CN115389291A - 一种尿液微量蛋白的富集、纯化和保护方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种尿液微量蛋白的富集、纯化和保护方法，属于生物化学分析技术领域。所述的富集、纯化和保护方法由尿液微量蛋白富集方法、纯化方法、保护方法三部分组成，本发明的尿液微量蛋白富集方法采用饱和盐溶液盐析沉淀；尿液微量蛋白纯化方法采用脱盐分子筛进行纯化；尿液微量蛋白保护方法采用组合成分蛋白保护剂进行保护。该方法具有操作简单、富集性高、纯度高和蛋白活性好等特点；该尿液微量蛋白富集、纯化和保护方法确保临床患者尿液中微蛋白定量检测结果的稳定。
Description
技术领域
本申请属于生物化学分析技术领域，具体涉及一种从尿液中富集、纯化和保护尿液微量蛋白的方法。
背景技术
尿液由人血浆经肾小球滤过和肾小管重吸收实现人体废物排出，维持人体各体液的稳态平衡。正常生理状态时，肾小球过滤膜具有分子筛屏障和电荷屏障的作用；微蛋白的分子量大约为70KD且带有负电荷，因此不能通过肾小球的保护屏障，尿液中不会出现各种大量微蛋白。病理状态时，尿液中微量蛋白出现的种类包括：α1-微球蛋白、α2-微球蛋白、β1-微球蛋白、β2-微球蛋白、转铁蛋白、IgA 蛋白、肌红蛋白、游离血红蛋白、IgG蛋白、尿白蛋白和视黄醇结合蛋白等；当肾小球分子筛屏障和电荷屏障发生病理改变而使其完整性受到损害，蛋白滤过增加超过肾小管髓袢的重吸收阈值，从而会在尿液中出现各微球蛋白，另外当肾小管的髓袢发生病理改变而使完整性受到损害，导致髓袢蛋白和离子的重吸收发生障碍而尿液中出现各种大量的微蛋白；在剧烈运动或劳累时，肾小球滤过膜具有分子筛屏障和电荷屏障出现非器质性病理改变时，在尿液中会出现血红蛋白和肌红蛋白。
尿液中蛋白的变化是评价泌尿系统损伤的重要临床检验指标，从尿液中微量蛋白出现的种类不同可推断出肾脏损伤的部位，如：尿液中α1-微球蛋白出现时，可推断出肾小球过滤膜出现问题；尿液中 IgA蛋白出现时，可推断出肾小管髓袢损伤后蛋白重吸收出现问题，由此可推断出肾小管的损伤，因此在尿液检测中评价尿微量蛋白的变化，可以准确预测肾脏的损伤部位。临床检验中，尿液中成分极为复杂和受饮食影响个体间差异较大，尿液中蛋白是微量同时存在大量非免疫反应蛋白，临床上尿微量蛋白定量分析时24小时尿液样本保存过程中，也会出现蛋白的降解或者变性腐败，造成蛋白样本与抗体不发生反应，从而导致检测结果不准确，不能实现早期微量蛋白变化的准确分析，目前，保持尿液样本中各微量蛋白的稳定是目前临床上一个急需解决的问题，传统的保护方法不能解决上述问题。
因此，本申请的目的是开发一种及时的尿液微量富集、纯化和保护方法，以确保尿液样本稳定以满足临床检验的合格样本要求。
发明内容
基于现有技术中存在的不足，本申请旨在提供一种尿液微量蛋白的富集、纯化和保护方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一种尿液微量蛋白的富集、纯化和保护方法，包括以下步骤：
（1）尿液样品除杂：取尿液样品进行离心，去除尿液中的残渣，保留上清液备用；
（2）尿液微量蛋白盐析沉淀：取步骤（1）得到的上清液加入蛋白盐析沉淀饱和盐溶液，静置，得到固液分离的尿液；
（3）尿液沉淀样本离心：取步骤（2）中固液分离的尿液离心，去除上清液，保留离心管底的沉淀蛋白，备用；
