2）
SEQ ID NO:6MABT人源化轻链可变区的氨基酸序列（CDR3）
SEQ ID NO:7MABT人源化轻链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO:8MABT人源化轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO:9人源化MABT轻链恒定区的氨基酸序列
SEQ ID NO:10MABT人源化重链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO:11MABT人源化重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:12:IGγ-4链C区的氨基酸序列–修饰的
SEQ ID NO:13:MABT人源化重链可变区的CDR2的核苷酸序列
SEQ ID NO:14:MABT人源化重链可变区的CDR3的核苷酸序列
SEQ ID NO:15:MABT人源化轻链可变区的CDR1的核苷酸序列
SEQ ID NO:16:MABT人源化轻链可变区的核苷酸序列
SEQ ID NO:17:MABT人源化轻链的核苷酸序列
SEQ ID NO:18:MABT人源化轻链恒定区的核苷酸序列
SEQ ID NO:19:MABT人源化重链可变区的核苷酸序列
SEQ ID NO:20:MABT人源化重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:21:MABT人源化重链恒定区的核苷酸序列
SEQ ID NO:22:HCDR2之前的典型氨基酸序列
5.发明详述
以下描述了用于测试抗淀粉样蛋白β抗体的基于细胞的测定系统以及使用抗淀粉样蛋白β抗体监测和调节患者治疗的方法。以下还说明了用于测试神经保护性试剂的安全性和效力的细胞基测定系统以及使用神经保护性试剂监测和调节患者治疗的方法。以下还说明了安全和功能性抗体以及使用这类安全和功能性抗体用于治疗阿尔茨海默病的方法。还说明了药物制备和施用形式。
5.1细胞基测定系统
本文提供了体外基于细胞的测定系统以测试抗体或其他试剂对于淀粉样变性治疗的安全性和功能性。在某些实施方式中，在存在和不存在测试抗体的情况下培育受淀粉样变性（处于其病理形式的淀粉样蛋白）影响的细胞（“靶细胞”）和免疫效应细胞（例如，自然杀伤细胞、巨噬细胞，如小神经胶质细胞、中性粒细胞和肥大细胞）。可以测量以测试抗体的安全性和功能性的参数包括靶细胞的存活率、淀粉样蛋白向免疫效应细胞的内化和免疫效应细胞中p38MAP激酶途径的激活作用。在某些实施方式中，安全和功能性的抗体导致最大内化和p38MAP激酶途径的中间体激活。
在更具体的实施方式中，所述淀粉样变性为阿尔茨海默病，所述淀粉样蛋白为β淀粉样蛋白，并且所述免疫效应细胞为小神经胶质细胞，并且所述靶细胞为神经元。在具体的实施方式中，所述细胞得自现有的细胞系以产生混合培养物。在其他实施方式中，所述混合细胞培养物为原代皮层培养物（Meberg&Miller2003,Methods Cell Biol71:111-127）。在某些实施方式中，所述混合细胞培养物为来自大鼠、小鼠或黑猩猩的原代皮层培养物。在某些实施方式中，通过来自人患者的皮层活组织检查或脊柱活组织检查获得所述原代皮层培养物。
将包括神经元和小神经胶质细胞的混合细胞培养物与β淀粉样蛋白一起培育。在一种实施方式中，作为β淀粉样蛋白寡聚体提供了β淀粉样蛋白。可以在本测定系统中测量下列参数：（1）可以通过（例如）代谢更新确定神经元存活率，所述代谢更新可以通过（例如）3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四氮唑（MTT）的线粒体氧化或ATP释放确定；（2）可以通过（例如）对β淀粉样蛋白的免疫细胞化学或标记和直接测量和/或β淀粉样蛋白的可视化来确定β淀粉样蛋白寡聚体向小神经胶质细胞的内化；和（3）可以通过（例如）对磷酸化的p38MAPK（“磷酸-p38”）的ELISA来确定p38MAPK途径的激活作用。
在某些实施方式中，与在不存在安全和功能性的抗体的情况下的神经元存活率相比，在存在β淀粉样蛋白以及安全和功能性的抗体的情况下神 经元存活率提高了至少10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、225%、250%、275%、300%、325%、350%、375%、400%、425%、450%、475%或至少500%。
在某些实施方式中，与在不存在安全和功能性的抗体的情况下的内化率相比，在存在安全和功能性的抗体的情况下β淀粉样蛋白向小神经胶质细胞的内化提高了至少10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、225%、250%、275%、300%、325%、350%、375%、400%、425%、450%、475%或至少500%。
在某些实施方式中，与存在β淀粉样蛋白但不存在安全和功能性的抗体的情况下的p38MAP激酶的激活作用相比，在存在β淀粉样蛋白以及安全和功能性的抗体的情况下小神经胶质细胞中p38MAP激酶的激活作用提高了5%-15%；10%-20%；15%-25%；20%-30%；35%-45%；40%-50%；或45%-55%。在更具体的实施方式中，与存在β淀粉样蛋白但不存在安全和功能性的抗体的情况下的p38MAP激酶的激活作用相比，在存在β淀粉样蛋白以及安全和功能性的抗体的情况下小神经胶质细胞中p38MAP激酶的激活作用提高了10%-30%。此外，在存在β淀粉样蛋白以及安全和功能性的抗体的情况下小神经胶质细胞中p38MAP激酶的激活作用增加了比在存在IgG1同种型抗β淀粉样蛋白抗体的情况下激活p38MAP激酶小的5%-15%；10%-20%；15%-25%；20%-30%；35%-45%；40%-50%；或45%-55%。
在某些实施方式中，培育β淀粉样蛋白的病理形式（例如，寡聚β淀粉样蛋白）、测试抗体和小神经胶质细胞以确定抗体的安全性和功能性。可以在本测定系统中测量下列参数：（1）可以通过（例如）对β淀粉样蛋白的免疫细胞化学或β淀粉样蛋白的标签来确定β淀粉样蛋白寡聚体向小神经胶质细胞的内化；和（2）可以通过（例如）对磷酸-p38的ELISA来确定p38MAPK途径的激活作用。
为了确定p38MAP激酶的激活作用，可以使用本领域的技术人员所知的任何方法。在某些实施方式中，将ELISA、免疫印迹或使用与磷酸化p38MAP激酶特异性结合的抗体的免疫细胞化学用于确定磷酸化（即激活）的p38MAP激酶的水平。在某些实施方式中，通过使用与p38MAP激酶特异性结合以确定p38MAP激酶的核定位程度的抗体的免疫细胞化学来确定p38MAP激酶的激活作用。p38MAP激酶核定位程度越高，则p38MAP激酶的激活作用水平越高。
在某些实施方式中，可以测量p38MAP激酶信号通路中其他组分的激活作用。在某些实施方式中，可以测量p38MAP激酶的下游靶标的表达水平以确定p38MAP激酶在患者中的激活作用。这些下游靶标包括（但不限 于）90kDa核醣体S6激酶（pp90rsk）；(RSK)家族：RSK1、RSK2、MNK1/2和MSK1/2；和核翻译因子，如Elk-1、ATF2、STAT3和CREB。可以通过本领域的技术人员所知的任何方法来确定下游靶标的表达水平，如（但不限于）RNA印迹、免疫印迹或聚合酶链反应。
5.2治疗的监测和调节
在某些实施方式中，在正用与淀粉样蛋白（如β淀粉样蛋白）特异性结合的安全和功能性的抗体治疗的患者的免疫效应细胞（如小神经胶质细胞）中监测p38MAP激酶的激活作用。可以通过本领域的技术人员所知的任何方法从患者获得免疫效应细胞。在具体的实施方式中，通过皮层活组织检查或脊柱活组织检查获得小神经胶质细胞。可以通过本领域的技术人员所知的任何方法将免疫效应细胞维持在培养中。
在某些实施方式中，在正用试剂（如神经保护性试剂）治疗的患者的免疫效应细胞（如小神经胶质细胞）中监测p38MAP激酶的激活作用。在某些更具体的实施方式中，治疗患者的淀粉样变性，如阿尔茨海默病。在某些更具体的实施方式中，用他克林（COGNEX,MorrisPlains,NJ）、多奈哌齐（ARICEPT,Tokyo,JP）、利凡斯的明（EXELON,East Hanover,NJ）、加兰他敏（REMINYL,New Brunswick,NJ）或美金刚（NAMENDA,NewYork,NY）治疗患者。
在某些实施方式中，对患者调整施用剂量和/或施用方案从而使小神经胶质细胞中p38MAP激酶的激活作用处于中等水平，即，比不存在所述抗体时的更高，但比在存在IgG1抗体的情况下的更低，所述IgG1抗体在存在β淀粉样蛋白寡聚体的情况下与β淀粉样蛋白特异性结合。如果p38MAP激酶的激活作用高于中等水平，则降低剂量和/或降低施用频率。如果p38MAP激酶的激活作用低于中等水平，则增加剂量和/或提高施用频率。
在某些实施方式中，将p38MAP激酶信号通路的调节剂与安全和功能性的抗体共施用以调节p38MAP激酶的激活作用至中等水平。如果p38MAP激酶的激活作用高于中等水平，则可以共施用p38MAP激酶信号通路的抑制剂。如果p38MAP激酶的激活作用低于中等水平，则可以共施用p38MAP激酶信号通路的激活剂。
p38MAP激酶信号通路的示例性抑制剂包括4-[4-(4-氟苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯酚（“SB202190”）；4-[5-(4-氟苯基)-2-[4-(甲磺酰基)苯基]-1H-咪唑-4-基]吡啶（“SB203580”）；和反式-4-[4-(4-氟苯基)-5-(2-甲氧基-4-嘧啶基)-1H-咪唑-1-基]环己醇（“SB239063”）及它们的可药用衍生物。
p38MAP激酶信号通路的示例性激活剂包括茴香霉素、MKK、Rac、Cdc42和PAK1、IL-1、IL-1-受体、TNF、LPS、TRAF6和TAB1/2。
在某些实施方式中，p38MAP激酶的中间激活水平比在不存在安全和功能性的抗体的情况下所述患者的小神经胶质细胞中的p38MAP激酶的激活作用高5%-15%；10%-20%；15%-25%；20%-30%；35%-45%；40%-50%；或45%-55%。
为了确定p38MAP激酶的激活作用，可以使用本领域的技术人员所知的任何方法。在某些实施方式中，将ELISA、免疫印迹或使用与磷酸化p38MAP激酶特异性结合的抗体的免疫细胞化学用于确定磷酸化（即激活）的p38MAP激酶的水平。在某些实施方式中，通过使用与p38MAP激酶特异性结合以确定p38MAP激酶的核定位程度的抗体的免疫细胞化学来确定p38MAP激酶的激活作用。p38MAP激酶核定位程度越高，则p38MAP激酶的激活作用水平越高。
在某些实施方式中，可以测量p38MAP激酶信号通路中其他组分的激活作用。
在某些实施方式中，可以测量p38MAP激酶的下游靶标的表达水平以确定p38MAP激酶在患者中的激活作用。这些下游靶标包括但不限于90kDa核醣体S6激酶（pp90rsk）；(RSK)家族：RSK1、RSK2、MNK1/2和MSK1/2；和核翻译因子，如Elk-1、ATF2、STAT3和CREB。可以通过本领域的技术人员所知的任何方法来确定下游靶标的表达水平，如（但不限于）RNA印迹、免疫印迹或通过（例如）RT-PCR的基因转录本的检测。
此外，本文提供了用于评价抗β-淀粉样蛋白抗体对于患者中阿尔茨海默病的治疗的安全性和功能性的方法。在某些实施方式中，小神经胶质细胞可以得自患者。在具体的实施方式中，在开始使用抗β-淀粉样蛋白抗体治疗患者之前可以从所述患者获得小神经胶质细胞。可以使用本领域已知的标准技术将来自所述患者的小神经胶质细胞维持在细胞培养中。
在某些实施方式中，将来自所述患者的小神经胶质细胞与抗β淀粉样蛋白抗体和β淀粉样蛋白寡聚体一起培育。可以确定下列参数：抗体-β淀粉样蛋白复合物与小神经胶质细胞的结合；抗体-β淀粉样蛋白复合物向小神经胶质细胞的内化；和/或小神经胶质细胞中p38MAP激酶的激活作用。
可以通过将来自患者的小神经胶质细胞仅与抗β-淀粉样蛋白抗体（即无β-淀粉样蛋白寡聚体）；和/或仅与β-淀粉样蛋白寡聚体（即，无所述抗体）；和/或在存在β淀粉样蛋白寡聚体的情况下与IgG1抗β-淀粉样蛋白抗体一起培育来实施对照。在某些实施方式中，如果p38MAP激酶的激活作用比在存在β-淀粉样蛋白寡聚体但不存在安全和功能性的抗体的情况下 所述患者的对照小神经胶质细胞中的p38MAP激酶的激活作用高5%-15%；10%-20%；15%-25%；20%-30%；35%-45%；40%-50%；或45%-55%，则抗β-淀粉样蛋白抗体是安全和功能性的。在某些实施方式中，如果β淀粉样蛋白向小神经胶质细胞的内化比单克隆抗体MABT高或低5%-15%；10%-20%；15%-25%；20%-30%；35%-45%；40%-50%；或45%-55%，则抗β淀粉样蛋白抗体是安全和功能性的（参见第6节）。
5.3安全和功能性的抗体
