CN106519029B - 一种Aβ寡聚体抗体的制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Aβ寡聚体抗体的制备工艺，制备工艺包括以下步骤：调整上层析柱前样品的电导、pH和蛋白浓度；亲和凝胶层析；将亲和层析柱下来的洗脱液过滤，超滤，配制；病毒灭活，无菌分装。该工艺采用一步亲和层析，提纯倍数为85‑100倍，纯化获得的Aβ寡聚体抗体浓度高、靶向性明确，具有广阔的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及抗体制备技术领域，特别是涉及一种Aβ寡聚体抗体的制备工艺。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)又称老年性痴呆，最早由德国医生Alois Alzheimer于1907年发现，是一种最为常见的中枢神经系统退行性疾病。AD主要症状表现为渐进性记忆和认知功能障碍以及语言障碍等神经精神症状。随着国家人口的老龄化加剧，AD所带来的社会和经济问题将日益严峻。
AD的发病机制有多种学说，其中“β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)学说”被广泛接受为AD最主要的发病机理。Aβ分子量约4kDa，是由β淀粉样前体蛋白(β-amyloidprecursor protein，APP)水解而来。Aβ可以聚集形成具有毒性作用的Aβ寡聚体，从而导致AD的发生发展。正常人和AD患者体内均能检测到Aβ寡聚体抗体，但是AD患者体内Aβ寡聚体抗体滴度明显降低。静注人免疫球蛋白(Intravenous Immunoglobulin，IVIG)来源于数以千计献血者的血浆混样，其抗体滴度相当于正常人群平均抗体的一定浓缩倍数，其抗体谱较广。IVIG含有天然存在的Aβ寡聚体抗体，其主要针对病理相关的可溶性Aβ寡聚体。
近年来，一些临床研究表明IVIG中相应的抗体能够靶向Aβ，并能到达患者脑内起到治疗作用。但是由于该类抗体在IVIG中的含量仅为0.2％左右，同时由于人体的血脑屏障作用，只有很少的抗体能从血液循环进入脑内，因此，应用IVIG治疗AD患者时，能够进入脑内发挥疗效的Aβ寡聚体抗体水平很低，达不到有效的治疗浓度，这可能是许多AD病人应用IVIG治疗时症状没有明显改善的主要原因。IVIG来自于人血浆，资源宝贵，如果大量应用IVIG势必会造成资源的浪费。况且大剂量的IVIG可能诱发头疼、感染等一系列副作用。
虽有文献报道用亲和凝胶从IVIG中提取纯化Aβ寡聚体抗体但是其只限于实验室研究，所用凝胶不耐压(最大承受压力0.015MPa)，流速低(最大线流速25cm/h)，纯化工艺回收率低，不适合工业化生产。
发明内容
针对以上现状，本发明提供了一种Aβ寡聚体抗体的制备工艺。该工艺利用亲和层析技术纯化获得了高浓度针对Aβ寡聚体的抗体，适合工业化生产。
本发明的一种Aβ寡聚体抗体的制备工艺技术方案，包括以下步骤：
(1)调整上层析柱之前样品的电导，pH值和蛋白浓度；
(2)亲和层析分离Aβ寡聚体抗体；
(3)过滤，超滤，配制亲和层析洗脱的样品；
(4)病毒灭活，无菌分装。
步骤(1)中，所述的上层析柱之前样品为富含Aβ寡聚体抗体的料液。可以由Cohn组份I+II+III沉淀、Cohn组分I+III沉淀或者其他血浆组份制备，也可以通过基因工程技术表达。
步骤(1)中，上层析柱之前样品用0.15mol/L氢氧化钠调整pH为6.0-8.0，用层析平衡液调整电导为10-80mS/cm，蛋白浓度为5-15g/L。
步骤(2)中，亲和层析的凝胶是GE Healthcare公司的
blue、
bluehigh sub、Blue
6 Fast Flow凝胶,或BIO-RAD公司的Affi-
Blue Gel、DEAE Affi-
