CN109575122B - 尿微量白蛋白免疫原及其制备方法、多克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种尿微量白蛋白免疫原及其制备方法、多克隆抗体及其制备方法、检测试剂、检测试纸。该尿微量白蛋白免疫原的制备方法包括以下步骤：纯化尿液中的尿微量白蛋白；及将尿微量白蛋白经热处理及冷处理而部分变性，热处理的温度为55℃～65℃，冷处理的温度为0℃～5℃，得到尿微量白蛋白免疫原。以该尿微量白蛋白免疫原免疫得到的多克隆抗体的在检测尿微量白蛋白上准确性高。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，特别是涉及一种尿微量白蛋白免疫原及其制备方法、多克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
尿微量白蛋白(mAlB)是临床评估肾功能损伤程度的重要指标，依托于生化分析仪的生化检测是检测该指标的重要手段。依受检者病变程度不同，临床生化检测结果中mAlB含量差异非常大。正常人尿液中mAlB含量为0.01mg/mL左右，而严重肾病变患者mAlB含量可能高达40mg/mL～50mg/mL。因此，临床应用中，mAlB高值阳性样本，由传统的尿微量白蛋白作为免疫原制备得到的mAlB多克隆抗体来检测高值阳性样本中的尿微量白蛋白时，因mAlB高值阳性样本中的尿微量白蛋白超过了mAlB多克隆抗体的检测上限而出现漏检。而对于mAlB低值阳性样本，由传统的尿微量白蛋白作为免疫原制备得到的mAlB多克隆抗体的灵敏度及特异性不足而容易误判为阳性。
发明内容
基于此，有必要针对尿微量白蛋白的多克隆抗体存在的漏检和假阳性问题，提供一种尿微量白蛋白免疫原的制备方法。
一种尿微量白蛋白免疫原的制备方法，包括以下步骤：
将所述尿微量白蛋白经热处理及冷处理而部分变性，所述热处理的温度为55℃～65℃，所述冷处理的温度为0℃～5℃，得到所述尿微量白蛋白免疫原。
经大量研究发现，以传统方法制备的尿微量白蛋白免疫原制备得到的多克隆抗体对检测尿微量白蛋白的有效检测浓度范围比较窄，特异性有限，因此常出现假阳性或者高值阳性样本(样本中尿微量白蛋白的含量高的样本)漏检的情况。而以上述尿微量白蛋白免疫原的制备方法制备得到尿微量白蛋白免疫原所制备得到的多克隆抗体，则对尿微量白蛋白有较宽的有效检测浓度范围，特异性高，能够有效提高多克隆抗体在检测尿微量白蛋白上的准确性，减少漏检或者假阳性。
在其中一个实施例中，所述热处理的温度为57℃～65℃。
在其中一个实施例中，所述热处理的时间为30min～60min；及/或
所述冷处理的时间为1h以上。
在其中一个实施例中，在将所述尿微量白蛋白经热处理及冷处理而部分变性的步骤中，所述冷处理在避光的条件进行。
一种尿微量白蛋白免疫原，由上述尿微量白蛋白免疫原的制备方法制备得到。
一种多克隆抗体，上述的尿微量白蛋白免疫原制备得到。
一种多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
以上述尿微量白蛋白免疫原免疫活体，得到所述多克隆抗体。
一种尿微量白蛋白的检测试剂，包括上述多克隆抗体或上述多克隆抗体的制备方法制得的多克隆抗体。
一种尿微量白蛋白的检测试纸，包括上述尿微量白蛋白的检测试剂。
一种尿微量白蛋白的检测试剂盒，包括上述尿微量白蛋白的检测试剂或上述尿微量白蛋白的检测试纸。
附图说明
图1为实施例6的多克隆抗体与市售多克隆抗体的反应度对比图；
图2为实施例7的多克隆抗体与市售多克隆抗体的反应度对比图；
图3为实施例8的多克隆抗体与市售多克隆抗体的反应度对比图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的部分实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