在某些实施方式中，可以修饰或替换与待治疗的淀粉样变性的淀粉样蛋白特异性结合的抗体的恒定区以提供安全和功能性的抗体。在某些实施方式中，所得抗体的恒定区以中等活性与免疫效应细胞（如自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞）表面上的Fc受体结合。在某些实施方式中，所得抗体以中等水平激活免疫效应细胞中的p38MAPK途径，即高于不存在所述抗体时的p38MAP激酶的激活作用但低于在存在相同浓度的具有相同结合特异性的IgG1抗体的情况下的p38MAP激酶的激活作用。在某些实施方式中，还可以修饰互补决定区（“CDR”）之外的可变区以提供安全和功能性的抗体。本文还提供了用于产生该抗体和包含该抗体的药物组合物的方法。
通过分别嵌入在抗体轻链和重链的可变区中的互补决定区（“CDR”）提供抗原结合特异性。围绕可用于本文所提供的安全和功能性的抗体的构建的CDR的抗体恒定区和框架区包括5.3.1节中所述的那些。在某些实施方式中，可用于安全和功能性的抗体的构建的CDR或可变区可以来源于表2中所列的抗体。
在某些实施方式中，特异性结合人β淀粉样蛋白的已知抗体的CDR（参见下表2）与人IgG4的恒定区结合并且用人IgG（如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4）的框架区替换所述抗体的CDR之间的框架区。在某些实施方式中，已知的人源化抗β淀粉样蛋白抗体（例如，巴匹珠单抗（Bapineuzumab）或苏兰珠单抗（Solanezumab））的可变区与人IgG4的恒定区结合。
5.3.1恒定区
用于产生本文所提供的安全和功能性的抗体的抗体恒定区可以来源于任何同种型，包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在某些实施方式中，用于产生本文所提供的安全和功能性的抗体的抗体恒定区可以来源于亚型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
类似地，用于产生本文所提供的安全和功能性的抗体的抗体重链区的框架区可以来源于任何同种型，包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在某些 实施方式中，用于产生本文所提供的安全和功能性的抗体的抗体框架区可以来源于亚型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
在具体的实施方式中，用于产生本文所提供的安全和功能性的抗体的恒定区可以来源于同种型IgG。在更具体的实施方式中，用于产生本文所提供的安全和功能性的抗体的恒定区可以来源于同种型IgG4。
在具体的实施方式中，用于产生本文所提供的安全和功能性的抗体的框架区可以来源于同种型IgG。在更具体的实施方式中，用于产生本文所提供的安全和功能性的抗体的框架区可以来源于同种型IgG4。
在某些实施方式中，安全和功能性的抗体的重链的恒定区是来自不同同种型或亚型的嵌合恒定区。在具体的实施方式中，重链恒定区是负责IgG4效应子功能的IgG4重链恒定区部分和不同IgG亚型之间的嵌合体。在具体的实施方式中，重链恒定区是人IgG4重链恒定区的CH2结构域和不同IgG亚型之间的嵌合体。
在某些实施方式中，嵌合恒定区对如下所述的Fcγ具有中等结合活性。在某些实施方式中，嵌合恒定区介导向免疫效应子细胞（如小神经胶质细胞）的内化从而使p38MAP激酶途径活性处于中等水平，如通过5.1节中所述的基于细胞的测定系统所确定的。
在某些实施方式中，通过引入突变优化恒定区。可以利用DNA重组技术将突变引入到恒定区中。在某些实施方式中，所得抗体促进β淀粉样蛋白以较高水平向小神经胶质细胞内化，而p38MAP激酶途径的激活作用处于中等水平。可以利用5.1节中所述的基于细胞的测定系统来确定内化速率和p38MAP激酶的激活作用。在某些实施方式中，具有突变恒定区的抗体对如下所述的Fc受体具有中等结合活性。
在某些实施方式中，通过改变糖基化类型优化恒定区。可以通过其中合成抗体和/或使糖基化氨基酸（例如，Asn297）突变来改变糖基化类型。在某些实施方式中，所得抗体促进β淀粉样蛋白以较高水平向小神经胶质细胞内化，而p38MAP激酶途径的激活作用处于中等水平。可以利用5.1节中所述的基于细胞的测定系统来确定内化速率和p38MAP激酶的激活作用。在某些实施方式中，具有糖基化类型改变的恒定区的抗体对如下所述的Fc受体具有中等结合活性。
在某些实施方式中，所述恒定区对其Fc受体具有中等结合活性。表1中列出了示例性Fc受体及其各自的主要抗体配体。可以使用本领域的技术人员所知的任何方法确定抗体配体和Fc受体之间的结合活性。测量结合亲合力的示例性方法包括但不限于ELISA测定和BIACORE分析。在某些更具体的实施方式中，Fc受体是介导抗体抗原复合物向免疫效应细胞内化的 Fc受体。在某些更具体的实施方式中，Fc受体是在小神经胶质细胞上表达的Fcγ受体。
表1：示例性抗体同种型或亚型及其各自的Fc受体
受体名称 主要抗体配体
FcγRI(CD64) IgG1和IgG3
FcγRIIA(CD32) IgG
FcγRIIB1(CD32) IgG
FcγRIIB2(CD32) IgG
FcγRIIIA(CD16a) IgG
FcγRIIIB(CD16b) IgG
FcεRI IgE
FcεRII(CD23) IgE
FcαRI(CD89) IgA
FcαRI/μR IgA和IgM
FcRn IgG
在某些实施方式中，所述抗体恒定区是同种型IgG的抗体恒定区，所述Fc受体是Fcγ受体。用于产生安全和功能性的抗体的恒定区与Fcγ受体的结合活性是IgG1与Fcγ受体结合活性的10%至30%；20%至40%；30%至50%；40%至60%；50%至70%；60%至80%；或70%至90%。在具体的实施方式中，用于产生治疗阿尔茨海默病的安全和功能性的抗体的恒定区是IgG1与Fcγ的结合活性的15%至25%，或更具体约20%。
在某些实施方式中，对抗Aβ抗体的效应子区域进行修饰从而降低或消除所述抗体的效应子功能。所述修饰可以是使得氨基酸发生取代和/或缺失的任何遗传改变。在更具体的实施方式中，所述恒定区是效应子功能降低或消除的修饰的IgG1恒定区。可以引入这样的修饰，例如在2000年7月20日公开的国际专利申请公开WO 00/42072中所述的，该专利以其全部内容并入本文。在某些实施方式中，相对于未修饰的恒定区，具有修饰的恒定区的抗体对其Fc受体的结合能力降低。在其他实施方式中，恒定区及其Fc受体之间的结合未改变，但在存在效应子细胞的情况下，相对于未修饰的恒定区，效应子功能（如细胞毒性）降低。
5.3.2可变区
在某些实施方式中，已知与β淀粉样蛋白特异性结合的抗体的可变区和/或其病理形式可以用于产生安全和功能性的抗体。在某些更具体的实施方式中，已知与β淀粉样蛋白特异性结合的人源化抗体的可变区和/或其病理形式可以用于产生安全和功能性的抗体。在某些实施方式中，所述可变区获自非IgG4人源化抗体。在具体的实施方式中，所述可变区获自非IgG4人源化抗体，并且将IgG4恒定区用作恒定区。
可以将已知与所关心的淀粉样蛋白结合的抗体的CDR用于产生在本文所述的方法中有用的安全和功能性的抗体。在某些实施方式中，可以将已知与β淀粉样蛋白特异性结合的抗体的CDR和/或其病理形式用于产生这种安全和功能性的抗体。
其CDR或可变区可以使用的示例性抗体包括但不限于表2中所列的那些。
表2：示例性抗β淀粉样蛋白抗体
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来源的抗体
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在一种具体实施方式中，本发明的安全和功能性的抗体的CDR如下所示：重链CDR1具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列；重链CDR2具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列；重链CDR3具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；轻链CDR1具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；轻链CDR2具有SEQID NO:5的氨基酸序列；轻链CDR3具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在另一种具体实施方式中，本发明的安全和功能性的抗体的轻链可变区具有与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同的氨基酸序列。在一种更具体的实施方式中，本发明的安全和功能性的抗体的轻链可变区具有与SEQ ID NO:7的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列。
在另一种具体实施方式中，本发明的安全和功能性的抗体的重链可变区具有与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同的氨基酸序列。在一种更具体的实施方式中，本发明的安全和功能性的抗体的重链可变区具有与SEQ ID NO:10的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列。
在更具体的实施方式中，本发明的安全和功能性的抗体的轻链可变区具有与SEQID NO:7的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同的氨基酸序列，并且本发明的安全和功能性的抗体的重链可变区具有与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本发明的安全和功能性的抗体的轻链可变区具有与SEQ IDNO:7的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列，并且本发明的安全和功能性的抗体的重链可变区具有与SEQ ID NO:10的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列。
可以稍微修饰mMABT抗体的CDRL2序列（“KVSNRFS”（SEQ ID NO:5））而不会不利地影响抗体活性。可以通过在位置50处用R替换K并在位置53处用S替换N来进行保守取代。因此，两个替代性CDRL2序 列分别为“RVSNRFS”和“KVSSRFS”。将这些引入到鼠VK序列中而无其他变化，分别作为mMABT VK-R和mMABT VK-S。
5.3.3抗体的构建
在某些实施方式中，将特异性结合淀粉样蛋白或其病理形式（如β淀粉样蛋白）的抗体的CDR置于具有与本发明的安全和功能性的抗体一致的恒定区的抗体中（5.3.1节）。在某些实施方式中，将特异性结合淀粉样蛋白或其病理形式（如β淀粉样蛋白）的抗体的可变区与和本发明的安全和功能性的抗体一致的恒定区结合（5.3.1节）。
构建人源化抗体的方法在本领域中是公知的。例如，在作为WO2008/011348公开的国际专利申请No.PCT/US2007/073504中描述了产生人源化抗体的方法，以上专利以其全部内容作为参考并入本文。
5.3.4安全性测试
在使用抗β淀粉样蛋白抗体治疗阿尔茨海默病期间所观察到的副作用包括炎性副作用，如脑膜炎和脑膜脑炎，以及脑中的液体积累（脑水肿）。其他副作用包括不良免疫反应，即患者对所施用的抗β淀粉样蛋白抗体的免疫反应。
5.3.4.1不良免疫反应
可以在接受抗β淀粉样蛋白抗体的患者中监测的一个副作用是对该抗体的抗体反应。可以使用本领域的技术人员所知的任何技术来检测、监测或定量该不良免疫反应程度。当抗体与抗β淀粉样蛋白抗体结合时，发生这种抗体反应。当可溶性抗原与血管腔隙中的抗体结合时，它们可以形成循环免疫复合物，该复合物会在多种器官的血管床中非特异性截留，从而导致所谓的免疫复合物疾病，如血清病、血管炎、伴有血管炎的肾炎全身性红斑狼疮或血管球性肾炎。
可以使用本领域中已知的任何方法检测和/或监测免疫复合物病。例如，可以使用免疫复合物测试来证明血液中的循环免疫复合物，从而估计免疫复合物病的严重性。可以通过本领域技术人员所知的任何方法实施免疫复合物测试。具体地，可以使用美国专利No.4,141,965、美国专利No.4,210,622、美国专利No.4,210,622、美国专利No.4,331,649、美国专利No.4,544,640、美国专利No.4,753,893和美国专利No.5,888,834中所述的任何一种或多种方法来实施免疫复合物测试，以上专利中的每一篇均以其全部内容作为参考并入本文。