Blue Gel凝胶。
步骤(2)亲和层析凝胶进行亲和层析吸附后，用平衡液洗涤层析柱中的非特异性结合的抗体，用洗脱液洗脱被吸附的Aβ抗体；洗脱液用0.5-1.5mol/L甘氨酸(pH2.0)进行中和，调整pH为3.8-4.5；上样量控制为15-25个柱床体积；
所述的平衡液：含10-50mmol/L磷酸氢二钠，100-500mmol/L氯化钠，pH6.5-7.5；
所述的洗涤液：10-50mmol/L磷酸氢二钠，0.5-2mol/L氯化钠，pH6.5-7.5；
洗脱液：0.1-0.5mol/L甘氨酸，1-4mol/L氯化钠，pH9.0-11.0或者10-50mmol/L磷酸氢二钠，1-3M盐酸胍溶液，pH6.5-7.5。平衡、上样和洗脱流速为3-5mL/min；
柱保存：20％乙醇保存。
步骤(3)中，收集从亲和层析柱上洗脱得到的制品，用精度不低于1μm滤芯过滤，过滤后的溶液进行超滤、脱盐和浓缩，超滤膜孔径30KDa，超滤稀释液为：0.1-0.4mol/L甘氨酸(pH3.5-4.5)。
超滤后制品电导≤1mS/cm，用超滤稀释液将超滤后制品稀释至蛋白浓度40-60g/L。
步骤(4)中，将步骤(3)得到的制品通过0.22μm膜除菌至孵育罐内于25±1℃进行21天低pH孵育灭活病毒，然后进行无菌分装，灌装。
本发明的有益效果是：
(1)本发明的工艺将IVIG中的Aβ寡聚体抗体提纯倍数达到85-100倍，回收率为80％-100％。
(2)本发明的工艺使用的亲和层析凝胶能耐受较高的压力(0.2MPa-0.3MPa)，流速高(最大线流速为300-600cm/h)，适合工业化生产。
(3)本发明的制备方法中加入低pH孵育灭活病毒步骤，确保了制品的安全性。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
实施例1
从静注人免疫球蛋白(IVIG)中提取高浓度的Aβ寡聚体的抗体
1)对上层析柱之前样品进行电导、pH值和蛋白浓度调整
将5L IVIG成品(5％，2.5g)用0.15mol/L氢氧化钠调整样品pH至7.0，用层析平衡液调整电导为25mS/cm，样品蛋白浓度为8g/L，Aβ寡聚体抗体的纯度为0.2％。
2)亲和层析
将调整好的样品溶液通过平衡好的GE Healthcare公司的
Blue凝胶亲和层析柱。用平衡液洗涤层析柱中非特异吸附的抗体，用洗脱液洗脱被吸附的Aβ抗体。洗脱液用1.0mol/L甘氨酸(pH2.0)中和，调整pH至4.0。样品上样量为20个柱床体积。
平衡液：20mmol/L磷酸氢二钠、200mmol/L氯化钠，pH7.0；洗涤液：20mmol/L磷酸氢二钠、1.5mol/L氯化钠，pH7.0；洗脱液：0.2mol/L甘氨酸，1.5mol/L氯化钠，pH10.0。平衡，上样，洗涤和洗脱流速4ml/min。
柱保存：20％乙醇保存。
3)过滤，超滤，配制
收集从Capto Blue亲和层析柱上洗脱得到的制品，用0.22μm滤芯过滤，过滤后的制品进行超滤、脱盐和浓缩。超滤膜孔径30KDa，超滤稀释液为：0.2mol/L甘氨酸溶液(pH4.0)。超滤后制品电导≤1mS/cm。用超滤稀释液将超滤后制品稀释至蛋白浓度50g/L，Aβ寡聚体抗体的纯度为20％，回收率为85％。
4)病毒灭活，无菌分装
上述制品通过0.22μm膜除菌至孵育罐内于25±1℃进行21天低pH孵育灭活病毒。在洁净区内进行无菌分装，灌装。
实施例2
从血浆组份I+II+III沉淀中提取高浓度的Aβ寡聚体的抗体
1)从组份I+II+III沉淀制备富含IgG的料液
取血浆组分I+II+III沉淀5000g，用50L 0.02mol/L的醋酸/醋酸钠缓冲液(pH4.5)溶解，溶解结束后用0.3mol/L NaOH溶液，调pH至4.5。搅拌1h后，缓慢加入正辛酸，至溶液中正辛酸的终浓度为0.11mol/L时停止，快速搅拌2h，沉淀杂蛋白；溶液过滤后经过一步离子交换层析，得到富含IgG的料液。