一实施方式的尿微量白蛋白免疫原的制备方法，包括以下步骤：
S110、纯化尿液中的尿微量白蛋白。
具体地，纯化尿液中的尿微量白蛋白的步骤包括以下操作：
S111、粗纯。
具体地，将尿液经盐析，得到尿微量白蛋白粗产品。
在其中一个实施例中，将尿液经硫酸铵盐析处理，得到尿微量白蛋白粗产品。进一步地，硫酸铵的饱和度为40％～55％。更进一步地，硫酸铵的饱和度为40％、50％或55％。当然，在其他一些实施例中，还可以采用其他盐(比如氯化钠、硫酸钠等)对尿液进行盐析处理。可以理解的是，得到尿微量白蛋白粗产品的方式还可以是除盐析外的其他本领域熟知的方式。
在其中一个实施例中，尿液为人的尿液。进一步地，尿液来自尿微量白蛋白含量高于正常值的病人。
S112、将尿微量白蛋白粗产品进行层析处理，得到尿微量白蛋白中级纯化品。
具体地，层析处理选自离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析及亲和层析中的至少一种。
在其中一个实施例中，将尿微量白蛋白粗产品透析至缓冲液，然后上亲和层析柱，并依次经过0％～20％线性洗杂、100％一步洗脱，得到尿微量白蛋白中级纯化品。具体地，将尿微量白蛋白粗产品透析至5mM～20mM的磷酸盐(盐的名称)缓冲液，离心、取上清上样至亲和层析柱，并依次经过0％-20％线性洗杂、100％一步洗脱。其中，层析的填料为Affic-blue、DEAE或phenyl。洗脱液为氯化钠、氯化锂或硫酸钠。
在其中一个实施例中，在亲和层析处理之后还包括除IgG的步骤。具体地，将收集亲和层析的洗脱组分，然后过ProteinG柱，收集流穿样，得到尿微量白蛋白中级纯化品。ProteinG柱能够使得IgG杂蛋白结合在ProteinG柱上而除去IgG杂蛋白。
可以理解的是，在其他一些实施例中，还可以采用本领域常用的除亲和层析外的其他去除杂蛋白的方式对尿微量白蛋白粗产品进行处理，比如DEAE、切向流超滤等。当然，采用层析也可以是多种不同层析的结合，比如先将尿微量白蛋白粗产品过亲和层析柱，然后过凝胶层析柱等。只要能够对尿微量白蛋白粗产品进一步纯化即可。
S113、将尿微量白蛋白中级纯化品进行超滤浓缩，得到尿微量白蛋白浓缩物。
具体地，将尿微量白蛋白中级纯化品用超滤膜包、中空纤维膜包或超滤浓缩管浓缩，得到尿微量白蛋白浓缩物。其中，尿微量白蛋白浓缩物中尿微量白蛋白的浓度在20mg/mL以上。进一步地，超滤膜包、中空纤维膜包或超滤浓缩管的孔径为10kd或20kd。超滤浓缩的目的是将含有尿微量白蛋白的溶液进一步纯化及浓缩。可以理解的是，在其他一些实施例中，步骤S113可以省略。
S114、将尿微量白蛋白浓缩物进行凝胶过滤层析，得到纯化后的尿微量白蛋白。
具体地，将尿微量白蛋白浓缩物进行凝胶过滤层析，进一步除去其余杂质蛋白，收集主峰，得到尿微量白蛋白。进一步地，凝胶过滤层析的填料为superdex200、superdex100或superdex75。可以理解的是，在一些实施例中，可以先进行步骤S114，后进行步骤S113。
S120、将尿微量白蛋白进行热处理及冷处理而部分变性，得到尿微量白蛋白免疫原。
具体地，先将尿微量白蛋白进行热处理，然后进行冷处理，得到尿微量白蛋白免疫原。
在其中一个实施例中，将尿微量白蛋白在55℃～65℃处理30min～60min后，在0℃～5℃至少处理1h。优选地，热处理的温度为57℃～65℃。
在其中一个实施例中，热处理的温度为56℃、58℃、60℃、61℃、63℃或65℃。热处理的时间为30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min。