另一种方法是使用免疫测定，如酶联免疫吸附测定（ELISA）来检测抗所述抗体的抗特应抗体。参见Gerostamoulos,J.等人,(2001).The Use Of Elisa(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay)Screening In Postmortem Blood. TIAFT,The InternationalAssociation of Forensic Toxicologists；Clarke,W.和Dufour,D.R.主编的Contemporary Practice in Clinical Chemistry,(2006)AACC Press,Washington,DC.Harris,N.and Winter,W；Presta美国专利No.6737056；Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory,New York1988555-612)；WO96/13590和WO96/29605。
5.3.4.2水肿
可以在接受抗β淀粉样蛋白抗体的患者中监测的一个副作用是水肿，具体地，脑水肿，其可以通过（例如）MRI扫描、DCE-MRI扫描、PET扫描和/或CT扫描来评价。可以使用本领域的技术人员所知的任何技术来检测、监测或定量水肿的程度。还可以在水肿动物模型中测量水肿。在这些方法中，计算了水肿的体积（同侧的半球体积，对侧的半球体积）是计算。
在CT和T1-加权MRI上，可以将脑水肿作为低密度或高信号病变显像。脑水肿和具有高水含量（如脑脊髓液）的其他结构在T2加权的MRI上是高信号。由于脑水肿作为对同强度或高信号背景的高信号病变清楚地显像，因此液体衰减反转恢复MR图像提供了额外的信息。
5.3.4.3脑膜炎
可以在接受抗β淀粉样蛋白抗体的患者中监测的一种副作用是脑膜炎。可以使用本领域的技术人员所知的任何技术来检测、监测或定量脑膜炎的程度。还可以进行神经学检查，其包括设计用于评价：运动和感觉功能；神经功能；听觉和语言；视觉；协调和平衡；精神状态；和情绪或行为变化的一系列测试。可以借助于物品如音叉、小灯、反射锤和针，通过强度和感觉测试来评价神经系统功能。
对围绕并且保护脑和脊髓的脑脊髓液的分析可以检测急性和慢性炎症。在被称为脊椎抽液（或腰椎穿刺）的程序中，通过插入到腰部的特殊的针来除去少量脑脊髓液。在采样前，用局部麻醉使皮肤麻痹。测试了在健康的人中完全透明的液体以检测细菌或血液的存在性并测量了葡萄糖水平（低葡萄糖水平是细菌或霉菌性脑膜炎的病征）和白血球（白血球数升高也是感染的病征）。该程序通常在医院中进行并需要花费45分钟。
无创性成像程序通常用于达成脑膜炎诊断。这种计算机辅助成像可以显示脑炎的病征；内部流血或出血；和可能与脑膜炎有关的其他异常。计算机断层，也称为CT扫描，其结合了X射线和计算机技术以产生快速、清晰的骨、器官和组织的二维图象。有时，将对比染料注射到血流中以突出脑中的不同组织并检测脑膜的炎症。磁共振成象（MRI）使用计算机产生的无线电波和强磁铁以产生详细的体结构图像，其包括组织、器官、骨和 神经。可以在测试前注射对比染料以显示更多细节。用于帮助脑膜炎诊断的另一种成像技术是超声。
脑电描记法或EEG可以通过监测脑中穿过颅骨的电活性来鉴别与脑膜炎有关的异常脑电波。EEG用于帮助诊断脑炎症。
5.3.5功能性测试
5.3.5.1神经心理学测试
可以使用一种或多种神经心理学测试来评价本文所述的阿尔茨海默病治疗的功能性。以下描述了示例性神经心理学测试并且其无限制地包括阿尔茨海默病联合登记协作组织（“CERAD”；参见，例如，Morris JC,Mohs RC,Rogers H,Fillenbaum G,HeymanA.Consortium to establish a registry for Alzheimer's disease(CERAD)clinicaland neuropsychological assessment of Alzheimer's disease.PsychopharmacolBull.1988;24(4):641-52；Morris JC,Heyman A,Mohs RC,Hughes JP,van Belle G,Fillenbaum G,Mellits ED,Clark C.The Consortium to Establish a Registry forAlzheimer's Disease(CERAD).Part I.Clinical and neuropsychological assessmentof Alzheimer's disease.Neurology.1989年9月;39(9):1159-65；和Welsh K,Butters N,Hughes J,Mohs R,Heyman A.Detection of abnormal memory decline in mild casesof Alzheimer's disease using CERAD neuropsychological measures.ArchNeurol.1991年3月;48(3):278-81）所建立的那些。
在一种实施方式中，可以使用阿尔茨海默病评估量表认知功能测试（“ADAS-Cog”；参见，例如，Rosen WG,Mohs RC,Davis KL.A new rating scale for Alzheimer'sdisease.Am J Psychiatry.1984年11月;141(11):1356-64；Ihl R,Brinkmeyer J,JannerM,Kerdar MS.A comparison of ADAS and EEG in the discrimination of patientswith dementia of the Alzheimer type from healthycontrols.Neuropsychobiology.2000年1月;41(2):102-7；和Weyer G,Erzigkeit H,Kanowski S,Ihl R,Hadler D.Alzheimer's Disease Assessment Scale:reliabilityand validity in a multicenter clinical trial.Int Psychogeriatr.1997年6月;9(2):123-38）来评价本文所述的阿尔茨海默病治疗的功能性。
在另一种实施方式中，可以使用阿尔茨海默病行为病理评定量表（“BEHAVE-AD”；参见，例如，Reisberg B,Borenstein J,Salob SP,Ferris SH,Franssen E,GeorgotasA.Behavioral symptoms in Alzheimer's disease:phenomenology and treatment.JClin Psychiatry.1987年5月;48Suppl:9-15）来评价本文所述的阿尔茨海默病治疗的功能性。
在另一种实施方式中，可以使用布雷氏失智信息-记忆-集中测试来评价本文所述的阿尔茨海默病治疗的功能性（参见，例如，Blessed G,Tomlinson BE,Roth M.Theassociation between quantitative measures of dementia and of senile change inthe cerebral grey matter of elderly subjects.Br J Psychiatry.1968年7月;114(512):797-811）。
在另一种实施方式中，可以使用剑桥神经心理自动化成套测试（“CANTAB”；参见，例如，Swainson R,Hodges JR,Galton CJ,Semple J,Michael A,Dunn BD,Iddon JL,Robbins TW,Sahakian BJ.Early detection and differential diagnosis ofAlzheimer's disease and depression with neuropsychological tasks.DementGeriatr Cogn Disord.2001;12:265-280；Fray PJ,Robbins TW.CANTAB battery:proposed utility in neurotoxicology.Neurotoxicol Teratol.1996年7-8月;18(4):499-504；和Robbins TW,James M,Owen AM,Sahakian BJ,McInnes L,RabbittP.Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery(CANTAB):a factoranalytic study of a large sample of normal elderly volunteers.Dementia.1994年9-10月;5(5):266-81）来评价本文所述的阿尔茨海默病治疗的功能性。
在另一种实施方式中，可以使用画钟测验来评价本文所述的阿尔茨海默病治疗的功能性（参见，例如，Sunderland T,Hill JL,Mellow AM,Lawlor BA,Gundersheimer J,Newhouse PA,Grafman JH.Clock drawing in Alzheimer's disease.A novel measureof dementia severity.J Am Geriatr Soc.1989年8月;37(8):725-9；和Lee H,SwanwickGR,Coen RF,Lawlor BA.Use of the clock drawing task in the diagnosis of mildand very mild Alzheimer's disease.Int Psychogeriatr.1996年秋天;8(3):469-76）。
在另一种实施方式中，可以使用康奈尔痴呆抑郁量表（“CSDD”；Alexopoulos GS,Abrams RC,Young RC,Shamoian CA.Cornell Scale for Depression in Dementia.BiolPsychiatry.1988年2月1日;23(3):271-84）来评价本文所述的阿尔茨海默病治疗的功能性。
在另一种实施方式中，可以使用老年抑郁量表（“GDS”；参见，例如，Burke WJ,Roccaforte WH,Wengel SP.The short form of the Geriatric Depression Scale:acomparison with the 30-item form.J Geriatr Psychiatry Neurol.1991年7-9月;4(3):173-8）来评价本文所述的阿尔茨海默病治疗的功能性。
在另一种实施方式中，可以使用简易精神状态检查（“MMSE”；参见，例如，FolsteinMF,Folstein SE和McHugh PR."Mini-Mental State":a practical method for gradingthe cognitive state of patients for the clinician.J Psychiatr Res.1975;12:189-198；和Cockrell JR和Folstein MF.Mini-Mental State Examination(MMSE).Psychopharm Bull.1988;24(4):689-692）来评价本文所述的阿尔茨海默病治疗的功能性。
在另一种实施方式中，可以使用神经精神症状问卷（“NPI”；Cummings JL,Mega M,Gray K,Rosenberg-Thompson S,Carusi DA,Gornbein J.The NeuropsychiatricInventory:comprehensive assessment of psychopathology indementia.Neurology.1994年12月;44(12):2308-14；Cummings JL.The NeuropsychiatricInventory:assessing psychopathology in dementia patients.Neurology.1997年5月;48(5Suppl6):S10-6）来评价本文所述的阿尔茨海默病治疗的功能性。
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5.3.5.2体内成像
可以使用在受试者中体内成像来评价本文所述的阿尔茨海默病治疗的功能性。
可以通过静脉注射到所述患者的身体中或者通过颅内注射或通过颅骨钻孔直接注射到脑中来施用成像试剂。试剂的剂量应在与治疗方法相同的范围内。通常，将试剂标记，尽管在一些方法中，具有亲合力的第一试剂是未标记的，而第二标记剂用来结合所述第一试剂。标记物的选择取决于检测方式。例如，荧光标记物适合于光学检测。顺磁标记物的使用适合于无外科手术的断层成象检测。还可以使用正电子发射断层成象术（PET）或单光子发射计算机断层成像术（SPECT）来检测放射性标记物。
