一种从尿液中制备人血白蛋白的方法
技术领域
本发明涉及人血白蛋白的制造领域,尤其涉及一种从尿液中制备人血白蛋白的方法。
背景技术
人血白蛋白(HumanSerumAlbumin,HSA)是人体血液中最重要的一种功能性蛋白质,其主要生理功能为维持血液渗透压,结合并运输小分子营养物质和药物。HSA是目前用量最大的一种蛋白药物,临床上用于治疗低蛋白血症、慢性肾炎、肝炎、肝硬化和晚期恶性肿瘤等疾病,此外,人血白蛋白还用作赋形剂和稳定剂、生产疫苗的免疫佐剂、无血清细胞培养基的组分等。
人血白蛋白主要来源于血浆,据2012年市场统计资料显示,全球每年人血白蛋白需求量达600吨以上,除美国外,其他国家大多数需要依靠部分进口,以满足需求。目前,我国的年需求量约为170吨左右,其中临床用量120吨左右,疫苗生产企业用量约40吨左右,随着我国疫苗需求量的增加,培养基级白蛋白用量迅速扩大,预计未来白蛋白市场需求将升至250吨以上,由于我国血浆供给的制约等因素,市场缺口非常大,因此,进一步扩展白蛋白的来源成为业界亟待解决的问题。目前,白蛋白的基因工程产品取得了较大的进展,EP0612761、EP0570916、US6638740B1等均公开了纯化重组人血白蛋白的方法,但这些方法制得的白蛋白容易残留微量异源蛋白引起过敏等副反应,存在重组白蛋白生理功能不确定的缺陷容易引起不可知隐患,因此其应用受到严重的限制。
资料显示,人尿中也含有白蛋白,其结构、理化性质与人血白蛋白完全一致(刘兰英等,1984,吉林大学自然科学学报,122-126),因此人尿来源的白蛋白若能得到开发利用,可在一定程度上替代血浆来源的白蛋白,从而缓解白蛋白市场的紧张局面。
本发明以中国专利ZL201010106302.9为基础,通过树脂在线吸附富集白蛋白等尿蛋白,并通过应用现代层析技术成功实现白蛋白的纯化,成本低,收率高,无免疫原性,质量稳定,适合大规模生产操作,为白蛋白的来源开辟了一条全新的渠道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的不足,提供一种从尿液中制备人血白蛋白的方法,成本低,收率高,无免疫原性,SDS-PAGE显示为单一条带,HPLC显示不含多聚体,质量稳定,适合大规模生产操作,为白蛋白的来源开辟了一条全新的渠道。
为实现上述目的,本发明从尿液中制备人血白蛋白的方法技术方案是:
一种从尿液中制备人血白蛋白的方法,收集已吸附尿蛋白的树脂,进行清洗处理,还包括如下步骤:
a)尿蛋白解吸附,得到尿蛋白浓缩液;
b)采用平衡液平衡好的金属螯合亲和层析柱层析,冲洗液洗脱收集洗脱峰;
c)采用平衡液平衡好的阴离子层析柱层析,上样上一步的洗脱峰,冲洗液洗脱收集洗脱峰;
d)采用平衡液平衡好的疏水层析柱层析,上样上一步的洗脱峰,冲洗液洗脱收集洗脱峰;
e)采用平衡液平衡好的阴离子交换层析,上样上一步的洗脱峰,冲洗液洗脱收集洗脱峰,得到人血白蛋白。
步骤a)利用0.5-1.5M的NaCl溶液进行尿蛋白的解吸附。
步骤d)和步骤e)之间增加一个去病毒步骤,调节步骤d)中的洗脱液蛋白质浓度至20%-25%,加入辛酸钠作为保护剂,进行60℃加热处理10小时。
步骤b)中金属螯合亲和层析柱的螯合金属离子是Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+中的任意一种。优选Cu2+。
步骤b)中尿蛋白浓缩液上金属螯合亲和层析柱之前超滤浓缩,调节pH4-8,电导0.5-10mS/cm,平衡液为0.02-0.2M醋酸盐或磷酸盐缓冲液,NaCl浓度为0.2-2.0M,洗脱液为0.02-0.2M磷酸盐溶液,0.5-1.5MNH4Cl,pH6.0-8.4。平衡液优选0.02M醋酸盐缓冲液,NaCl浓度为0.5M,洗脱液优选配0.02M磷酸盐,1.0MNH4Cl,pH8.0。