2)调整上层析柱之前样品的电导、pH值和蛋白浓度。
将步骤1)得到的富含IgG的料液用0.15mol/L氢氧化钠调整pH至6.5，用层析平衡液调整电导至50mS/cm，蛋白浓度至12g/L，Aβ寡聚体抗体的纯度为0.18％。
3)亲和层析
将调整好的样品溶液通过平衡好的GE Healthcare公司的Blue
6Fast Flow亲和层析柱。用平衡液洗涤层析柱中非特异结合的抗体，用洗脱液洗脱被吸附的Aβ抗体。洗脱液用1.0mol/L甘氨酸(pH2.0)中和至pH3.8。样品上样量为25个柱床体积。
平衡液：50mmol/L磷酸氢二钠、300mmol/L氯化钠，pH6.5；洗涤液：50mmol/L磷酸氢二钠、1mol/L氯化钠，pH6.5；洗脱液：0.2mol/L甘氨酸，1.0mol/L氯化钠，pH11.0。平衡，上样，洗涤和洗脱流速3ml/min。
柱保存：20％乙醇保存。
4)将亲和层析柱下来的洗脱液过滤，超滤，配制
收集从Blue
6 Fast Flow亲和层析柱上洗脱得到的制品，用0.45μm滤芯过滤后进行超滤、脱盐和浓缩。超滤膜孔径30KDa，超滤稀释液为：0.1mol/L甘氨酸溶液(pH3.6)。超滤后制品电导≤1mS/cm。用超滤稀释液将超滤后制品稀释至蛋白浓度40g/L，Aβ寡聚体抗体的纯度为16％，回收率为90％。
5)病毒灭活，无菌分装
上述制品通过0.22μm膜除菌至孵育罐内于25±1℃进行21天低pH孵育灭活病毒。在洁净区内进行无菌分装，灌装。
Claims (4)
1.一种Aβ寡聚体抗体的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：
(1)调整上层析柱前样品的电导、pH和蛋白浓度；
所述样品为富含Aβ寡聚体抗体的静注人免疫球蛋白IVIG或血浆组份I+II+III沉淀；
上层析柱前的样品用0.15mol/L氢氧化钠调整pH为6.0-8.0，用层析平衡液调整电导为10-80mS/cm，蛋白浓度为5-15g/L；
(2)亲和层析分离Aβ寡聚体抗体；
亲和层析凝胶进行亲和层析吸附后，用平衡液洗涤层析柱中非特异结合的抗体，用洗脱液洗脱被吸附的Aβ寡聚体抗体；洗脱液用pH2.0的0.5-1.5mol/L甘氨酸中和，调整pH至3.8-4.5；上样量为15-25个柱床体积；
所述亲和层析的凝胶为GE Healthcare公司的
blue或Blue
6FastFlow；
所述的平衡液：10-50mmol/L磷酸氢二钠，100-500mmol/L氯化钠，pH6.5-7.5；
所述的洗涤液：10-50mmol/L磷酸氢二钠，0.5-2mol/L氯化钠，pH6.5-7.5；
所述的洗脱液：0.1-0.5mol/L甘氨酸，1-4mol/L氯化钠，pH9.0-11.0；平衡、上样和洗脱流速为3-5mL/min；
柱保存：20％乙醇保存；
(3)将亲和层析柱下来的洗脱液过滤，超滤，配制；
(4)病毒灭活，无菌分装。
2.根据权利要求1所述的一种Aβ寡聚体抗体的制备工艺，其特征在于，步骤(3)中，收集亲和层析洗脱的样品，用精度不低于1μm滤芯过滤后进行超滤、脱盐和浓缩，超滤膜孔径30KDa，超滤稀释液为：0.1-0.4mol/L甘氨酸，pH3.5-4.5。
3.根据权利要求2所述的一种Aβ寡聚体抗体的制备工艺，其特征在于，超滤后制品电导≤1mS/cm，用超滤稀释液将超滤后制品调整至蛋白浓度40-60g/L。
4.根据权利要求1所述的一种Aβ寡聚体抗体的制备工艺，其特征在于，步骤(4)中，将步骤(3)得到的制品通过0.22μm膜除菌至孵育罐内于25±1℃进行21天低pH孵育灭活病毒，然后无菌分装，灌装。
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