可以通过将标记位点的数目、大小和/或强度与相应的基线值进行比较来评价治疗的功能性。基线值可以表示未患有阿尔茨海默病的个体群体中的平均水平。作为另外一种选择，基线值可以表示在相同患者中确定的上述水平。例如，可以在开始治疗前在患者中确定基线值，并随后与基线值相比较来测量数值。数值相对于基线的降低可以表示对治疗的阳性反应。
抗β淀粉样蛋白抗体还对确定在脑脊髓液或其他身体组织或体液中是否存在平截形式的Aβ是有用的。在患者中，相对于基线这种形式存在水平的降低可以表示对治疗的阳性反应。
（1）正电子发射断层成象术
在一种实施方式中，可以通过使用放射性标记的示踪剂作为探针通过正电子发射断层成象术（PET）监测阿尔茨海默病的病理生理学以评价本文所述的阿尔茨海默病的治疗的功能性（参见，例如，等人,2009,European Journal of Nuclear Medicine andMolecular Imaging,Radiopharmaceuticals for positron emission tomographyinvestigations of Alzheimer's disease,2009年12月22日在线公开）。例如，可以将碳-11-标记的匹兹堡化合物B用作放射性示踪剂通过PET使淀粉样蛋白斑块负荷成 像（参见，例如，Rinne2010,Lancet Neurology9:363-372）。用于淀粉样蛋白斑块负荷PET成像的其他示踪剂包括18F-标记的1-2-二苯乙烯和苯乙烯基吡啶（参见，例如，Kung等人,2010,Journal of Medicinal Chemistry53:933-941）；18F-标记的苯并噻唑（BTA）-衍生物3'-18FFPIB；刚果红衍生物SB-13的11C-和18F-标记形式；和氨基萘基衍生物18FFDDNP（参见，例如，Henriksen等人,2008,European Journal of Nuclear Medicine and MolecularImaging Suppl1:S75-81）。
（2）磁共振成象
在一种实施方式中，可以通过使用磁共振成象（MRI）来评价本文所述的阿尔茨海默病的治疗的功能性。MRI可用于评价中枢神经系统中的体积变化（参见，例如，Fagan等人,2009,Annals of Neurology65:176-183）和定量血管源性水肿（参见，例如，Black等人,2010,Alzheimer Disease and Associated Disorders24:198-203）。
5.3.5.3动物模型
在一些实施方式中，可以使用阿尔茨海默病模型体内测试本文所述的阿尔茨海默病的治疗的功能性。这些阿尔茨海默病的动物模型在本领域中是熟知的并且无限制地包括使用小鼠、大鼠和灵长类的模型。
示例性的阿尔茨海默病的鼠模型包括TgCRND8小鼠（参见，例如，Chishti,M.A.等人,Early-onset amyloid deposition and cognitive deficits in transgenic miceexpressing a double mutant form of amyloid precursor protein 695.J.Biol Chem276,21562-21570(2001)；Janus,C.等人,Aβ peptide immunization reducesbehavioural impairment and plaques in a model of Alzheimer'sdisease.Nature408,979-982(2000)）。TgCRND8小鼠表达具有已知会在人中导致阿尔茨海默病的两个错义突变（KM670/671NL和V717F）的人淀粉样蛋白前体蛋白转基因（APP695）。在约三个月大时，这些小鼠显示出进行性空间学习能力缺陷并伴随脑Aβ水平升高和脑细胞外淀粉状斑数目增加。到六个月大时，TgCRND8小鼠脑中的Aβ水平以及淀粉状斑的形态、密度和分布与在具有确定阿尔茨海默病的人脑中所观察到的那些类似。如在患有阿尔茨海默病的人患者中一样，该小鼠模型的生物化学、行为学和神经病理学特征伴有加速死亡。其他示例性的阿尔茨海默病鼠模型在本领域中是已知的并且这些小鼠是可商购的（参见，例如，在Jackson实验室的网站上可获得的阿尔茨海默病小鼠模型资源）。
阿尔茨海默病的灵长类模型在本领域中也是已知的（参见，例如，Wenk,1993,Behavioural Brain Research57(2):117-122；和Fainman等人,2007,American Journalof Medical Genetics 144B(6):818-819）。
在动物模型中对该阿尔茨海默病治疗后，可以使用在本领域中已知的方法来评价所述治疗的功能性，其无限制地包括如下所述的那些。
（1）存活研究
可以使用Kaplan-Meier技术来评价小鼠的存活概率，计算每次死亡发生时的存活概率，并因此使其适合于小样本量。对于存活分析，可以将小鼠分成对照组和治疗组，并且可以使用（例如）Tarone-Ware检验来评价各组之间的比较。
（2）莫里斯水迷宫实验
可以如前所述实施莫里斯水迷宫实验（参见，例如，Morris,R.Development of awater-maze procedure for studying spatial learning in the rat.J.NeurosciMethods11,47-60(1984)）。在该程序中，可以将小鼠放置在充满水的圆形池中，其具有刚刚淹没在水面下的逃生平台。可以在该平台上设置可见标志物从而使动物可以通过导航至邻近的目视标志来找到它。（作为另外一种选择，可以给小鼠更复杂的测试形式，其中没有正规的标志来标记平台位置。在这种形式中，小鼠必须学会相对于远处视觉标志的平台位置。）小鼠在水中所处的时间长度与认知能力逆相关。
示例性试验如下所示：第1天，在没有预先训练的情况下小鼠进入具有隐藏平台的莫里斯水迷宫实验。可以对小鼠测试3天，每天6次试验。第4天，可以将平台从池中移除并给每只小鼠一次30秒的游泳探索试验。最后一天，可以对小鼠施用标志试验以评价它们的游泳能力、视力和一般认知能力。标志试验可以由放置在与用于测试的四分之一圆不同位置的平台组成，并且可以用旗子标记。允许动物在60秒内找到平台。在最终的空间记忆分析中不使用找不到平台的动物。可以使用以药物或基因型以及训练期作为重复测量因素的因素方差分析（ANOVA）的混合模型来分析行为数据。
（3）运动活力
可以使用已知方法，例如使用转棒（San Diego Instruments,San Diego,Calif.）来评价运动活力。例如，可以将小鼠在如前所述的转棒中分析2天（参见，例如，Masliah,等人,(2000)）。在该分析中，第1天可以训练小鼠5次：第一次以10rpm，第二次以20rpm，第三到第五次以40rpm。第2天，可以测试小鼠7次，每次均以40rpm。试验期间，可以将小鼠单独放置在圆柱体上并且在一段时间内将转速增加至适当的速度。可以记录小鼠在棒上停留的时间长度（摔落等待时间）并将其用作运动功能的量度。
（4）脑淀粉样蛋白负荷
可以如下所示测试脑淀粉样蛋白负荷：可以除去来自试验动物的脑并且可以将一个半球固定在4%多聚甲醛中并以中矢面包埋在石蜡中。为了产生系统均一的不定向切片组，可以收集穿过整个半球的5微米连续切片。可以将50微米间隔的切片组用于分析（10-14个切片/组）。可以在用甲酸抗原修复并与第一抗β淀粉样蛋白抗体（例如，Dako M-0872）培育，然后与第二抗体（例如，Dako StreptABC复合物/辣根试剂盒）培育后鉴别斑块。可以用二氨基联苯胺（DAB）使最终产物显像，并且可以将最终产物用（例如）luxol fast blue复染。可以使用（例如）与Leica显微镜和Hitachi KP-M1UCCD摄像机连接的Leco IA-3001图像分析软件评价淀粉样蛋白斑块负荷。然后，可以使用Openlab图像软件（Improvision,Lexington,Mass.）将显微照片转化为双值图像以用于斑块数目和斑块面积的确定。
（5）血浆和脑淀粉样蛋白β
可以如下所示确定血浆和脑中的淀粉样蛋白β的水平：可以使半脑样品在缓冲蔗糖溶液中匀质化，然后在0.4%二乙胺/100mM NaCl中匀质化以用于可溶性淀粉样蛋白β水平或在冷的甲酸中匀质化以用于分离总Aβ。中和后，可以将样品稀释并使用可商购的试剂盒（例如，BIOSOURCEInternational提供的那些）分析Aβ。可以使用脲凝胶对所有部分进行Aβ种类的免疫印迹分析（参见，例如，Wiltfang,J.等人,Highly conserved and disease-specific patterns of carboxyterminally truncated Abeta peptides 1-37/38/39inaddition to 1-40/42 in Alzheimer's disease and in patients with chronicneuroinflammation J Neurochem81,481-496(2002)）。可以使用（例如）6E10（BIOSOURCEInternational）和增强化学发光（Amersham）检测淀粉样蛋白β。
（6）脑中APP的分析
可以如下所示检测脑中的APP：可以将小鼠半脑样品在与0.4%DEA（二乙胺）/100mMNaCl混合的20mM Tris（pH7.4）、0.25M蔗糖、1mMEDTA和1mM EGTA以及蛋白酶抑制剂的混合物中匀质化并以109,000×g离心。如前所述，可以通过使用单克隆抗体的免疫印迹来分析上清液的APP水平，并且可以使用（例如）单克隆抗体C1/6.1分析颗粒中的APP全蛋白（参见，例如，Chishti,M.A.等人,Early-onset amyloid deposition and cognitive deficitsin transgenic mice expressing a double mutant form of amyloid precursorprotein695.J.Biol Chem 276,21562-21570(2001)；和Janus,C.等人,A.beta.peptideimmunization reduces behavioural impairment and plaques in a model ofAlzheimer's disease.Nature408,979-982(2000)）。
（7）长期增强作用
可以使用标准程序记录小鼠海马CA1区中的场电位（参见，例如，Sarvey,J M,Burgard E C&Decker G.Long-term potentiation:studies in the hippocampalslice.J Neurosci Methods 28,109-124(1989)；和Stanton,P K& Sarvey JM.Norepinephrine regulates long-term potentiation of both the populationspike and dendritic EPSP in hippocampal dentate gyrus.Brain Res Bull.18,115-119(1987)）。可以除去小鼠的脑并且可以分离来自每个半球的海马，从中可以制备切片（例如，可以制备350μm冠状切片）。可以将切片转移至含有NaCl-CSF的保持室中并允许恢复1小时以上。一旦放入室中，可以通过含有15ml ACSF的闭合环路连续灌注切片以保存寡聚Aβ。基线稳定20分钟后，可以将1ml15×浓缩的7PA2条件培养基加入到灌注环路中。可以将双极刺激电极（例如，World Precision Inst.提供的那些）放置在沙飞侧支中以传递基线刺激和强直刺激。可以将含有ACSF的硅酸硼玻璃记录电极布置在距刺激电极约75-200μm处。可以设置刺激物的强度（通常在10-20μAmp之间）以获得25-40%的最大场电位响应。可以以0.05Hz递送测试刺激物。为了引起长期增强作用，可以以5分钟的间隔递送4次强直刺激（100Hz，1秒）。可以使用（例如）Axopatch200B将场电位响应放大10倍。可以以10kHz对数据采样并以2kHz过滤。可以使用（例如）pClamp9.2分析扫描线。可以使用约10-60%的总响应估计场电位的斜率。
（8）突触素的定量分析
可以在多聚甲醛固定的治疗和对照小鼠的3个空间均匀分布的矢状切片上进行突触素免疫组织化学染色。可以用（例如）抗突触素IgG（1:40；Roche,Laval,PQ）对突触素免疫标记切片。可以捕捉并分析数字图像。在每个切片内，可以对海马CA1区中三个随机选择的100μm2区域中的突触素反应性细胞体和棒头计数。结果可以表示为每100μm2中反应性体和棒头的个数的平均值（参见，例如，Chen,F.等人,Carboxyl-terminal fragments ofAlzheimer beta-amyloid precursor protein accumulate in restricted andunpredicted intracellular compartments in presenilin1-deficient cells.JBiol.Chem.275,36794-36802(2002)；Phinney,A.等人,No hippocampal neuron orsynaptic bouton loss in learning-impaired agedβ-amyloid precursor protein-null mice.Neuroscience90,1207-1216(1999)）。
