KR101247836B1 - 항 ａ 베타 항체의 정제 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, Aβ 결합 단백질을 Fc 결합제 예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G에 흡착시키는 단계 → 2가 양이온 염으로 세척하여, 불순물을 제거하는 단계 → 흡착된 Aβ 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, Fc 부위를 가지는 Aβ 결합 단백질 예를 들어, 항-Aβ 항체 또는 항체 융합체를 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 정제된 Aβ 결합 단백질을 용리시키는 방법과, 그러한 방법을 정제 기술에 포함시키는 것에 관한 것이기도 하다. 본 발명의 방법을 수행하기 위한 성분과 사용 설명서를 포함하는 키트도 제공된다.
Figure R1020087000127
항체, Aβ 결합 단백질, Fc 결합제, 정제, 변이체

Description

항 Ａ 베타 항체의 정제 방법{METHODS OF PURIFYING ANTI A BETA ANTIBODIES}
관련 출원
본 출원은 미국 가 명세서 특허 출원 제60/691821호[2005년 6월 17일자 출원; 발명의 명칭 "METHODS OF PURIFYING Fc REGION CONTAINING PROTEINS"]의 우선권의 이익을 주장한다. 이 출원의 전체 내용은 본원에 참고용으로 인용되어 있다.
알츠하이머 병(Alzheimer's disease; "AD")은 아밀로이드 플라크(amyloid palque)와 신경 섬유의 다발성 병변(neurofibrillary tangle)의 형성 및 심각한 신경 세포의 손실을 특징으로 하는 신경 퇴행성 질환이다. 노인성 플라크(senile plaque)의 주성분인 β-아밀로이드 단백질(Aβ 펩티드라고도 부름)은 알츠하이머 병의 병인이다[Selkoe (1989) Cell 58:611-612; Hardy (1997) Trends Neurosci. 20:154-159]. β-아밀로이드는 배양 뉴런에 직접적으로 악영향을 미칠 뿐만 아니라[Lorenzo and Yankner (1996) Ann. NY Acad. Sci. 777:89-95], 다양한 매개 인자를 통해 간접적으로 악영향을 미치기도 한다는 사실이 밝혀진 바 있다[Koh et al. (1990) Brain Research 533:315-320; Mattson et al. (1992) J. Neurosciences 12:376-389]. 뿐만 아니라, 생체 내 모델 예를 들어, PDAPP 마우스 및 래트 모델을 통하여, β-아밀로이드가 학습 장애, 인지 능의 변질 그리고 해마의 장기 상승 작용의 억제에 관여한다는 사실이 규명되었다[Chen et al. (2000) Nature 408:975-985; Walsh et al. (2002) Nature 416:535-539]. 그러므로, 연구의 초점은 알츠하이머 병의 심각성을 잠재적으로 감소시키거나 이 질병 자체를 완치시키기 위해 β-아밀로이드 수준을 변경시키는 치료에 맞추어져 오고 있다.
최근 PDAPP 마우스 및 래트의 실험 모델을 통한 연구에서 성공을 거둠으로써 부상한 AD 치료 방법의 한가지 예로서는, 면역 글로불린 예를 들어, β-아밀로이드에 특이적인 항체를 제공하는, 개체의 수동 면역화 방법이 있다[예를 들어, Bard et al. (2000) Nat. Med. 6:916-919 및 Bard et al (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:2023-2028 참조]. 뿐만 아니라, 최근 들어, 수동 면역화를 통하여 Aβ를 감소시킬 경우, 트랜스게닉 마우스의 알츠하이머 병 모델에 있어서 시냅스 변성과 같은 점진적 상실 현상을 막아주는 것으로 규명된 바 있다[Buttini et al. (2005) J. Neurosci. 25:9096-101].
최근에는 재조합 기술이 발달함에 따라서 실질적으로 임의의 표적 예를 들어, 암 세포, 박테리아 및 바이러스에 대한 항체도 생산할 수 있게 되었다. 통상적으로, 항체는 항체를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 세포주를 사용하여 생산된다. 결과적으로, 조작된 세포주는 당, 아미노산 및 성장 인자와, 다양한 단백질 예를 들어, 혈청 단백질의 복합적인 혼합물을 포함하는 배양액 중에서 생육된다. 그러나, 세포의 부산물과 배양액 성분들로부터 항체를 완벽하게 즉, 연구용 또는 치료용으로서 사용하기에 충분한 정도의 순도로 분리해 내는 데는 치명적인 한계가 있다. 항체 분자가 인간에게 투여되는 의약품으로서 사용되는 경우, 항체 분자의 정제는 특히 중요하다.
통상적인 항체 정제 계획(또는 전략)은 종종, 크로마토그래피 컬럼의 고상(즉, 작용화된 고상)에, 여러가지 불순물에 비하여 우선적으로 결합하거나 또는 이에 체류하게 되는 항체 분자의 능력을 이용하는 크로마토그래피 단계를 포함한다. 이러한 계획은, 우선, CH2/CH3 부위-함유 단백질과 고상에 고정되어 있는 단백질 A를 결합시켜 항체를 정제한 후, 이 고상을 소수성 전해질 용매로 세척함으로써 고상에 결합되어 있던 불순물을 제거하여, 마지막으로는 이 고상으로부터 CH2/CH3 부위-함유 단백질을 회수하는 순서로 제시되거나 또는 수행되었다. 그러나, 이러한 계획은, CH2/CH3 부위-함유 단백질을 우선적으로 결합시키는데 적용되는 조건이 불순물(예를 들어, 불완전 CH2/CH3 부위를 포함하는 항체)의 결합 또한 허용한다는 점에서 한계가 따른다. 인간의 치료제를 개발함에 있어서, 이러한 불순물은 매우 바람직하지 못하다.
그러므로, 세포 배양액 중에서 생산된, 불변부를 가지는 단백질 또는 폴리펩티드, 특히, Fc 부위를 가지는 단백질(예를 들어, 항체)을 정제하는 방법을 개선할 필요가 있는 것이다.
발명의 개요
본 발명은 Aβ-결합 단백질, 구체적으로, Aβ-결합 항체의 정제 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 특히 인간에게 투여하기 위해 개발한 단백질(예를 들어, 항체)의 정제에 적당하다. 구체적으로, 본 발명은 세포 배양액 중에서 생산된, 불 변부를 가지는 단백질, 특히, Fc 부위를 가지는 단백질(예를 들어, 항체)의 정제에 관한 것이다.
다양한 측면에서, 본 발명은 Fc 부위를 가지는 Aβ 결합 단백질 예를 들어, 항-Aβ 항체를, 단백질 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 원액으로부터 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 있어서, Aβ 결합 단백질은 Fc 결합제에 흡착되는데, 이후 이 Fc 결합제는 2가 양이온 염을 함유하는 완충 용액으로 세척되어, 이것으로부터 하나 이상의 불순물이 제거된다. 이후, 이 단백질은 용리 용액에 의해 Fc 결합제로부터 회수된다. 본 발명의 방법은 불순물 예를 들어, 인트론 리드쓰루 변이종(intron read through variant species; IRT), 디설파이드 (disulfide) 결합 부족 종(under disulfide bonded species; UDB) 및/또는 저 분자량 변이종(low molecular weight variant species; LMW)을 제거하는데 특히 유용하다. 본 발명의 방법은 또한 불순물 예를 들어, 숙주 세포 단백질(HCP) 및 DNA를 제거하는데에도 유용하다.
본 발명의 방법은 하나 이상의 크로마토그래피 분리 단계를 포함할 뿐만 아니라, 하나 이상의 여과 단계도 포함할 수 있다. 크로마토그래피 분리 단계는 연속적이거나 불연속적(예를 들어, 회분 방식)일 수 있거나, 아니면 이 두 가지 방식을 조합한 방식일 수 있다. 다양한 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 예를 들어, 바이러스를 제거하고, 표적 단백질을 함유하는 용액을 농축 및 완충하며, 또한 미생물 오염물을 제거하기 위한 하나 이상의 여과 단계를 포함한다.
다양한 구체예에서, 항-Aβ 항체는 뮤린(murine)의 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간의 항체이다. 몇몇 구체예에서, 상기 항-Aβ 항체는 Aβ의 1∼7, 1∼5, 3∼7, 3∼6, 13∼28, 15∼24, 16∼24, 16∼21, 19∼22, 33∼40, 33∼42번 위치의 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이다. 대표적인 항 Aβ 항체는 Aβ의 1∼10번 잔기 예를 들어, Aβ의 1∼7, 1∼5, 3∼7 또는 3∼6번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 기타 대표적인 항 Aβ 항체는 Aβ의 13∼28번 잔기 예를 들어, Aβ의 16∼21 또는 19∼22번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 대표적인 항 Aβ 항체는 Aβ의 C 말단 에피토프 예를 들어, Aβ의 33∼40 또는 33∼42번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 구체예에 있어서, 항 Aβ 항체는 Aβ의 1∼7번 및 13∼28번 잔기를 포함하는 불연속적 에피토프에 결합한다. 다른 구체예는 항-Aβ 항체의 Fab, Fab'(2) 또는 Fv 단편에 관한 것이다. 이와 같은 몇몇 구체예에 있어서, 항체는 이중 특이적 항체이거나 또는 국제 특허 공보 제 WO 03/070760에 개시된 방법에 의하여 생산된 항체이다.
바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 인간화 항-Aβ 항체이고, 몇몇 구체예에서, 이 항체는 3D6, 10D5, 12B4, 12A11, 15C11 및 266으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-Aβ 항체이다. 이 항체의 동 기준 표본은 IgM, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 기타 임의의 약학적으로 허용 가능한 동 기준 표본일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 동 기준 표본은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4이다.
다양한 구체예에서, Aβ 결합 단백질은 재조합적으로 생산된다. 다양한 구체예에서, Aβ 결합 단백질은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 재조합적으로 생산된다.
다양한 구체예에서, 하나 이상의 불순물은 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 DNA, 세포 배양 단백질, Aβ 결합 단백질의 원치 않는 종 및 이의 혼합물 중 하나 이상을 포함한다. 예를 들어, 다양한 구체예에 있어서, Aβ 결합 단백질의 원치 않는 종은 인트론 리드쓰루 서열을 가지는 항체 사슬 또는 이의 단편, 부적당한 디설파이드 결합을 가지는 항체 사슬 또는 이의 단편, 반항체(half-antibody) 또는 이의 단편, 경쇄 이량체 또는 이의 단편, 그리고 중쇄 이량체 또는 이의 단편 중 하나 이상을 포함한다.
하나의 측면에서, 본 발명의 방법은, 처음에는 단백질과 Fc 결합제를 흡착시키고, 그 다음 이 Fc 결합제를 2가 양이온 염을 함유하는 완충 용액으로 세척하여 하나 이상의 불순물을 제거한 후, 이 Fc 결합제로부터 단백질을 회수함으로써, 단백질 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 원액으로부터 Aβ 결합 단백질, 바람직하게는 항-Aβ 항체를 정제하는 방법이다. 다양한 구체예에 있어서, 상기 단백질을 Fc 결합제에 흡착시키는 단계 및 이 Fc 결합제를 2가 양이온 염을 함유하는 완충 용액으로 세척하는 단계는 약 2℃∼약 24℃의 온도에서 수행된다. 다양한 구체예에서, Fc 결합제로부터 단백질을 회수하는 단계는, pH 약 2.0∼약 6.5인 용리 완충액을 사용하여 단백질을 용리시키는 과정을 포함한다.
다양한 구체예에서, Fc 부위 결합제는 단백질 A 및 단백질 G 중 하나 이상을 포함한다. 바람직한 구체예에서, Fc 결합제는 고상에 고정된다. 이와 같은 고상은 예를 들어, 비드, 아가로스 매트릭스, 실리카 중 하나 이상과, 이의 혼합물을 포함할 수 있다.
Fc 결합제를 세척하는데 사용되는 완충액 중에 존재하는 2가 양이온 염은 예를 들어, 카오트로픽 염(chaotropic salt)을 포함할 수 있다. 세척 완충 용액의 제조에 적당한 2가 양이온 염으로서는 염화마그네슘, 염화칼슘, 염화니켈 및 이의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 구체예에서, 세척 완충 용액의 제조용으로서 적당한 2가 양이온 염으로서는 2족 원소(예를 들어, 마그네슘, 칼슘 및 바륨 등)의 2가 양이온, 전이 금속 원소(예를 들어, 구리, 니켈 및 망간 등)의 2가 양이온의 티오시안산염(SCN-), 과염소산염 (ClO4 -), 질산염(NO3 -), 염화물, 및 브롬화물 염, 그리고 이들 염의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다양한 구체예에서, 2가 양이온 염을 함유하는 완충 용액의 pH값은 약 4∼약 9이고, 몇몇 구체예에서는 약 4∼약 8, 약 4.5∼약 7.5 또는 약 6∼약 8이다. 본원에 제시된 범위 내에 포함되고/포함되거나 이의 중간값에 해당하는 pH값과 이의 범위는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 2가 양이온 염의 pH값은 약 7.1∼약 7.9, 약 7.2∼약 7.9, 약 7.3∼약 7.7, 약 7.4∼약 7.6, 약 4∼약 5, 약 5∼약 6, 약 6∼약 7, 또는 약 8∼약 9이다.
뿐만 아니라, 본원에 언급된 수치를 상한선 또는 하한선으로 가지는 범위도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 2가 양이온 염의 pH값은 약 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5 또는 8 이상(또는 이 pH 범위 내의 pH)이다.
다양한 구체예에서, 완충 용액의 2가 양이온 염의 농도는 약 0.1 M∼약 5 M이고, 몇몇 구체예에서는 약 0.5 M∼약 3 M, 약 1.0 M∼약 3 M 또는 약 0.6 M∼약 2.5 M이다. 예를 들어, 2가 양이온 완충액은 약 0.6 M 이상의 CaCl2, 또는 약 2 M 이상의 MgCl2 또는 약 2 M 이상의 CaCl2를 포함할 수 있다. 본원에 제시된 범위 내에 포함되고/포함되거나 이 범위의 중간값에 해당하는 수치 및 범위 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 완충 용액 중 2가 양이온 염의 농도는 약 0.5 M∼약 0.75 M, 약 0.5 M∼약 0.8 M, 약 0.5 M∼약 0.9 M, 약 0.5 M∼1.0 M, 약 0.5 M∼2 M, 약 1.5 M∼약 2.0 M, 약 1.5 M∼약 2.5 M, 약 1.5 M∼약 3.0 M, 또는 약 2.5 M∼약 3 M이다.
뿐만 아니라, 본원에 상한선 또는 하한선으로서 언급된 수치를 가지는 범위는 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들어, 완충 용액의 2가 양이온 염의 농도는 약 0.6M, 1M, 1.5M, 2M, 2.5M 또는 3M 이상(또는 이 농도 범위 내의 농도)이다. 다양한 구체예에서, 2가 양이온 염을 함유하는 완충 용액의 온도는 약 2℃∼약 24℃이다.
다양한 구체예에서, Fc 결합제로부터 항체를 회수하는 단계는, pH 범위 약 2.0∼약 6.5, 바람직하게는 약 2.0∼약 4.0, 더욱 바람직하게는 약 2.5∼약 3.5인 용리 완충액을 사용하여 항체를 용리시키는 과정을 포함한다. 본원에 제시된 범위 내에 포함되고/포함되거나 이 범위의 중간값에 해당하는 수치 및 범위도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 용리 완충액의 pH는 약 2∼약 3 또는 약 3∼약 4이다.
더욱이, 본원에 언급된 수치를 상한선 또는 하한선으로 가지는 범위는 본 발 명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 용리 완충액의 pH는 약 2, 2.5, 3, 3.5 또는 4(또는 이 pH 범위 내의 pH)이다.
다양한 구체예에서, 회수된 단백질에 대해서는 Fc 결합제의 크로마토그래피 단계 이전, 또는 이후에 행하여지는 부가의 정제 단계를 수행할 수 있다. 예를 들어, 대표적인 추가의 정제 단계로서는 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 고정 금속 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC), 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 투석, 친화성 크로마토그래피, 황산암모늄 침전법, 에탄올 침전법, 역상 HPLC(RP-HPLC), 크로마토포커싱(chromatofocusing), 한외 여과법, 정용 여과법, 미세 여과법 및 겔 여과법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 구체예에서, Fc 결합제 크로마토그래피 단계 이후에는 음이온 교환 크로마토그래피 및 HIC 단계가 수행된다. 다양한 구체예에서, 크로마토그래피 단계 이후에는 또한 바이러스 여과 단계, 한외 여과/정용 여과 단계 및/또는 미생물 오염물 여과 단계가 수행된다.
하나의 측면에서, 본 발명은 불순물-함유 용액으로부터 Aβ 결합 단백질, 바람직하게는 항-Aβ 항체를 정제하는 방법을 제공한다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 방법은 우선, 단백질을 Fc 결합제에 흡착시키는 단계 → 2가 양이온 염을 함유하는 완충 용액으로 Fc 결합제를 세척하여 하나 이상의 불순물을 제거하는 단계 → Fc 결합제로부터 단백질을 회수하여 첫 번째 용리 풀을 마련하는 단계를 포함한다.
다양한 구체예에서, 정제 과정 이후에는 계속해서 첫 번째 용리 풀을 이온 교환 크로마토그래피시키는데, 즉, 이온 교환 수지와 첫 번째 용리 풀을 접촉시켜 표적 단백질이 수지에 흡착되지 않도록 만들고, 또한 이후에 소통 중인(flow-through) 표적 단백질을 회수하여 두 번째 용리 풀을 마련한다. 다양한 구체예에서, 이온 교환 크로마토그래피 단계는 또한 이온 교환 수지를 완충 세척 용액으로 세척하여 임의의 흡착된 표적 단백질 중 최소한의 일부를 회수하는 단계를 더 포함한다.
다양한 구체예에서, 정제 과정 이후에는 계속해서 두 번째 용리 풀을 소수성 상호 작용 크로마토그래피시키는데, 즉, 표적 단백질을 소수성 상호 작용 수지(예를 들어, 소수성 리간드로 작용화된 고상)에 흡착시키고, 또한 표적 단백질을 실질적으로 용리시키지 않는 정도의 이온 세기를 가지는 완충 세척 용액으로 소수성 상호 작용 수지를 세척함으로써, (통상적으로 소수성 상호 작용 수지로부터 표적 단백질을 방출시키는데 충분한 만큼 낮은 이온 세기를 가지는 용리 완충액을 이용하여) 정제된 표적 단백질을 회수한다.
본 발명의 다양한 측면의 바람직한 구체예에서, Fc 결합제는 바람직하게는, 원액과 접촉하기 이전에 적당한 완충액으로 평형화된 고상에 고정된다. 상기 고상은 Fc 결합제를 고정시키는 아가로스를 포함하는 컬럼인 것이 바람직하다. 다양한 구체예에서, 상기 컬럼은 컬럼에 비특이적으로 부착되는 것을 줄여주거나 또는 막아주는 시약 예를 들어, 글리세롤로 코팅된다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 단백질은 약학적으로 허용 가능한 담체 중에 제형화되어, 진단용, 치료용 또는 이러한 분자가 사용되는 것으로 알려져 있는 기타 여러 분야에 사용될 수 있다.
다양한 측면에서, 본 발명은 단백질 및 이의 인트론 리드쓰루 변이체(IRT)를 함유하는 용액으로부터 Aβ 결합 단백질, 바람직하게는 항-Aβ 항체를 정제하는 방법을 제공한다. 바람직한 측면에서, 본 발명의 방법은 단백질 제제 예를 들어, 항체 제제 중 하나 이상의 인트론 리드쓰루 변이종의 수준을 감소시키는데 사용된다. 다수의 구체예에서, Fc 결합제로부터 회수된 단백질의 인트론 리드쓰루 변이체의 수준은, 원액 중 인트론 리드쓰루 변이체 수준보다 5배 이상 낮으며, 몇몇 구체예에서는 원액 중 인트론 리드쓰루 변이체 수준보다 10배 이상 낮다. 다양한 구체예에서, 인트론 리드쓰루 변이체는 Fc 결합제로부터 회수된 단백질을 함유하는 용액 중 이 단백질 종의 약 1.0%, 0.8%, 0.5%, 0.2% 또는 0.1% 미만을 구성한다.
다양한 측면에서, 본 발명은 단백질 및 이의 저 분자량 변이체(LMW)를 함유하는 용액으로부터 Aβ 결합 단백질, 바람직하게는 항-Aβ 항체를 정제하는 방법을 제공한다. 바람직한 측면에서, 본 발명의 방법은 단백질 제제 예를 들어, 항체 제제 중 하나 이상의 저 분자량 변이종의 수준을 감소시키는데 사용된다. 다수의 구체예에 있어서, Fc 결합제로부터 회수된 단백질의 저 분자량 변이체 수준은, 원액 중 저 분자량 변이체 수준보다 5배 이상 낮으며, 몇몇 구체예에서는 원액 중 저 분자량 변이체 수준보다 10배 이상 낮다. 다양한 구체예에서, 상기 저 분자량 변이체는 Fc 결합제로부터 회수된 상기 단백질을 함유하는 용액 중 상기 단백질 종의 약 1.0%, 0.8%, 0.5%, 0.2% 또는 0.1% 미만을 구성한다.
다양한 측면에서, 본 발명은 단백질 및 이의 디설파이드 결합 부족 변이체(UDB)를 함유하는 용액으로부터 Aβ 결합 단백질, 바람직하게는 항-Aβ 항체를 정제하는 방법을 제공한다. 바람직한 측면에서, 본 발명의 방법은 단백질 제제 예를 들어, 항체 제제 중 하나 이상의 디설파이드 결합 부족 변이종의 수준을 감소시키는데 사용된다. 다양한 구체예에서, Fc 결합제로부터 회수된 단백질의 디설파이드 결합 부족 변이체의 수준은, 원액 중 디설파이드 결합 부족 변이체 수준보다 5배 이상 낮으며, 몇몇 구체예에서는 원액 중 디설파이드 결합 부족 변이체 수준보다 10배 이상 낮다. 다양한 구체예에서, 상기 디설파이드 결합 부족 변이체는 Fc 결합제로부터 회수된 상기 단백질을 함유하는 용액 중 상기 단백질 종의 약 20%, 15%, 10%, 5%, 2% 또는 1% 미만을 구성한다.