在洗脱之前加入冲洗步骤,用pH5.0-8.0,NH4Cl浓度≤0.5M的冲洗液冲洗金属螯合亲和层析柱,所述的冲洗液缓冲介质为0.02-0.2M磷酸盐或者醋酸盐。冲洗液优选0.02M磷酸盐,0.2MNH4Cl,pH6.0。
步骤c)中的阴离子层析柱平衡液为0.02-0.2M磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液,pH5-8;洗脱液为0.05-1.0M磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液,pH4-8。平衡液优选0.02M磷酸盐缓冲液,pH6.0,洗脱液优选0.5M醋酸盐缓冲液,pH5.0。
步骤d)洗脱峰上疏水层析柱之前对洗脱峰进行超滤浓缩液调节pH和电导,pH6-9,电导5.0-10mS/cm。
步骤d)中的疏水层析柱平衡液为0.02-0.2M磷酸盐缓冲液,(NH4)2SO4浓度为0.5-2.0M,pH6-9,洗脱液为0.02-0.2M磷酸盐缓冲液,(NH4)2SO4浓度为0.2-1.0M,pH6-9。平衡液优选0.02M磷酸盐缓冲液,(NH4)2SO4浓度为1.5M,pH7.0,洗脱液优选0.02M磷酸盐缓冲液,(NH4)2SO4浓度为0.5M,pH7.0。
步骤e)洗脱峰上阴离子交换柱之前对洗脱峰进行超滤浓缩,调节pH6-9,电导0.5-5.0mS/cm。
步骤e)中的阴离子交换层析柱平衡液为0.02-0.2M磷酸盐缓冲液,NaCl浓度为0.1-1.0M,pH6-9;洗脱液为0.02-0.2M磷酸盐缓冲液,NaCl浓度为0.5-2.0M,pH6-9。平衡液优选0.02M磷酸盐缓冲液,NaCl浓度为0.2M,pH7.0,洗脱液优选0.02M磷酸盐缓冲液,NaCl浓度为1.0M,pH7.0。
本发明与现有技术相比,具有以下优点:
本发明纯化的白蛋白与传统cohn法生产的人血白蛋白理化性质、生物学性质完全一致;
纯人源性产品,无异源蛋白污染,更安全可靠;
本发明白蛋白产品几乎不含多聚体,控制了内毒素含量,提高了白蛋白的稳定性,纯度比cohn法制得血浆白蛋白高,可达99%以上,产品各项质量指标均符合国家药典标准;
本发明利用在线吸附法可富集多种尿蛋白,并通过与乌司他丁、人尿激肽原酶等尿蛋白进行联产,大幅度降低成本,使其更加具有产业化基础;
本发明操作方便,适用于大规模生产。
附图说明
图1为本发明步骤实施流程图。
图2为本发明制得的白蛋白纯品SDS-PAGE图。
图3为本发明制得的白蛋白纯品HPLC图。
图4为市面上在售的人血白蛋白药品肽图。
图5为本发明制得的白蛋白纯品肽图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式,进一步阐明本发明,应理解这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围,在阅读了本发明之后,本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
一种从尿液中制备人血白蛋白的方法,收集已吸附尿蛋白的树脂,进行清洗、解吸处理。
a)利用0.5-1.5M的NaCl溶液进行尿蛋白的解吸附;