（9）条件性味觉厌恶
条件性味觉厌恶（CTA）是在治疗施用前后用于测试动物认知功能的非常敏感的、熟知的标准测试。CTA用于测试动物学习将疾病与新型刺激（如，味道）相关联的能力，从而使该动物一旦随后再次暴露于该新型刺激时会避免这种新型味道。CTA在多种皮层和皮层下水平涉及脑。可以通过影响任何相互连接单元的变化来减弱或加强将上行和下行信息联系在一 起从而产生厌恶行为的这种结合。作为联想学习的一种形式，通过多种变量确定了CTA的强度，仅举几个例子来说，其包括口服刺激物的新型性（例如，非新型刺激物不能产生厌恶条件）、所产生的“坏”的程度（毒性）、重复次数（训练）、抵抗驱动力（如口渴）。尽管多种化学和物理试剂可以以剂量依赖方式产生CTA，但氯化锂可靠地产生了不适和厌食症。像天然存在的疾病一样，锂通过刺激如上所述的途径产生CTA，其包括细胞因子释放。
（10）巴恩斯迷宫
巴恩斯迷宫由具有圆孔的圆形工作台组成，所述圆孔围绕该工作台的圆周。每个孔的下方是箱的狭槽，其称为下落箱。动物在该迷宫中的目标是达到下落箱，它是具有顶部开口的箱并且可以穿过工作台上的一个孔。在工作台表面上暴露起到负强化的作用，从而促进测试受试者寻找遮蔽处。唯一可用的遮蔽处是下落箱，测试受试者必须逃至此处。为了使测试受试者习惯于该迷宫，通过遮蔽光的手将其引导至下落箱中。试验4至5次后，正常的测试受试者可以快速确定下落孔。设置在平台周围的固定视觉线索用于在测试期间定向啮齿动物。
通常通过受试者犯错次数（即它将鼻子伸向不含有下落箱的圆孔或将其头部在不含有下落箱的圆孔上方徘徊的次数）来测量性能。在受试者间测量错误/试验次数的降低率。还可以测量其他性能值，例如，可以将每只啮齿动物所使用的策略评分为随机（随机检查每个孔）、系统（以一定方式检查每个孔）或空间（直接移动到具有下落箱的孔）。
（11）延迟匹配样本
延迟匹配样本（DMTS）程序一般用于在实验动物中评价空间认知记忆。在示例性规程中，将受试者置于配备有两根可收缩杆和食品颗粒分散器的室中。一段时间后，出现样品杆，并且受试者必须按压该杆以获得食物。然后，收回该杆并且在延迟不同时间后，再次出现两根杆并要求受试者进行选择。在匹配条件下，正确的响应将构成按压之前已存在的杆并且通过分配食物颗粒作为回报。用5秒暂停期（在此期间关闭室内灯光）惩罚错误的响应。通过分析受试者正确和错误响应的次数来确定工作记忆。
（12）小神经胶质细胞的激活作用
小神经胶质细胞的激活作用可以在阿尔茨海默病的治疗中起到有益的作用。因此，可以使用用于测量小神经胶质细胞激活作用的已知方法来评价本文所述的阿尔茨海默病治疗的功能性（参见，例如，Higuchi,2009,Current Alzheimer Research6:137-143）。这类方法使用了如上所述那些的成 像技术（包括PET成像）以确定与对照受试者相比治疗受试者的小神经胶质细胞激活作用水平。
5.4治疗方法
本文提供了使用安全和功能性的抗体对淀粉样变性（包括但不限于阿尔茨海默病）进行安全和功能性的治疗的方法。在某些实施方式中，方法包括使用剂量和/或施用方案的与淀粉样蛋白和/或其病理形式（如聚集物）特异性结合的非IgG1抗体的施用，从而使p38MAP激酶以中等水平在免疫效应细胞中激活。如在本节中所使用的与p38MAP激酶的激活作用有关的术语“中等水平”表示比不存在所述抗体时更高但比存在具有相同结合特异性但具有IgG1抗体的恒定区的抗体时更低的水平。可以如5.1节中所示确定p38MAP激酶的激活作用水平。
在某些实施方式中，使用导致靶标抗原（如淀粉样蛋白β蛋白质）向免疫效应细胞（如小神经胶质细胞）最大内化以及p38MAP激酶以中等水平激活的剂量和/或施用方案施用与淀粉样蛋白和/或其病理形式（如聚集体）特异性结合的非IgG1抗体。在某些实施方式中，将所述抗体结合p38MAP激酶途径的调节剂施用从而使p38MAP激酶以中等水平激活。
在某些实施方式中，用于本文所述方法的非IgG1抗体是具有人IgG4抗体的恒定区的抗体。在某些实施方式中，非IgG1抗体具有IgG的恒定区，其具有人IgG4抗体的CH2区。在某些实施方式中，与人β淀粉样蛋白（参见下表2）特异性结合的已知非人源化抗体的CDR与人IgG4抗体的恒定区结合并且用人IgG抗体（如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4）的框架区替换抗体CDR之间的框架区。在某些实施方式中，已知的人源化抗β淀粉样蛋白抗体（例如，巴匹珠单抗（Bapineuzumab）或苏兰珠单抗（Solanezumab））的可变区与人IgG4抗体的恒定区结合。
可以使用本领域的技术人员已知的任何技术测量β淀粉样蛋白向小神经胶质细胞的内化和p38MAP激酶的激活作用。在某些实施方式中，使用5.1节中所述的基于细胞的测定系统确定在淀粉样变性（包括但不限于阿尔茨海默病）的治疗中使用的本发明的安全和功能性的抗体的剂量。具体地，调节所述剂量从而使β淀粉样蛋白向小神经胶质细胞的内化最大，同时p38MAP激酶途径的激活作用以比存在IgG1同种型抗β淀粉样蛋白抗体时激活的p38MAP激酶低5%-15%；10%-20%；15%-25%；20%-30%；35%-45%；40%-50%；或45%-55%被激活。
在某些实施方式中，使用5.1节中所述的基于细胞的测定系统来确定在淀粉样变性（包括但不限于阿尔茨海默病）的治疗中使用的本发明的安全和功能性的抗体的给药方案。具体地，调节所述剂量从而使β淀粉样蛋白 向小神经胶质细胞的内化最大，同时p38MAP激酶途径的激活作用以比存在IgG1同种型抗β淀粉样蛋白抗体时激活的p38MAP激酶低5%-15%；10%-20%；15%-25%；20%-30%；35%-45%；40%-50%；或45%-55%被激活。
在某些实施方式中，调节本发明的安全和功能性的抗体的剂量从而使β淀粉样蛋白向小神经胶质细胞的内化最大，同时p38MAP激酶途径的激活作用以比不存在所述抗体时p38MAP激酶的激活水平高5%-15%；10%-20%；15%-25%；20%-30%；35%-45%；40%-50%；或45%-55%被激活。
在某些实施方式中，使用5.1节中所述的基于细胞的测定系统来确定在淀粉样变性（包括但不限于阿尔茨海默病）的治疗中使用的本发明的安全和功能性的抗体的给药方案。具体地，调节所述剂量从而使β淀粉样蛋白向小神经胶质细胞的内化最大，同时p38MAP激酶途径的激活作用以比不存在所述抗体时p38MAP激酶的激活水平高5%-15%；10%-20%；15%-25%；20%-30%；35%-45%；40%-50%；或45%-55%被激活。
在具体的实施方式中，所述淀粉样变性是阿尔茨海默病，所述淀粉样蛋白是β-淀粉样蛋白，所述免疫效应细胞是小神经胶质细胞。尽管所述方法和组合物是具体针对阿尔茨海默病更详细地说明的，但是这些方法和组合物通常适用于淀粉样变性的治疗和预防，所述淀粉样变性包括但不限于，继发性淀粉样变性和年龄有关的淀粉样变性，如疾病，其包括但不限于如阿尔茨海默病（AD）的神经障碍，其包括以认真记忆能力丧失为特征的疾病或病况，如（例如）轻度认知障碍（MCI）、路易体痴呆症、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉样变性（荷兰型）；关岛型肌萎缩侧索硬化-帕金森综合征-痴呆复合征；以及基于淀粉样蛋白样蛋白质或与之有关的其他疾病，如进行性核上麻痹、多发性硬化、海绵状脑病、帕金森氏病、HIV相关性痴呆病、ALS（肌萎缩性侧索硬化症）、包涵体肌炎（IBM）、成年型糖尿病、内分泌肿瘤和老年性心脏淀粉样变性；和多种眼部病症，其包括黄斑变性、脉络膜小疣相关性视神经病和由于β淀粉样蛋白沉积的白内障。在具体的实施方式中，所述淀粉样变性是阿尔茨海默病并且所述患者是人患者。
在某些实施方式中，使用本文所提供的安全和功能性的抗体和目前用于阿尔茨海默病治疗的下列药物中的一种或多种的组合治疗阿尔茨海默病，所述药物如他克林（COGNEX,Morris Plains,NJ）、多奈哌齐（ARICEPT,Tokyo,JP）、利凡斯的明（EXELON,EastHanover,NJ）、加兰他敏（REMINYL,New Brunswick,NJ）和美金刚（NAMENDA,New York,NY）。
5.5药物制备和给药
可以使用已知技术在生理学可用的制剂中制备本文所提供的安全和功能性的抗体（5.2节）并且所述抗体可以包含可药用载体、稀释剂和/或赋形剂例如，如本文所述的安全和功能性的抗体与可药用载体、稀释剂和/或赋形剂结合以形成治疗性组合物。适合的药物载体、稀释剂和/或赋形剂在本领域中是熟知的并且包括（例如）磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳浊液（如油/水乳浊液)、多种类型的润湿剂、无菌溶液等。
可以根据本领域的技术人员所知的标准方法完成本文所提供的药物组合物制剂。
可以将本文所提供的药物组合物以适合的药物功能性剂量以固体、液体或气溶胶的形式给予受试者。固体组合物的实例包括丸剂、乳膏剂和可植入的剂量单位。丸剂可以口服给药。治疗性乳膏剂可以局部给药。可植入剂量单位可以在（例如）肿瘤位点的位置上给予或者可以（例如）皮下植入以全身释放治疗性组合物。液体组分的实例包括适合于肌内、皮下、静脉内、动脉内注射的制剂和用于局部和眼内给药的制剂。气溶胶制剂的实例包括用于向肺部给药的吸入器制剂。
所述组合物可以通过标准给药途径给药。一般地，可以通过局部、口服、直肠、鼻、皮内、腹膜内或胃肠外（例如，静脉内、皮下或肌内）途径给予所述组合物。另外，可以将所述组合物引入到缓释基质（如可生物降解的聚合物）中，将所述聚合物植入到需要递送的位置（例如，肿瘤位点）附近。所述方法包括单次剂量的给药，以预定时间间隔的重复剂量的给药在预定时间段内的持续给药。
如本文所使用的缓释基质是由通过酶促或酸/碱水解或通过溶解可降解的材料（通常是聚合物）制成的基质。一旦插入体内，该基质通过酶和体液开始起作用。缓释基质期望地选自生物相容性材料，如脂质体、聚交酯（聚乳酸）、聚乙交酯（乙醇酸的聚合物）、聚交酯-共-乙交酯共聚物（乳酸和乙醇酸的共聚物）、聚酐、聚原酸酯、多肽、透明质酸、胶原、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸（如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸）、多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和聚硅氧烷。一般用于本发明目的的可生物降解基质包括但不限于聚交酯、聚乙交酯或聚交酯-共-乙交酯共聚物（乳酸和乙醇酸的共聚物）中任一种的基质。
本领域的技术人员公知组合物的剂量将取决于多种因素，例如待治疗的病症、所使用的具体的组合物和其他临床因素，如患者的体重、身高、 性别和一般健康状况、体表面积、待给药的具体的化合物或组合物、同时给药的其他药物和给药途径。
所述组合物可以结合其他组合物，连同根据本发明的抗体和可选地可药用载体和/或稀释剂和/或赋形剂和用于疾病治疗的程序给药，所述组合物包含生理活性物质或化合物，具体地，选自以下化合物的至少一种化合物：抗氧胁迫化合物、抗凋亡化合物、金属螯合剂、DNA修复抑制剂，如哌仑西平和代谢产物、3-氨基-1-丙烷磺酸（3APS）、1,3-丙烷二磺酸（1,3PDS）、α-分泌酶激活剂、β-和γ-分泌酶抑制剂、τ蛋白、神经递质、β片层阻断肽、清除/排除β淀粉样蛋白的细胞组分的引诱剂、N末端平截的β淀粉样蛋白的抑制剂，其包括焦谷氨酸化淀粉样蛋白β3-42、抗炎分子、“非典型抗精神病药物”，如（例如）氯氮平、齐拉西酮、利培酮、阿立哌唑或奥氮平或胆碱酯酶抑制剂（ChEI），如他克林、利凡斯的明、多奈哌齐和/或加兰他敏、M1激动剂及其他药物，其包括任何淀粉样蛋白或τ修饰药物和营养添加剂，例如维生素B12、半胱氨酸、乙酰胆碱前体、卵磷脂、胆碱、银杏、乙酰基-L-卡尼汀、艾地苯醌、丙戊茶碱或黄嘌呤衍生物。
给药通常会是肠胃外给药，例如，静脉内给药。用于肠胃外给药的制剂包括无菌水或非水溶液、混液和乳浊液。非水溶剂包括但不限于丙二醇、聚乙二醇、植物油（如橄榄油）和可注射的有机酯（如油酸乙酯）。水溶剂可以选自水、醇/水溶液、乳浊液或混悬液，包括盐水和缓冲培养基。肠胃外赋形剂包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖液、葡萄糖-氯化钠液、乳酸林格氏液或非发挥性油。静脉内赋形剂包括液体和营养补充剂、电解质补充剂（如基于林格氏葡萄糖液的那些）等等。还可以存在防腐剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。