다른 측면에서, 본 발명은 우선, Fc 결합제를 단백질과 흡착시키는 단계 → 이 Fc 결합제를 2가 양이온 염을 함유하는 완충 용액으로 세척하여 하나 이상의 불순물을 제거하는 단계 → Fc 결합제로부터 단백질을 회수하는 단계 중 최소한의 단계들을 포함하는 방법 중 임의의 방법에 따라서 정제된, Aβ 결합 단백질, 바람직하게는 항-Aβ 항체를 제공한다. 다양한 구체예에서, 상기 항-Aβ 항체는 3D6, 10D5, 12B4, 12A11, 15C11 및 266으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간화 항-Aβ 항체이다. 다양한 구체예에서, 항-Aβ 항체는 3D6, 10D5, 12B4, 12A11로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간화 항-Aβ 항체이다.
다른 측면에서, 본 발명은 우선, Fc 부위를 가지는 Aβ 결합 단백질 예를 들어, 항-Aβ 항체를 Fc 결합제에 흡착시키는 단계 → 이 Fc 결합제를 2가 양이온 염을 함유하는 완충 용액으로 세척하여 하나 이상의 불순물을 제거하는 단계 → Fc 결합제로부터 단백질을 회수하는 단계 중 최소한의 단계들을 포함하는 방법 중 임 의의 방법을 수행하는데 적당한 시스템을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 우선, Aβ 결합 단백질, 바람직하게는 항-Aβ 항체를 Fc 결합제에 흡착시키는 단계 → 이 Fc 결합제를 2가 양이온 염을 함유하는 완충 용액으로 세척하여 하나 이상의 불순물을 제거하는 단계 → Fc 결합제로부터 단백질을 회수하는 단계 중 최소한의 단계들을 포함하는 방법 중 임의의 방법을 수행하기 위한 정제 기법을 제공한다.
본 발명은 또한 다양한 측면에서, 본 발명의 방법 중 하나 이상의 방법을 수행하는데 사용되는 키트에 관한 것이기도 하다. 다양한 구체예에서, 이 키트는 하나 이상의 시약과 이 키트의 사용 설명서를 포함한다. 예를 들어, 이 키트는 이 키트의 사용 설명서와 함께, 예를 들어, Aβ 결합 단백질 예를 들어, 항-Aβ 항체를 정제하기 위한 하나 이상의 시약 예를 들어, Fc 결합제, 2가 양이온 염 및 2가 양이온 염을 함유하는 완충 세척 용액 제조용 시약을 포함한다.
도 1은 인간화 3D6 버젼 2(hu3D6.v2) 항 Aβ 항체의 경쇄 및 중쇄의 전체 아미노산 서열인 서열 번호 1 및 서열 번호 2를 나타내는 것이다. 경쇄의 상보성 결정 부위(CDR) 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 24∼39번, 55∼61번 및 94∼102번 위치의 잔기(상부 패널)에 존재한다. 중쇄 상보성 결정 부위(CDR) 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3는 각각 40∼44번, 50∼65번 및 99∼108번 위치의 잔기(하부 패널)에 존재한다. 예상 분자 간 디설파이드 결합은 관련 시스테인 잔기의 연관성에 의해 도시된다. 분자 내 디설파이드 결합을 형성하는 것으로 예상되는 시스테인에는 밑줄을 그어 표시하였으며, 이로써 연관성도 나타내었다. 항체 중쇄의 N-결합 글리코실화 공통 위치는 299∼301번 위치의 잔기(하부 패널)에 이탤릭체로 표시하였다. 예상 중쇄 C-말단 리신은 괄호 안에 집어넣어 표시하였다.
본 발명을 더욱 상세히 설명하기에 앞서서, 본원에 사용된 임의의 용어에 관하여 본원에 제시한 정의들을 이해하는 것이 도움이 될 수 있다. 본원에 제시된 정의들은 오직 용이하게 참고하고자 분류한 것이지, 한정하기 위해 분류한 것은 아니다.
단백질 관련 정의
본 발명은 Aβ-결합 단백질, 구체적으로 Aβ-결합 항체의 정제 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 세포 배양액 중에서 생산되는, 불변부를 가지는 단백질, 구체적으로 Fc 부위를 가지는 단백질(예를 들어, 항체)의 정제에 관한 것이다. 다양한 측면에서, 본 발명은 단백질 및 이의 하나 이상의 리드쓰루 변이체 예를 들어, 인트론 리드쓰루 변이체를 함유하는 용액으로부터 Fc 부위를 함유하는 Aβ 결합 단백질 예를 들어, 항-Aβ 항체를 정제하는 방법을 제공한다. 바람직한 측면에서, 본 발명의 방법은 단백질 제제 예를 들어, 항체 제제 중에 존재하는 하나 이상의 인트론 리드쓰루(IRT) 변이종의 수준을 감소시키는데 사용된다. "인트론 리드쓰루 변이체" 및 "인트론 리드쓰루 변이종"이란 용어는, 본원에서 호환되어 사용될 수 있는 것으로서, Aβ 결합 단백질의 합성 과정 중 폴리펩티드 사슬 연장이, 암호화 부위의 앞에 위치하는 인트론 부위에 있는 종결 코돈에 의해서 암호화 부위가 전사되기 전에 종결되는 과정의 생성물을 의미하는 것이다. 그 결과, 하나 이상의 불완전 도메인을 가지거나 또는 하나 이상의 도메인이 상실된, 목적으로 하는 단백질의 변이체(즉, 인트론 리드쓰루 변이체)가 생성되는 것이다. 이러한 인트론은 하나 이상의 종결 코돈을 함유하므로, 몇가지의 상이한 인트론 리드쓰루 변이체가 생성될 수 있다.
"디설파이드 결합 부족 변이체(UDB)"란 용어는, 하나 이상의 디설파이드 결합이 상실된 임의의 종을 의미하는 것이다. 상실된 디설파이드 결합은 사슬 내 디설파이드 결합 또는 사슬 간 디설파이드 결합일 수 있거나 또는 이 두가지를 조합한 경우에 해당할 수 있다.
"저 분자량 종" 또는 "LMT" 종이란 용어는, Aβ 결합 단백질 예를 들어, 항-Aβ 항체의 변이체, 예를 들어, 유리 중쇄, 유리 경쇄, IRT 종, 절반-분자(half-molecule) 및 4분의 3-분자(three-quarters-molecule)로 이루어진 단백질 종, 또는 이의 혼합물을 의미하는 것이다.
단백질 A는 대부분의 스타필로코커스 아우레아스(Staphylococcus aureas) 균주에서 발견되는 약 42kDa인 세포 벽 단백질로서, 항체의 Fc 부위와는 높은 친화도(인간 IgG와는 약 10-8M의 친화도)로 결합하는 단백질이다. 본원에 사용된 "단백질 A"라는 용어에는, CH2/CH3 부위를 가지는 단백질에 결합하는 능력을 보유하는, 본래의 공급원으로부터 회수되는 단백질 A, 합성에 의해 생산되는(예를 들어, 펩티드 합성 및 재조합 기술 등에 의해 생산되는) 단백질 A, 및 이의 변이체를 포함한다.
단백질 G는 G군 스트렙토코커스로부터 유래하는 세포 벽 단백질이다. 단백질 G는 항체 구체적으로, IgG 항체의 Fc 부위와 고도의 친화도로 결합하는 제III형의 Fc-수용체이다. 본원에 사용된 "단백질 G"란 용어에는, Fc 부위를 가지는 단백질에 결합하는 능력을 보유하는, 본래의 공급원으로부터 회수되는 단백질 G, 합성에 의해 생산되는(예를 들어, 펩티드 합성 및 재조합 기술 등에 의해 생산되는) 단백질 G, 및 이의 변이체를 포함한다.
"β-아밀로이드 단백질", "β-아밀로이드 펩티드", "β-아밀로이드", "Aβ" 및 "Aβ 펩티드"란 용어는 본원에서 호환되어 사용되고 있다.
본원에 있어서, "Aβ 결합 단백질"이란 용어는, Aβ 펩티드(들) 또는 이 Aβ 펩티드(들) 내에 존재하는 에피토프(들)에 특이적으로 결합할 수 있거나, 또는 Aβ에 대한 결합 친화도가 감지할 수 있을 정도인 단백질을 의미하는 것이다. 예시적인 구체예에 있어서, Aβ 결합 단백질은 Fc 부위를 함유하므로, 본 발명의 방법에 따른 Fc 결합제와 결합할 수 있다.
"항체" 또는 "면역 글로불린"(본원에서 호환 사용됨)이란 용어는, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄로 이루어진, 기본적인 4-폴리펩티드 사슬 구조를 가지는 항원-결합 단백질을 의미하는 것으로서, 여기서, 상기 사슬은 예를 들어, 항원과 특이적으로 결합하는 능력을 가지는 사슬 간 디설파이드 결합에 의해 안정화된다. 중쇄 및 경쇄 둘 다는 도메인으로 폴딩된다. "항체" 또는 "면역 글로불린"이란 용어에는 모노클로날 항체(예를 들어, 전장 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 다중 특이적 항체(예를 들어, 이중 특이적 항체), 키메라 항체, CDR-이식된 항체, 인간화 항체, 인간 항체 및 단일 사슬 항체(scFv)가 포함된다. 본원에 있어서, "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"이란 용어는, 표적 항원의 특정 에피토프 예를 들어, Aβ의 에피토프(들)를 인지하여 이에 결합할 수 있는 항원 결합 위치 중 한가지만을 함유하는 항체 분자의 군을 의미하는 것이다. 그러므로, 모노클로날 항체 조성물은 통상적으로, 면역학적으로 반응하는 특정 표적 항원에 대한 친화성 및 하나의 결합 특이성을 나타낸다. 비-인간 항체는 예를 들어, 미국 특허 제5,225,539호에 개시된 기술에 의하여 "인간화"될 수 있다. 하나의 방법에서, 비-인간 CDR은 인간 항체 또는 공통 항체 틀 서열에 삽입된다. 또한, 이후 추가의 변이가 항체의 틀에 도입되어, 친화성 또는 면역원성이 조정될 수 있다.
"항-Aβ 항체"란 용어는, 인간 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 Aβ 펩티드에 대한 결합 특이성을 가지는 항체를 의미한다. Aβ 펩티드는 또한 당 업계에 베타 아밀로이드 펩티드라고 알려져 있다. Aβ 펩티드는 APP의 39∼43번 아미노산으로 이루어진 약 4kDa의 내부 단편이다(각각 Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 및 Aβ43). "항-Aβ 항체"란 용어는, Aβ 펩티드의 이와 같은 형태의 것들 중 임의의 것에 대한 결합 특이성을 가지는 항체를 포함하는 의미이다. 목적으로 하는 특이적 항-Aβ 항체로서는 3D6, 10D5, 12B4, 12A11, 15C11 및 266과, 이것들의 인간화 항체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 대표적인 항-Aβ 항체에 관하여는 미국 특허 출원 제10/010,942호(2001년 12월 6일 출원)[미국 특허 공보 20030165496A1; PCT 공보 WO 2002/46237A2]; 미국 출원 제10/388,389호(2003년 3월 12일 출원)[미국 특허 공보 20040087777A1; PCT 공보 WO 2004/080419A2 참조]; 미국 출원 제10/388,214호(2003년 3월 12일 출원)[미국 특허 공보 20040082762A1; PCT 공보 WO 2003/077858A2); 미국 출원 제10/858,855호(2004년 6월 1일 출원)[미국 특허 공보 20050118651A1; PCT 공보 WO 2004/108895A2]; 및 미국 출원 제11/304,986호(2005년 12월 15일 출원)[PCT/US05/45515][상기 문헌의 전반적인 내용은 본원에 참고용으로 인용됨]에 개시되어 있다.
부가의 대표적인 항-Aβ 항체에 관하여는 미국 출원 제10/226,435호(2001년 2월 26일 출원)[미국 특허 공보 20040043418A1; PCT 공보 WO 01/062801A2], 미국 출원 제10/487,322호(2002년 8월 14일 출원)[미국 특허 공보 20040192898A1; PCT 공보 WO 03/016466A2]; 미국 출원 제10/476,265호(2002년 4월 26일 출원)[미국 특허 공보 20050090648A1; PCT 공보 WO 02/088306A2]; 미국 출원 제10/497,475호(2002년 4월 26일 출원)[미국 특허 공보 20050142131A1; PCT 공보 WO 02/088307A2]; 미국 출원 제10/505,313호(2003년 2월 20일 출원)[미국 특허 공보 20050169925; PCT 공보 WO 03/070760A2]에 개시되어 있다.
"항체 단편"이란 용어는, 원 상태의(intact) 항체나 항체 사슬 또는 완전한 항체나 항체 사슬보다 적은 수의 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 사슬의 일부 또는 부분을 의미하는 것이다. 단편은 원 상태 또는 완전한 항체 또는 항체 사슬을 화학 처리 또는 효소 처리하여 생성될 수 있다. 단편은 또한 재조합 수단에 의해 생성될 수도 있다. 대표적인 단편으로서는 Fab, Fab', F(ab')2, Fabc 및/또는 Fv 단편을 포함한다. Fab 단편을 구성하는 방법에 관하여는 예를 들어, 문헌[Huse, et al. (1989) Science 246:1275 1281]에 개시되어 있다. 기타 항체 단편 예를 들어, (i) 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성되는 F(ab')2 단편 ; (ii) F(ab')2 단편의 디설파이드 결합을 환원함에 의해 생성되는 Fab 단편; (iii) 항체 분자를 파페인과 환원제로 처리함으로써 생성되는 Fab 단편, 및 (iv) Fv 단편은 당 업계에 공지된 기술에 의하여 생산될 수 있다. "항원-결합 단편"이란 용어는, 특이적인 항원 결합으로 인해 유래되며, 항원과 결합하거나 또는 원 상태의 항체와 경쟁하는 항체 또는 면역 글로불린의 폴리펩티드 단편을 의미하는 것이다.
"도메인"이란 용어는, 예를 들어, β-병풍 및/또는 사슬 내 디설파이드 결합에 의해 안정화된, 펩티드 루프를 포함하는(예를 들어, 3∼4개의 펩티드 루프 포함), 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드로 이루어진 구상 부위를 의미하는 것이다. 본원에서 도메인을 "불변성" 또는 "가변성"으로 분류하는데, 이러한 분류는 "불변" 도메인의 경우, 다양한 군의 일원으로 이루어진 도메인 내에서 비교적 서열 변이가 일어나지 않으며, 또한 "가변" 도메인의 경우, 다양한 군의 일원으로 이루어진 도메인 내에서 변이가 상당한 수준으로 일어나는 특징을 바탕으로 한 것이다. 경쇄 상의 "불변" 도메인을 각각 "경쇄 불변부", "경쇄 불변 도메인", "CL부" 또는 "CL 도메인"이라고도 부른다. 중쇄 상의 "불변" 도메인을 각각 "중쇄 불변부", "중쇄 불변 도메인", "CH부" 또는 "CH 도메인"이라고도 부른다. 경쇄 상의 "가변" 도메인을 각각 "경쇄 가변부", "경쇄 가변 도메인", "VL부" 또는 "VL 도메인"이라고도 부른다. 중쇄 상의 "가변" 도메인을 각각 "중쇄 가변부", "중쇄 가변 도메인", "VH부" 또는 "VH 도메인"이라고도 부른다.
"부위"란 용어는, 항체 사슬 또는 항체 사슬 도메인의 부분 또는 일부(예를 들어, 본원에 정의한 바와 같은, 중쇄 또는 경쇄의 부분 또는 일부, 또는 불변 또는 가변 도메인의 부분 또는 일부)와, 이 사슬 또는 도메인의 보다 구체적인 부분 또는 일부를 의미하는 것이다. 예를 들어, 경쇄 및 중쇄, 또는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인으로서는 본원에 정의한 바와 같이, "틀 부위"들 또는 "FR"들의 중간에 삽입되어 존재하는 "상보성 결정 부위" 또는 "CDR"을 포함한다.
"형태"란 용어는, 단백질 또는 폴리펩티드 예를 들어, 항체, 항체 사슬, 도메인 또는 이의 부위의 3차 구조를 의미하는 것이다. 예를 들어, "경쇄(또는 중쇄) 형태"란 어구는, 경쇄(또는 중쇄) 가변부의 3차 구조를 의미하는 것이고, "항체 형태" 또는 "항체 단편의 형태"란 어구는, 항체 또는 이의 단편의 3차 구조를 의미하는 것이다.
항체의 "특이적 결합"이라는 용어는, 특정 항원 또는 에피토프에 대한 친화도가 감지할 수 있을 정도이되, 다만, 교차 반응성은 거의 나타내지 않는 항체를 의미하는 것이다. 대표적인 구체예에 있어서, 항체는 교차 반응성을 나타내지 않는다[예를 들어, 비-Aβ 펩티드 또는 Aβ 상에 존재하는 원방 또는 원거리에 있는 에피토프와 교차 반응하지 않는다]. "감지할 수 있는" 결합 또는 바람직한 결합이란, 친화도가 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 또는 10-10M 이상으로 결합하는 것을 포함한다. 친화도가 10-7M 이상, 바람직하게는 10-8M 이상인 것이 더욱 바람직하다. 본원에 제시된 수치의 중간값도 본 발명의 범위 내에 포함되며, 바람직한 결합 친화도 범위는 예를 들어, 10-6 M∼10-10 M, 바람직하게는 10-7 M∼10-10 M, 더욱 바람직하게는 10-8 M∼10-10 M일 수 있다. "교차 반응성을 거의 나타내지 않는" 항체는, 원치 않는 실체(예를 들어, 원치 않는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드)와 거의 결합하지 않을 항체이다. 예를 들어, Aβ에 특이적으로 결합하는 항체는, Aβ와 감지할 수 있을 정도로 결합하되, 다만, 비-Aβ 단백질 또는 펩티드(예를 들어, 플라크 내에 포함된 비-Aβ 단백질 또는 펩티드)와는 거의 반응을 하지 않을 항체이다. 특정 에피토프에 특이적인 항체는, 예를 들어, 동일한 단백질 또는 펩티드 상에 존재하는 원방의 에피토프 또는 상이한 에피토프와 거의 교차 반응을 하지 않을 것이다. 특이적 결합은 이와 같은 결합을 측정하기 위한 것으로서 당 업계에 알려진 임의의 기술에 의하여 측정될 수 있다. 바람직하게, 특이적 결합은 스캐차드 분석법 및/또는 경쟁적 결합 검정법에 따라서 측정된다.
"이중 특이적" 또는 "이 작용성" 면역글로불린 또는 항체 이외의 면역 글로불린 또는 항체는, 각각 동일한 결합 위치를 가지는 것으로 생각된다. "이중 특이적 항체" 또는 "이 작용성 항체"는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍과, 2개의 상이한 결합 위치를 가지는 인공적 하이브리드 항체이다. 이중 특이적 항체는 다양한 방법 예를 들어, 하이브리도마 융합법 또는 Fab 단편 결합법에 의하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al, J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)]을 참조하시오.
"항원"이란, 항체가 특이적으로 결합하는 항원 결정기를 함유하는 분자(예를 들어, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물 또는 소 분자)이다.
"에피토프" 또는 "항원 결정기"란 용어는, 면역 글로불린 또는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)가 특이적으로 결합하는 항원 상의 위치를 의미하는 것이다. 에피토프는 단백질의 3차원 폴딩에 의해 병치되는 불연속적 아미노산 또는 연속적 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다. 연속적 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 통상적으로 변성 용매에 노출시 유지되는 반면에, 3차원 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 통상적으로 변성 용매로 처리시 소멸된다. 에피토프는 통상적으로 독특한 공간적 형태를 이루는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 이상의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간적 형태를 측정하는 방법으로서는 예를 들어, X선 결정학적 방법 및 2-차원 핵 자기 공명법을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)]을 참조하시오.
전술한 바와 같은 항-Aβ 항체 이외에도, 기타 Aβ 결합 단백질로서는 항체 융합 단백질을 포함한다. "항체 융합 단백질" 및 "항체 융합체"란 용어는, 하나 이상의 비-항체 단백질의 일부 또는 폴리펩티드에 융합된 항체의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 단백질을 의미하는 것이다. 융합은 일반적으로 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 유전자 조작에 의해 이루어진다. 부가의 대표적인 항체 융합 단백질로서는 기타 가용성 또는 세포 내 생물학적 단백질의 전부 또는 일부 예를 들어, (세포 내 또는 가용성) 수용체 또는 이의 일부, 시토킨 또는 이의 일부, 효소 또는 이의 일부 등에 융합된 항체의 세포 수용체 결합 부분(예를 들어, Fc 부위)을 포함한다. 구체적으로, 항체의 Fc 부위를 포함할 수 있는 본 발명의 항체 융합 단백질은 Aβ에 결합할 수 있는 비-항체 단백질 부분 또는 폴리펩티드에 융합되어 있다.
"Fc 결합제"란 용어는, 항체(예를 들어, IgG 항체)의 Fc 부위에 결합할 수 있는 분자 예를 들어, 항체의 Fc 부위에 대한 친화도가 높은 보체 단백질, Fc 수용체 또는 박테리아-유래 단백질 예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G를 의미하는 것이다.
"Fc 부위"란 용어는, IgG 항체의 C-말단 부위, 구체적으로, 상기 IgG 항체의 중쇄(들)의 C-말단 부위를 의미하는 것이다. 비록 IgG 중쇄의 Fc 부위의 경계가 약간 상이할 수 있을지라도, Fc 부위는 통상적으로 아미노산 잔기 Cys226으로부터 IgG 중쇄(들)의 카복실-말단에 이르기까지로 한정된다.
크로마토그래피 관련 정의
본원에 사용된 "원액"이란 용어는, 기타 물질로부터 정제하고자 하는 하나 이상의 표적 물질을 함유하는 액체를 의미하는 것이다. 원액은 예를 들어, 수용액, 유기 용매 시스템 또는 수성/유기 용매의 혼합물 또는 용액일 수 있다. 원액은 종종 다수의 생물학적 분자(예를 들어, 단백질, 항체, 호르몬 및 바이러스), 소 분자(예를 들어, 염, 당 및 지질 등) 및 미립자 물질을 함유하는 복합적 혼합물 또는 용액이기도 하다. 생물학적 기원의 통상적인 원액은 처음에는 수용액 또는 수성 현탁액일 수 있으며, 또한 이는 분리 단계의 초반부 예를 들어, 용매 침전 및 추출 등의 과정에 사용되는 유기 용매를 함유할 수도 있다. 본 발명의 다양한 구체예에 의한 정제 방법에 의해 정제될 수 있는 중요한 생물학적 물질을 함유할 수 있는 원액의 예로서는, 생물 반응기로부터 유래하는 배양 상청액, 균질화 세포 현탁액, 혈장, 혈장 분획 및 모유를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 있어서 "표적 물질" 또는 "표적 단백질" 또는 "표적 항체"란 용어는, 원액으로부터 정제될 하나 이상의 목적 Aβ 결합 단백질 예를 들어, 항-Aβ 항체를 의미하는 것이다. 표적 물질은 원액 중에 현탁액으로서 존재할 수 있거나, 또는 용액 중에 존재할 수 있다.