在其中一个实施例中，将尿微量白蛋白热处理后，立即冷处理。进一步地，冷处理的温度为0℃～5℃。冷处理的时间为1h以上。优选地，冷处理的时间为1h、2h、4h、6h、8h、10h或12h.。
在其中一个实施例中，在将尿微量白蛋白进行热处理及冷处理而部分变性的步骤中，冷处理在避光的条件下进行。
上述尿微量白蛋白免疫原的制备方法的制备工艺简便。
一种尿微量白蛋白免疫原，由上述尿微量白蛋白免疫原的制备方法制得。
一实施方式的多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
将上述尿微量白蛋白免疫原免疫活体，得到多克隆抗体。
具体地，将上述尿微量白蛋白免疫原注射入活体内进行免疫，然后采集血清，分离纯化后，得到多克隆抗体。
在其中一个实施例中，活体选自羊、兔及小鼠中的一种。
在其中一个实施例中，用上述尿微量白蛋白免疫原对活体进行多次免疫，取末次免疫后的血清，然后进行分离纯化，得到多克隆抗体。
在其中一个实施例中，将上述尿微量白蛋白免疫原由皮下注射进入山羊体内，免疫计量为每只2mg/针，每间隔7～15天注射一次，第5～7针后采集血清，然后纯化和提纯mAlB多克隆抗体，其中，第一针由弗氏完全佐剂作为免疫佐剂，其余的免疫佐剂为弗氏不完全佐剂；注射方式采用皮下多点注射。
在其中一个实施例中，分离纯化的步骤包括：将免疫得到的血清经硫酸葡聚糖脱脂处理，50％硫酸铵沉淀。当然，在其他一些实施例中也可以采用本领域常用的其他方法来从血清中纯化上述多克隆抗体。
上述多克隆抗体的制备方法简便易行。
一种多克隆抗体，能够抗尿微量白蛋白，由上述多克隆抗体的制备方法制得。
经证实，按照上述多克隆抗体的制备方法制备得到的多克隆抗体，不仅对低浓度的尿微量白蛋白的反应度高，对高浓度的尿微量白蛋白的反应度也高，从而对尿微量白蛋白有效检测浓度范围宽、特异性高，能够有效提高多克隆抗体在检测尿微量白蛋白上的准确性，减少漏检或者假阳性。
上述多克隆抗体在制备尿微量白蛋白的检测试剂中的应用。
具体地，一种尿微量白蛋白的检测试剂，包括上述多克隆抗体。
上述尿微量白蛋白的检测试剂在制备尿微量白蛋白的检测试纸中的应用。
具体地，一种尿微量白蛋白的检测试纸，包括上述尿微量白蛋白的检测试剂。
上述尿微量白蛋白的检测试剂或在上述尿微量白蛋白的检测试纸在制备尿微量白蛋白的检测试剂盒中的应用。
具体地，一种尿微量白蛋白的检测试剂盒，包括上述尿微量白蛋白的检测试剂或上述尿微量白蛋白的检测试纸。
上述尿微量白蛋白的检测试剂、上述尿微量白蛋白的检测试纸、上述尿微量白蛋白的检测试剂盒均包括上述多克隆抗体，能够对尿微量白蛋白有较宽的有效检测浓度范围，能够有效提高多克隆抗体在检测尿微量白蛋白上的准确性，减少漏检或者假阳性。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例，如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
纯化尿液中的尿微量白蛋白
(1)将来自肾病科临床病人的尿液经50％饱和度的硫酸铵盐析处理，沉淀部分杂蛋白，取上清，得到尿微量白蛋白粗产品。
(2)将尿微量白蛋白粗产品透析至10mM的磷酸盐缓冲液，离心，取上清上affic-blue亲和层析柱(填料affic-blue来自美国公司Bio-Rad)，并依次经过0％～20％B(含1.4MNaCl的磷酸盐缓冲液，PBS)线性洗杂、100％B一步洗脱，收集affic-blue100％亲和层析的洗脱组分，然后过ProteinG柱，收集流穿样，得到尿微量白蛋白中级纯化品。
(3)将尿微量白蛋白中级纯化品用20kd的超滤膜包进行超滤浓缩处理，得到尿微量白蛋白浓度达到20mg/mL的尿微量白蛋白浓缩物。
(4)将尿微量白蛋白浓缩物进行凝胶过滤层析，收集主峰，得到尿微量白蛋白。其中，凝胶过滤层析的填料为superdex75。