所述药物组合物还可以包含蛋白质载体，例如血清白蛋白或免疫球蛋白，尤其是人源的。根据预期用途，其他生物活性剂可以存在于本发明的药物组合物中。
当结合靶标位于脑中时，本发明的某些实施方式提供了抗体或其活性片段以穿过血脑屏障。某些神经变性疾病与血脑屏障的渗透性增加有关，从而使得抗体或其活性片段可以容易地进入脑中。当血脑屏障完整无损时，存在用于将分子输送穿过血脑屏障的几种本领域已知的方法，包括但不限于物理方法、基于脂质的方法和基于受体和通道的方法。
输送抗体或其活性片段穿过血脑屏障的物理方法包括但不限于彻底绕过血脑屏障或通过在血脑屏障中开口。绕过方法包括但不限于向脑中直接注射（参见，例如，Papanastassiou等人,Gene Therapy9:398-406(2002)）和在脑中植入递送装置（参见，例如，Gill等人,Nature Med.9:589-595 (2003)；和Gliadel WafersTM,GuildfordPharmaceutical）。在所述屏障中开口的方法包括但不限于，超声（参见，例如，美国专利公开No.2002/0038086）、渗透压（例如，通过给予高渗甘露醇（Neuwelt,E.A.,Implication ofthe Blood-Brain Barrier and its Manipulation,Vols 1 & 2,Plenum Press,N.Y.(1989)））、通过例如血管舒缓激肽或可透化剂A-7的透化作用（参见，例如，美国专利No.5,11,2596、5,268,164、5,506,206和5,686,416）和用含有编码所述抗体或抗原结合片段的基因的载体转染跨在血脑屏障上的神经元（参见，例如，美国专利公开No.2003/0083299）。
输送抗体或其活性片段穿过血脑屏障的基于脂质的方法包括但不限于将所述抗体或其活性片段包埋在脂质体中，所述脂质体与结合血脑屏障血管内皮上的受体的抗体结合片段相连（参见，例如，美国专利申请公开No.20020025313），和在低密度脂蛋白颗粒（参见，例如，美国专利申请公开No.20040204354）或脱脂蛋白E（参见，例如，美国专利申请公开No.20040131692）中涂覆所述抗体或其活性片段。
用于输送抗体或其活性片段穿过血脑屏障的基于受体和通道的方法包括但不限于，使用糖皮层激素阻断剂提高血脑屏障的渗透性（参见，例如，美国专利申请公开No.2002/0065259、2003/0162695和2005/0124533）；激活钾通道（参见，例如，美国专利申请公开No.2005/0089473）、抑制ABC药物转运蛋白（参见，例如，美国专利申请公开No.2003/0073713）；用转铁蛋白涂覆抗体并调节所述一种或多种转铁蛋白受体的活性（参见，例如，美国专利申请公开No.2003/0129186）和使所述抗体阳离子化（参见，例如，美国专利No.5,004,697）。
仅利用常规实验方法，本领域的技术人员就认识到或者能够确定与本文所述的本发明的具体实施方式相当的多种实施方式。意在将这些等价实施方式涵盖在所附的权利要求中。
本文所引用的所有参考文献以它们的全部内容并且以达到似乎每个专利公开或专利或专利申请均具体并单独指明出于所有目的以其全部内容作为参考并入本文的相同程度出于所有目的作为参考并入本文。
本发明未受限于本文所述的具体实施方式的范围。事实上，根据以上说明和附图，除本文所述的那些之外的本发明的多种改变对于本领域的技术人员将是显而易见的。意在将这些改包括在所附权利要求的范围内。
6.实施例
6.1与多种Aβ构象等同结合的人源化IgG4抗体的鉴别
通过使用如前所述的脂质体疫苗制剂用Aβ肽抗原免疫小鼠产生了鼠抗Aβ单克隆抗体（Muhs等人,2007）。将几种标准用于选择候选抗体，其 包括结合多个Aβ种类和抑制Aβ1-42向小细胞毒性肽聚集物组装的能力。使用阿尔茨海默病的单转基因鼠突变人APP和双转基因鼠突变humanAPP/PS1模型，选择具有IgG2b主链的单克隆鼠mAb（mMABT）进行体内功能性研究。使用mMABT的治疗改善了记忆并且降低了斑块负荷（参见图7）。mMABT进一步亲合力成熟并人源化至人IgG4主链上（所得抗体也称为“MABT”）。为测试MABT与Aβ的体外结合，制备并鉴定了一系列不同的Aβ1-42制剂。这些为从通过尺寸排阻色谱（SEC）分离的单体和寡聚Aβ1-42部份、成熟的Aβ1-42纤维到高度神经毒性的Aβ1-42寡聚体组件的更复杂的混合物，其尺寸从二聚体和三聚体到更高分子量的多聚体（参见图8）。通过ELISA测量了MABT与不同的Aβ1-42肽制剂的结合，其类似于mABT，并且显示在不同的Aβ1-42组件状态中是高度可比较的（图1A-图1C）。
随后测试了MABT与表达人淀粉样蛋白前体蛋白质（hAPP）的转基因小鼠的脑中的Aβ斑块以及和人AD脑切片中的淀粉状斑的结合。用MABT单克隆抗体免疫修饰hAPP转基因小鼠（图1D上部）和AD脑（图1D下部）中的淀粉状斑。综合考虑，这些数据提供了MABT与AD脑中所存在的可溶性神经毒性Aβ寡聚体和Aβ组件均结合的强有力证据。
6.2病理学Aβ组件的抑制和预先形成的原纤维体Aβ1-42肽的解聚
体外数据已表明当与Aβ结合时抗Aβ抗体能够防止病理学较高等级的Aβ组件的形成并逆转预先形成的Aβ聚集物（Legleiter等人,2004；Solomon等人,1997）。MABT单克隆抗体的结合表位定位在Aβ1-42的氨基酸14至23，并因此与负责自结合、后续寡聚化以及Aβ1-42β-片层组件的核的Aβ1-42的主要疏水性阳离子部分重叠（Pike等人,1993；Esler等人,1996；Haass和Selkoe,2007）。利用不阻止淀粉样蛋白组装但一旦与富含β-片层的小淀粉样蛋白聚集物结合就会发荧光的染料硫黄素T（ThT）测试了MABT对体外Aβ1-42聚集的影响（Levine,III,1993）。当与针对Aβ1-42N末端的对照抗Aβ单克隆抗体相比时，（并因此未与形成自组装结构域的核心氨基酸重叠），MABT显示出对Aβ1-42聚集的强抑制作用（图1E左侧部分）和预聚集的Aβ1-42肽的消除（图1E右侧部分）。在两个测定中，与抗中间结构域MABT单克隆抗体相比，针对Aβ的N末端的对照单克隆抗体具有约一半的抑制活性。当将MABT与抗C末端抗Aβ单克隆抗体相比时，获得了类似的结果（未示出）。这些体外测定是基于ThT与Aβ1-42肽的延伸的β-片层结合的能力（Levine,III,1993）。因此，为了验证这不是由于结合富含β-片层的Aβ1-42的ThT的潜在的单克隆抗体介导的取代的人工产物，实施了不依赖于ThT荧光而是依赖于标记的Aβ1-42聚集到或自组装到固定 的未标记的Aβ1-42上的能力的测定。在该测定中获得了可比较的结果，即MABT防止Aβ1-42以剂量依赖的方式自组装（图1F）。这些数据表明在该测定中相对于靶向Aβ其他结构域的抗体，针对如MABT的Aβ的中间结构域的抗体提供了对Aβ1-42纤丝伸长和/或聚集的最稳健的抑制作用。
已表明可溶性Aβ1-42寡聚体与其他蛋白质（可溶性蛋白和膜结合蛋白两者）结合的能力有助于其毒性（Strittmatter等人,1993；Liu等人,2009）。ApoE4与Aβ1-42的相互作用位点需要氨基酸18至28（Strittmatter等人,1993）。体外测试了MABT对Aβ1-42与重组人ApoE4结合的影响，并且与对Aβ1-42的N末端或C末端特异的单克隆抗体进行了比较。在其中使用ApoE4和Aβ1-42的饱和浓度的条件下，MABT抑制了超过80%的Aβ1-42和ApoE4的相互作用，大于所测试的任何其他单克隆抗体（参见图9）。总的来说，这些数据表明MABT防止Aβ1-42向有毒的生物学活性组件状态的进一步寡聚化并且消除了已聚集或斑块结合的Aβ1-42。此外，通过位于中间的结合表位，MABT能够竞争Aβ肽与其他蛋白质（如ApoE）的相互作用，并因此阻断了与在Aβ中间结构域中需要氨基酸的Aβ的相互作用，包括自结合。
6.3Aβ1-42寡聚体的神经毒性作用的体外MABT介导的中和
通过显示MABT单克隆抗体的治疗功能性的生物化学和体内功能性数据，使用细胞毒性Aβ1-42寡聚体测试了原代细胞培养模型中MABT单克隆抗体的作用。使来自P1大鼠的原代皮层培养物生长并用游离的Aβ1-42寡聚体或复合至MABT的寡聚体处理。在所有实验中将非特异性IgG单克隆抗体用作对照。用2.5或5μM Aβ1-42寡聚体处理皮层培养物24小时导致作为细胞存活力指示的代谢更新的降低，如通过MTT的线粒体氧化所测量的（图2A）。在存在MABT的情况下，对于Aβ1-42寡聚体浓度多至5μM观察到完全免受毒性（MABT与Aβ1-42寡聚体的摩尔比为1:7.5）。为了确认这些结果，使用发光测定测量了ATP释放并且也显示出相似的MABT细胞保护效果（图2B）。为了进一步评价MABT对Aβ1-42介导的神经元细胞死亡的影响，将小鼠胚胎皮层神经元保持培养6天，并用具有或不具有MABT的Aβ1-42处理4天。对照培养显示出健康的形态（图2C，最左侧部分）。用Aβ1-42处理4天导致轴突退化并且导致轴突总数减少（图2C，中间部分）。用Aβ1-42与MABT的组合处理细胞并且MABT表现与对照细胞类似（图2C，最右侧部分）。这些结果表明抗AβMABT单克隆抗体能够保护大鼠皮层培养物不受急性Aβ1-42寡聚体介导的存活力丧失和胚胎小鼠皮层神经元不受Aβ1-42诱导的退化。
6.4Aβ1-42寡聚体与细胞膜的相互作用受抗AβMABT mAb的抑制
已知Aβ肽，特别是聚集中间体（Bateman等人,2007）与存在于细胞膜中的多种脂质和蛋白质结合。测试了MABT是否可以通过降低或甚至阻断Aβ1-42寡聚体与神经元的结合来发挥其神经保护性作用。对膜结合Aβ实施了免疫荧光染色。将Aβ1-42寡聚体应用于混合的皮层培养物30分钟或18小时，此后用抗神经元特异性III型β-微管蛋白的抗体对培养物的Aβ染色。用Aβ1-42寡聚体处理皮层神经元导致Aβ与神经元的强结合，特别是对于神经炎过程（图3A，中间部分和插图）。与MABT的共处理（co-treatment）阻断了Aβ1-42寡聚体与神经元的相互作用，特别是与神经元突起（neuronal process）的结合。该作用早在30分钟时已容易地出现（图3A和图3B）并且保持至少处理18小时（图3B）。尽管在我们的测定中使用了N末端抗AβmAb（克隆6E10）来对Aβ1-42寡聚体染色（图3A），并因此降低了MABT和用于染色的检测单克隆抗体之间干扰的可能性，但是仍使用HiLyte Fluor-488荧光标记的Aβ1-42确认了这些结果。用该直接标记的Aβ1-42肽处理皮层培养物还支持以下结论：MABT降低了Aβ1-42与原代皮层培养物中的神经元突起的结合（图3C和图3D）。
已表明神经元内Aβ142的积累明显促进了神经元功能障碍（Casas等人,2004；Wirths等人,2001；Cleary等人,2005；Oddo等人,2003）。使用ELISA测定在无胰蛋白酶的细胞中确定了Aβ1-42的胞内累积。该分析表明MABT将Aβ1-42寡聚体的内化降低了60%以上（图3E）。出乎意料的是，免疫荧光研究观察还表明在存在MABT的情况下，Aβ1-42寡聚体结合远离神经元突起向与小神经胶质细胞类似的细胞谱（cellular profile）偏移。
6.5Aβ1-42寡聚体的小神经胶质细胞吸收
研究了MABT/Aβ1-42复合物形成和Aβ1-42的小神经胶质细胞吸收之间的关系。为了验证复合至MABT的Aβ1-42寡聚体是通过小神经胶质细胞吸收的，对处理的混合神经元培养物进行了共聚焦成像。当与仅用Aβ1-42寡聚体处理的细胞相比时，发现MABT介导的Aβ1-42寡聚体向其快速吸收的细胞谱可能是小神经胶质细胞（图4A）。这早在处理后30分钟时就已容易地出现。小神经胶质细胞在作为APP小鼠中所损害的功能的Aβ的吸收和降解中起决定性作用（Hickman等人,2008）。对于抗Aβ免疫疗法，已经提出了借此消除Aβ斑块的一个可能机制是通过结合至Aβ的抗Aβ的FcγR结合性质（Koenigsknecht-Talboo等人,2008）。然而，小神经胶质细胞的抗Aβ/Aβ复合物的吸收和FcγR的激活可以触发这些细胞成为激活细胞。
除了克服Aβ1-42寡聚体对神经元的直接细胞毒性之外，治疗性抗Aβ抗体理想地将具有显著降低的促炎反应以及显著降低的由该促炎反应所引 起的负面结果。因此，将MABT与具有相同抗原结合序列但以不同FcγR结合亲和力锚定不同IgG主链的抗体（因此，具有不同的小神经胶质细胞激活潜能）相比较。这些包括具有完全FcγR结合能力的野生型人IgG1（MABT-IgG1）和具有显著降低FcγR结合的D265A突变的人IgG1主链（Shields等人,2001）。所测试的所有主链变体对Aβ1-42的结合具有相似的亲和力，如使用表面等离子共振所验证的。