"불순물"이란 용어는, 표적 물질(들)과는 상이한, 원액 중에 존재하는 물질을 의미하는 것으로서, 바람직하게는 최종 표적 물질 생성물(들)로부터 제거되는 것이 바람직한 물질을 의미한다. 통상적인 불순물로서는, 핵산, 단백질(예를 들어, 인트론-리드쓰루 종, 저 분자량 종 및 디설파이드 결합 부족 종), 펩티드, 내독소, 바이러스 및 소 분자를 포함한다.
"부산물"이란 용어는, 본 발명의 치료용 단백질의 비율을 감소시키거나 낮추는, 원치 않는 생성물을 포함하는 의미이다.
"고 분자량 종"이란 용어는, 분자량이 본 발명의 목적 단백질보다 큰 단백질의 복합체를 의미하는 것이다. 항체 예를 들어, IgG 항체의 경우, 이것의 응집체 분자량은 약 150kDa 이상이다.
"저 분자량 종"이란 용어는, 분자량이 본 발명의 목적 단백질보다 적은 단백질 예를 들어, 분해 산물을 의미하는 것이다. 항체 예를 들어, IgG 항체의 경우, 이러한 분해 산물의 분자량은 약 150kDa 미만이다.
본원에 있어서, "고상"이란 용어는, 정제 과정 중에 표적 물질과 상호 작용을 하거나, 또는 Fc 결합제가 부착할 수 있는, 비-수성 매트릭스를 의미하는 것이다. 적당한 고상 재료로서는 예를 들어, 유리, 실리카(예를 들어, 실리카 겔), 다당류(예를 들어, 다당류 매트릭스) 예를 들어, 아가로스 및 셀룰로스, 유기 중합체 예를 들어, 폴리아크릴아미드, 메틸메타크릴레이트 및 폴리스티렌-디비닐벤젠 공중합체 예를 들어, 앰버라이트(Amberlite)™ 수지(Rohm & Haas Chemical Co., Philadelphia, PA)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고상은 친화성, 이온 교환 및 이온 포획 수지로서 일반적으로 알려져 있는 수지 군 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다. 고상은 예를 들어, 정제 컬럼, 개별 입자의 불연속 상 또는 이것들의 조합체일 수 있다. 고상은 다공성 또는 비 다공성을 가질 수 있으며, 또한 압착 가능하거나 또는 압착 불가능하다. 다양한 구체예에 있어서, 고상은 중합체 매트릭스 또는 아가로스 입자 또는 비드이다. 다양한 구체예에서, 고상은 예를 들어, 고상에 불순물이 비 특이적으로 부착되는 것을 막기 위하여, 시약(예를 들어, 글리세롤)으로 코팅될 수 있다. Fc 결합 고상은 Fc 결합제를 이 고상의 표면에 부착시킬 수 있는 결합 리간드 또는 화학 물질을 보유할 필요가 있다. 바람직한 고상 물질은 정제 과정에 이용된 조건들 예를 들어, 펌핑 및 직교류 여과, 온도, pH 및 기타 사용된 액체의 약상에 따라서, 물리적 및 화학적으로 변성될 것이다.
"친화성 리간드"란, 성분의 결합 위치와의 특이적 상호 작용을 통하여 원액 성분들과 선택적으로 또는 우선적으로 결합하는 부분을 의미한다. 본 발명에 있어서, 친화성 리간드(예를 들어, Fc 결합제)는 통상적으로 고상 예를 들어, 수지에 고정된다. 본 발명의 방법에 유용한 크로마토그래피 수지를 제공하기 위하여 수지 지지체에 결합될 수 있는 친화성 리간드의 예로서는, 단백질 Fc 부위에 선택적으로 결합하는 단백질 A, 단백질 G 및 이의 유사체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 친화성 리간드를 고체 지지체 재료에 결합시키는 방법에 관하여는 정제 업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Affinity Separations: A Practical Approach (Practical Approach Series), Paul Matejtschuk (Editor), Ir1 Pr: 1997; 및 Affinity Chromatography, Herbert Schott, Marcel Dekker, New York: 1997]을 참조.
"친화성 크로마토그래피 수지" 또는 "친화성 수지"란, 표면에 친화성 리간드가 결합되어 있는 고상 또는 기질을 포함하는 크로마토그래피 수지를 의미하는 것이다.
"이온 교환 크로마토그래피 수지" 또는 "이온 교환 수지"란, 양으로 하전되었거나 또는 음으로 하전된 리간드에 공유 결합되어 있어서, 이온 교환 수지와 접촉하는 용액 중의 이온과 교환할 수 있는 유리 짝 이온을 가지는 고체 지지체를 의미하는 것이다.
"양이온 교환 수지"란, 음으로 하전된 리간드에 공유 결합되어 있어서, 수지와 접촉하는 용액 중의 양이온과 교환되는 유리 양이온을 가지는 이온 교환 수지를 의미하는 것이다. 다양한 양이온 교환 수지가 당 업계에 공지되어 있는데, 그 예로서는 공유 결합된 기가 카복시산염 또는 설폰산염인 수지가 있다. 시판중인 양이온 교환 수지로서는 CMC-셀룰로스, SP-세파덱스(Sephadex)™ 및 급속 S-세파로스(Fast S-Sepharose)™ [상기 SP-세파덱스™ 및 급속 S-세파로스™는 파마시아(Pharmacia)에서 시판됨]를 포함한다.
"음이온 교환 수지"란, 양으로 하전된 기 예를 들어, 4차 아미노 기가 공유 결합되어 있는 이온 교환 수지를 의미하는 것이다. 시판중인 음이온 교환 수지로서는 DEAE 셀룰로스, TMAE, QAE-세파덱스™, 및 급속 Q-세파로스™ [상기 QAE-세파덱스™, 및 급속 Q-세파로스™는 파마시아(Pharmacia)에서 시판됨]를 포함한다.
본원에 사용된 "카오트로픽 염"이란 용어는, 단백질 수화 외피를 통과할 수 있고, 이의 표면에 직접적으로 결합할 수 있는 유방성(lyotropic) 계열의 저 분자량 이온 성분을 하나 이상 포함하는 염을 의미하는 것이다. 이는 공동 수화 결합(cohydrative association)을 파괴하여 단백질의 가용화를 촉진한다. 카오트로픽 염의 예로서는 2족 원소의 할로겐화물 염(예를 들어, 염화칼슘, 염화마그네슘, 염화바륨, 브롬화칼슘, 브롬화마그네슘, 브롬화바륨, 요드화칼슘, 요드화 마그네슘 및 요드화 바륨)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
적당한 2가 양이온 염의 예로서는 Mn2 +, Ni2 + 또는 Cu2 +, Mg2 +, Ca2 + 및 Ba2 +의 염 예를 들어, 티오시안산염(SCN-), 과염소산염(ClO4 -), 질산염(NO3 -), 염화물(Cl-), 및 브롬화물(Br-)의 염, 그리고 이들 염의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
임의의 구체예에서, 2가 양이온 염은 2가 양이온(예를 들어, Mg2 +, Ca2 +, Ni2 + 및 Ba2 +)을 포함한다. 바람직한 방법에 사용하기에 바람직한 카오트로픽 염으로서는 MgCl2, NiCl2 및 CaCl2가 있다. 2가 양이온 염 세척 단계 이후에, 표적 단백질은 친화성 크로마토그래피 매트릭스로부터 용리된다.
"완충액"이란, 이것이 용액으로서 존재할 때, pH의 단위 변화를 유발시키기 위하여 첨가되어야 하는 산 또는 알칼리의 양을 증가시키는 물질이다. 완충 용액은 이것의 산-염기 컨쥬게이트 성분의 작용으로 인하여 pH를 변화시키지 않는다. 생물학적 시약으로서 사용하기 위한 완충 용액은, 일반적으로 수소 이온의 농도를 일정하게 유지시켜 주어, 용액의 pH가 생리적 범위 내에 있도록 만들어 줄 수 있다. "생리적 pH"란 용어는, 포유 동물 혈액의 pH(즉, pH 7.38 또는 pH 약 7.4)를 의미하는 것이다. 그러므로, 생리적 pH 범위는 약 7.2∼7.6이다. 통상적인 완충액 성분으로서는 유기 및 무기 염, 산 및 염기를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 생물학적 분자(예를 들어, 단백질 분자)의 정제에 사용되는 대표적인 완충액으로서는 쥬비터 이온 또는 "굿 완충액(Good buffer)"을 포함한다[예를 들어, Good et al. (1966) Biochemistry 5:467 및 Good and Izawa (1972) Methods Enzymol. 24:62]. 대표적인 완충액으로서는 TES, MES, PIPES, HEPES, MOPS, MOPSO, TRICINE 및 BICINE를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 있어서 "평형 완충액"이란 용어는, Fc 결합 시약, 고상, 또는 이들 둘 다를 제조하는데 사용되는 완충액으로서, 표적 단백질을 함유하는 원액을 로딩하기 위한 완충액을 의미한다. 평형 완충액은 등장성인 것이 바람직하며, 일반적으로 pH는 약 6∼약 8이다. "로딩 완충액"이란, Aβ 결합 단백질 예를 들어, 항-Aβ 항체와, Fc 결합제가 고정되어 있는 고상에 존재하는 불순물을 함유하는 원액을 로딩하는데 사용되는 완충액을 의미한다. 종종, 평형 완충액과 로딩 완충액은 동일하다. "용리 완충액"이란, 고정되어 있는 Fc 결합제로부터 Aβ 결합 단백질을 용리시키는데 사용되는 완충액을 의미하는 것이다. 이 용리 완충액은 pH가 낮아서, Fc 결합제와 목적 단백질 사이의 상호 작용을 파괴하는 것이 바람직하다. 바람직하게, 낮은 pH의 용리 완충액의 pH는 약 2∼약 5, 가장 바람직하게는 약 3∼약 4이다. pH를 이 범위에서 조절할 완충액의 예로서는 글리신, 인산염, 아세트산염, 시트르산염 및 암모늄 완충액과, 이들의 조합을 포함한다. 바람직한 완충액으로서는 시트르산염 및 아세트산염 완충액, 가장 바람직하게는 시트르산나트륨 또는 아세트산나트륨 완충액이 있다. 기타 용리 완충액은 고 pH 완충액(예를 들어, pH가 9 이상인 완충액)인 것으로 간주되거나, 또는 목적 단백질을 용리하기 위한 화합물 또는 조성물 예를 들어, MgCl2(2mM)를 포함하는 완충액이다.
본원에 있어서 "세척액" 또는 "세척 완충액"이란, 목표 물질이 결합되어 있는 크로마토그래피 수지로부터 불순물을 제거하는데 사용되는 액체를 의미하는 것이다. 하나 이상의 세척액은 연속적으로 사용될 수 있는데, 예를 들어, 연속 세척액은 크로마토그래피 수지와 비-특이적으로 결합되어 있는 여러가지 유형의 불순물을 해리시켜 제거하기 위해 지정된, 다양한 특성 예를 들어, pH, 전도성, 용매 농도 등을 가진다.
본원에 있어서 "용리액" 또는 "용리 완충액"이란, 하나 이상의 세척액으로 세척된 후에 크로마토그래피 수지로부터 표적 물질을 해리시키는데 사용되는 액체를 의미하는 것이다. 용리액은 표적 물질을 비가역적으로 변성시키지 않고 해리시키는 작용을 한다. 통상의 용리액에 관하여는 크로마토그래피 업계에 널리 공지되어 있으며, 또한 고농도의 염, 유리 친화성 리간드 또는 유사체, 또는 크로마토그래피 수지로부터 표적 물질이 해리되는 것을 촉진하는 기타 물질을 가질 수 있다. "용리 조건"이란, 크로마토그래피 수지로부터 표적 물질을 해리시키는 표적 물질-결합 크로마토그래피 수지와 관련된 공정 조건 예를 들어, 표적 물질-결합 크로마토그래피 수지와 용리액 또는 용리 완충액을 접촉시켜, 상기와 같은 해리를 유도하는 것과 같은 공정 조건을 의미한다.
본원에 있어서, "세정액" 또는 "세정 완충액"이란, 정제 과정을 마친 후에 크로마토그래피 수지를 세척하는데 사용되는 액체를 의미하는 것이다. 이와 같은 세정액은 세제, 바이러스-불활성화 제제 또는 비교적 고농도인 염을 함유할 수 있으며, 또한 정제 과정시 사용되는 액체보다 높거나 낮은 pH를 가질 수 있다. 이것의 용도는 크로마토그래피 수지를 다시 사용할 수 있도록 만들기 위해 이 수지에서 오염 물질을 제거하기 위한 것이다. 통상의 세정액에 관하여는 크로마토그래피 업계에 널리 공지되어 있다.
본원에 있어서, "보관액" 또는 "보관 완충액"이란, 크로마토그래피 수지를 사용하고 난 후 다음 사용시까지 현탁시켜 놓는 액체를 의미하는 것이다. 보관액은 또한 완충 이온 이외에도 살균제 또는 기타 보존제를 함유할 수도 있다. 이와 같은 보관액에 관하여는 크로마토그래피 업계에 널리 공지되어 있다.
다양한 측면에서, 본 발명은, 단백질을 Fc 결합제에 흡착시킨 후에, 이 Fc 결합제를 2가 양이온 염을 함유하는 완충 용액으로 세척하여, 하나 이상의 불순물을 제거한 후, 이 Fc 결합제로부터 단백질을 회수하는 과정에 의하여, 단백질과 하나 이상의 불순물을 포함하는 원액으로부터 Aβ 결합 단백질, 바람직하게는, 항-Aβ 항체를 정제하는 방법에 관한 것이다. 적당한 Fc 결합제로서는 단백질 A 및 단백질 G를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 Aβ 결합 단백질, 구체적으로 항-Aβ 항체를 정제하는 방법에 관한 것이다. 대표적인 정제 과정은 친화성 크로마토그래피 단계를 포함한다. 친화성 크로마토그래피 단계는 연속적이거나 불연속적인 방식으로 행하여질 수 있거나, 아니면 두 가지 방식을 조합한 방식으로 행하여질 수 있다. 예를 들어, 친화성 크로마토그래피 단계는 불연속적 방식 예를 들어, 회분식 방식으로서 행하여질 수 있다. 친화성 크로마토그래피는 생물 선택적 흡착 단계와, 추후 고정된 리간드로부터 표적 화합물을 회수하는 단계로 이루어진 과정이다. 이러한 과정은 표적 화합물을 고도로 특이적이고, 효율적으로 정제할 수 있도록 해준다. 이 과정에는, 일반적으로 해리 상수 10-4∼10- 8으로 표적 화합물(예를 들어, 항-Aβ 항체)과 결합하여 온화한 조건 하에서도 이 표적 화합물을 회수할 수 있도록 해주는, 적당히 선택적인 리간드(예를 들어, Fc 결합제)를 사용하여야 한다. 이 리간드는 일반적으로 비드형 및 다공성 매트릭스 상에 고정되는데, 이때 상기 매트릭스는 컬럼을 팩킹하고 있을 수 있거나, 또는 회분형 흡착 매질의 형태를 가질 수 있다.
바람직한 결합제로서는 단백질 A가 있다. 단백질 A는 면역 글로불린의 Fc 부위에 결합한다. 단백질 A는 6개의 부위로 이루어져 있는데, 이들 중 5개의 부위는 IgG와 결합한다. 단백질 A는 인간 IgG1, IgG2 및 IgG4 뿐만 아니라, 마우스 IgG2a, IgG2b 및 IgG3와도 고도의 친화도로 결합한다. 단백질 A는 인간 IgD, IgM, IgA 및 IgE 뿐만 아니라, 마우스 IgG1과도 중간 정도의 친화도로 결합한다. 친화성 리간드로서, 단백질 A는 매트릭스에 고정되어, 상기와 같은 부위들이 자유롭게 결합할 수 있게 되어 있다. 고정된 단백질 A 중 하나의 분자는 IgG 중 2개 이상의 분자와 결합할 수 있다. 원래의 단백질 A 및 이의 재조합 단백질 A는 IgG의 Fc 부위에 대한 유사한 특이성을 공유한다. 재조합 단백질 A(r단백질 A)는 예를 들어, C-말단 시스테인을 포함하도록 조작될 수 있으며, 또한 티오에스테르 커플링을 통하여 고상 매트릭스에 고정될 수 있다. 이러한 커플링으로 인하여, 단백질 A의 결합 능이 강화된다.
대안적 결합제로서는 단백질 G가 있다. 이 단백질 G는 IgG에 특이적으로서, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 뿐만 아니라, 마우스 IgG1 및 IgG3와도 높은 친화도로 결합한다. 단백질 G 플러스는 인간 IgG4 및 마우스 IgG2a, IgG2b 및 IgG3에 대한 친화도가 중간 정도이다. 재조합 단백질 G(r단백질 G)는 원래의 단백질 중 알부민-결합부가 결실되도록 조작될 수 있다. 재조합 단백질 G는 2개의 Fc 결합부를 함유한다.
대안적 결합제로서는 단백질 A/G가 있다. 이 단백질 A/G는 유전자 조작된 단백질로서, 단백질 A와 단백질 G의 IgG 결합 프로필을 모두 갖추고 있다. 이는 바실러스(Bacillus)의 비 병원체로부터 분비되는 유전자 융합 산물이다. 단백질 A/G는 단백질 A로부터 유래하는 4개의 Fc 결합 도메인과, 단백질 G로부터 유래하는 2개의 Fc 결합 도메인을 함유한다. 단백질 A/G는 단백질 A와 같이 pH 의존성은 아니지만, 단백질 A 및 단백질 G의 추가의 특성을 가진다.
단백질 A/G는 특히 폴리클로날 또는 모노클로날 IgG 항체의 정제에 적당한 모든 인간 IgG 하위 군(특정되지 않은 하위 군)에 결합한다. 뿐만 아니라, 이 단백질 A/G는 IgA, IgE 및 IgM과 결합하며, (그 정도는 낮지만) IgD와도 결합한다. 단백질 A/G는 특히, IgG 하위 군으로부터 마우스 모노클로날 항체를 정제하는데 적당한 모든 마우스 IgG 하위 군과도 잘 결합하는데, 이 경우, IgA 및 IgM과 뮤린의 혈청 알부민의 간섭을 받지 않는다[예를 들어, Sikkema. (1989) Amer. Biotech. Lab 7, 42 참조]. 마우스 모노클로날 항체의 각각의 하위 군들의 친화도는 단백질 A 또는 단백질 G에 대한 경우보다는 카메라 단백질 A/G에 대한 경우가 더 클 수 있다[예를 들어, Eliasson et al. (1988) J Biol. Chem. 263, 4323-4327 참조].
본 발명에 있어서, 고정된 Fc 결합제(예를 들어, 단백질 A)는 2가 양이온 염 용액으로 세척되어, 불순물이 제거된다. 특히, 재조합 항체 발현 기술의 결과로서 생성되는, 바람직하지 않은 불순물은 2가 양이온 염을 이용하는 세척 단계를 통하여 제거될 수 있다.
본 발명의 방법은 임의로는 친화성 크로마토그래피 단계와 2가 양이온 세척 단계 이후에 행하여지는 정제 단계를 포함할 수도 있다. 추후의 정제 단계는 이온 교환 크로마토그래피 단계 및/또는 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC) 단계를 포함할 수 있다. 크로마토그래피 이후의 단계들은 연속적이거나 불연속적 방식(예를 들어, 회분 방식)일 수 있거나, 아니면 이 두 가지 방식을 조합한 방식일 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피는 단백질의 전체 하전 량의 차이에 따라서 분자를 분리한다. 표적 단백질은 결합하기 위하여 수지에 부착된 작용기의 하전과는 반대인 하전을 띠어야만 한다. 예를 들어, 일반적으로 전체 하전이 양 하전인 항체는, 음 하전된 작용기를 함유하는 양 이온 교환 수지와 잘 결합할 것이다. 이와 같은 상호 작용은 이온에 의한 것이기 때문에, 결합은 이온 조건이 낮을 때에 이루어져야 한다. 용리는 이온 세기를 증가시켜, 이온 간 상호 작용을 파괴하거나, 또는 단백질의 pH를 바꿔줌으로써 이루어질 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피는 단백질을 분리해 내기 위하여 이 단백질의 하전을 바꿔주는 것을 원리로 하는 반면에, 소수성 상호 작용 크로마토그래피는 몇몇 단백질의 소수성을 이용한다. 단백질 상에 존재하는 소수성 기는 컬럼 상에 존재하는 친수성 기와 결합한다. 단백질의 소수성이 강할수록, 이 단백질은 컬럼에 더욱 강하게 결합할 것이다. 예를 들어, HIC 단계는 숙주 세포 유래 불순물(예를 들어, DNA 및 기타 고 분자량 및 저 분자량 생성물-관련 종)을 제거한다. 추가의 정제 단계는 본원에 기술된 바와 같이, 바이러스 제거 단계와, 한외 여과 단계 및/또는 정용 여과 단계를 포함할 수 있다.
다양한 구체예에서, 단백질을 함유하는 Fc 부위는, Fc 결합제의 Fc 수용체에 결합하는 Fc 부위를 가지는 항체 융합 단백질 또는 항체이다. Fc 결합제를 세척하기 위한 2가 양이온 염을 함유하는 완충 용액을 사용함으로써, 목적 단백질(예를 들어, 원액 중의 표적 물질)의 불순물 예를 들어, 리드쓰루 변이체 및 불변부 함유 단편(예를 들어, LMW 및 UDB 종)을 더욱 많이 제거할 수 있다.
본 발명의 방법은 하나 이상의 크로마토그래피 분리 단계 이외에도, 원액 중 불순물로부터 Aβ 결합 단백질("표적 단백질")을 분리하기 위한 하나 이상의 여과 단계들을 포함할 수도 있다.