实施例2
制备尿微量白蛋白免疫原
(1)将实施例1制备的尿微量白蛋白的浓度调至3mg/mL，然后在55℃热水浴处理30min后，立即在避光条件下0℃冰浴处理2h，得到尿微量白蛋白免疫原。
(2)采用比浊法测试(1)得到的尿微量白蛋白免疫原的反应度。实施例2的检测结果如表1所示。
实施例3
(1)将实施例1制备的尿微量白蛋白的浓度调至3mg/mL，然后在63℃热水浴处理30min后，立即在避光条件下0℃冰浴处理2h，得到尿微量白蛋白免疫原。
(2)采用比浊法测试(1)得到的尿微量白蛋白免疫原的反应度。实施例3的检测结果如表1所示。
实施例4
(1)将实施例1制备的尿微量白蛋白的浓度调至3mg/mL，然后在65℃热水浴处理30min后，立即在避光条件下0℃冰浴处理2h，得到尿微量白蛋白免疫原。
(2)采用比浊法测试(1)得到的尿微量白蛋白免疫原的反应度。实施例4的检测结果如表1所示。
实施例5
(1)将实施例1制备的尿微量白蛋白的浓度调至3mg/mL，然后在65℃热水浴处理40min后，立即0℃冰浴并避光处理2h，得到尿微量白蛋白免疫原。
(2)采用比浊法测试(1)得到的尿微量白蛋白免疫原的反应度。实施例5的检测结果如表1所示。
对比例1
(1)将实施例1制备的尿微量白蛋白的浓度调至3mg/mL，然后10mM PB+150mM NaClPH7.4体系(1xPBS)，用6M Urea(尿素)+0.1Mβ-巯基乙醇，37℃处理2h，透析入PBS，得到尿微量白蛋白免疫原。
(2)采用比浊法测试(1)得到的尿微量白蛋白免疫原的反应度。对比例1的检测结果如表1所示。
对比例2
(1)将实施例1制备的尿微量白蛋白的浓度调至3mg/mL，然后6MGua-HCl，37度处理3h，透析入PBS，得到尿微量白蛋白免疫原。
(2)采用比浊法测试(1)得到的尿微量白蛋白免疫原的反应度。对比例2的检测结果如表1所示。
对比例3
(1)将实施例1制备的尿微量白蛋白的浓度调至3mg/mL，然后在4℃条件下，0.4mg/mL的胰蛋白酶4度酶切8h，透析入PBS，得到尿微量白蛋白免疫原。
(2)采用比浊法测试(1)得到的尿微量白蛋白免疫原的反应度。对比例3的检测结果如表1所示。
对比例4
(1)将实施例1制备的尿微量白蛋白的浓度调至3mg/mL，然后20％葡萄糖37℃处理5天，使尿微量白蛋白被糖分子修饰，得到尿微量白蛋白免疫原。
(2)采用比浊法测试(1)得到的尿微量白蛋白免疫原的反应度。对比例4的检测结果如表1所示。
对比例5
(1)将实施例1制备的尿微量白蛋白的浓度调至3mg/mL，然后100V的SDS-PAGE恒压分离后，切下尿微量白蛋白位置的胶条，装入透析袋，在40mA条件下电洗脱处理4h，得到尿微量白蛋白免疫原。
(2)采用比浊法测试(1)得到的尿微量白蛋白免疫原的反应度。对比例5的检测结果如表1所示。
对比例6
(1)将实施例1制备的尿微量白蛋白的浓度调至3mg/mL，然后在52℃热水浴处理30min后，立即在避光条件下0℃冰浴处理2h，得到尿微量白蛋白免疫原。
(2)采用比浊法测试(1)得到的尿微量白蛋白免疫原的反应度。对比例6的检测结果如表1所示。
对比例7
(1)将实施例1制备的尿微量白蛋白的浓度调至3mg/mL，然后在68℃热水浴处理30min后，立即在避光条件下0℃冰浴处理2h，得到尿微量白蛋白免疫原。
(2)采用比浊法测试(1)得到的尿微量白蛋白免疫原的反应度。对比例7的检测结果如表1所示。
表1
实施例6
制备多克隆抗体
(1)将实施例3制备得到的尿微量白蛋白免疫原由皮下多点注射进入山羊体内，免疫计量为每只2mg/针，每间隔15天注射一次，第7针后采集血清其中，第一针的免疫佐剂为弗氏完全佐剂，其余的免疫佐剂为弗氏不完全佐剂。
(2)将得到的血清经硫酸葡聚糖脱脂处理，50％硫酸铵沉淀，得到抗尿微量白蛋白多克隆抗体。