（4）尿液微量蛋白重悬：使用去离子蒸馏水对步骤（3）中的沉淀蛋白进行溶解、重悬，移液器吹打混匀，得到重悬液；
（5）尿液微量蛋白脱盐：取步骤（4）重悬液在脱盐分子筛柱上进行脱盐过滤；得到脱盐微量蛋白液；
（6）尿液微量蛋白保护：取步骤（5）中的脱盐微量蛋白液加入蛋白保护剂进行保护处理，即得到待检测的尿液微量蛋白溶液。
其中，
步骤（1）中所述的离心温度为20-25℃，转速为1500-2000rpm，时间为5-10min；优选地，所述的离心温度为20-25℃，转速为1800-2000rpm，时间为8-10min；再优选地，所述的离心温度为20-25℃，转速为2000rpm，时间为10min。
步骤（1）中所述的离心的目的是去除尿液中的白细胞、红细胞、鳞状上皮细胞、非鳞状上皮细胞、内皮脱落细胞、细菌、透明管型、病理管型、盐离子结晶等物质，上述物质去除后，可以获得尿液上清液，离心速度不超过2500rpm，时间不超过20min，避免蛋白沉淀被去除。
步骤（2）中所述的蛋白盐析沉淀饱和盐溶液选自硫酸铵饱和盐溶液、氯化铵饱和盐溶液、氯化钠饱和盐溶液和硫酸钠饱和盐溶液的一种或多种；优选地，所述的蛋白盐析沉淀饱和盐溶液为硫酸铵饱和盐溶液。
本申请所述的盐析沉淀的主要原理为蛋白质表面的电荷被中和，破坏了其表面的水化膜，于是达到蛋白质沉淀的效果，盐析沉淀蛋白可以完整保存蛋白活性。
步骤（2）中所述的上清液与蛋白盐析沉淀饱和盐溶液的体积比为1:2；所述的静置时间为10min。
步骤（3）中所述的离心温度为2-8℃，转速为12000-14000rpm，时间为10-20min；优选地，所述的离心温度为2-8℃，转速为14000rpm，时间为 10-20min。
此条件下离心可以保护蛋白活性，避免蛋白的降解或变性，高速离心可确保上述沉淀蛋白得以全部重回收，最大程度保留尿液微量蛋白成分。
步骤（4）中采用去离子水对蛋白进行溶解和重悬，尽可能减少离子基团的引入，并使得蛋白得以复性得到活性蛋白。
步骤（5）中所述的分子筛选自交联羟丙基葡聚糖分子筛Sephadex LH-20、4%聚丙烯酰胺分子筛和琼脂糖分子筛Sepharose 6FF的一种或多种；优选为交联羟丙基葡聚糖分子筛Sephadex LH-20。
所述的脱盐过滤的温度为2-8℃，转速为30-50rpm，时间为1min。
步骤（5）中进行蛋白脱盐是因为使得蛋白复性需要去除其主要的盐离子成分，而分子筛的孔状结构可以最大程度保存溶液中的内水，使得蛋白溶液中的盐离子等物质得以去除。
步骤（6）中所述的蛋白保护剂选自葡萄糖、羟乙基淀粉、EATD-2Na、硫酸庆大霉素和Bis-Tris 的一种或多种；优选的地，所述的蛋白保护剂选自羟乙基淀粉、EATD-2Na和Bis-Tris的混合物。
进一步优选地，所述的蛋白保护剂为的浓度比为1.0g/mL：0.001g/mL：0.02g/mL的羟乙基淀粉、EATD-2Na和Bis-Tris的混合物
所述的蛋白保护剂对蛋白进行抗菌、抗氧化、抗降解从而保护尿液微量蛋白的活性，使得蛋白得以长期稳定保存。
步骤（6）中所述的脱盐微量蛋白液与蛋白保护剂的体积比为2:1。
与现有技术相比，本申请的有益效果在于：
（1）本申请对尿液进行离心除杂处理，控制离心温度为20-25℃，转速为1500-2000rpm，时间为5-10min，可以去除尿液中的白细胞、红细胞、鳞状上皮细胞、非鳞状上皮细胞、内皮脱落细胞、细菌、透明管型、病理管型、盐离子结晶等物质，从而获得尿液上清液；