예를 들어, 원액은 여과, 원심 분리 또는 가공되어, 이 원액과 Fc 결합제가 접촉하기 이전에, 미립자인 파편 등이 제거될 수 있다. 예를 들어, 재조합 기술을 이용하여, 단백질은 세포 내 즉, 세포질 주변 공간에 생성되게 할 수 있거나, 또는 배양 배지 중에 직접적으로 분비되게 할 수 있다. 만일 단백질이 세포 내에서 생산되면, 미립자인 파편 예를 들어, 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어, 원심 분리 또는 한외 여과에 의하여 제거될 수 있다. 단백질이 배지 중에 분비되는 경우, 재조합 숙주 세포는 예를 들어, 접선 유동 여과(tangential flow filtration)에 의하여 세포 배양 배지로부터 분리될 수 있다.
다양한 구체예에서, 표적 단백질을 함유하는 원액은 (바람직하게는 고상에 고정되고, 적당한 완충액으로 평형화된) Fc 결합제와 접촉하게 되며, 그 결과, 표적 단백질은 Fc 결합제(예를 들어, 고정된 Fc 결합제)에 흡착하게 된다. 원액은 평형 완충액과 동일할 수 있는 로딩 완충액 중에서 Fc 결합제(예를 들어, 고정된 Fc 결합제)와 접촉된다. 불순물-함유 원액이 고상을 통과해 흐를 때, 표적 단백질은, 고상을 통과하여 흐르고 있거나 또는 이 고상에 비 특이적으로 결합하는 다양한 기타 불순물(예를 들어, 표적 단백질이 재조합 숙주 세포 내에서 생산되는 경우에는 숙주 세포 단백질, 또는 기타 공정-유래 불순물) 및 Fc 결합제에 흡착하게 된다. 다양한 구체예에서, Fc 결합제는 단백질 A이고, 평형 완충액은 20 mM Tris, 0.15 M NaCl(pH 7.5)이다. 기타 적당한 평형 완충액은 예를 들어, 생리적 농도 예를 들어, 농도 약 0.5 mM∼약 100 mM(예를 들어, 10 mM, 20 mM 및 50 mM 등)로 존재하고, 생리적 염 농도(예를 들어, 약 0.15 mM NaCl)를 가지며, pH 5.0∼9.0인 BIS 및 HEPES 등을 포함한다.
고상은 Fc 결합제를 고정시키기 위한 아가로스(예를 들어, 세파로스) 비드 또는 입자인 것이 바람직하다. 다양한 구체예에서, 컬럼은 시약 예를 들어, 글리세롤로 코팅되어, 이 컬럼에 비특이적으로 부착되는 현상을 감소 또는 방지할 수 있다. 다양한 구체예에서, Fc 결합제는 단백질 A이다. rmp 단백질 A 세파로스™ 급류(FF) 컬럼(애머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences) 시판)은 바람직한 방법에 사용하기 적당한 단백질 A 컬럼의 일례이다.
이후, Fc 결합제는 2가 양이온 염을 함유하는 완충 세척 용액으로 세척되며, 이로써, 고상 또는 Fc 결합제와 결합한 단백질 변이종이 제거된다. 특히, 2가 양이온 염 세척 단계를 통하여, 원치 않는 불순물을 상당량 제거할 수 있음을 발견하였다. 특히, 항-Aβ 항체의 인트론 리드쓰루 변이체, 저 분자량 변이체 및 디설파이드 결합 부족 변이체는 2가 양이온 염 세척을 통해 제거될 수 있음을 알아냈다. 더욱이, 숙주 세포 단백질(HCP) 및 DNA도 2가 양이온 염 세척을 통해 제거될 수 있다. 다양한 구체예에서, 세척 용액 중 2가 양이온 염은 카오트로픽 염을 함유한다. 적당한 카오트로픽 염의 예로서는 염화칼슘((CaCl2), 염화니켈(NiCl2) 및 염화마그네슘(MgCl2)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 단일 2가 양이온 염이 세척 용액 중에 존재할 수 있지만, 다양한 구체예에 있어서, 2개 이상의 2가 양이온 염을 사용할 수도 있다.
다양한 구체예에서, 2가 양이온 염을 함유하는 세척 용액 이외의 세척 용액이 불순물을 제거하는데 사용된다. 예를 들어, 다양한 구체예에서, Fc 결합제를 세척할 경우, 20 mM∼50 mM Tris, 0.75 M∼2.0 M NaCl, pH 5.0∼9.0인 용액 및/또는 10 mM Tris, pH 7.5인 용액이 2가 양이온 염 함유 세척 용액으로 Fc 결합제를 세척하기 이전, 이후, 또는 이전과 이후에 사용된다.
다양한 구체예에서, 2가 양이온 염은 약 0.5 M∼2.5 M의 농도로 pH 약 5∼약 9, 및 바람직하게는 pH 약 7∼약 8인 pH 완충 용액에 첨가되는 것이 바람직하다. 2가 양이온 염의 바람직한 농도는 0.6 M, 2.0 M 및 2.5 M을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 목적으로서 적당한 완충액으로서는 농도 20 mM∼50 mM의 Tris 또는 아세트산염 완충액을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
세척 단계(들) 수행 후, 표적 단백질은 Fc 결합제로부터 회수된다. 이는 일반적으로 적당한 용리 완충액을 사용함으로써 이루어진다. 예를 들어, 표적 단백질은 pH가 낮은(예를 들어, pH 약 2∼약 6.5, 및 바람직하게는 pH 약 2.5∼약 3.5) 용리 완충액을 사용하여 컬럼으로부터 용리될 수 있다.
다양한 구체예에서, 이와 같이 회수된 표적 단백질은 약학적으로 허용 가능한 담체 중에 제형화되어, 진단용, 치료용 또는 이 분자들이 사용되는 것으로 알려진 기타 다양한 용도로 사용될 수 있다.
다양한 구체예에서, 용리된 표적 단백질 제제는 Fc 결합제 크로마토그래피 단계 이후 부가적인 정제 단계로 도입될 수 있다. 예를 들어, 추가 정제 단계의 대표 예로서는 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC), 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 투석, 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 고정 금속 친화성 크로마토그래피), 크기별 배제 크로마토그래피(SEC), 황산암모늄 침전법, 에탄올 침전법, 역상 HPLC(RP-HPLC), 크로마토포커싱, 한외 여과법, 정용 여과법 및 겔 여과법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 구체예에서, Fc 결합제 크로마토그래피 단계 이후에는 음이온 교환 크로마토그래피 및 HIC 단계가 수행된다. 다양한 구체예에서, 크로마토그래피 단계 이후에는 또한 바이러스 여과 단계, 한외 여과/정용 여과 단계, 및 미생물 오염물 여과 단계가 수행된다. 다양한 구체예에서, 이와 같은 부가의 정제 단계는 Fc 결합제 크로마토그래피 단계 이전에 수행될 수 있다.
다양한 구체예에서, Aβ 결합 단백질, 바람직하게는 항-Aβ 항체의 정제 방법은, 우선, 고상에 고정되어 있는 단백질 A를 포함하는 Fc 결합제에 표적 단백질을 흡착시키는 단계 → 2가 양이온 염을 함유하는 완충 용액을 이용하여 Fc 결합제를 세척하여 하나 이상의 불순물을 제거하는 단계 → 단백질 A로부터 단백질을 회수하여 첫 번째 용리 풀을 마련하는 단계를 포함한다.
다양한 구체예에서, 정제 과정 이후에는 계속해서 첫 번째 용리 풀을 음이온 교환 크로마토그래피시키는데, 즉, 음이온 교환 수지와 첫 번째 용리 풀을 접촉시켜, 불순물은 수지에 흡착되고 표적 단백질은 수지에 흡착되지 않도록 만든다. 이후, 소통중인 용리 풀로부터 표적 단백질을 회수하여 두 번째 용리 풀을 마련하게 된다. 다양한 구체예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 추가로 음이온 교환 수지를 완충 세척 용액으로 세척하여, 임의의 흡착된 표적 단백질의 최소한의 일부를 회수한 후, 이 단백질 일부를 두 번째 용리 풀과 합하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 첫 번째 용리 풀은, 항체는 흡착되고 임의의 불순물은 통과하도록 만든 후, 임의로는 흡착된 항체를 세척 및 용리시키는 방식으로, 음이온 교환 수지와 접촉할 수 있다.
다양한 구체예에서, 정제 과정 이후에는 계속해서, 두 번째 용리 풀을 HIC 시키는데, 즉, 표적 단백질을 소수성 상호 작용 수지(예를 들어, 소수성 리간드로 작용화된 고상)에 흡착시키고, 소수성 상호 작용 수지를 완충 세척 용액(이온 세기가 표적 단백질을 실질적으로 용리시킬 정도는 아닌 용액)으로 세척하며, 세 번째 용리 풀에 존재하는 표적 단백질을 (통상적으로, 이온 세기가 소수성 상호 작용 수지로부터 표적 단백질을 방출시키기에 충분할 정도로 낮은 용리 완충액을 사용하여) 회수하는 단계가 수행된다. 대안적으로, 두 번째 용리 풀은, 표적 단백질이 흡착되지 않으면서 컬럼을 통과하여 세 번째 용리 풀로서 회수되는 방식으로, HIC 컬럼과 접촉할 수 있다.
다양한 구체예에서, 정제 과정은 예를 들어, 바이러스를 제거하고, 표적 단백질을 함유하는 용액을 농축 및 완충하며, 또한 미생물 오염물을 제거하기 위한 하나 이상의 여과 단계를 포함한다.
다양한 구체예에서, 본 발명은 단백질과 하나 이상의 불순물(여기서, 이 불순물은 하나 이상의 IRT 변이체를 포함함)을 포함하는 원액으로부터 Aβ 결합 단백질, 바람직하게는 항-Aβ 항체를 정제하는 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, 이 방법은 IRT 변이체 수준을 원액 중 수준보다 약 2∼약 20배 감소시킨다. 바람직하게, IRT 변이체 수준은 5배 이상, 더욱 바람직하게는 10배 이상 감소된다. 예를 들어, IRT 항체 변이체 수준이 약 3∼5%(원액 중 전체 종에 대한 백분율로서)인 원액(출발 시료) 중, IRT 항체 변이종의 수준은 약 0.3∼약 0.5%로 감소될 수 있다. 다양한 구체예에서, IRT 변이종의 수준은 1% 미만, 0.8% 미만, 0.5% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만 및/또는 0.1% 미만으로 감소한다. 바람직하게, 단백질 제제화를 위한 원액의 정제에 있어서, IRT 변이체 수준은 1% 미만, 0.8% 미만, 0.5% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만 및/또는 0.1% 미만(원액 중 전체 종에 대한 백분율로서)으로 감소한다.
다양한 구체예에서, 본 발명은 단백질과 하나 이상의 불순물(여기서, 이 불순물은 하나 이상의 LMW 변이체를 포함함)을 포함하는 원액으로부터 Aβ 결합 단백질, 바람직하게는 항-Aβ 항체를 정제하는 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, 이 방법은 LMW 변이체 수준을 원액 중 수준보다 약 2∼약 20배 감소시킨다. 바람직하게, LMW 변이체 수준은 5배 이상, 더욱 바람직하게는 10배 이상 감소된다. 예를 들어, LMW 항체 변이체 수준이 약 3∼5%(원액 중 전체 종에 대한 백분율로서)인 원액(출발 시료) 중, LMW 항체 변이종의 수준은 약 0.3∼약 0.5%로 감소될 수 있다. 다양한 구체예에서, LMW 변이종의 수준은 1% 미만, 0.8% 미만, 0.5% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만 및/또는 0.1% 미만으로 감소한다. 바람직하게, 단백질 제조용 원액의 정제에 있어서, LMW 변이체 수준은 1% 미만, 0.8% 미만, 0.5% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만 및/또는 0.1% 미만(원액 중 전체 종에 대한 백분율로서)으로 감소한다.
다양한 구체예에서, 본 발명은 단백질과 하나 이상의 불순물(여기서, 이 불순물은 하나 이상의 UDB 변이체를 포함함)을 포함하는 원액으로부터 Aβ 결합 단백질, 바람직하게는 항-Aβ 항체를 정제하는 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, 이 방법은 UDB 변이체 수준을 원액 중 수준보다 약 2∼약 20배 감소시킨다. 바람직하게, UDB 변이체 수준은 5배 이상, 더욱 바람직하게는 10배 이상 감소된다.
예를 들어, UDB 항체 변이체 수준이 약 20%(원액 중 전체 종에 대한 백분율로서)인 원액(출발 시료) 중, UDB 항체 변이종의 수준은 약 10∼약 2%로 감소될 수 있다. 다양한 구체예에서, UDB 변이종의 수준은 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만으로 감소한다. 바람직하게, 단백질 제조용 원액의 정제에 있어서, UDB 변이체 수준은 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만(원액 중 전체 종에 대한 백분율로서)으로 감소한다.
뿐만 아니라, 예를 들어, UDB 항체 변이체 수준이 약 3∼5%(원액 중 전체 종에 대한 백분율로서)인 원액(출발 시료) 중, UDB 항체 변이종의 수준은 약 0.3∼약 0.5%로 감소될 수 있다. 다양한 구체예에서, UDB 변이종의 수준은 1% 미만, 0.8% 미만, 0.5% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만 및/또는 0.1% 미만으로 감소한다. 바람직하게, 단백질 제조용 원액의 정제에 있어서, UDB 변이체 수준은 1% 미만, 0.8% 미만, 0.5% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만 및/또는 0.1% 미만(원액 중 전체 종에 대한 백분율로서)으로 감소한다.
본 발명의 정제 방법에 사용되는 Aβ 결합 단백질
본원에 개시된 바와 같이, 본 발명에 따라서 정제될 Aβ 결합 단백질 예를 들어, 항-Aβ 항체는 당 업계에 널리 확립된 기술을 이용하여 제조될 수 있는데, 이러한 기술의 예로서는 합성 기술(예를 들어, 재조합 기술 및 펩티드 합성 기술 또는 이러한 기술들의 병행 기술)을 포함하며, 또한 상기 단백질은 단백질의 내부 공급원으로부터 분리될 수 있다. 다양한 구체예에서, 항체는 예를 들어, 폴리클로날 항체 제제, 모노클로날 항체, 재조합 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 항체 생산 기술에 관하여는 이하에 더욱 상세히 기술되어 있다. 기타 구체예에서, Aβ 결합 단백질은 Aβ와 결합할 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드의 일부분에 융합되어 있는 항체 Fc 부위를 포함하는 항체 융합 단백질일 수 있다. 항체 융합 단백질의 제조에 관하여도 이하에 상세히 기술되어 있다.
폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는 적당한 개체를 면역원으로 면역화함으로써 제조될 수 있다. 면역화된 개체 내 항체 역가는 표준적인 기술 예를 들어, 면역화된 표적 항원을 이용하는 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA)을 이용하여 경시적으로 관찰될 수 있다. 원한다면, 표적 항원에 대해 생성된 항체 분자는 포유 동물(예를 들어, 포유 동물의 혈액)으로부터 분리될 수 있으며, 또한 널리 공지된 기술 예를 들어, 단백질 A 세파로스 크로마토그래피로 정제되어, 항체 예를 들어, IgG 분획을 얻을 수 있다. 면역화 후 적당한 시기 예를 들어, 항-항원 항체의 역가가 가장 높을 때, 항체-생산 세포를 개체로부터 얻어서, 이를 표준적인 기술 예를 들어, 하이브리도마 기술[Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497, 및 Brown et al. (1981) J. Immunol. 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem .255:4980-83; Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:2927-31; 및 Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75 참조]에 의해 모노클로날 항체를 제조하는데 사용할 수 있다. 키메라 폴리클로날 항체의 제조에 관하여는 미국 특허 제6,420,113호(Buechler et al.)를 참조하시오.
모노클로날 항체
림프구와 무한 증식 세포주를 융합시키는데 사용되는 것으로 널리 알려져 있는 다수의 방법들 중 임의의 방법을, 모노클로날 항체를 생산하는데 적용할 수 있다[예를 들어, G. Galfre et al. (1977) Nature 266:55052; Gefter et al. Somatic Cell Genet, 상동; Lerner, Yale J. Biol. Med., 상동; Kenneth, Monoclonal Antibodies, 상동]. 뿐만 아니라, 통상의 기술자는 이러한 방법에 관한 다수의 변법도 유용할 것임을 이해할 것이다. 통상적으로, 무한 증식 세포주(예를 들어, 골수종 세포주)는 림프구와 동일한 포유동물 세포 종으로부터 유래된다. 예를 들어, 뮤린의 하이브리도마는 본 발명의 면역원성 제제로 면역화된 마우스로부터 유래하는 림프구와 무한 증식 마우스 세포주를 융합함으로써 제조될 수 있다. 바람직한 무한 증식 세포주로서는 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 함유하는 배양 배지("HAT 배지")에 감수성인 마우스 골수종 세포주가 있다. 다수의 골수종 세포주 중 임의의 것 예를 들어, P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 또는 Sp2/O-Ag14 골수종 세포주는 표준적인 기술에 따라서, 융합 파트너로서 사용될 수 있다. 이와 같은 골수종 세포주는 ATCC로부터 입수할 수 있다. 통상적으로, HAT-감수성 마우스 골수종 세포는 폴리에틸렌 글리콜("PEG")을 이용하여 마우스의 비장 세포에 융합된다. 이후, 이와 같은 융합으로 인하여 생성된 하이브리도마 세포는 융합되지 않았거나 비 증식적으로 융합된 골수종 세포를 사멸시키는(융합되지 않은 비장 세포는 형질 전환되지 않았으므로, 몇일 경과 후에 사멸함), HAT 배지를 사용하여 선별된다. 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는, 표준적인 ELISA 검정법을 통해서, 표적 항원과 결합하는 항체에 대하여 하이브리도마 배양 상청액을 스크리닝함으로써 검출된다.
재조합 항체
모노클로날 항체-분비 하이브리도마를 제조하는 방법의 대안으로서, 모노클로날 항체는 재조합 조합형 면역 글로불린 라이브러리(예를 들어, 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 표적 항원으로 스크리닝함으로써 동정 및 분리될 수 있으며, 그 결과, 표적 항원과 결합하는 면역 글로불린 라이브러리 일원을 분리할 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 생산 및 스크리닝하기 위한 키트는 시판되고 있다[예를 들어, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; 및 Stratagene SurfZAP™ Phage Display Kit, Catalog No. 240612]. 뿐만 아니라, 항체 디스플레이 라이브러리를 생산 및 스크리닝하는데 사용하기에 특히 적당한 시약과 방법의 예에 관하여는 예를 들어, 문헌[Ladner et al. 미국 특허 제 5,223,409호; Kang et al. PCT 국제 특허 공보 WO 92/18619; Dower et al. PCT 국제 특허 공보 WO 91/17271; Winter et al. PCT 국제 특허 공보 WO 92/20791; Markland et al. PCT 국제 특허 공보 WO 92/15679; Breitling et al. PCT 국제 특허 공보 WO 93/01288; McCafferty et al. PCT 국제 특허 공보 WO 92/01047; Garrard et al. PCT 국제 특허 공보 WO 92/09690; Ladner et al. PCT 국제 특허 공보 WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol. Biol. 226:889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res. 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982; 및 McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554]에 개시되어 있다.
키메라 항체 및 인간화 항체
인간의 것의 일부분과 인간 이외의 것의 일부분을 포함하며, 표준적인 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있는 재조합 항체 예를 들어, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
"인간화 면역 글로불린" 또는 "인간화 항체"란 용어는, 하나 이상의 인간화 면역 글로불린 또는 항체 사슬(즉, 하나 이상의 인간화 경쇄 및 중쇄)을 포함하는 면역 글로불린 또는 항체를 의미하는 것이다. "인간화 면역 글로불린 사슬" 또는 "인간화 항체 사슬"(즉, "인간화 면역 글로불린 경쇄" 또는 "인간화 면역 글로불린 중쇄")이란 용어는, 가변부를 가지는 면역 글로불린 또는 항체 사슬(즉, 경쇄 또는 중쇄)로서, 실질적으로 인간의 면역 글로불린 또는 항체로부터 유래하는 가변 틀 부위와, 실질적으로 비-인간 면역 글로불린 또는 항체로부터 유래하는 상보성 결정 부위(CDR)(예를 들어, 하나 이상의 CDR, 바람직하게는 2개의 CDR, 더욱 바람직하게는 3개의 CDR)를 포함하고, 또한 추가로 불변부(예를 들어, 경쇄의 경우에는, 하나 이상의 불변부 또는 이의 일부분, 그리고 중쇄의 경우에는 3개의 불변부)를 포함하는 것을 의미한다. "인간화 가변부"(예를 들어, "인간화 경쇄 가변부" 또는 "인간화 중쇄 가변부")란 용어는, 실질적으로 인간의 면역 글로불린 또는 항체로부터 유래하는 가변부 틀 부위와, 실질적으로 비-인간 면역 글로불린 또는 항체로부터 유래하는 상보성 결정 부위(CDR)를 포함하는 가변부를 의미하는 것이다.
"실질적으로 인간의 면역 글로불린 또는 항체로부터 유래하는" 또는 "실질적으로 인간의 것인"이란 어구는, 비교를 위하여 인간의 면역 글로불린 또는 항체의 아미노산 서열과 함께 배열하였을 때, 예를 들어, 보존적 치환, 공통 서열 치환, 생식 계열 치환 및 역 돌연 변이 등으로 인해, 인간 틀 부위 또는 불변부 서열과 특정 부위의 동일성(즉, 국소 서열 동일성)이 80∼90% 이상, 90∼95% 이상 또는 95∼99% 이상인 경우를 의미하는 것이다. 보존적 치환, 공통 서열 치환, 생식 계열 치환 및 역 돌연 변이 등을 도입하는 것을 종종 인간화 항체 또는 사슬의 "최적화"라고도 부른다. "실질적으로 비-인간 면역 글로불린 또는 항체로부터 유래하는" 또는 "실질적으로 비-인간의 것인"이란 어구는, 비-인간 유기체 예를 들어, 비-인간 포유동물과의 면역 글로불린 또는 항체 서열 동일성이 80∼95% 이상, 바람직하게는 90∼95% 이상, 더욱 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99%인 경우를 의미하는 것이다.