然后，对Aβ1-42寡聚体处理的原代皮层小神经胶质细胞共聚焦成像比较了这些不同的单克隆抗体主链将Aβ1-42寡聚体内化至小神经胶质细胞的能力。发现Aβ1-42寡聚体的内化与FcγR的结合具有良好的相关性，其中MABT-IgG1>MABT>MABT-IgG1-D265A（图4B和图4C）。为了验证小神经胶质细胞确实是吸收复合至单克隆抗体的Aβ1-42的细胞，利用HiLyteFluor-488标记的Aβ1-42重复该研究并对小神经胶质细胞标志物Iba1共染色。一旦结合至MABT或MABT-IgG1单克隆抗体，标记的Aβ1-42开始在Iba1+小神经胶质细胞中富集（图4D）。在用Aβ1-42结合MABT-IgG1单克隆抗体处理的细胞培养物中，小神经胶质细胞具有更致密的核和更明亮的Iba1染色，这是表明更大抗原/抗体介导的小神经胶质细胞激活作用的特征。为了验证FcγR结合差异，测量了不同的交联IgG mAb与低亲和力FcγRIIIa-V158的结合，并且鉴别了结合的程度，其中MABT-IgG>MABT>MABT-IgG1-D265A（图4E）。在图10中示出了与FcγR家族其他成员的结合。
测试了不同的IgG单克隆抗体主链逆转混合的原代皮层培养物中Aβ142寡聚体介导的毒性的能力。对于Aβ1-42寡聚体介导的毒性的完全逆转，需要对MABT和MABT-IgG1单克隆抗体两者所存在的功能性FcγR结合活性。缺少FcγR结合功能性的MABT-IgG1-D265A单克隆抗体仅显示出对Aβ1-42寡聚体介导的细胞毒性的逆转的非显著趋势。意外的是，当与MABT相比时，与IgG4MABT单克隆抗体相比具有更大的FcγR结合亲和力的野生型MABT-IgG1单克隆抗体倾向于较小的保护效果。因此，尽管需要完全避免与小神经胶质细胞FcγR的结合，但是与MABT相比MABT-IgG1主链与FcγR结合的提高可以导致不希望的小神经胶质细胞激活作用，这可以转化为对Aβ1-42寡聚体介导的神经毒性降低的整体保护。
6.6MABT-IgG1野生型主链引起促炎性小神经胶质细胞反应
为了鉴别通过抗Aβ单克隆抗体改变其激活状态的Aβ1-42寡聚体所引起的毒性的下游介体（mediator），检查了几种候选信号通路。已广泛报道了p38MAPK在促进神经毒性和小神经胶质细胞激活中的作用（Li等人,2004；Wang等人,2004）。在用Aβ1-42寡聚体单独处理的或结合抗Aβ MABT、MABT-IgG1、MABT-IgG1-D265A或不结合Aβ1-42寡聚体的对照IgG1处理的原代混合皮层培养物中检查了p38MAPK的激活作用。当用Aβ1-42寡聚体处理细胞时，p38MAPK在15分钟内被激活（未示出）并在30分钟达到最大。与不同的单克隆抗体结合之后，仅具有IgG1野生型主链并且对FcγR具有最大结合亲和力的MABT-IgG1甚至进一步提高了Aβ1-42寡聚体引起的p38MAPK活性，如通过磷酸-p38MAPK-特异性ELISA所示出的（图5A）。由于多种抗Aβ抗体以相似的亲和力结合Aβ1-42，因此MABT-IgG1单克隆抗体应以和MABT相同的程度中和毒性Aβ1-42寡聚体。然而，IgG1主链更大的FcγR结合亲和力会导致对于对Aβ1-42寡聚体的作用高度敏感的细胞（如神经元）可以是有害的小神经胶质细胞的激活作用。复合至Aβ1-42寡聚体的MABT单克隆抗体不会降低Aβ1-42寡聚体引起的p38MAPK活性，而是显示出更高活性的倾向，这反映了该抗体的部分FcγR激活作用。
由于这些初始测定测量了混合的皮层培养物（包括神经元细胞和胶质细胞两者）中总p38MAPK活性，因此测试了当用Aβ1-42寡聚体和MABT的组合处理细胞时所检测的p38MAPK活性是否对小神经胶质细胞特异的问题。如前所述处理细胞，但这次通过免疫荧光染色连同小神经胶质细胞标志物Iba1一起检验磷酸-p38MAPK活性。一旦用复合至MABT或MABT-IgG1单克隆抗体的Aβ1-42寡聚体处理，约93%的对磷酸-p38MAPK呈阳性的细胞染色是Iba1+（图5B）。为了确认小神经胶质细胞中p38MAPK的激活，以同样方式处理纯化的小神经胶质细胞。在这些条件下，容易地鉴别了小神经胶质细胞中Aβ1-42/IgG复合物介导的p38MAPK激活（图5C）。
为了获知p38MAPK激活作用对Aβ1-42寡聚体介导的神经毒性的贡献，用第二代p38MAPK特异性抑制剂处理细胞，然后仅用Aβ1-42寡聚体或结合MABT或低FcγR结合的MABT-IgG1-D265A单克隆抗体处理。出乎意料的是，MABT介导的MTT信号的升高降低至存在p38MAPK抑制剂时MABT-IgG1-D265A的水平，这表明一旦p38MAPK抑制，则MABT介导的避免功能降低。p38MAPK抑制对用与MABT-IgG1-D265A单克隆抗体复合的Aβ1-42寡聚体处理的细胞无影响。这些结果表明，尽管MABT单克隆抗体不会显著引起p38MAPK水平高于仅用Aβ-1-42寡聚体所观察到的那些水平，但是p38MAPK激活作用确实在MABT介导的神经保护中起作用。不受理论的束缚，混合培养系统中这种活性的细胞靶标是小神经胶质细胞。
为了将小神经胶质细胞活性的升高更直接地与下游促炎结果相联系，测量了富含小神经胶质细胞的原代细胞培养的TNFα释放（>61%Iba1+，未示出）。当用Aβ1-42寡聚体处理时，在存在所测试的所有抗Aβ单克隆抗体的情况下，通过富集的小神经胶质细胞的促炎TNFα的释放降低（图6）。然而，在存在MABT的情况下观察到了最大的效果。因此，与抗AβIgG1单克隆抗体相比抗AβIgG4单克隆抗体可能具有更期望的谱图，其将神经保护作用与通过具有受限的小神经胶质激活作用的小神经胶质细胞促进Aβ吞噬的能力相结合。
6.7材料和方法
6.7.1细胞培养物的制备
如Meberg和Miller（Meberg and Miller,2003）所述，由出生后1天的斯普拉-道来氏大鼠（Charles River Laboratories L'Arbresle,France）制备了大鼠原代皮层培养物。除去小脑和脑膜，将皮层切成小块并通过酶促破环在37°C在解离缓冲液（木瓜蛋白酶、CaCl2、EDTA和HEPES；均来自Invitrogen,Carlsbad,CA）中解离。将脱氧核糖核酸酶（Invitrogen）加入10分钟。解离后，将分散的皮层神经元铺板到聚L-赖氨酸（0.01%；分子量150000-300000；Sigma）涂覆的6孔、24孔或96孔组织培养板上。对于免疫细胞化学，将细胞在涂覆的玻璃盖玻片上在24孔板中生长。将细胞在加湿培育箱中在37°C和5%CO2条件下维持在添加了L-谷氨酰胺（2mM;Sigma）、B27添加剂（Invitrogen）和青霉素/链霉素（Sigma）的无酚红神经基础培养基（Invitrogen）中。培养1小时和30分钟后，将培养基更换为星形细胞条件培养基。再培养4天后，通过用2.5μM的阿糖胞苷（Ara-C，Invitrogen）处理阻断细胞增殖。在这些培养条件下，通过NeuN/DAPI染色将20%的细胞鉴定为神经元（未示出）。除非另外说明，否则通常在体外6天（“DIV”）时使用混合皮层培养物进行实验。如以上对皮层培养物所述的，收获从皮层和海马制备的富集的小神经胶质细胞。将皮层和海马放进含有高葡萄糖的DMEM中并通过用10mL移液管然后用注射器吸取来匀质化。将匀浆液以1000×g离心3分钟，然后在预加热的含有高葡萄糖和10%FCS和青霉素/链霉素的DMEM（小神经胶质细胞培养基）中再悬浮。然后，将细胞悬液转移到T75组织培养瓶中并在37°C和5%CO2的条件下在加湿培育箱中保持1周。晃动三角瓶以将小神经胶质细胞与贴壁细胞分离，收集细胞并在DMEM中清洗。将所得细胞在1mL小神经胶质细胞培养基中再悬浮，计数并以5×104个细胞/孔铺板。为了验证小神经胶质细胞的富集，分别用星形胶质细胞和小神经胶质细胞标志物GFAP和Iba1对细胞染色。60%以上染色的细胞对Iba1呈阳性，没有细胞对GFAP和Iba1均染色。由 出生后3天的CX3CR1-GFP小鼠（Jackson Laboratories）制备纯化的小神经胶质细胞。将皮层和海马切开并使用10mL移液管，然后用18号针在含有高葡萄糖的DMEM中捣碎。将匀浆液以1000g离心3分钟，然后在预加热的含有高葡萄糖、10%FBS和青霉素/链霉素的DMEM（小神经胶质细胞培养基）中再悬浮。然后，将细胞悬液转移到T75组织培养瓶中并在37°C和5%CO2条件下在加湿培育箱中保持7-10天。通过晃动分离小神经胶质细胞，收集细胞并在DMEM中清洗。将所得细胞在1mL小神经胶质细胞培养基中再悬浮，计数并在组织培养物处理的玻璃室载玻片上以5×104个细胞/孔铺板以在实验中使用。
6.7.2抗Aβ抗体的产生
IgG4抗Aβ单克隆抗体MABT是通过用如前所述制备的疫苗使小鼠免疫产生的小鼠IgG2b单克隆抗体（mMABT）的人源化形式（Muhs等人,2007）。
6.7.3FcγR结合
使用酶联免疫吸附测定（ELISA）测量了测试抗体与一组人Fcγ受体（FcγR）的结合。人FcγR（Genentech,Inc.,CA）是在C末端具有Gly/6xHis/谷胱甘肽S转移酶（GST）多肽标记的含有受体γ-链的胞外域的融合蛋白。在该实验中，将具有人IgG1框架的单克隆抗体用作阳性对照（IgG1对照）。在4°C，在0.05M碳酸钠缓冲液（pH9.6）中用小鼠单克隆抗GST抗体（Genentech,Inc.）涂覆板过夜。用含有磷酸盐缓冲盐水（PBS）、0.5%的BSA和0.05%的吐温-20的测定缓冲液阻断后，将板在室温下与FcγR一起培育1小时。通过与抗GST涂层的相互作用，将人FcγR固定至板上。在含有10%阻断剂酪蛋白的PBS溶液（Pierce;Rockford,IL）的测定缓冲液中制备了抗AβMABT、MABT-IgG1、MABT-IgG1-D265A或IgG1对照单克隆抗体的连续稀释。稀释样品作为高亲合力受体（FcγRIa）的单体形式或者作为低亲合力受体（FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa）的多聚体形式应用。通过将山羊抗人κ链的F(ab')2片段（MPBiomedicals,Solon,OH）与测试单克隆抗体以约3：1的摩尔比交联产生了测试抗体的多聚体形式。将板与FcγR在室温下培育2小时。在每个培育步骤后，用含有PBS和0.05%吐温-20的清洗缓冲液清洗板三次。用结合辣根过氧化酶（HRP）的山羊抗人F(ab')2的F(ab')2片段（Jackson ImmunoResearch Laboratories;West Grove,PA）检测与FcγR结合的抗体。将四甲基联苯胺（TMB;Kirkegaard & Perry Laboratories,Gaithersburg,MD）用作底物。将板在室温下培育15至20分钟以使得显色。用1M H3PO4终止反应，并且在酶标仪（MolecularDevices, Sunnyvale,CA）上测量以650nm为基准波长的450nm的吸光值。通过将样品稀释的重复的平均吸光值与相应样品的吸光值作图产生了结合曲线。
6.7.4体内功能性研究
实施了两项研究用于体内功能性评价。为了测量回忆记忆，每组12只突变人APP小鼠腹膜内注射两次MABT单克隆抗体或赋形剂对照（PBS）。第二次注射后1天，使用所述的新型物体识别任务（ORT）研究回忆记忆（Dewachter等人,2002）。将认知指数（RI）定义为探索新物体所花时间与探索新物体和3小时前观察过的物体所花时间的比值，它是占用海马的非空间记忆的量度在独立的研究中，将双转基因淀粉样蛋白斑块阳性突变体人APP/PS1小鼠用来测量单克隆抗体施用对皮层斑块负荷的影响。在16周的一段时间内，每周用500μgMABT单克隆抗体腹膜内注射小鼠，随后测量皮层斑块负荷。将脑切开并将大脑右半球在4%多聚甲醛的PBS溶液中浸入固定过夜，并且切割矢状振动切片机切片（40μm）用于自由漂浮培养并在4°C在具有0.1%叠氮化钠的PBS中储存直至染色。用硫磺素S针对致密斑块染色位于不同水平的5个切片。随机对切片染色并进行盲定量。用配备有Sony DXC-9100P照相机的Leica DMR显微镜获得图像并使用LeicaQ-Win软件通过计算机分析。在整个图象获取过程中，显微镜的光强度和聚光器设置保持恒定。在硫磺素S染色中选择脑下脚区域进行淀粉样蛋白负荷的自动定量。
6.7.5毒性Aβ1-42寡聚体的制备
将Aβ1-42肽（Bachem）在HFIP中溶解，超声并在室温下振动过夜。然后，将等份在氩气流下干燥，真空干燥并在-80°C下作为单体Aβ1-42肽膜储存直至使用。将165μg肽膜等份在7μL DMSO、85μL PBS和9μL2%的SDS中再悬浮并在37°C培育6小时。然后，加入300μL水，并且在37°C过夜培育后，将Aβ1-42寡聚体用900μL33%甲醇、4%乙酸的溶液在4°C沉淀1小时，以16200g离心10分钟。除去上清液并且将Aβ1-42寡聚体干燥，随后在Na2HPO4/NaCl溶液中再悬浮至最终浓度为1μg/μL。
6.7.6Aβ1-42细胞毒性测定