b)洗脱峰超滤浓缩后调节pH4-8,电导0.5-10mS/cm,上样已平衡好的金属螯合亲和层析柱,平衡液为0.02-0.2M醋酸盐或磷酸盐缓冲液,NaCl浓度为0.2-2.0M,用pH5.0-8.0,NH4Cl浓度≤0.5M的冲洗液冲洗,所述的冲洗液缓冲介质为0.02-0.2M磷酸盐或者醋酸盐;用0.02-0.2M磷酸盐,0.5-1.5MNH4Cl,pH6.0-8.4洗脱液洗脱,收集洗脱峰;
c)洗脱峰超滤浓缩调节pH和电导,pH6-9,电导0.2-2mS/cm,上样阴离子交换柱,平衡液冲洗,洗脱液洗脱,收集洗脱峰,平衡液为0.02-0.2M磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液,pH5-8;洗脱液为0.05-1.0M磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液,pH4-8;
d)洗脱峰超滤浓缩,调节pH6-9,电导5.0-10mS/cm,上样疏水层析柱,平衡液冲洗,洗脱液洗脱,收集洗脱峰,平衡液为0.02-0.2M磷酸盐缓冲液,(NH4)2SO4浓度为0.5-2.0M,pH6-9,洗脱液为0.02-0.2M磷酸盐缓冲液,(NH4)2SO4浓度为0.2-1.0M,pH6-9;
e)洗脱峰超滤后调节pH6—9,电导0.5-5mS/cm,上阴离子交换层析柱,平衡液冲洗,洗脱液洗脱,收集洗脱峰,平衡液为0.02-0.2M磷酸盐缓冲液,NaCl浓度为0.1-1.0M,pH6-9;洗脱液为0.02-0.2M磷酸盐缓冲液,NaCl浓度为0.5-2.0M,pH6-9。
步骤d)和步骤e)之间增加一个去病毒步骤,调节步骤d)中的洗脱液蛋白质浓度至20%-25%,加入辛酸钠作为保护剂,进行60℃加热病毒灭活处理10小时。
实施例1
a金属螯合亲和层析
收集吸附尿蛋白的树脂100公斤,用饮用水冲洗干净,装柱;用0.5M的NaCl进行洗脱,收集洗脱峰,测得其中的白蛋白含量为5.60g。
用截留分子量30K的超滤膜进行超滤浓缩,将超滤浓缩液调节pH至4.0,电导至0.5mS/cm,上已经平衡好的金属离子为Cu2+的金属螯合亲和层析柱(ChelatingsepharoseFF);再用平衡液(平衡液配方:0.2M醋酸盐缓冲液,2.0MNaCl,pH4.0)冲洗金属螯合亲和层析柱,收集上样穿透液和冲洗穿透液,用0.2M的磷酸盐缓冲液,0.1M氯化铵(pH5.0)冲洗,用0.2M磷酸盐,0.5M氯化铵(pH6.0)洗脱金属螯合亲和层析柱,收集洗脱峰(A液)。
b阴离子交换层析
A液上样DEAE-琼脂糖凝胶柱,结合缓冲浓度为0.2M磷酸盐缓冲液,pH为8.0。洗脱液为1.0M磷酸盐缓冲液,pH为8.0。
其中,步骤a中A液调节pH和电导,pH调至8.0,电导1.0mS/cm,上阴离子交换柱,平衡液冲洗,洗脱液洗脱,收集洗脱峰(B液)。
c疏水层析
疏水介质为Phenyl—琼脂糖凝胶柱,平衡液平衡(平衡液配方:0.02M磷酸盐缓冲液,0.5M硫酸铵,pH6.0),将B液调节pH至6.0,电导调至5.0mS/cm,上疏水柱,平衡液冲洗,洗脱液洗脱(洗脱液配方:0.02M磷酸盐缓冲液,0.2M硫酸铵,pH6.0),收集洗脱峰,超滤得溶液C。
d阴离子交换层析
溶液C超滤后调节蛋白浓度为20%,加入0.01M辛酸钠,60℃加热处理10小时,调节电导至1.0mS/cm,pH至6.0,上样已平衡好的阴离子交换柱(平衡液配方:0.02M磷酸盐缓冲液,0.1MNaCl,pH6.0),平衡液冲洗,洗脱液洗脱(洗脱液配方:0.02M磷酸盐缓冲液,0.5MNaCl,pH6.0),收集洗脱液,测得白蛋白总含量为3.48g,纯度高于96%。
实施例2:
a金属螯合亲和层析
收集吸附尿蛋白的树脂100公斤,用饮用水冲洗干净,装柱;用1.5M的NaCl进行洗脱,收集洗脱峰,测得其中的白蛋白含量为4.8g。