그러므로, 인간화 면역 글로불린 또는 항체, 또는 인간화 면역 글로불린 또는 항체 사슬의 모든 부위 또는 잔기들(CDR 제외)은, 하나 이상의 인간의 원래 면역 글로불린 서열의 상응하는 부위 또는 잔기들과 실질적으로 동일하다. "상응하는 부위" 또는 "상응하는 잔기"란 용어는, 비교를 위하여 첫 번째 서열과 두 번째 서열을 최적으로 정렬할 때, 첫 번째 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 상에 존재하는 부위 또는 잔기의 위치와 동일한(즉, 균등한) 위치에 존재하는, 두 번째 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 상의 부위 또는 잔기를 의미하는 것이다.
"유의적 동일성"이란 용어는, 2개의 폴리펩티드 서열을 예를 들어, 프로그램 GAP 또는 BESTFIT[디폴트 갭, 가중치 사용]에 의해 최적으로 정렬하였을 때, 서열 간 동일성이 50∼60% 이상, 바람직하게는 60∼70% 이상, 더욱 바람직하게는 70∼80% 이상, 더욱 바람직하게는 80∼90% 이상, 더더욱 바람직하게는 90∼95% 이상, 및 더더욱 바람직하게는 95% 이상(예를 들어, 99% 이상)인 경우를 의미하는 것이다. "실질적 동일성"이란 용어는, 2개의 폴리펩티드 서열을 예를 들어, 프로그램 GAP 또는 BESTFIT[디폴트 갭, 가중치 사용]에 의해 최적으로 정렬하였을 때, 서열 간 동일성이 80∼90% 이상, 바람직하게는 90∼95% 이상, 및 더욱 바람직하게는 95% 이상(예를 들어, 99% 이상)인 경우를 의미하는 것이다. 서열을 비교함에 있어서, 통상적으로 하나의 서열은 참조 서열(즉, 시험 서열이 비교되는 서열)로서의 역할을 한다. 서열 비교 알고리즘을 이용할 때, 시험 서열 및 참조 서열이 컴퓨터에 입력되고, 부분 서열 좌표가 지정되며, 또한 필요에 따라서는 서열 알고리즘 프로그램 매개 변수가 지정된다. 이후, 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 매개 변수를 바탕으로 하여, 참조 서열에 대한 시험 서열(들)의 서열 동일성%를 계산한다.
예를 들어, 국소 상동성 알고리즘[Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)], 상동성 정렬 알고리즘[Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)], 유사성 검색 방법[Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)], 이러한 알고리즘[GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI]의 컴퓨터화된 수행법, 또는 가시적 관찰[일반적으로, Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology 참조]에 의하여, 비교를 위한 서열의 최적 정렬이 수행될 수 있다. 서열 동일성%와 서열 유사성%를 측정하는데 적당한 알고리즘의 일례로서는 BLAST 알고리즘[Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403 (1990)]이 있다. BLAST 분석법을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명 공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통하여 공중이 이용 가능하게 되어 있다[국립 건강 NCBI 기구의 인터넷 서버를 통해 공중이 이용 가능함]. 통상적으로 디폴트 프로그램 매개 변수는 서열 비교를 수행하는데 사용될 수 있으나, 이 매개 변수는 임의로 설정할 수도 있다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트값으로서, 단어 길이 = 3 및 기대치(E) = 10, 그리고 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915(1985))를 이용한다.
바람직하게, 동일하지 않은 잔기 위치들은 보존적 아미노산 치환에 의하여 상이하다. 아미노산 치환을 보존적인 것 또는 비 보존적인 것으로 분류함에 있어서, 아미노산을 다음과 같이 구분한다: 제I군(소수성 측쇄): leu, met, ala, val, leu, ile; 제II군(중성의 친수성 측쇄): cys, ser, thr; 제III군(산성 측쇄): asp, glu; 제IV군(염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; 제V군(사슬의 배향에 영향을 미치는 잔기): gly, pro; 및 제VI군(방향성 측쇄): trp, tyr, phe. 보존적 치환은 동일한 군에 속하는 아미노산 사이에서 치환이 발생하는 경우이다. 비-보존적 치환은 이러한 군들 중 어느 하나의 군에 속하는 일원이 다른 군에 속하는 일원으로 바뀌는 경우이다.
바람직하게, 인간화 면역 글로불린 또는 항체는 상응하는 비-인간화 항체의 3배, 4배 또는 5배의 친화도로 항원과 결합한다. 예를 들어, 만일 비 인간화 항체의 결합 친화도가 10-9 M이면, 인간화 항체의 결합 친화도는 3×10-8 M 이상, 4×10-8 M 이상, 5×10-8 M 또는 10-9 M일 것이다. 면역 글로불린 사슬이 원 상태의 면역 글로불린 또는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)에 특이적 결합 특성 또는 결합 친화성을 부여할 때, 이 면역 글로불린 사슬은 "항원과 직접 결합한다"고 한다. 돌연 변이(예를 들어, 역 돌연 변이)가 원 상태의 면역 글로불린 또는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 결합 친화도에 영향을 미치면(예를 들어, 이 친화도를 감소시키면), 이 돌연 변이는 중쇄 또는 경쇄가 항원의 결합을 유도하는 능력에 실질적으로 영향을 미치는 것으로 간주되며, 이때 상기 사슬은 이러한 돌연 변이가 발생하지 않은 균등 사슬을 포함하는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 사슬보다 큰 사슬을 포함한다. 돌연 변이가 원 상태의 면역 글로불린 또는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 결합 친화도에 영향을 미치면(예를 들어, 이 친화도를 감소시키면), 이 돌연 변이는 사슬이 항원의 결합을 유도하는 능력에 "실질적으로 영향을 미치지 않는" 것으로 간주되며, 이때 상기 사슬은 이러한 돌연 변이가 발생하지 않은 균등 사슬을 포함하는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 사슬보다 2배, 3배 또는 4배 큰 사슬을 포함한다.
"키메라 면역 글로불린" 또는 "키메라 항체"란 용어는, 가변부가 첫 번째 종으로부터 유래하고, 불변부는 두 번째 종으로부터 유래하는 면역 글로불린 또는 항체를 의미하는 것이다. 키메라 면역 글로불린 또는 항체는 예를 들어, 유전자 조작에 의해, 상이한 종에 속하는 면역 글로불린 유전자 분절로부터 구성될 수 있다. "인간화 면역 글로불린" 또는 "인간화 항체"란 용어는, 이미 정의한 바와 같이, 키메라 면역 글로불린 또는 항체는 포함하지 않는 의미이다. 비록 인간화 면역 글로불린 또는 항체가 구성면에 있어서 키메라일지라도(즉, 단백질 중 하나 이상의 종류로부터 유래하는 부위를 포함할지라도), 이 면역 글로불린 또는 항체는 본원에 정의된 바와 같이, 키메라 면역 글로불린 또는 항체에서는 살펴볼 수 없는 부가의 특징(즉, 공여 CDR 잔기 및 수용 틀 잔기를 포함하는 가변부)을 포함한다.
이와 같은 키메라 및 인간화 모노클로날 항체는 당 업계에 공지된 재조합 DNA 기술 예를 들어, 문헌[Robinson et al. 국제 출원 PCT/US86/02269; Akira et al. 유럽 특허 출원 184,187; Taniguchi, M., 유럽 특허 출원 171,496; Morrison et al. 유럽 특허 출원 173,494; Neuberger et al. PCT 국제 공보 WO 86/01533; Cabilly et al. 미국 특허 제4,816,567호; Cabilly et al. 유럽 특허 출원 125,023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cane. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; 및 Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; Winter, 미국 특허 제5,225,539호; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; 및 Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060]에 개시된 방법에 의하여 제조될 수 있다.
트랜스게닉 동물로부터 유래한 인간 항체 및 파지 디스플레이
대안적으로, 면역화되었을 때, 내부적으로 면역 글로불린을 생산하지 않고 인간 항체의 전체 레파토리를 생산할 수 있는 트랜스게닉 동물(예를 들어, 마우스)을 생산할 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식 계열 돌연 변이 마우스 내 항체 중쇄 연결 부위(JH) 유전자를 동형 접합 결실시키면, 내부적으로 항체를 생산하는 것을 완전히 억제할 수 있다고 규명된 바 있다. 이와 같은 생식 계열 돌연 변이 마우스 내에 인간 생식 계열 면역 글로불린 유전자 어레이를 전이시키면, 항원 투입시 인간 항체가 생산된다. 예를 들어, 미국 특허 제6,150,584호; 미국 특허 제6,114,598호 및 미국 특허 제5,770,429호를 참조하시오.
완전히 인간의 것인 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리로부터 유래될 수도 있다[Hoogenboom et al, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991)]. 키메라 폴리클로날 항체도 또한 파지 디스플레이 라이브러리로부터 얻을 수 있다[Buechler et al. 미국 특허 제6,420,113호].
이중 특이적 항체 및 항체 컨쥬게이트
이중 특이적 항체(BsAbs)란, 2개 이상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성 인자를 가지는 항체이다. 이러한 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab)'2 이중 특이적 항체)로부터 유래할 수 있다. 이중 특이적 항체를 제조하는 방법에 관하여는 당 업계에 공지되어 있다. 전장 이중 특이적 항체의 통상의 제조 방법은, 2개의 사슬이 상이한 특이성을 가지는 경우, 2개의 면역 글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 공동 발현시키는 것에 기초한다[Millstein et al, Nature, 305:537-539 (1983)]. 면역 글로불린 중쇄 및 경쇄를 랜덤하게 분류하였기 때문에, 이와 같은 하이브리도마(쿼드로마(quadroma))는 상이한 항체 분자의 혼합물일 수 있는 혼합물을 생산한다[WO 93/08829 및 Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991) 참조].
이중 특이적 항체는 또한 가교 또는 "이종 컨쥬게이트" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종 컨쥬게이트인 항체 중 하나는 아비딘과 커플링될 수 있으며, 다른 하나의 항체는 바이오틴이나 기타 파트너와 커플링될 수 있다. 이종 컨쥬게이트 항체는 임의의 편리한 가교 방법에 의해 제조될 수 있다. 적당한 가교제에 관하여는, 다수의 가교 기술과 함께 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 이에 관하여는 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.
또 다른 구체예에서, 항체는 파트너 예를 들어, 반응성의, 검출 가능하거나 작용성인 부분 예를 들어, 면역 독소에 화학적 또는 유전적으로 컨쥬게이트화되어, 항체 컨쥬게이트를 생산할 수 있다. 이와 같은 파트너로서는 예를 들어, 면역 독소, 화학 요법제 및 방사성 동위 원소를 포함하며, 이들 모두는 당 업계에 널리 공지되어 있다.
항체 융합 단백질
본 발명에 사용되는, Fc 부위를 가지는 Aβ 결합 단백질은 Aβ와 결합할 수 있는 비-항체 단백질 또는 폴리펩티드에 융합된 항체의 최소한의 Fc 부분을 함유하는 융합 단백질일 수 있다. 그러므로, Aβ와 결합할 수 있고, Fc-관련 기능(예를 들어, 혈청 안정성 및 Fc 수용제 결합성 등)을 가지는 가용성 융합 단백질이 생산된다. 항체 융합 단백질(당 업계에서는 Fc 융합 단백질 또는 Ig 융합 단백질이라고도 칭함)은 표준적인 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조될 수 있으며, 이에 관하여는 당 업계에 공지되어 있다[예를 들어, 미국 특허 제5,116,964호, 미국 특허 제5,225,538호, 미국 특허 제5,336,603호 및 미국 특허 제5,428,130호(모두 Capon et al.)].
항 Aβ 항체
일반적으로, 본 발명의 항체로서는 Aβ 펩티드를 표적화함으로써, 아밀로이드 형성 질병 특히, 알츠하이머 병을 치료하기 위한 다양한 항체를 포함한다.
"Aβ 항체", "항Aβ 항체" 및 "항Aβ"란 용어는, 본원에서 호환되어 사용할 수 있는 것으로서, 인간의 아밀로이드 전구체 단백질(APP), Aβ 단백질 또는 이것들 둘 다의 하나 이상의 에피토프 또는 항원 결정기에 결합하는 항체를 의미한다. 대표적인 에피토프 또는 항원 결정기는 APP 내에서 발견될 수 있으나, 바람직하게는 APP의 Aβ 펩티드 내에서 발견될 수 있다. APP의 아형으로서는 다수의 것이 존재하는데, 그 예로서는 APP695, APP751 및 APP770이 있다. APP 내 아미노산에는 APP770 아형 서열에 따라서 번호가 메겨진다(예를 들어, GenBank 등록 번호 P05067). 현재 인간에 존재하는 것으로 알려져 있는 APP의 특정 아형의 예로서는 695번 아미노산 폴리펩티드[Kang et. al. (1987) Nature 325:733-736; "정상" APP로서 명명됨]; 751번 아미노산 폴리펩티드[Ponte et al. (1988) Nature 331:525-527 (1988) 및 Tanzi et al. (1988) Nature 331 :528-530]; 및 770번 아미노산 폴리펩티드[Kitaguchi et al. (1988) Nature 331 :530-532]가 있다. 상이한 시크리타제 효소에 의한 생체 내 또는 시험관 내 APP의 단백 분해의 결과로서, Aβ는 단형(short form)"(길이 = 40개의 아미노산) 및 "장형(long form)"(길이 = 42∼43개의 아미노산)과 같이 두 가지 형태로서 발견된다. 단형인 Aβ40은 APP의 672∼711번 아미노산으로 이루어져 있다. 장형 예를 들어, Aβ42 또는 Aβ43은 각각 672∼713번 아미노산 잔기 또는 672∼714번 아미노산 잔기로 이루어져 있다. APP의 소수성 도메인의 일부는 Aβ의 카복시 말단부에서 발견되며, 이는 특히, Aβ가 장형으로 존재하는 경우 응집되는 현상을 설명해 줄 수 있다. Aβ 펩티드는 인간 및 기타 포유동물 예를 들어, 정상 개체 및 아밀로이드 형성 질환을 앓고 있는 개체 둘 다의 체액 예를 들어, 뇌척수액에서 발견될 수 있거나 또는 이로부터 정제될 수 있다.
"β-아밀로이드 단백질", "β-아밀로이드 펩티드", "β-아밀로이드", "Aβ" 및 "Aβ 펩티드"라는 용어는, 본원에서 호환되어 사용된다. Aβ 펩티드(예를 들어, Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 및 Aβ43)는 APP의 39∼43개의 아미노산으로 이루어진 내부 단편(약 4kDa)이다. 예를 들어, Aβ40은 APP의 672∼711번 잔기로 이루어져 있으며, Aβ42는 APP의 672∼713번 잔기로 이루어져 있다. Aβ 펩티드는 APP를 시크리타제로 절단하여 생성된 펩티드와, 이 절단 생성물과 동일한 서열 또는 본질적으로 동일한 서열을 가지는 합성 펩티드를 포함한다. Aβ 펩티드는 다양한 공급원 예를 들어, 조직, 세포주 또는 체액(예를 들어, 혈청 또는 뇌척수액)으로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, Aβ는 APP-발현 세포 예를 들어, APP717V →F로 안정하게 형질 감염된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포로부터 유래할 수 있다[예를 들어, Walsh et al. (2002), Nature, 416, pp 535-539 참조]. Aβ 제제는 전술한 바와 같은 방법을 사용하여 조직 공급원으로부터 유래될 수 있다[예를 들어, Johnson-Wood et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1550 참조]. 대안적으로, Aβ 펩티드는 당 업계에 널리 공지된 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Fields et al., Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W.H. Freeman & Co., New York, NY, 1992, p 77]을 참조하시오. 그러므로, 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템즈 펩티드 신디사이저(Applied Biosystems Peptide Synthesizer) 모델 430A 또는 431 상에서, 측쇄 보호 아미노산을 이용하여 α-아미노기가 t-Boc 또는 F-moc 화학 물질로 보호된 펩티드는, 자동화 메리필드 고상 합성 기술(automated Merrifield techniques of solid phase synthesis)을 사용하여 합성될 수 있다. 긴 펩티드 항원은 널리 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 또는 융합 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 합성 또는 분자 클로닝되어, 적당한 숙주 세포를 통한 형질 감염 및 이종 발현용으로서 적당한 발현 벡터 내에 삽입될 수 있다. Aβ 펩티드란, 또한 정상 유전자의 Aβ 부위 내 돌연 변이로부터 유도된 관련 Aβ 서열을 의미한다.
Aβ 항체가 결합하는 대표적인 에피토프 또는 항원 결정기는 인간의 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 내에서 발견될 수도 있으나, APP의 Aβ 펩티드 내에서 발견되는 것이 바람직하다. Aβ 내 대표적인 에피토프 또는 항원 결정기는 Aβ의 N-말단부, 중심 부위 또는 C-말단부 내에 위치한다. "N-말단 에피토프"는 Aβ 펩티드의 N-말단부 내에 위치하거나 또는 이를 포함하는 항원 결정기 또는 에피토프이다. 대표적인 N-말단 에피토프는 Aβ의 1∼10번 또는 1∼12번 아미노산, 바람직하게는 Aβ42의 1∼3, 1∼4, 1∼5, 1∼6, 1∼7, 2∼6, 2∼7, 3∼6 또는 3∼7번 아미노산에 존재하는 잔기들을 포함한다. 기타 대표적인 N-말단 에피토프는, Aβ의 1∼3번 잔기에서 시작되어, 7∼11번 잔기에서 끝난다. 부가의 대표적인 N-말단 에피토프는 Aβ의 2∼4, 5, 6, 7 또는 8번 잔기, Aβ의 3∼5, 6, 7, 8 또는 9번 잔기, 또는 Aβ42의 4∼7, 8, 9 또는 10번 잔기를 포함한다. "중심 에피토프"는 Aβ 펩티드의 중심 또는 중간 부위 내에 위치하는 잔기들을 포함하는 에피토프 또는 항원 결정기이다. 대표적인 중심 에피토프는, Aβ의 13∼28번 아미노산 내에 존재하는 잔기, 바람직하게는 Aβ의 14∼27, 15∼26, 16∼25, 17∼24, 18∼23 또는 19∼22번 아미노산 내에 존재하는 잔기를 포함한다. 기타 대표적인 중심 에피토프는 Aβ의 16∼24, 16∼23, 16∼22, 16∼21, 18∼21, 19∼21, 19∼22, 19∼23 또는 19∼24번 아미노산 내에 존재하는 잔기들을 포함한다. "C-말단" 에피토프 또는 항원 결정기는 Aβ 펩티드의 C-말단부 내에 위치하거나 또는 이를 포함하는 에피토프 또는 항원 결정기로서, 그 예로서는 Aβ의 33∼40, 33∼41 또는 33∼42번 아미노산 내에 존재하는 잔기들을 포함한다. "C-말단 에피토프"는 Aβ 펩티드의 C-말단부 내에 위치하는 잔기들(예를 들어, Aβ의 약 30∼40개의 아미노산 또는 약 30∼42개의 아미노산)을 포함하는 에피토프 또는 항원 결정기이다. 부가의 대표적인 C-말단 에피토프 또는 항원 결정기로서는 Aβ의 33∼40번 또는 33∼42번 잔기들을 포함한다.
항체가 특정의 잔기 예를 들어, Aβ의 3∼7번 잔기 내에 존재하는 에피토프와 결합한다는 의미는, 이 항체가 특정의 잔기들(즉, 이 예에서는 Aβ의 3∼7번 잔기)을 함유하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다는 의미이다. 이와 같은 항체는 Aβ의 3∼7번 잔기 모두에 반드시 결합하는 것은 아니다. 뿐만 아니라, 이 Aβ 3∼7번 잔기에 단일 아미노산이 치환되었거나 결실이 일어난다고 하여, 반드시 결합 친화도에 상당한 영향을 미치는 것도 아니다. 다양한 구체예에서, Aβ 항체는 말단부-특이적인 항체이다. 본원에 사용된 "말단부-특이적"이란 용어는, 항체가 Aβ 펩티드의 N-말단부 또는 C-말단부 잔기에 특이적으로 결합하되, 더 많은 수의 잔기들을 포함하는 긴 Aβ 종 또는 APP로서 존재할 경우에는 동일한 잔기를 인지하지 않는 항체를 의미하는 것이다. 다양한 구체예에서, Aβ 항체는 "C-말단-특이적"인 항체이다. 본원에 사용된 "C 말단-특이적"이란 용어는, 항체가 Aβ 펩티드의 유리 C-말단부를 특이적으로 인지하는 경우를 의미하는 것이다. C 말단부-특이적 Aβ 항체의 예로서는, 40번 잔기에서 끝나는 Aβ 펩티드를 인지하되, 41, 42 및/또는 43번 잔기에서 끝나는 Aβ 펩티드는 인지하지 않는 항체; 42번 잔기에서 끝나는 Aβ 펩티드는 인지하되, 40, 41 및/또는 43번 잔기에서 끝나는 Aβ 펩티드는 인지하지 않는 항체를 포함한다.
하나의 구체예에서, Aβ 항체는 3D6 항체 또는 이의 변이체, 또는 10D5 항체 또는 이의 변이체, 또는 문헌[미국 특허 공보 20030165496A1, 미국 특허 공보 20040087777A1, 국제 특허 공보 WO 02/46237A3 및 국제 특허 공보 WO 04/080419A2]에 개시된 바와 같이 이들 두 가지 경우 모두일 수 있다. 3D6 및 10D5 항체에 관하여는 또한 예를 들어, 문헌[국제 특허 공보 WO 02/088306A2 및 국제 특허 공보 WO 02/088307A2]에 개시되어 있다. 부가의 3D6 항체에 관하여는 문헌[미국 특허 출원 제11/303,478호 및 국제 출원 PCT/US05/45614]에 개시되어 있다. 3D6은 인간의 β-아밀로이드 펩티드 특히, 1∼5번 잔기에 위치하는 N-말단 에피토프에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체(mAb)이다. 이와는 대조적으로, 10D5는 인간 β-아밀로이드 펩티드 특히, 3∼6번 잔기에 위치하는 N-말단 에피토프에 특이적으로 결합하는 mAb이다. 3D6 모노클로날 항체(RB96 3D6.32.2.4)를 생산하는 세포주는 미국 모식균 배양 수집소(ATCC)(Manassas, VA 20108, USA)에 2003년 4월 8일자로 부다페스트 조약에 다라서 수탁 번호 PTA-5130으로서 기탁되어 있다. 10D5 모노클로날 항체(RB44 10D5.19.21)를 생산하는 세포주는 ATCC에 2003년 4월 8일자로 부다페스트 조약에 따라서 수탁 번호 PTA-5129로서 기탁되어 있다.