（2）本申请对除杂后的尿液进行盐析沉淀，采用硫酸铵饱和盐溶液、氯化铵饱和盐溶液、氯化钠饱和盐溶液或硫酸钠饱和盐溶液进行盐析，能够更好的使蛋白质表面的电荷被中和，破坏了其表面的水化膜，达到蛋白质沉淀的效果，盐析沉淀蛋白可以完整保存蛋白活性；
（3）本申请对盐析沉淀后的尿液进行离心，控制离心温度为2-8℃，转速为12000-14000rpm，此条件可以保护蛋白活性，避免蛋白的降解或变性，高速离心可确保上述沉淀蛋白得以全部重回收，最大程度保留尿液微量蛋白成分；
（4）本申请对尿液微量蛋白溶液进行脱盐处理是因为使得蛋白复性需要去除其主要的盐离子成分，而分子筛，尤其是交联羟丙基葡聚糖分子筛的孔状结构可以最大程度保存溶液中的内水，使得蛋白溶液中的盐离子等物质得以去除。
（5）采用本申请提供的方法对尿液微蛋白进行富集、纯化保护能够使蛋白回收率大于99%；且得到保护的尿液微蛋白在37℃的恒温条件下24小时热稳定破坏后，蛋白保护剂对微量蛋白的稳定性具备保护效果。
附图说明
图1为本申请所述的尿液微量蛋白的富集、纯化和保护方法流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1一种尿液微量蛋白的富集、纯化和保护方法
包括以下步骤：
（1）尿液样品除杂：取5-10ml尿液样品进行离心（温度：25℃，转速：2000rpm，时间：10min），去除尿液中的残渣，保留上清液备用；
（2）尿液微量蛋白盐析沉淀：取步骤（1）得到的上清液1ml，加入硫酸铵饱和盐溶液2ml，静置10min，得到固液分离的尿液；
（3）尿液沉淀样本离心：取步骤（2）中固液分离的尿液离心（温度：4℃，转速：14000rpm，时间：15min），去除上清液，保留离心管底的沉淀蛋白，备用；
（4）尿液微量蛋白重悬：使用200μL去离子蒸馏水对步骤（3）中的沉淀蛋白进行溶解、重悬，移液器吹打混匀，得到重悬液；
（5）尿液微量蛋白脱盐：取200μL步骤（4）重悬液在交联羟丙基葡聚糖分子筛（Sephadex LH-20）上进行脱盐过滤（温度：4℃，转速：50rpm，时间：1min），得到脱盐微量蛋白液；
（6）尿液微量蛋白保护：取200μL步骤（5）中的脱盐微量蛋白液加入100μL蛋白保护剂（1.0g/mL羟乙基淀粉、0.001g/mL EATD-2Na和0.02g/mL Bis-Tris）混匀进行保护处理，即得到待检测的尿液微量蛋白溶液。
实施例2一种尿液微量蛋白的富集、纯化和保护方法
包括以下步骤：
（1）尿液样品除杂：取5-10ml尿液样品进行离心（温度：25℃，转速：1500rpm，时间：10min），去除尿液中的残渣，保留上清液备用；
（2）尿液微量蛋白盐析沉淀：取步骤（1）得到的上清液1ml，加入硫酸钠饱和盐溶液2ml，静置10min，得到固液分离的尿液；
（3）尿液沉淀样本离心：取步骤（2）中固液分离的尿液离心（温度：4℃，转速：14000rpm，时间：15min），去除上清液，保留离心管底的沉淀蛋白，备用；
（4）尿液微量蛋白重悬：使用200μL去离子蒸馏水对步骤（3）中的沉淀蛋白进行溶解、重悬，移液器吹打混匀，得到重悬液；
（5）尿液微量蛋白脱盐：取200μL步骤（4）重悬液在琼脂糖分子筛柱（Sepharose6FF）上进行脱盐过滤（温度：4℃，转速：30rpm，时间：1min），得到脱盐微量蛋白液；