在DIV5，测试了Aβ1-42寡聚体对混合的皮层培养物的细胞毒性。在细胞处理前，在37°C下将所有抗体以100μg/mL的最终浓度与Aβ1-42寡聚体在无血清细胞培养基中共培育30分钟。对于一些实验，在用Aβ1-42寡聚体处理前，用1μM作为有效的第二代p38抑制剂的SB239063对混合的皮层培养物预处理1小时。为了评价细胞存活力，按照生产商的说明书，实施了标准化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑（MTT）还原测定（Promega,Madison,WI,USA）。为了评价对多种处理响应的细胞存活 力，实施了标准化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑（MTT）还原测定（Promega,Madison,WI,USA）。简要地，对于最后3h的处理，将在96孔板（Costar）中生长的细胞与MTT染料溶液培育并且通过使用酶标仪（Tecan）读取570nm和690nm下的吸光值来测量蓝色甲臜产物的产生。结果表示为相对于Aβ1-42寡聚体处理的细胞，存活细胞的增加百分比。还使用免疫荧光在体外测定中评价了MABT单克隆抗体保护神经元不受Aβ1-42寡聚体引起的退化的能力。分离了胚胎期17.5天的小鼠皮层神经元，将其解离并在具有B27添加剂的神经基础培养基中体外培养。如上所述，制备了用于Aβ1-42单体肽膜的Aβ1-42，随后加入10μL DMSO以溶解所述肽。然后，加入78.6μL汉姆氏F12培养基并且在细胞处理前将Aβ1-42肽溶液以25μM在4°C培育48小时。细胞总计生长9天，并在第3天和处理当天补料。对于处理，在第5天或第6天加入具有或不具有50μg/mL MABT的2μM的Aβ1-42，将相同体积的单独的DMSO-F12用作赋形剂对照。在第9天，处理3天或4天后，固定神经元并用TuJ1（抗β微管蛋白抗体）染色。使用荧光显微术将FITC标记的第二抗体用于使微管显象。
6.7.7免疫组织化学
将来自AD患者和年龄相当的非AD对照（Tissue Solutions,Clydebank,UK）的石蜡封固的颞叶脑切片（20μm）用于免疫组织化学染色。使用甲酸对脱蜡的切片进行抗原修复，然后用50μg/mL MABT作为第一抗体标记。将山羊抗人的生物素化IgG用作第二抗体。用二氨基联苯胺（Dako,Glostrup,Denmark）染色并使用Eukitt封固剂封固。通过来自Zeiss的LSM700倒置显微镜获得图像。
6.7.8Aβ1-42ELISA
为了通过ELISA测量胞内Aβ1-42的累积，在6孔细胞培养板（Costar）中处理原代皮层培养物，此后将它们清洗并清除胰蛋白酶（Bateman等人,2007），随后在由50mM Tris-HCl（pH8.0）、150mM NaCl、5mM EDTA、1mM原钒酸钠、1%Triton X-100和含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的混合物组成的细胞溶胞缓冲液中溶胞。通过BCA测定（Pierce）确定蛋白浓度。根据生产商的说明书，将高灵敏度的Aβ1-42特异性ELISA（The Genetics Company,Inc.,Zürich,Switzerland）用于测量细胞溶胞产物Aβ1-42。
6.7.9免疫细胞化学和共聚焦成像
细胞在玻璃盖玻片上生长。处理后，用PBS快速清洗细胞，然后用4%多聚甲醛固定20分钟。彻底清洗后，在-20°C将细胞在100%甲醇中浸没10分钟。然后，再次清洗细胞并在室温下在阻断溶液（含有10%正常山羊血清的PBS）中培育1小时。与第一抗体培育过夜后，清洗细胞并与第二 抗体培育2小时，然后清洗并使用ProLong Gold抗荧光淬灭剂（invitrogen）封固在载玻片上。使用63×透镜在来自Zeiss的LSM700倒置显微镜上获得落射荧光和共聚焦图像。在通过饱和落射荧光图描绘的细胞体中测量荧光强度。使用ImageJ1.42（NationalInstitutes of Health,freeware）将多层光切（Z-stack）转化为立体图像，从中获得了含有标记蛋白的顶点至远端的切片。除了不使用第一或第二抗体标记Aβ1-42以外，以相同方式处理用HyLiteFluor-488标记的Aβ1-42处理的细胞。
6.7.10磷酸-p38ELISA
将大鼠皮层培养物接种到聚L-赖氨酸涂覆的6孔细胞培养板（Costar,Cambridge,MA,USA）上并在DIV5使用。除非另外说明，否则用含有或不含有100μg/mL单克隆抗体的2μMAβ1-42寡聚体处理细胞30分钟。在一些测定中，用第二代p38抑制剂SB239063预处理细胞1小时。将茴香霉素用作阳性对照。通过将细胞置于冰上并吸出培养基来终止处理。用冰冷的PBS清洗细胞，使用细胞刮刀收获并在由50mM Tris-HCl（pH8.0）、150mMNaCl、5mM EDTA、1mM原钒酸钠、1%Triton X-100和含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的混合物组成的溶胞缓冲液中溶胞。通过BCA测定（Pierce,Rockford,IL,USA）确定蛋白浓度。对于p38MAPK的激活作用的半定量测量，按照生产商的说明书使用大鼠磷酸p38MAPK比色ELISA试剂盒（CellSignalingTechnology,Beverly，MA,USA）。在370nm下，在微孔板分光光度计（Tecan）上对板进行读数。对于一些实验，使用免疫细胞化学测定磷酸p38。
6.7.11TNFα释放
用含有或不含有100μg/mL抗体的10μM Aβ1-42寡聚体处理富含小神经胶质细胞的大鼠皮层培养物（总DAPI+细胞中>60%Iba1+）6小时和24小时。将1μg/mL的LPS（Sigma）用作阳性对照刺激物。在指定时间点除去细胞上清液，将其通过0.2μm过滤器并按照生产商的说明书用Quantikine大鼠TNFα/TNFSF1A（R&D Systems）测试TNFα。
此外，用1μg/ml LPS、10μM单独的Aβ1-42寡聚体或与100μg/ml抗AβMABT、MABT-IgG1、MABT-IgG1-D265A结合、对照IgG1或单独的抗体处理来自CX3CR1-GFP P3幼犬的纯小神经胶质细胞培养物24小时。收获细胞上清液，将其通过0.2μm过滤器，并在Bio-Plex小鼠23-plex测定（Bio-Rad,Hercules,CA,USA）上测试。
6.7.12统计分析
所有统计分析均使用5版GraphPad Prism（GraphPad Software,SanDiego,CA,USA）进行。如所指明的，数据表示为平均值±标准偏差（SD） 或平均标准误差（SEM）。适用时，通过学生氏t检验，单向ANOVA并随后通过图基（Tukey）事后多重比较或维尔克松（Wilcoxon）秩和非参量性检验分析数据。采取P值<0.05表示统计学显著性差异。
6.7.13淀粉状斑的体内成像
如前所述（Trachtenberg等人2002，Holtmaat等人2009），在初始成像期前2周，在10个月大的APP hAPP(V717I)/PS1小鼠的体感皮层上植入颅骨窗。在每个成像期之前24小时，对动物腹膜内注射10mg/kg甲氧基-X04以使各个淀粉状斑显象（Klunk等人2002），并且在成像前立即静脉内注射AngioSense680（VisEn Medical）以使血管显象。对于每个成像期，用异氟烷-氧混合物使动物麻醉并使用头部固定杆（head post）将其固定在显微镜上。使用调节至820nm的递送约30mW至40×NA0.8物镜后焦面的Ti：蓝宝石激光（MaiTaiDeepSee;Spectra Physics）通过双光子激光扫描显微镜（Ultima in vivo;PrairieTechnologies）采集图像。将脉管系统图象用于相对于物镜每日可重复地定位小鼠，从而使得各个淀粉状斑能够在多个星期内成像。通过将给定斑块周围所感兴趣区域内高于背景的像素个数相加来估计各个斑块的体积。将背景定义为在淀粉样蛋白斑块附近划出的所感兴趣的区域内的平均像素强度加两个标准偏差。在第4和第8成像期后，对动物腹膜内给药60mg/kg MABT剂量。
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Claims (11)

1.一种用于检测测试抗-β淀粉样蛋白抗体的安全性的体外、非诊断方法，其中，所述方法包括
a.在所述测试抗-β淀粉样蛋白抗体的存在下，将细胞培养物中的小神经胶质细胞与β淀粉样蛋白一起培育；
b.在所述测试抗-β淀粉样蛋白抗体的存在下，测量小神经胶质细胞中p38MAP激酶激活作用；和
c.如果所述测试抗-β淀粉样蛋白抗体在小神经胶质细胞中诱导中等水平的p38MAP激酶激活作用，则鉴定所述测试抗-β淀粉样蛋白抗体是安全的，
其中，所述中等水平的p38MAP激酶激活作用是高于在存在β淀粉样蛋白而不具有所述测试抗-β淀粉样蛋白抗体情况下的p38MAP激酶激活作用水平，但低于存在β淀粉样蛋白和特异性结合于β淀粉样蛋白的IgG1抗-β淀粉样蛋白抗体情况下的p38MAP激酶激活作用水平的水平，并且其中所述测试抗体具有人IgG4同种型，并且所述IgG1抗-β淀粉样蛋白抗体与所述测试抗-β淀粉样蛋白抗体相同，只是所述IgG1抗-β淀粉样蛋白抗体具有人IgG1同种型。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括通过在存在或不存在所述测试抗-β淀粉样蛋白抗体的条件下测量细胞培养物中的小神经胶质细胞对β淀粉样蛋白的吸收来测试所述测试抗-β淀粉样蛋白抗体的神经保护活性的步骤，其中，在不存在所述测试抗-β淀粉样蛋白抗体的情况下，相比于小神经胶质细胞对β淀粉样蛋白的吸收，小神经胶质细胞对β淀粉样蛋白肽的吸收增加表示所述测试β淀粉样蛋白抗体具有神经保护活性。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述β淀粉样蛋白为β淀粉样蛋白1-42寡聚体。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述测试抗-β淀粉样蛋白抗体包含：
a)轻链可变区互补决定区(CDR)1，具有表2中所列的抗-β淀粉样蛋白抗体的轻链可变区CDR1的氨基酸序列；
b)轻链可变区CDR2，具有表2中所列的抗-β淀粉样蛋白抗体的轻链可变区CDR2的氨基酸序列；和
c)轻链可变区CDR3，具有表2中所列的抗-β淀粉样蛋白抗体的轻链可变区CDR3的氨基酸序列。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述测试抗-β淀粉样蛋白抗体包含：
a)重链可变区CDR1，具有表2中所列的抗-β淀粉样蛋白抗体的重链可变区CDR1的氨基酸序列；
b)重链可变区CDR2，具有表2中所列的抗-β淀粉样蛋白抗体的重链可变区CDR2的氨基酸序列；和
c)重链可变区CDR3，具有表2中所列的抗-β淀粉样蛋白抗体的重链可变区CDR3的氨基酸序列。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述测试抗-β淀粉样蛋白抗体进一步包含：
a)重链可变区CDR1，具有表2中所列的抗-β淀粉样蛋白抗体的重链可变区CDR1的氨基酸序列；
b)重链可变区CDR2，具有表2中所列的抗-β淀粉样蛋白抗体的重链可变区CDR2的氨基酸序列；和
c)重链可变区CDR3，具有表2中所列的抗-β淀粉样蛋白抗体的重链可变区CDR3的氨基酸序列。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述重链可变区的所述CDR1、CDR2和CDR3全部来源于表2中所列的相同抗-β淀粉样蛋白抗体。
8.根据权利要求4所述的方法，其中，所述轻链可变区的所述CDR1、CDR2和CDR3全部来源于表2中所列的相同抗-β淀粉样蛋白抗体。
9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述轻链可变区的所述CDR1、CDR2和CDR3和所述重链可变区的所述CDR1、CDR2和CDR3全部来源于表2中所列的相同抗β淀粉样蛋白抗体。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述IgG1抗-β淀粉样蛋白抗体包含轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列且所述重链可变区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述中等水平的小神经胶质细胞中的p38MAP激酶的激活作用比不存在所述抗-β淀粉样蛋白抗体时小神经胶质细胞中p38MAP激酶激活作用高5％-15％；10％-20％；15％-25％；20％-30％；35％-45％；40％-50％或45％-55％之间。
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