대표적인 변이체 3D6 항체는 예를 들어, 서열 번호 3 및 서열 번호 5에 제시된 바와 같은 가변부 아미노산 서열을 포함하는 인간화 경쇄와, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 제시된 바와 같은 가변부 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄를 가지는 항체이다. 기타 대표적인 변이체 3D6 항체는 예를 들어, 서열 번호 7에 제시된 바와 같은 인간화 경쇄 아미노산 서열과, 서열 번호 8에 제시된 바와 같은 인간화 중쇄 아미노산 서열을 가지는 항체이다.
대표적인 변이체 10D5 항체는 예를 들어, 서열 번호 9 또는 서열 번호 11에 제시된 바와 같은 가변부 아미노산 서열을 포함하는 인간화 경쇄와, 서열 번호 10 또는 서열 번호 12에 제시된 바와 같은 가변부 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄를 가지는 항체이다. 기타 대표적인 변이체 10D5 항체는 예를 들어, 서열 번호 13에 제시된 인간화 경쇄 아미노산 서열과, 서열 번호 14에 제시된 인간화 중쇄 아미노산 서열을 가지는 항체이다. 이러한 변이체 항체에 관하여는 WO 02/088307 A2에 추가로 개시되어 있다.
다른 구체예에서, 항체는 미국 특허 공보 20040082762 A1 및 국제 특허 공보 WO 03/077858 A2에 개시된 바와 같은 12B4 항체 또는 이의 변이체일 수 있다. 12B4는 인간의 β-아밀로이드 펩티드 특히, 이것의 3∼7번 잔기에 위치하는 N-말단 에피토프에 특이적으로 결합하는 mAb이다.
대표적인 변이체 12B4 항체는 예를 들어, 서열 번호 15 또는 서열 번호 17에 제시된 바와 같은 가변부 아미노산 서열을 포함하는 인간화 경쇄(또는 경쇄)와, 서열 번호 16, 서열 번호 18 또는 서열 번호 19에 제시된 바와 같은 가변부 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄를 가지는 항체이다.
또 다른 구체예에서, 항체는 미국 특허 공보 20050118651 A1 및 미국 특허 출원 제11/303,478호, 국제 특허 공보 WO 04/108895A2 및 국제 특허 출원 PCT/US05/45614에 개시된 바와 같은 12A11 항체 또는 이의 변이체일 수 있다. 12A11은 인간의 β-아밀로이드 펩티드 특히, 이것의 3∼7번 잔기에 위치하는 N-말단 에피토프에 특이적으로 결합하는 mAb이다. 이 12A11 모노클로날 항체를 생산하는 세포주는 ATCC에 2005년 12월 13일자로, 부다페스트 조약에 따라서 수탁 번호 PTA-7271로서 기탁되어 있다.
대표적인 변이체 12A11 항체는 예를 들어, 서열 번호 20에 제시된 바와 같은 가변부 아미노산 서열을 포함하는 인간화 경쇄와, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 또는 서열 번호 41에 제시된 바와 같은 가변부 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄를 포함하는 항체이다.
또 다른 구체예에서, 항체는 미국 특허 출원 제11/305,899호 및 국제 출원 PCT/US05/45860에 개시된 바와 같은 6C6 항체 또는 이의 변이체일 수 있다. 6C6은 인간의 β-아밀로이드 펩티드 특히, 이것의 3∼7번 잔기에 위치하는 N-말단 에피토프에 특이적으로 결합하는 mAb이다. 이 6C6 모노클로날 항체를 생산하는 세포주는 ATCC에 2005년 11월 1일자로, 부다페스트 조약에 따라서 수탁 번호 PTA-7200으로서 기탁되어 있다.
또 다른 구체예에서, 항체는 미국 특허 출원 제11/305,899호 및 국제 출원 PCT/US05/45860에 개시된 바와 같은 2H3 항체일 수 있다. 2H3은 인간의 β-아밀로이드 펩티드 특히, 이것의 2∼7번 잔기에 위치하는 N-말단 에피토프에 특이적으로 결합하는 mAb이다.
또 다른 구체예에서, 항체는 미국 특허 출원 제11/305,899호 및 국제 출원 PCT/US05/45860에 개시된 바와 같은 3A3 항체일 수 있다. 3A3은 인간의 β-아밀로이드 펩티드 특히, 이것의 3∼7번 잔기에 위치하는 N-말단 에피토프에 특이적으로 결합하는 mAb이다.
ATCC 수탁 번호가 각각 PTA-7267 및 PTA-7269인, 항체 2H3 및 3A3을 생산하는 세포주는 2005년 12월 13일자로 부다페스트 조약에 따라서 기탁되었다.
또 다른 구체예에서, 항체는 미국 특허 출원 제11/304,986호 및 국제 특허 출원 PCT/US05/45515[발명의 명칭:"Humanized Antibodies that Recognize Beta Amyloid Peptide"]에 개시된 바와 같은 15C11 항체 또는 이의 변이체일 수 있다. 15C11은 인간의 β-아밀로이드 펩티드 특히, 이것의 19∼22번 잔기에 위치하는 중심 에피토프에 특이적으로 결합하는 mAb이다. 이 15C11 모노클로날 항체를 생산하는 세포주는 ATCC에 2005년 12월 13일자로, 부다페스트 조약에 따라서 수탁 번호 PTA-7270으로서 기탁되어 있다.
또 다른 구체예에서, 항체는 미국 특허 공보 20050249725 A1 및 국제 출원 공보 WO 01/62801 A2에 개시된 바와 같은 266 항체일 수 있다. 266은 인간의 β-아밀로이드 펩티드 특히, 이것의 16∼24번 잔기에 위치하는 중심 에피토프에 특이적으로 결합하는 mAb이다. 이 266 모노클로날 항체를 생산하는 세포주는 ATCC에 2004년 7월 20일자로, 부다페스트 조약에 따라서 수탁 번호 PTA-6123으로서 기탁되어 있다.
대표적인 변이체 266 항체는 예를 들어, 서열 번호 42 또는 서열 번호 44에 제시된 바와 같은 가변부 아미노산 서열을 포함하는 인간화 경쇄와, 서열 번호 43 또는 서열 번호 45에 제시된 바와 같은 가변부 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄를 가지는 항체이다. 기타 대표적인 변이체 266 항체는 예를 들어, 서열 번호 46에 제시된 인간화 경쇄 아미노산 서열과, 서열 번호 47에 제시된 인간화 중쇄 아미노산 서열을 가지는 항체이다. 이러한 변이체 항체에 관하여는 미국 특허 출원 제20050249725 A1 및 국제 특허 공보 WO 01/62801 A2에 개시되어 있다.
또 다른 구체예에서, 항체는 미국 특허 출원 제11/305,899호 및 국제 특허 출원 PCT/US05/45860[발명의 명칭:"Aβ Antibodies for Use in Improving Cognition"]에 개시된 바와 같은 2B1 항체 또는 이의 변이체일 수 있다. 2B1은 인간의 β-아밀로이드 펩티드 특히, 이것의 19∼23번 잔기에 위치하는 중심 에피토프에 특이적으로 결합하는 mAb이다.
또 다른 구체예에서, 항체는 미국 특허 출원 제11/305,899호 및 국제 특허 출원 PCT/US05/45860[발명의 명칭:"Aβ Antibodies for Use in Improving Cognition"]에 개시된 바와 같은 1C2 항체 또는 이의 변이체일 수 있다. 1C2는 인간의 β-아밀로이드 펩티드 특히, 이것의 16∼23번 잔기에 위치하는 중심 에피토프에 특이적으로 결합하는 mAb이다.
또 다른 구체예에서, 항체는 미국 특허 출원 제11/304,986호 및 국제 특허 출원 PCT/US05/45515에 개시된 바와 같은 9G8 항체 또는 이의 변이체일 수 있다. 9G8은 인간의 β-아밀로이드 펩티드 특히, 이것의 16∼21번 잔기에 위치하는 중심 에피토프에 특이적으로 결합하는 mAb이다.
항체 2B1, 1C2 및 9G8을 생산하는 세포주는 2005년 11월 1일자로 ATCC에 부다페스트 조약에 따라서, 각각 수탁 번호 PTA-7202, PTA-7199 및 PTA-7201로 기탁되어 있다.
본 발명에 사용되는, 인간의 β-아밀로이드 펩티드 내에 위치하는 C-말단 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체로서는 미국 특허 제5,786,180호[발명의 명칭:"Monoclonal antibody 369.2B specific for β A4 peptide."]에 개시된 바와 같은 369.2B를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 사용되는 항체에 관한 부연 설명은 예를 들어, 문헌[Bussiere et al. Am. J. Pathol. 165(3):987-95 (2004), Bard et al. PNAS 100(4):2023-8 (2003), Kajkowski et al. J. Biol. Chem. 276(22): 18748-56 (2001), Games et al. Ann. NY Acad. Sci. 920:274-84 (2000), Bard et al. Nat. Med. 6(8):916-9 (2000), 및 국제 특허 출원 WO 03015691 A2(발명의 명칭:"Effecting rapid improvement of cognition in a subject having Alzheimer's disease, Down's syndrome, cerebral amyloid angiopathy, or mild cognitive impairment, comprises administering anti-A beta antibody"]에서 살펴볼 수 있다. 본 발명에 사용되는 항체 단편에 대한 부연 설명은 예를 들어, 문헌[Bales et al.(Abstract P4-396, page S587, presented at Poster Session P4: Therapeutics and Therapeutic Strategies-Therapeutic Strategies, Amyloid-Based) 및 Zameer et al. (Abstract P4-420, page S593, presented at Poster Session P4: Therapeutics and Therapeutic Strategies-Therapeutic Strategies, Amyloid-Based]에서 살펴볼 수 있다.
본 발명에 사용되는 항체는 재조합적으로 또는 합성에 의하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체는 재조합 세포 배양 방법 예를 들어, CHO 세포, NIH 3T3 세포, PER.C6? 세포, NS0 세포, VERO 세포, 닭 배아 섬유 아세포 또는 BHK 세포를 이용하는 방법에 의해 생산될 수 있다. 뿐만 아니라, Aβ 펩티드와 결합하는 1차적인 기능상의 특성을 보유하는, 최소한의 변형이 일어난 항체도 본 발명에 의해 고려된다. 바람직한 구체예에서, 항체는 Aβ 펩티드에 선택적으로 결합하는 인간화 항Aβ 펩티드 3D6 항체이다. 더욱 구체적으로, 인간화 항Aβ 펩티드 3D6 항체는, 예를 들어, (예를 들어, 알츠하이머 병 환자) 뇌 속의 플라크 침적물 내에서 발견되는 인간 β-아밀로이드의 1-40 또는 1-42 펩티드에 존재하는 1∼5번 아미노산 잔기와 같은 NH2-말단 에피토프에 특이적으로 결합하도록 디자인된다.
대표적인 인간화 항Aβ 펩티드 항체는 인간화 3D6 버젼 2(h3D6v2)이다. 상응하는 발현 벡터의 DNA 서열로부터 유래하는 것으로 예상되는 h3D6v2 경쇄 및 중쇄의 완전한 아미노산 서열을 도 1(잔기의 번호는, 경쇄 및 중쇄의 NH2-말단부를 잔기 번호 1로 시작하여 메김) 및 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 각각 나타내었다. 중쇄 DNA 서열에 의해 암호화되는 마지막 아미노산 잔기인 Lys449은 h3D6v2의 성숙한 분비형으로서 관찰되지는 않지만, 어떠한 이론에도 국한되지 않았을 때, 이 잔기는 CHO 세포의 단백질 분해 효소에 의해 세포 내 가공 과정 중에 제거되는 것으로 예측된다. 그러므로, h3D6v2 중쇄의 COOH-말단부는 Gly448일 수도 있다. COOH-말단 리신 가공 과정은 재조합 및 혈장-유래 항체에서 일어나는 것으로 관찰되고 있으며, 또한 이 항체의 기능에는 영향을 주지 않는 것으로 파악된다[Harris (1995) J. Chromatogr. A. 705:129-134]. 정제된 h3D6v2는 N-결합 글리칸이 중쇄의 Fc 부분에 부가됨으로 인하여 번역 후 변형된 것으로서, 단일 N-글리코실화 공통 위치를 함유하는 것으로 알려져 있다. 상기 N-글리코실화 위치는 3개의 주요 복합 바이안테너리(biantennary) 중성 올리고당 구조[일반적으로 포유 동물 IgG 단백질의 N-글리코실화 위치와 유사한 위치에서 관찰됨]를 나타낸다.
기타 대표적인 인간화 항 Aβ 펩티드 항체로서는, 도 1에 제시한 서열을 가지되, 다만, 경쇄의 1번 위치에 있는 D가 Y로 치환되고, 중쇄의 75번 위치(캐벗 번호 메김 방식에 따르는 경우에는 74번 위치)에 있는 S가 A로 치환되었으며, 중쇄의 78번 위치(캐벗 번호 메김 방식에 따르는 경우에는 77번 위치)에 있는 T가 S로 치환되었으며, 또한 중쇄의 93번 위치(캐벗 번호 메김 방식에 따르는 경우에는 89번 위치)에 있는 V가 L로 치환된, 인간화 3D6 버젼 1(h3D6v1) 항체가 있다.
본 발명의 다양한 측면 및 구체예에 관하여는 이하 실시예를 통해 부연적으로 기술될 것이다. 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지, 한정하기 위한 것이 아니다.
이하의 실시예는 오로지 예시의 목적으로 제공되는 것이다. 실시예에서는 2개의 상이한 항-Aβ 모노클로날 항체를 사용한다. 6회의 별도 실험에 관하여 기술하고 있는데, 각각의 실험에서는 항체 및 불순물 제거를 함께 수행하였다.
재료 및 방법
일반적으로, 본 발명의 수행을 위해서는, 별도의 언급이 없는 한, 종래의 화학적 기술, 분자 생물학적 기술, 재조합 DNA 기술, 면역학적 기술(특히, 예를 들어, 면역 글로불린 기술) 및 표준적인 전기 영동 기술을 사용하였다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al. C.S.H.L. Press, Pub. (1999); Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons (1992). Bousse et al. Protein Sizing on a Microchip, Anal.Chem. 73, 1207-1212 (2001); Knapp et al. Commercialized and Emerging Lab-on-a-Chip Applications; In: Proceedings of the μTAS 2001 Symposium, Ramsey, J.M. & van den Berg, A., 7-10 (2001); 및 Mhatre et al. Strategies for locating disulfide bonds in a monoclonal antibody via mass spectrometry, Rapid Commun.Mass Spectrom, 13 (24) 2503-2510 (1999)]을 참조하시오.
표적 항체의 생산
표적 항체는 예를 들어, 현탁 배양액에서 생육한 재조합 포유동물 세포주를 이용하여 생산될 수 있다. 생산용 생물 반응기 내에서 목적 항체를 함유하는 컨디셔닝 배지를 제작한다. 결과로 생성된 생성물은 적당한 정제 단계 예를 들어, 미세 여과 단계 및 0.22㎛ 여과 단계 또는 원심 분리 단계, 또는 패드 여과 단계 및 0.22㎛ 여과 단계를 통하여 정제된다.
표적 항체의 정제
본원에 예시된 표적 모노클로날 항체(AAB 또는 12A11)의 정제 방법은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 상에 표적 분자를 포획시키는 단계로 이루어져 있다. 이 단계에서는 rmp 단백질 A 세파로스™ 급류, 단백질 A 세파로스™ 급류, 또는 맵셀렉트(mAbSelect) 단백질 A를 사용할 수 있다. 이후, 이 수지를 각 실험에 기술된 바와 같이 세척하고, 생성물을 용리한 다음, 불순물 수준을 테스트한다.
표적 항체의 분석
역상 HPLC(RP-HPLC)를 사용하여 AAB 모노클로날 항체 시료 중에 존재하는 IRT의 양을 정량하였다. 크기별 배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography; SEC-HPLC)를 사용하여 단량체 단백질(단량체 IgG), 고 분자량 종(HMW) 및 저 분자량 종(LMW)의 비율을 측정하였다. 변성 SEC-HPLC 분석법을 수행하여, 시료 중 디설파이드 결합 부족(UDB) 종의 상대량을 측정하였다. 테스트 시료 중 HCP의 수준은 효소-결합 면역 흡착 검정법(ELISA)을 이용하여 측정하였다.
분석용 검정법: IRT & UDB
역상 HPLC ( AAB IRT 분석법)
RP-HPLC를 다음과 같이 수행하였다. 각 시료를 2.5 mM의 DTT 존재 하에서, 60분 동안 40℃에서 항온 처리함으로써, 이들 시료의 디설파이드 결합을 환원시켰다. 각 시료를 5.5 mM의 요드화아세트산의 존재 하에 실온에서 항온 처리함으로써, 이들 시료를 알킬화하였다. 환원 및 알킬화시킨 후, 모든 시료에 1 M의 DTT를 5㎕ 첨가하여 시료들을 급랭시켰다. 이 검정법에 대한 정량화의 한계는 0.5%로 한다. 각각의 환원 및 알킬화된 시료들을 약 40㎍씩 취하여, 이를 POROS R1/H RP-HPLC 컬럼에 주입하고, 이를 다음과 같은 조건 하에서 70분 동안 전개시켰다:
컬럼: Poros R1/H RP-HPLC
컬럼 온도: 50℃;
이동 상 A: 수중 0.1% TFA(w/v);
이동 상 B: 95% 아세토니트릴 중 0.1% TFA(w/v);
유속: 1.0 ㎖/분
검출 파장: 217㎚
전개 시간: 70분
주입: 40 ㎍씩 3회 주입
구배 시간은 이하 표 1에 나열하였다.
RP-HPLC 방법에 있어서의 구배 시간
구배 시간 A% B%
0∼1 95 5
2 70 30
54 60 40
55.1∼70 95 5
dSEC - HPLC ( AAB UDB 분석)
변성 SEC-HPLC를 다음과 같이 수행하였다. 변성 SEC 검정용 시료의 전처리 과정에는, 시약/시료의 혼합물[최종 농도 200㎍/㎖의 단백질, 구아니딘 HCl = 3 M, 및 100 mM Tris(pH7.4)]을 사용한다. 시료를 뒤집어가며 혼합하면서 80℃에서 20분 동안 가열하였다. 이 검정법에 있어서는, UDB 수준을 고려 대상에서 제외할 수 있도록 2개의 대조군을 사용하였다. (UDB 수준이 낮고 높은) 내부 참조 기준들을 대조군으로서 사용하였다.
크로마토그래피/검정 조건은 다음과 같았다:
컬럼: Tosoh BioSep G3000 SW×1
컬럼 온도: 상온
이동 상: 3 M 구아니딘 HCl, 25 mM NaPO4, pH 6.8
구배: 일정
유속: 0.5㎖/분
검출 파장: 280㎚
전개 시간: 50분
주입: 50㎕(10㎍)씩 3회 주입
실시예 1: IRT 가 제거되었는지 여부에 대한 세척 완충액의 비교
본 실시예에서는, 항-Aβ 모노클로날 항체 AAB를 함유하는 불순 용액을, 단백질 A 컬럼 상에 흡착시킨 후, 이 컬럼을 CaCl2, MgCl2, NaCl 또는 프로필렌 글리콜을 함유하는 세척 완충액으로 1차 세척하여 정제하였다.
GE 헬스케어(GE Healthcare)의 AKTA FPLC 크로마토그래피 시스템과 연결되어 있는 rmp 단백질 A 세파로스™ FF 컬럼(8.9㎖)를 사용하여, 이 모노클로날 항체를 함유하는 배양액을 소규모로 정제하였다. 실험 1에 기술되어 있는 rmp 단백질 A 세파로스™ FF 크로마토그래피의 모든 단계에 있어서, 다음과 같은 조건을 적용하였다(예외 사항은 각각의 실험에 관한 설명에 제시함).
컬럼 치수: 1.0㎝ × 11.4㎝
작동 유속: 150㎝/시간
평형 완충액 1: 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5(5 컬럼 부피)
플러시액(Flush): 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5(1 컬럼 부피)
세척액 1: 1번 전개액(세척액 1은 함유하지 않음)을 제외하고는 다양할 수 있음(표 2 참조).
세척액 2: 20 mM Tris, 1.0 M NaCl, pH 7.5(5 컬럼 부피)
세척액 3: 10 mM Tris, 75 mM NaCl, pH 7.5(7 컬럼 부피)
용리액: 50 mM 글리신, 75 mM NaCl, pH 3.1(6 컬럼 부피)
스트립액(Strip) 1: 20 mM 시트르산 나트륨, pH 2.7(5 컬럼 부피)
스트립액 2: 6 M 구아니딘 HCl(2 컬럼 부피)
스트립 세척액: 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5(5 컬럼 부피)
보관액: 16% 에탄올(5 컬럼 부피)
전개 온도: 2℃∼8℃
5 컬럼 부피의 20 mM Tris 및 150 mM NaCl(pH 7.5)을 사용하여 상기 rmp 단백질 A 세파로스™ FF 컬럼 전개액을 평형화시켰다. 이 컬럼에 수지 1㎖당 약 10㎎의 생성물의 유속으로 로딩하였다. 로딩은 다음과 같이 하였다: 1 컬럼 부피의 플러시액과 평형화 완충액 → 5 컬럼 부피의 세척 용액 1. 테스트된 모든 세척 용액 1을 이하 표 2에 요약하였다. 세척액 1은 1번 전개액을 제외한 모든 전개액에 포함시켰다. 세척액 1 로딩 후, 5 컬럼 부피의 20 mM Tris, 1.0 M NaCl(pH 7.5) 및 7 컬럼 부피의 10 mM Tris, 75 mM NaCl(pH 7.5)을 로딩하였다. 이 컬럼으로부터 50 mM 글리신, 75 mM NaCl(pH 3.1)과 함께 모노클로날 항체가 용리되었다. 이후, 2 M Tris(pH 8.5)를 사용하여 생성물 풀을 pH 7.9∼8.1로 중화시켰다. 이후, 이 컬럼을 스트립핑, 세척 및 보관하였다. 표 2에는 다양한 전개시 생성된 생성물 풀 중에 존재하는 IRT 종과 LMW의 수준이 나열되어 있다. 염화마그네슘 및 염화칼슘 세척액 중 IRT 및 LMW 종의 수준은 감소하였다.