（6）尿液微量蛋白保护：取200μL步骤（5）中的脱盐微量蛋白液加入100μL蛋白保护剂（1.0g/mL 羟乙基淀粉、0.001g/mL EATD-2Na 和 0.02g/mL Bis-Tris）混匀进行保护处理，即得到待检测的尿液微量蛋白溶液。
实施例3一种尿液微量蛋白的富集、纯化和保护方法
包括以下步骤：
（1）尿液样品除杂：取5-10ml尿液样品进行离心（温度：25℃，转速：1800rpm，时间：10min），去除尿液中的残渣，保留上清液备用；
（2）尿液微量蛋白盐析沉淀：取步骤（1）得到的上清液1ml，加入氯化钠饱和盐溶液2ml，静置10min，得到固液分离的尿液；
（3）尿液沉淀样本离心：取步骤（2）中固液分离的尿液离心（温度：4℃，转速：14000rpm，时间：15min），去除上清液，保留离心管底的沉淀蛋白，备用；
（4）尿液微量蛋白重悬：使用200μL去离子蒸馏水对步骤（3）中的沉淀蛋白进行溶解、重悬，移液器吹打混匀，得到重悬液；
（5）尿液微量蛋白脱盐：取200μL步骤（4）重悬液在聚丙烯酰胺分子筛柱（4%）上进行脱盐过滤（温度：4℃，转速：50rpm，时间：1min），得到脱盐微量蛋白液；
（6）尿液微量蛋白保护：取200μL步骤（5）中的脱盐微量蛋白液加入100μL蛋白保护剂（1.0g/mL 羟乙基淀粉、0.001g/mL EATD-2Na和0.02g/mL Bis-Tris）混匀进行保护处理，即得到待检测的尿液微量蛋白溶液。
实施例4一种尿液微量蛋白的富集、纯化和保护方法
包括以下步骤：
（1）尿液样品除杂：取5-10ml尿液样品进行离心（温度：25℃，转速：2000rpm，时间：10min），去除尿液中的残渣，保留上清液备用；
（2）尿液微量蛋白盐析沉淀：取步骤（1）得到的上清液1ml，加入氯化铵饱和盐溶液2ml，静置10min，得到固液分离的尿液；
（3）尿液沉淀样本离心：取步骤（2）中固液分离的尿液离心（温度：4℃，转速：12000rpm，时间：10min），去除上清液，保留离心管底的沉淀蛋白，备用；
（4）尿液微量蛋白重悬：使用200μL去离子蒸馏水对步骤（3）中的沉淀蛋白进行溶解、重悬，移液器吹打混匀，得到重悬液；
（5）尿液微量蛋白脱盐：取200μL步骤（4）重悬液在琼脂糖分子筛柱（Sepharose6FF）上进行脱盐过滤（温度：4℃，转速：50rpm，时间：1min），得到脱盐微量蛋白液；
（6）尿液微量蛋白保护：取200μL步骤（5）中的脱盐微量蛋白液加入100μL蛋白保护剂（1.0g/mL羟乙基淀粉、0.001g/mL硫酸庆大霉素和0.02g/mL Bis-Tris）混匀进行保护处理，即得到待检测的尿液微量蛋白溶液。
阳性对照品
和实施例1的区别仅在于采用正常志愿者的尿液中加入牛血清白蛋白作为阳性对照品，具体如下：
（1）取0.01g牛血清白蛋白加入10mL正常志愿者的尿液中混匀，制备成为蛋白尿阳性标本；
（2）尿液样品除杂：取5-10ml尿液样品进行离心（温度：25℃，转速：2000rpm，时间：10min），去除尿液中的残渣，保留上清液备用；
（3）尿液微量蛋白盐析沉淀：取步骤（1）得到的上清液1ml，加入硫酸铵饱和盐溶液2ml，静置10min，得到固液分离的尿液；
（4）尿液沉淀样本离心：取步骤（2）中固液分离的尿液离心（温度：4℃，转速：14000rpm，时间：15min），去除上清液，保留离心管底的沉淀蛋白，备用；