用截留分子量30K的超滤膜进行超滤浓缩,将超滤浓缩液调节pH至8.0,电导至10mS/cm,上已经平衡好的金属离子为Zn2+的金属螯合亲和层析柱(ChelatingsepharoseFF),再用平衡液(平衡液配方:0.02M磷酸盐缓冲液,0.2MNaCl,pH8.0)冲洗金属螯合亲和层析柱,收集上样穿透液和冲洗穿透液,用0.02M的磷酸盐缓冲液,0.5M氯化铵(pH8.0)冲洗,用0.02M磷酸盐,1.5M氯化铵(pH8.4)洗脱金属螯合亲和层析柱,收集洗脱峰(A液)。
b阴离子交换层析
以DEAE-琼脂糖凝胶柱为例,对白蛋白的结合条件和洗脱条件进行优化。白蛋白的结合缓冲浓度为0.02M磷酸盐缓冲液,pH为5.0。洗脱液为0.05M醋酸盐缓冲液,pH为4.0。
步骤a中,A液调节pH和电导,pH调至5.0,电导0.2mS/cm,上阴离子交换柱,平衡液冲洗,洗脱液洗脱,收集洗脱峰(B液)。
c疏水层析
疏水层析介质为Phenyl-琼脂糖,平衡液平衡(平衡液配方:0.2M磷酸盐缓冲液,2.0M硫酸铵,pH9.0),将B液调节pH至9.0,电导调至10mS/cm,上疏水柱,平衡液冲洗,洗脱液洗脱(洗脱液配方:0.2M磷酸盐缓冲液,1.0M硫酸铵,pH9.0),收集洗脱峰,超滤得溶液C。
d阴离子交换层析
溶液C超滤后调节蛋白浓度为25%,加入0.01M辛酸钠,60℃加热处理10小时,调节电导至5.0mS/cm,pH至9.0,上样已平衡好的阴离子交换柱(平衡液配方:0.2M磷酸盐缓冲液,1.0MNaCl,pH9.0),平衡液冲洗,洗脱液洗脱(洗脱液配方:0.2M磷酸盐缓冲液,2.0MNaCl,pH9.0),收集洗脱峰,测得白蛋白总量为2.88g,纯度高于98%。
实施例3:
a金属螯合亲和层析
收集吸附尿蛋白的树脂5吨,用饮用水冲洗干净,装柱;用0.8M的NaCl进行洗脱,收集洗脱峰,测得其中的白蛋白含量为216.00g。
用截留分子量30K的超滤膜进行超滤浓缩,将超滤浓缩液调节pH至6.0,电导至5.0mS/cm,上已经平衡好的金属离子为Cu2+的金属螯合亲和层析柱(ChelatingsepharoseFF);再用平衡液(平衡液配方:0.1M磷酸盐缓冲液,1.0MNaCl,pH6.0)冲洗金属螯合亲和层析柱,收集上样穿透液和冲洗穿透液,用0.1M的磷酸盐缓冲液,0.3M氯化铵(pH7.0)冲洗,用0.1M磷酸盐,1.0M氯化铵(pH7.0)洗脱金属螯合亲和层析柱,收集洗脱峰(A液)。
b阴离子交换层析
A液上样DEAE-琼脂糖凝胶柱,结合缓冲浓度为0.1M磷酸盐缓冲液,pH为7.0。洗脱液为0.5M磷酸盐缓冲液,pH为6.0。
其中,步骤a中A液调节pH和电导,pH调至7.0,电导2.0mS/cm,上阴离子交换柱,平衡液冲洗,洗脱液洗脱,收集洗脱峰(B液)。
c疏水层析
平衡液平衡Phenyl-琼脂糖凝胶柱(平衡液配方:0.1M磷酸盐缓冲液,1.5M硫酸铵,pH7.0),将B液调节pH至7.0,电导调至8.0mS/cm,上疏水柱,平衡液冲洗,洗脱液洗脱(洗脱液配方:0.1M磷酸盐缓冲液,0.5M硫酸铵,pH7.0),收集洗脱峰,超滤得溶液C。
d阴离子交换层析
溶液C超滤后调节蛋白浓度为20%,加入0.01M辛酸钠,60℃加热处理10小时,调节电导至0.5mS/cm,pH至7.0,上样已平衡好的阴离子交换柱(平衡液配方:0.1M磷酸盐缓冲液,0.5MNaCl,pH7.0),平衡液冲洗,洗脱液洗脱(洗脱液配方:0.1M磷酸盐缓冲液,1.2MNaCl,pH7.0),收集洗脱液,测得白蛋白总含量为136.59g,纯度高于99%。