다양한 세척 완충액 1에 있어서 IRT 및 LMW 수치
전개액 번호 조성 LMW % IRT %
1 대조군(세척액 1 불포함) 4.4 2.5
2 20% 프로필렌 글리콜(pH 7.5) 4.7 2.5
3 50 mM Tris, 2.0 M 염화마그네슘(pH 7.5) 1.6 1.5
4 50 mM Tris, 2.5 M 염화마그네슘(pH 7.5) 1.5 1.3
5 50 mM 아세트산염, 2.0M 염화마그네슘(pH 4.5) 0.9 0.8
6 50 mM Tris, 4.0 M 염화나트륨(pH 7.5) 4.4 2.5
7 50 mM Tris, 2.0 M 염화칼슘(pH 7.5) 1.8 1.4
8 50 mM Tris, 2.5 M 염화칼슘(pH 7.5) 0.8 0.8
상기 결과들을 통하여, 염화마그네슘과 염화칼슘 함유 세척액 중 IRT 및 LMW 종의 수준은 감소 한 반면에, 염화나트륨 및 프로필렌 글리콜 함유 세척액 중 IRT 및 LMW 종의 수준은 감소하지 않았음을 알 수 있었다.
실시예 2: IRT 제거를 위해 CaCl 2 세척액을 사용하는 단백질 A 크로마토그래피
본 실시예에서는, IRT 종을 제거하기 위하여 CaCl2 세척액을 사용하는 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 더욱 큰 규모의 항체 정제를 수행하였다.
밀리포어 K-프라임 400(Millipore K-Prime 400) 크로마토그래피 시스템에 연결되어 있는 맵셀렉트(MabSelect) 단백질 A 컬럼(2.4ℓ)을 사용하여 모노클로날 항체를 함유하는 배양액을 시험적 규모로 정제하였다. 이하에 기술한 바와 같이, 맵셀렉트 전개를 2회 실시하였다.
컬럼 치수: 13㎝ × 18㎝
작동 유속: 150 ㎝/시간, 300 ㎝/시간
평형액 1: 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5(5 컬럼 부피)
플러시액: 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5(2 컬럼 부피)
세척액 1: 50 mM Tris, 2 M CaCl2, pH 7.5[전개액 1, 다만, 전개액 2는 세척액 1을 함유하지 않음]
세척액 2: 20 mM Tris, 1.0 M NaCl, pH 7.5(5 컬럼 부피)
세척액 3: 10 mM Tris, 75 mM NaCl, pH 7.5(5 컬럼 부피)
용리액: 50 mM 글리신, 25 mM NaCl, pH 3.1(6 컬럼 부피)
스트립액 1: 50 mM 글리신, 0.5 M NaCl, pH 2.7(5 컬럼 부피)
스트립액 2: 6 M 구아니딘 HCl(2 컬럼 부피).
스트립 세척액: 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5(5 컬럼 부피)
보관액: 16% 에탄올(5 컬럼 부피)
전개 온도: 2℃∼8℃
5 컬럼 부피의 20 mM Tris 및 150 mM NaCl(pH 7.5)을 사용하여 상기 맵셀렉트 단백질 A 컬럼을 평형화시켰다. 이후, 이 컬럼에 수지 1㎖당 약 10㎎의 생성물의 유속으로 로딩하였다. 로딩은 다음과 같이 하였다: 2 컬럼 부피의 플러시액과 평형화 완충액 → 5 컬럼 부피의 세척 용액 1. 세척 용액 1은 50 mM Tris, 2.0 M CaCl2(pH 7.5)을 포함하였다[전개액 1, 다만, 전개액 2는 세척액 1을 함유하지 않음] . 세척액 1 로딩 후, 5 컬럼 부피의 50 mM Tris, 1.0 M NaCl(pH 7.5) 및 5 컬럼 부피의 10 mM Tris, 75 mM NaCl(pH 7.5)를 로딩하였다. 이 맵셀렉트 단백질 A 컬럼으로부터 50 mM 글리신, 25 mM NaCl(pH 3.1)과 함께 모노클로날 항체가 용리되었다. 이후, 2 M Tris(pH 8.5)를 사용하여 생성물 풀을 pH 7.8∼8.2로 중화시켰다. 이후, 이 컬럼을 스트립핑, 세척 및 보관하였다. 그 결과를 이하 표 3에 나타내었다.
염화칼슘 세척액을 로딩한 경우 및 로딩하지 않은 경우 시험적 규모의 전개액 중
IRT 수준 %
전개액
번호		 세척 완충액 1 % IRT
1 50 mM Tris, 2 M CaCl2(pH 7.5) 0.8
2 대조군(불포함) 1.9
상기 결과를 통하여, 시험적 규모의 염화칼슘 세척으로도 생성물 풀로부터 IRT를 제거할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3: DNA 제거
본 실시예에서는, CaCl2 세척액이 AAB 모노클로날 항체를 함유하는 제제로부터 숙주 세포의 DNA를 제거하는 능력을 관찰하였다.
GE 헬스케어의 AKTA FPLC 크로마토그래피 시스템과 연결되어 있는 맵셀렉트 단백질 A 컬럼(19㎖)을 사용하여 모노클로날 항체를 함유하는 배양액을 소규모로 정제하였다. 이하에 기술된 바와 같이 맵셀렉트 전개를 3회 실시하였다.
컬럼 치수: 1.1㎝ × 20㎝
작동 유속: 300㎝/시간
평형액 1: 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5(5 컬럼 부피)
플러시액: 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5(2 컬럼 부피)
세척액 1: 50 mM Tris, 2.0 M CaCl2, pH 7.5(5 컬럼 부피) (전개액 2 및 전개액 3의 경우에만 포함)
세척액 2: 20 mM Tris, 1.0 M NaCl, pH 7.5(5 컬럼 부피) (전개액 1 및 전개액 3의 경우에만 포함)
세척액 3: 10 mM Tris, 75 mM NaCl, pH 7.5(7 컬럼 부피)
용리액: 50 mM 글리신, 75 mM NaCl, pH 3.0(6 컬럼 부피)
스트립액: 50 mM 글리신, 0.5 M NaCl, pH 2.7(5 컬럼 부피)
스트립 세척액: 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5(5 컬럼 부피)
보관액: 16% 에탄올(5 컬럼 부피)
전개 온도: 18℃∼24℃
5 컬럼 부피의 20 mM Tris 및 150 mM NaCl(pH 7.5)을 사용하여 상기 맵셀렉트 단백질 A 컬럼을 평형화시켰다. 이후, 이 컬럼에 수지 1㎖당 약 40㎎의 생성물의 유속으로 로딩하였다. 이후, 여기에 2 컬럼 부피의 플러시액과 평형화 완충액을 로딩하였다. 전개액 2 및 전개액 3의 경우, 상기 과정 후에 5 컬럼 부피의 세척 용액 1을 로딩시켰다. 전개액 1 및 전개액 3의 경우에는, 5 컬럼 부피의 세척 용액 2를 사용하였다. 3회의 전개 모두에 있어서, 7 컬럼 부피의 세척 용액 3을 사용하였다. 50 mM 글리신, 75 mM NaCl(pH 3.0)을 사용하여, 맵셀렉트 단백질 A 컬럼으로부터 모노클로날 항체를 용리시켰다. 이후, 2 M Tris(pH 8.5)를 사용하여 생성물 풀을 pH 7.5∼8.0으로 중화시켰다. 이후, 이 컬럼을 스트립핑, 세척 및 보관하였다. 그 결과를 이하 표 4에 나타내었다
염화칼슘 세척을 통한 DNA의 제거
전개액
번호		 세척액 1 세척액 2 DNA
(ng/ ㎖)		 DNA
(ppm)
1 불포함(대조군) 20 mM Tris, 1 M NaCl(pH 7.5) 3.6 0.37
2 50 mM Tris, 2 M CaCl2(pH 7.5) 불포함 0.9 0.09
3 50 mM Tris, 2 M CaCl2(pH 7.5) 20 mM Tris, 1 M NaCl(pH 7.5) 0.3 0.03
상기 결과를 통하여, 50 mM Tris, 2.0M의 염화칼슘(pH 7.5)을 첨가하면 세척 용액 중에 NaCl을 함유하는 경우에 비하여 DNA가 10배 이상 감소하였음을 알 수 있었다.
실시예 4: 숙주 세포 단백질 제거
본 실시예에서는, 정제를 위한 전개시 제2의 항-Aβ 모노클로날 항체인 12A11을 사용하였으며, 이때, 숙주 세포 단백질(HCP)을 제거하는 능력에 대해 다양한 세척 조건이 테스트되었다.
96-웰 여과 평판에서의 고 처리량 스크리닝(HTS)을 수행하여, 맵셀렉트 단계를 위해 불순물 예를 들어, HCP를 제거하는데 최선인 세척 조건을 확인하였다. 이 스크리닝에서는, 세척용 첨가물, 첨가물의 농도 그리고 pHDP 다양한 변화를 주었으며, 이를 통하여 이러한 조건이 공정과 관련된 불순물 예를 들어, HCP에 미치는 영향을 알 수 있었다.
맵셀렉트 수지를 5 mM Tris, 10 mM NaCl(pH 7.3)을 사용하여 평형화시키고, 이 컬럼에 생성물을 로딩하였다. 이후 수지의 팩킹을 해체하여 혼합한 다음, 96웰 여과 평판의 각 웰에 50㎕의 수지를 분배하였다. 각 웰에 있는 수지를 5 mM Tris, 10 mM NaCl(pH 7.3) 용액 중에서 평형화시킨 후, 이를 각 성분을 함유하는 세척 용액으로 3 단계에 걸쳐 세척하였다[이때, 각각의 단계에서 세척 완충액은 300㎕씩 사용함]. 첨가물 세척 후, 5 mM Tris, 10 mM NaCl(pH 7.3) 완충액을 사용하여 2차 세척을 4 단계에 걸쳐 실시하였다[각각의 단계에서 세척 완충액은 300 ㎕씩 사용함]. 이후 3단계에 걸쳐 수지로부터 생성물을 용리시켰다[세척 완충액은 300 ㎕씩 사용함]. 용리 단계 1 및 2의 용리액을 합하여 이것의 HCP 수준에 대해 테스트하였다.
수지 부피: 50 ㎕
세척 첨가물:염화나트륨, 염화칼슘, 염화마그네슘
첨가물 농도: 100, 250, 500, 1000, 1500 및 2000 mM
첨가물 pH: 6.0 및 7.5
용리 완충액: 25 mM Hepes, 10 mM NaCl, pH 3.0, 25 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 3.0, 50 mM 글리신, 10 mM NaCl, pH 3.0, 50 mM 글리신, 100 mM NaCl, pH 3.0 및 100 mM 아르기닌, 10 mM NaCl, pH 3.0, 100 mM 아르기닌, 100 mM NaCl, pH 3.0
전개 온도: 18℃∼24℃
그 결과를 이하 표 5 및 표 6에 나타내었다.
Figure 112008000378088-pct00001
[▲ 표 5: 염화나트륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘(pH 6.0)으로 세척한 맵셀렉트 수지에 있어서의 HCP 수치]
Figure 112008000378088-pct00002
[▲ 표 6: 염화나트륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘(pH 7.5)으로 세척한 맵셀렉트 수지에 있어서의 HCP 수치]
상기 결과들을 통하여, 염화칼슘 및 염화마그네슘 둘 다를 사용하였을 때(표 6)는, 염화나트륨(pH6.0)을 사용하였을 때(표 5)에 비하여, 맵셀렉트 피크 풀 중 HCP의 수준이 더 많이 감소하였음을 알 수 있었다.
실시예 5: 디설파이드 결합 부족 종(UDB)의 제거
본 실시예에서는, CaCl2 세척이 디설파이드 결합 부족 종(UDB)을 제거하는 능력에 대해 관찰하였다.
실시예 1에 기술된 바와 같이, rmp 단백질 A 세파로스™ FF 전개를 2회 실시하였다.
컬럼 치수: 1.0 ㎝ × 11.4 ㎝
작동 유속: 150 ㎝/시간
평형액 1: 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5(5 컬럼 부피)
플러시액: 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5(1 컬럼 부피)
세척액 1: 50 mM 아세트산염, 2.0 M CaCl2, pH 5.0[전개액 1, 다만, 전개액 2에는 함유되지 않음]
세척액 2: 20 mM Tris, 1.0 M NaCl, pH 7.5(5 컬럼 부피)
세척액 3: 10 mM Tris, 75 mM NaCl, pH 7.5(7 컬럼 부피)
용리액: 50 mM 글리신, 75 mM NaCl, pH 3.1(6 컬럼 부피)
스트립액 1: 20 mM 시트르산나트륨, pH 2.7(5 컬럼 부피)
스트립액 2: 6 M 구아니딘 HCl(2 컬럼 부피)
스트립 세척액: 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5(5 컬럼 부피)
보관액: 16% 에탄올(5 컬럼 부피)
전개 온도: 2℃∼8℃
5 컬럼 부피의 20 mM Tris 및 150 mM NaCl(pH 7.5)를 사용하여 상기 rmp 단백질 A 세파로스™ FF 컬럼 전개액을 평형화시켰다. 이 컬럼에 수지 1㎖당 약 10㎎의 생성물의 유속으로 로딩하였다. 로딩은 다음과 같이 하였다: 1 컬럼 부피의 플러시액과 평형화 완충액 → 5 컬럼 부피의 세척 용액 1. 이 세척 용액 1은 50 mM 아세트산염, 2.0 M CaCl2, pH 5.0[전개액 1, 다만, 전개액 2에는 함유되지 않음]을 포함하였다. 세척액 1 로딩 후, 5 컬럼 부피의 20 mM Tris, 1.0 M NaCl(pH 7.5) 및 7 컬럼 부피의 10 mM Tris, 75 mM NaCl(pH 7.5)를 로딩하였다. 이 rmp 단백질 A 세파로스™ FF 컬럼으로부터 50 mM 글리신, 75 mM NaCl(pH 3.1)과 함께 모노클로날 항체가 용리되었다. 이후, 2 M Tris(pH 8.5)를 사용하여 생성물 풀을 pH 7.8∼8.2로 중화시켰다. 이후, 이 컬럼을 스트립핑, 세척 및 보관하였다. 그 결과를 이하 표 7에 나타내었다.
칼슘 세척 시료를 함유하는 경우 및 함유하지 않는 경우에 있어서의 UDB %
전개액
번호		 시료 UDB %
1 50 mM 아세트산염, 2.0 M CaCl2, pH 5.0 9.5
2 불포함(대조군) 20.8
50 mM 아세트산염, 2.0 M CaCl2(pH 5.0)을 추가로 첨가하여 전개시켰을 경우, UDB 수준이 2배 감소하였음을 알 수 있었다.
실시예 6: 기타 2가 양이온 염 함유 세척액을 사용하였을 경우의 HCP 및 IRT 의 제거
본 실시예에서는, MnCl2 또는 NiCl2를 함유하는 세척액이, 항-Aβ 모노클로날 항체 AAB를 함유하는 제제로부터 불순물을 제거하는 능력에 대해 관찰하였다.
기타 2가 양이온 염 예를 들어, MnCl2 또는 NiCl2를 함유하는 세척액의 효과를 평가하기 위하여 2회 전개시켰다. 2개의 대조군 전개액도 전개시켰다[하나의 대조군 전개액은 50 mM Tris, 1.0 M NaCl, pH 7.5 세척액(IRT 또는 HCP가 제거될 것이라고 예상되지는 않음)을 사용하였고, 다른 하나의 대조군 전개액은 50 mM Tris, 2.0 M CaCl2, pH 7.5 세척액을 사용함].
GE 헬스케어의 AKTA FPLC 크로마토그래피 시스템과 연결되어 있는 맵셀렉트 단백질 A 컬럼(9㎖)을 사용하여 모노클로날 항체를 함유하는 배양액을 소규모로 정제하였다. 이하에 기술된 바와 같이 맵셀렉트 전개를 실시하였다. 이하에 기술된 바와 같이, 모든 작동 매개 변수는 4개의 전개시가 모두 동일하였다[다만, 세척액 1은 다양함(표 8)].
컬럼 치수: 1.0㎝ × 11.5㎝(9㎖)
작동 유속: 300㎝/시간(평형액, 세척액 2, 용리액, 재생 용액, 보관액)
작동 유속: 230㎝/시간(로딩액, 플러시액, 세척액 1)
평형액 1: 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5(5.0 컬럼 부피)
세척액 1: 다양함(조성에 관하여는, 표 8 참조)
세척액 2: 50 mM Tris, 10 mM NaCl, pH 7.5(5 컬럼 부피)
용리액: 50 mM 글리신, 10 mM NaCl, pH 3.0(3 컬럼 부피)
재생 용액: 50 mM NaOH, 0.5 M Na2SO4(5 컬럼 부피)
보관액: 16% 에탄올, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5(5 컬럼 부피)
전개 온도: 18℃∼24℃
5 컬럼 부피의 50 mM Tris 및 150 mM NaCl(pH 7.5)을 사용하여 상기 맵셀렉트 단백질 A 컬럼을 평형화시켰다. 이후, 이 컬럼에 수지 1 ㎖당 약 40 ㎎의 생성물의 유속으로 로딩하였다. 이후, 나머지 로딩액을 여기에 5 컬럼 부피의 50 mM Tris, 150 mM NaCl(pH 7.5)과 함께 플러싱시켰다. 이후, 이 컬럼을 표 11에 나타낸 용액 중 하나의 용액으로 세척하였다. 이 컬럼을 용리시키기 전에, 이 컬럼을 5 컬럼 부피의 50 mM Tris, 10 mM NaCl(pH 7.5)로 세척하였다. 50 mM 글리신, 10 mM NaCl(pH 3.0)을 사용하여, 맵셀렉트 단백질 A 컬럼으로부터 생성물을 용리시켰다. 이후, 2 M Tris(pH 9.0)를 사용하여 생성물 풀을 pH 8.0으로 중화시켰다. 이후, 이 컬럼을 5 컬럼 부피의 50 mM NaOH, 0.5 M Na2SO4로 스트립핑시킨 다음, 5 컬럼 부피의 16% 에탄올, 50 mM Tris, 150 mM NaCl(pH 7.5)와 함께 보관하여 두었다. 그 결과를 이하 표 8(HCP 제거) 및 표 9(IRT 제거)에 나타내었다.
다양한 세척 용액을 사용한 HCP 제거
전개액
번호		 세척액 1의 조성 HCP(ppm)
1 50 mM Tris, 1.0 M NaCl, pH 7.5 17,600
2 50 mM 아세트산나트륨, 1.5 M MnCl2, pH 5.0* 10,600
3 50 mM 아세트산나트륨, 1.5 M NiCl2, pH 5.0* 4,700
4 50 mM Tris, 2.0 M CaCl2, pH 7.5 6,500
* MnCl2 및 NiCl2의 가용성으로 인하여 pH 5.0으로 설정하였음
다양한 세척 용액을 사용한 IRT 제거
전개액
번호		 세척액 1의 조성 IRT(%)
1 50 mM Tris, 1.0 M NaCl, pH 7.5 2.78
2 50 mM 아세트산나트륨, 1.5 M MnCl2, pH 5.0* 0.77
3 50 mM 아세트산나트륨, 1.5 M NiCl2, pH 5.0* 0.47
4 50 mM Tris, 2.0 M CaCl2, pH 7.5 0.87
* MnCl2 및 NiCl2의 가용성으로 인하여 pH 5.0으로 설정하였음
표 8을 통하여, 2가 양이온을 함유하는 용액으로 세척한 전개액에 존재하는 HCP의 수준은, 대조군(1.0 M NaCl 세척액)으로 세척한 전개액에 존재하는 HCP 수준보다 1.5∼3.5배 낮음을 알 수 있었다. 표 9를 통하여, 2가 양이온 염을 함유하는 세척 용액을 전개하였을 경우의 IRT 제거율은, 1.0 M NaCl 함유 세척 용액을 전개하였을 경우 IRT 제거율에 비하여, 3.5배 더 컸음을 알 수 있었다. 그러므로, 이러한 결과들을 통하여, CaCl2를 사용하는 경우와는 달리 다른 2가 양이온(예를 들어, MnCl2 또는 NiCl2)을 사용하는 염 세척이 불순물 제거에 효과적임이 입증되었다.
균등 범위:
당업자들은 통상 수준 이상의 실험을 실시하지 않더라도, 본원에 개시된 본 발명의 특정 구체예와 균등한 범위에 속하는 다수의 구체예들이 실시될 수 있음을 알거나 또는 확신할 수 있을 것이다. 이와 같은 균등 범위는 이하 청구 범위에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Neuralab Limited, et al. <120> METHODS OF PURIFYING ANTI A BETA ANTIBODIES <130> ELN-053PC <150> 60/691,821 <151> 2005-06-17 <160> 47 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 1 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 2 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 3 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized antibody <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> Asp or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> Ser or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> Ser or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (15) <223> Leu, Ile, or Val <220> <221> MOD_RES <222> (50) <223> Arg or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (88) <223> Val or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (109) <223> Val or Leu <400> 3 Xaa Val Val Met Thr Gln Xaa Pro Leu Xaa Leu Pro Val Thr Xaa Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Xaa Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Xaa Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized antibody <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> Gln, Lys, or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (78) <223> Ser or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (87) <223> Arg or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (88) <223> Ala, Ser, or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (114) <223> Leu, Thr, Ile, or Val <400> 4 Glu Val Xaa Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Xaa Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Xaa Xaa Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized antibody <400> 5 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 6 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized antibody <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized antibody <400> 7 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Gln Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val 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humanized antibody <400> 26 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized antibody <400> 27 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr 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120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized antibody <400> 29 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 30 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized antibody <400> 30 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 31 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized antibody <400> 31 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 32 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized antibody <400> 32 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val 115 120 <210> 33 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized antibody <400> 33 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 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humanized antibody <400> 36 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 37 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized antibody <400> 37 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 38 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized antibody <400> 38 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 39 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized antibody <400> 39 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 40 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized antibody <400> 40 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 41 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized antibody <400> 41 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 42 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized antibody <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> Val or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> Ser or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (14) <223> Thr or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (15) <223> Leu or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (30) <223> Ile or Val <220> <221> MOD_RES <222> (50) <223> Arg, Gln, or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (88) <223> Val or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (105) <223> Gln or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (108) <223> Lys or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (109) <223> Val or Leu <400> 42 Asp Xaa Val Met Thr Gln Xaa Pro Leu Ser Leu Pro Val Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Xaa Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Xaa Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized antibody <400> 45 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 46 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized antibody <400> 46 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ile Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu 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5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 115 120 125 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 130 135 140 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 145 150 155 160 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 180 185 190 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 195 200 205 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 340 345 350 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440

Claims (45)

  1. Fc 부위를 가지는 항-Aβ 항체 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 원액(source liquid)으로부터 상기 항체를 정제하는 방법으로서,
    항-Aβ 항체를 단백질 A 및 단백질 G 중 하나 이상을 포함하는 Fc 결합제에 흡착시키는 단계;
    상기 Fc 결합제를 0.5 M 내지 3 M의 농도로 CaCl2을 함유하는 완충 용액으로 세척하여 하나 이상의 불순물을 제거하는 단계; 및
    pH 2 내지 4의 용리 완충액으로 항체를 용리하여 상기 Fc 결합제로부터 항-Aβ 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 불순물이 인트론 리드쓰루 변이종(intron read through variant species; IRT), 디설파이드 결합 부족 종(under disulfide bonded species; UDB) 및 저분자량 종(low molecular weight species; LMW)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 불순물이 IRT인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체가 항체 융합체, 뮤린 (murine) 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항체가 인간화 항-Aβ 항체인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 인간화 항-Aβ 항체가 3D6, 10D5, 12A11, 266, 15C11 및 12B4로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항체가 재조합적으로 생산되는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항체가 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary; CHO) 세포에서 재조합적으로 생산되는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 Fc 결합제가 단백질 A을 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 Fc 결합제가 고상에 고정화되는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 고상이 비드, 겔, 수지 및 입자 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제1항에 있어서, 상기 CaCl2을 함유하는 완충 용액의 pH 값이 4∼8인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 CaCl2을 함유하는 완충 용액의 pH 값이 7.3∼7.7인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 완충 용액이 0.5 M 내지 2 M 범위의 CaCl2 농도를 갖는 것인 방법.