(3)将(2)得到的多克隆抗体和市售的尿微量白蛋白多克隆抗体分别采用比浊法测定反应度。测定结果如图1所示。
由图1可知，由实施例3的尿微量白蛋白免疫原制备得到的多克隆抗体不仅对低浓度的尿微量白蛋白的反应度高，对高浓度的尿微量白蛋白的反应度也高。
实施例7
实施例7的步骤大致与实施例6相同，其不同在于，实施例7的免疫原为实施例4所制备得到的尿微量白蛋白免疫原。
实施例7得到的多克隆抗体和市售的尿微量白蛋白多克隆抗体的与尿微量白蛋白的反应度对比图如图2所示。
由图2可知，由实施例4的尿微量白蛋白免疫原制备得到的多克隆抗体不仅对低浓度的尿微量白蛋白的反应度高，对高浓度的尿微量白蛋白的反应度也高。
实施例8
实施例8的步骤大致与实施例6相同，其不同在于，实施例8的免疫原为实施例5所制备得到的尿微量白蛋白免疫原。
实施例8得到的多克隆抗体和市售的尿微量白蛋白多克隆抗体的反应度对比图如图3所示。
由图3可知，由实施例5的尿微量白蛋白免疫原制备得到的多克隆抗体不仅对低浓度的尿微量白蛋白的反应度高，对高浓度的尿微量白蛋白的反应度也高。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (6)
1.一种尿微量白蛋白免疫原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
纯化尿液中的尿微量白蛋白；及
将所述尿微量白蛋白经热处理及冷处理而部分变性，所述热处理的温度为55℃～65℃，所述冷处理的温度为0℃～5℃，所述冷处理在避光的条件下进行，得到所述尿微量白蛋白免疫原，其中，所述热处理的时间为30min～60min，所述冷处理的时间为1h以上。
2.根据权利要求1所述的尿微量白蛋白免疫原的制备方法，其特征在于，所述热处理的温度为57℃～65℃。
3.根据权利要求1所述的尿微量白蛋白免疫原的制备方法，其特征在于，所述冷处理的时间为1h～12h。
4.根据权利要求1～3任一项所述的尿微量白蛋白免疫原的制备方法，其特征在于，所述纯化尿液中的尿微量白蛋白的步骤包括：
将尿液盐析，得到尿微量白蛋白粗产品；
将所述尿微量白蛋白粗产品进行层析处理，得到尿微量白蛋白中级纯化品；
将所述尿微量白蛋白中级纯化品进行超滤浓缩，得到尿微量白蛋白浓缩物；及
将所述尿微量白蛋白浓缩物进行凝胶过滤层析，得到纯化后的尿微量白蛋白。
5.根据权利要求4所述的尿微量白蛋白免疫原的制备方法，其特征在于，在将所述尿微量白蛋白粗产品进行层析处理的步骤中，所述层析选自离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析及亲和层析中的至少一种。
6.根据权利要求4所述的尿微量白蛋白免疫原的制备方法，其特征在于，在将尿液盐析的步骤中，采用硫酸铵、氯化钠或硫酸钠盐析尿液。
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| Comparison and development of two different solid phase chemiluminescence ELISA for the determination of albumin in urine;Lixia Zhao等;《Analytica Chimica Acta》;20050613;第541卷(第1-2期);第197-205页 * |
| 人血清白蛋白抗体的制备及多种免疫学方法的初步建立;蒋琴;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20100815(第08期);E059-76 * |
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