  17. 삭제
  18. 제16항에 있어서, 상기 완충 용액이 1.5 M 내지 2.0 M 범위의 CaCl2 농도를 갖는 것인 방법.
  19. 삭제
  20. 제1항에 있어서, 상기 완충 용액이 2 M의 CaCl2를 포함하는 것인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 항-Aβ 항체를 Fc 결합제에 흡착시키는 단계 및 상기 Fc 결합제를 세척하는 단계를 2℃∼24℃의 온도에서 수행하는 것인 방법.
  22. 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 불순물이 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 DNA, 세포 배양 단백질 및 이들의 혼합물 중 하나 이상을 더 포함하는 것인 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 Fc 결합제로부터 항-Aβ 항체를 회수하는 단계는 pH가 2.5∼3.5인 용리 완충액을 사용하여 항체를 용리시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  24. 제1항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 고정 금속 친화성 크로마토그래피 및 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 크로마토그래피 단계를 더 포함하는 방법.
  25. 제1항에 있어서, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 투석, 친화성 크로마토그래피, 황산암모늄 침전법, 에탄올 침전법, 역상 HPLC(RP-HPLC) 및 크로마토포커싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가적인 정제 단계를 더 포함하는 방법.
  26. 삭제
  27. 제1항 내지 제11항, 제14항 내지 제16항, 제18항 및 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 각각 서열 번호 1의 24-39번, 55-61번 및 94-102번 잔기의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 및 서열 번호 2의 31-35번, 50-65번 및 99-108번 잔기의 아미노산 서열을 가지는 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호 1의 1-112번 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 2의 1-119번 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 인간화 3D6 항체인 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 번호 2의 1∼448번 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 인간화 3D6 항체인 방법.
  30. 제1항에 있어서, 상기 항체가 아이소타입 IgM, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 항체가 아이소타입 인간 IgG1인 방법.
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ZA (2) ZA200710330B (ko)

Families Citing this family (100)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080050367A1 (en) * 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6787523B1 (en) * 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US7790856B2 (en) * 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
TWI239847B (en) * 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
MY139983A (en) 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
BRPI0407058A (pt) * 2003-02-01 2006-01-17 Neuralab Ltd Métodos de profilaxia e de tratamento de uma doença, composição farmacêutica, e, uso de um fragmento
TWI374893B (en) * 2003-05-30 2012-10-21 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
JP4980222B2 (ja) * 2004-10-05 2012-07-18 ヤンセン アルツハイマー イミュノセラピー 組換えタンパク質製造を改良するための方法および組成物
EA012162B1 (ru) * 2004-10-22 2009-08-28 Эмджен Инк. Способ рефолдинга рекомбинантных антител
WO2006066089A1 (en) 2004-12-15 2006-06-22 Neuralab Limited Humanized amyloid beta antibodies for use in improving cognition
GT200600031A (es) * 2005-01-28 2006-08-29 Formulacion anticuerpo anti a beta
TW200740839A (en) * 2005-06-17 2007-11-01 Wyeth Corp Methods of purifying Fc region containing proteins
KR20140087058A (ko) 2005-11-30 2014-07-08 애브비 인코포레이티드 아밀로이드 베타 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 이의 용도
AU2006319358B2 (en) 2005-11-30 2012-01-19 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Anti-Abeta globulomer antibodies, antigen-binding moieties thereof, corresponding hybridomas, nucleic acids, vectors, host cells, methods of producing said antibodies, compositions comprising said antibodies, uses of said antibodies and methods of using said antibodies
SG10201404801YA (en) * 2005-12-12 2014-09-26 Ac Immune Sa Monoclonal antibody
WO2010044803A1 (en) * 2008-10-17 2010-04-22 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic diseases
US8784810B2 (en) * 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
WO2008011348A2 (en) * 2006-07-14 2008-01-24 Ac Immune S.A. Humanized antibody against amyloid beta
CA2661872A1 (en) * 2006-08-28 2008-03-06 Ares Trading S.A. Process for the purification of fc-fusion proteins
PL2061803T5 (pl) * 2006-08-28 2023-03-27 Ares Trading S.A. Proces oczyszczania białek zawierających fc
TW201516149A (zh) 2006-09-13 2015-05-01 Abbvie Inc 細胞培養改良
US8911964B2 (en) 2006-09-13 2014-12-16 Abbvie Inc. Fed-batch method of making human anti-TNF-alpha antibody
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
EP2124952A2 (en) * 2007-02-27 2009-12-02 Abbott GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
US8003097B2 (en) * 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
MX2009011127A (es) * 2007-04-18 2010-03-10 Janssen Alzheimer Immunotherap Metodo de prevencion y tratamiento de angiopatia amiloide cerebral.
JP2010528583A (ja) * 2007-06-11 2010-08-26 エーシー イミューン ソシエテ アノニム アミロイドβに対するヒト化抗体
KR101670088B1 (ko) * 2007-06-12 2016-10-28 에이씨 이뮨 에스.에이. 아밀로이드 베타에 대해 인간화된 항체
US8048420B2 (en) * 2007-06-12 2011-11-01 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US8613923B2 (en) 2007-06-12 2013-12-24 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
JP5889529B2 (ja) 2007-07-27 2016-03-22 ヤンセン・サイエンシズ・アイルランド・ユーシー アミロイド原性疾患の処置
RU2538709C2 (ru) * 2007-10-05 2015-01-10 Дженентек, Инк. Гуманизированное антитело
RU2542967C2 (ru) * 2007-10-05 2015-02-27 Дженентек, Инк. Применение антитела против амилоида бета при глазных заболеваниях
RU2482876C2 (ru) * 2007-10-05 2013-05-27 Дженентек, Инк. Применение антитела против амилоида-бета при глазных заболеваниях
JO3076B1 (ar) * 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
SI2211904T1 (sl) 2007-10-19 2016-12-30 Seattle Genetics, Inc. CD19 vezavna sredstva in njihove uporabe
ES2572958T3 (es) * 2007-10-30 2016-06-03 Genentech, Inc. Purificación de anticuerpos mediante cromatografía de intercambio catiónico
US20100233678A1 (en) * 2007-11-13 2010-09-16 Beadling Leslie C Tunable affinity ligands for the separation and detection of target substances
KR101247374B1 (ko) * 2008-06-26 2013-03-26 한국생명공학연구원 면역글로불린 Ｇ의 Ｆｃ 부위에 선택적으로 결합하는 신규펩타이드 및 그의 제조방법
US8592555B2 (en) 2008-08-11 2013-11-26 Emd Millipore Corporation Immunoglobulin-binding proteins with improved specificity
RU2520838C2 (ru) 2008-10-20 2014-06-27 Эббви Инк Выделение и очистка антител с использованием аффинной хроматографии на основе белка а
KR20110071011A (ko) * 2008-10-20 2011-06-27 아보트 러보러터리즈 Ｉｌ-18에 결합하는 항체 및 이의 정제 방법
CN104974251A (zh) 2008-10-20 2015-10-14 Abbvie公司 在抗体纯化过程中的病毒灭活
KR20110079693A (ko) 2008-10-29 2011-07-07 와이어쓰 엘엘씨 단일 도메인 항원 결합 분자의 정제 방법
AR073997A1 (es) 2008-10-29 2010-12-15 Wyeth Corp Formulaciones de moleculas de union a antigeno de dominio unico. metodo. kit
US9067981B1 (en) 2008-10-30 2015-06-30 Janssen Sciences Ireland Uc Hybrid amyloid-beta antibodies
KR20110086184A (ko) 2008-12-22 2011-07-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 면역글로불린 정제
SG195555A1 (en) 2008-12-24 2013-12-30 Emd Millipore Corp Caustic stable chromatography ligands
US8268820B2 (en) * 2009-03-26 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. 2,3-diaryl- or heteroaryl-substituted 1,1,1-trifluoro-2-hydroxypropyl compounds
ES2551854T3 (es) 2009-04-30 2015-11-24 Ablynx N.V. Procedimiento para la producción de anticuerpos de dominio
RU2571929C2 (ru) 2009-09-01 2015-12-27 Дженентек, Инк. Улучшенная очистка белка посредством модифицированного элюирования белка а
KR101632312B1 (ko) 2009-11-03 2016-06-21 삼성전자주식회사 항체 불변 영역에 특이적으로 결합하는 융합 단백질, 그의 제조 방법 및 이를 이용한 항체 분리 방법
JP2013516180A (ja) * 2009-12-31 2013-05-13 ミリアント・コーポレイション コハク酸アンモニウムを含有する発酵ブロスからのコハク酸の精製
JP5917417B2 (ja) * 2010-03-05 2016-05-11 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗体の選択的強化
WO2011110598A1 (en) * 2010-03-10 2011-09-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for purifying immunoglobulin solutions
MX360403B (es) 2010-04-15 2018-10-31 Abbvie Inc Proteinas de union a amiloide beta.
WO2012016173A2 (en) 2010-07-30 2012-02-02 Ac Immune S.A. Safe and functional humanized antibodies
WO2012024187A1 (en) 2010-08-14 2012-02-23 Abbott Laboratories Amyloid-beta binding proteins
KR20130139153A (ko) * 2011-01-18 2013-12-20 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 인간 혈액 중 항-베타 아밀로이드 항체의 측정
CN107915769A (zh) 2011-03-29 2018-04-17 葛兰素史密斯克莱有限责任公司 用于蛋白纯化的缓冲液体系
SG10201604554WA (en) * 2011-06-08 2016-07-28 Emd Millipore Corp Chromatography matrices including novel staphylococcus aureus protein a based ligands
JP2014527518A (ja) * 2011-07-20 2014-10-16 ゼプテオン インコーポレイテッド ポリペプチド分離法
EP2768845B1 (en) * 2011-10-19 2017-01-18 Roche Glycart AG Separation method for fucosylated antibodies
KR20150076172A (ko) * 2012-09-25 2015-07-06 그렌마크 파머수티칼스 에스. 아. 이질-이합체 면역글로불린의 정제
AR096713A1 (es) 2013-06-25 2016-01-27 Cadila Healthcare Ltd Proceso de purificación para anticuerpos monoclonales
US10611826B2 (en) 2013-07-05 2020-04-07 Laboratoire Français Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Affinity chromatography matrix
NZ718144A (en) 2013-09-13 2022-05-27 Genentech Inc Methods and compositions comprising purified recombinant polypeptides
BR112016028182A2 (pt) * 2014-06-02 2018-02-20 Lab Francais Du Fractionnement método para produzir um fragmento de fragmento cristalizável, e, fragmento fc.
JP6451118B2 (ja) * 2014-07-17 2019-01-16 東ソー株式会社 抗体の分離方法
AR101262A1 (es) 2014-07-26 2016-12-07 Regeneron Pharma Plataforma de purificación para anticuerpos biespecíficos
US11566082B2 (en) 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
CN105175548B (zh) * 2015-08-13 2019-02-05 齐鲁制药有限公司 重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法
EP3337818A1 (en) * 2015-08-21 2018-06-27 H. Hoffnabb-La Roche Ag Affinity chromatography purification with low conductivity wash buffer
WO2017032611A1 (en) * 2015-08-21 2017-03-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the reduction of host cell proteins in affinity chromatography
EP3344643A4 (en) * 2015-09-04 2019-05-01 Qiagen Sciences LLC METHODS FOR CO-ISOLATION OF PROTEINS AND NUCLEIC ACIDS
GB201600161D0 (en) * 2016-01-05 2016-02-17 Bayer As Isotope purification method
GB201600154D0 (en) * 2016-01-05 2016-02-17 Bayer As Isotope preparation method
JP7106187B2 (ja) 2016-05-11 2022-07-26 サイティバ・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ 分離マトリックスを保存する方法
US11753438B2 (en) 2016-05-11 2023-09-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Method of cleaning and/or sanitizing a separation matrix
US10889615B2 (en) 2016-05-11 2021-01-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
US10654887B2 (en) 2016-05-11 2020-05-19 Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab Separation matrix
ES2874974T3 (es) 2016-05-11 2021-11-05 Cytiva Bioprocess R & D Ab Matriz de separación
US10703774B2 (en) 2016-09-30 2020-07-07 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10730908B2 (en) 2016-05-11 2020-08-04 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
CN106519029B (zh) * 2016-10-31 2020-03-17 山东泰邦生物制品有限公司 一种Aβ寡聚体抗体的制备工艺
US10941178B2 (en) * 2017-03-17 2021-03-09 Gilead Sciences, Inc. Method of purifying an antibody
JP2018167260A (ja) * 2017-03-29 2018-11-01 三菱ケミカル株式会社 イオン交換体の保存方法、生理活性物質の精製装置及び生理活性物質の精製方法
EP3668985B1 (en) * 2017-08-17 2021-06-16 Just-Evotec Biologics, Inc. Method of purifying glycosylated protein from host cell galectins and other contaminants
US11447547B1 (en) 2017-12-13 2022-09-20 Amgen Inc. Method of antigen-binding protein production
CN109929038B (zh) * 2017-12-15 2020-10-09 山东博安生物技术有限公司 Vegf捕获剂融合蛋白的纯化方法
CN108048477A (zh) * 2017-12-15 2018-05-18 南京理工大学 基于大肠杆菌表达系统的制备多肽的方法
WO2019183334A1 (en) 2018-03-21 2019-09-26 Waters Technologies Corporation Non-antibody high-affinity-based sample preparation, sorbents, devices and methods
US20220314142A1 (en) 2019-07-01 2022-10-06 Pfizer Inc. Improvements to wash solutions for protein a chromatography in an antibody purification process
CN112409477B (zh) * 2019-08-21 2022-11-08 广东菲鹏生物有限公司 IgM纯化方法
CN110724204B (zh) * 2019-11-18 2021-10-22 广东菲鹏制药股份有限公司 Fc融合蛋白的纯化方法
CN113968909A (zh) * 2020-07-22 2022-01-25 信达生物制药(苏州)有限公司 一种双特异性抗体的纯化方法
EP4185612A1 (en) 2020-07-23 2023-05-31 Othair Prothena Limited Anti-abeta antibodies

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002046237A2 (en) * 2000-12-06 2002-06-13 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20040229330A1 (en) * 2003-02-27 2004-11-18 Bayer Pharmaceuticals Corporation Integrated method for capture and purification of tagged proteins

Family Cites Families (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
AU606320B2 (en) 1985-11-01 1991-02-07 International Genetic Engineering, Inc. Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4801687A (en) * 1986-10-27 1989-01-31 Bioprobe International, Inc. Monoclonal antibody purification process using protein A
US4851341A (en) * 1986-12-19 1989-07-25 Immunex Corporation Immunoaffinity purification system
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
EP1997891A1 (en) 1988-09-02 2008-12-03 Dyax Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5750373A (en) 1990-12-03 1998-05-12 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins having altered binding properties, M13 phagemids, and growth hormone variants
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US6150584A (en) * 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
SG48759A1 (en) * 1990-01-12 2002-07-23 Abgenix Inc Generation of xenogenic antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ATE185601T1 (de) 1990-07-10 1999-10-15 Cambridge Antibody Tech Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5112952A (en) * 1990-09-28 1992-05-12 Pierce Chemical Company Composition and method for isolation and purification of Immunoglobulin M
DK1820858T3 (da) 1991-03-01 2009-11-02 Dyax Corp Kimært protein omfatende mikroprotein med to eller flere disulfidbindinger og udförelsesformer deraf
WO1992018619A1 (en) 1991-04-10 1992-10-29 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5786180A (en) 1995-02-14 1998-07-28 Bayer Corporation Monoclonal antibody 369.2B specific for β A4 peptide
JP2002514919A (ja) 1997-04-04 2002-05-21 バイオサイト ダイアグノスティックス，インコーポレイテッド 多価ライブラリーおよびポリクローナルライブラリー
US6787523B1 (en) * 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6750324B1 (en) * 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US6913745B1 (en) 1997-12-02 2005-07-05 Neuralab Limited Passive immunization of Alzheimer's disease
US7588766B1 (en) * 2000-05-26 2009-09-15 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic disease
US6710226B1 (en) * 1997-12-02 2004-03-23 Neuralab Limited Transgenic mouse assay to determine the effect of Aβ antibodies and Aβ Fragments on alzheimer's disease characteristics
US6761888B1 (en) * 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US7179892B2 (en) 2000-12-06 2007-02-20 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7790856B2 (en) 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6743427B1 (en) 1997-12-02 2004-06-01 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20080050367A1 (en) 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US20050059802A1 (en) 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Ltd Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6787637B1 (en) 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
KR100767146B1 (ko) 2000-02-24 2007-10-15 워싱톤 유니버시티 Ａβ 펩티드를 격리시키는 인간화 항체
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
ATE420114T1 (de) 2001-04-30 2009-01-15 Lilly Co Eli Humanisierte antikörper die das beta-amyloid peptid erkennen& x9;
EP1385544B1 (en) 2001-04-30 2008-09-24 Eli Lilly And Company Humanized antibodies
CA2451998A1 (en) 2001-08-17 2003-02-27 Eli Lilly And Company Anti-a.beta. antibodies
WO2003015691A2 (en) 2001-08-17 2003-02-27 Eli Lilly And Company RAPID IMPROVEMENT OF COGNITION IN CONDITIONS RELATED TO A$g(b)
WO2003066662A2 (en) * 2002-02-05 2003-08-14 Genentech, Inc. Protein purification
AR038568A1 (es) 2002-02-20 2005-01-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-a beta y su uso
MY139983A (en) 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
BRPI0407058A (pt) 2003-02-01 2006-01-17 Neuralab Ltd Métodos de profilaxia e de tratamento de uma doença, composição farmacêutica, e, uso de um fragmento
GB0304576D0 (en) * 2003-02-28 2003-04-02 Lonza Biologics Plc Protein a chromatography
EP1601697B1 (en) 2003-02-28 2007-05-30 Lonza Biologics plc Antibody purification by Protein A and ion exchange chromatography
TWI374893B (en) 2003-05-30 2012-10-21 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US9469672B2 (en) * 2003-10-27 2016-10-18 Wyeth Llc Removal of high molecular weight aggregates using hydroxyapatite chromatography
EP2336147B1 (en) 2003-12-17 2014-04-30 Janssen Alzheimer Immunotherapy A beta immunogenic peptide carrier conjugates and methods of producing same
BRPI0417744B8 (pt) * 2003-12-17 2021-05-25 Wyeth Corp método para produzir um conjugado imunogênico, e,conjugado imunogênico
EP1697520A2 (en) * 2003-12-22 2006-09-06 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel fc ligand binding sites
US20070259865A1 (en) 2004-07-14 2007-11-08 Astellas Pharma Inc. Agent for Promoting the Recovery from Dysfunction After the Onset of Central Neurological Disease
JP4980222B2 (ja) 2004-10-05 2012-07-18 ヤンセン アルツハイマー イミュノセラピー 組換えタンパク質製造を改良するための方法および組成物
JP2008524247A (ja) 2004-12-15 2008-07-10 エラン ファーマ インターナショナル リミテッド 認知の改善における使用のためのアミロイドβ抗体
TW200636066A (en) * 2004-12-15 2006-10-16 Elan Pharm Inc Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
WO2006066089A1 (en) 2004-12-15 2006-06-22 Neuralab Limited Humanized amyloid beta antibodies for use in improving cognition
GT200600031A (es) * 2005-01-28 2006-08-29 Formulacion anticuerpo anti a beta
EP1841456A2 (en) 2005-01-28 2007-10-10 Wyeth Stabilized liquid polypeptide formulations
TW200740839A (en) 2005-06-17 2007-11-01 Wyeth Corp Methods of purifying Fc region containing proteins
MX2009011127A (es) * 2007-04-18 2010-03-10 Janssen Alzheimer Immunotherap Metodo de prevencion y tratamiento de angiopatia amiloide cerebral.
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
JP5889529B2 (ja) 2007-07-27 2016-03-22 ヤンセン・サイエンシズ・アイルランド・ユーシー アミロイド原性疾患の処置
JO3076B1 (ar) * 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
IT1395574B1 (it) 2009-09-14 2012-10-16 Guala Dispensing Spa Dispositivo di erogazione

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002046237A2 (en) * 2000-12-06 2002-06-13 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20040229330A1 (en) * 2003-02-27 2004-11-18 Bayer Pharmaceuticals Corporation Integrated method for capture and purification of tagged proteins

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Current Protocols in Cell Biology 16.3.1-16.3.12, John Wiley&Sons, Inc.(2000). *
Current Protocols in Cell Biology 16.3.1-16.3.12, John Wiley&Sons, Inc.(2000).*

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0611600A2 (pt) 2011-03-15
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