（5）尿液微量蛋白重悬：使用200μL去离子蒸馏水对步骤（3）中的沉淀蛋白进行溶解、重悬，移液器吹打混匀，得到重悬液；
（6）尿液微量蛋白脱盐：取200μL步骤（4）重悬液在交联羟丙基葡聚糖分子筛（Sephadex LH-20）上进行脱盐过滤（温度：4℃，转速：50rpm，时间：1min），得到脱盐微量蛋白液；
（7）尿液微量蛋白保护：取200μL步骤（5）中的脱盐微量蛋白液加入100μL蛋白保护剂（1.0g/mL羟乙基淀粉、0.001g/mL EATD-2Na和0.02g/mL Bis-Tris）混匀进行保护处理，即得到待检测的尿液微量蛋白溶液。
阴性对照品
和实施例 1 的区别仅在于采用生理盐水作为阴性对照品，具体如下：
（1）取10mL生理盐水，制备成为蛋白尿阴性标本；
（2）尿液样品除杂：取5-10ml尿液样品进行离心（温度：25℃，转速：2000rpm，时间：10min），去除尿液中的残渣，保留上清液备用；
（3）尿液微量蛋白盐析沉淀：取步骤（1）得到的上清液1ml，加入硫酸铵饱和盐溶液2ml，静置10min，得到固液分离的尿液；
（4）尿液沉淀样本离心：取步骤（2）中固液分离的尿液离心（温度：4℃，转速：14000rpm，时间：15min），去除上清液，保留离心管底的沉淀蛋白，备用；
（5）尿液微量蛋白重悬：使用200μL去离子蒸馏水对步骤（3）中的沉淀蛋白进行溶解、重悬，移液器吹打混匀，得到重悬液；
（6）尿液微量蛋白脱盐：取200μL步骤（4）重悬液在交联羟丙基葡聚糖分子筛（Sephadex LH-20）上进行脱盐过滤（温度：4℃，转速：50rpm，时间：1min），得到脱盐微量蛋白液；
（7）尿液微量蛋白保护：取200μL步骤（5）中的脱盐微量蛋白液加入100μL蛋白保护剂（1.0g/mL羟乙基淀粉、0.001g/mL EATD-2Na和0.02g/mL Bis-Tris）混匀进行保护处理，即得到待检测的尿液微量蛋白溶液。
对比例1
和实施例1的区别仅在于未加入蛋白保护剂，其他步骤及操作实施例1相同；具体为：
（1）尿液样品除杂：取5-10ml尿液样品进行离心（温度：25℃，转速：2000rpm，时间：10min），去除尿液中的残渣，保留上清液备用；
（2）尿液微量蛋白盐析沉淀：取步骤（1）得到的上清液1ml，加入硫酸铵饱和盐溶液2ml，静置10min，得到固液分离的尿液；
（3）尿液沉淀样本离心：取步骤（2）中固液分离的尿液离心（温度：4℃，转速：14000rpm，时间：15min），去除上清液，保留离心管底的沉淀蛋白，备用；
（4）尿液微量蛋白重悬：使用200μL去离子蒸馏水对步骤（3）中的沉淀蛋白进行溶解、重悬，移液器吹打混匀，得到重悬液；
（5）尿液微量蛋白脱盐：取200μL步骤（4）重悬液在交联羟丙基葡聚糖分子筛（Sephadex LH-20）上进行脱盐过滤（温度：4℃，转速：50rpm，时间：1min），得到脱盐微量蛋白液。
对比例2
和实施例1的区别仅在于加入叠氮化钠和蔗糖作为蛋白保护剂，其他步骤及操作实施例1相同；具体为：
（1）尿液样品除杂：取5-10ml尿液样品进行离心（温度：25℃，转速：2000rpm，时间：10min），去除尿液中的残渣，保留上清液备用；
（2）尿液微量蛋白盐析沉淀：取步骤（1）得到的上清液1ml，加入硫酸铵饱和盐溶液2ml，静置10min，得到固液分离的尿液；
（3）尿液沉淀样本离心：取步骤（2）中固液分离的尿液离心（温度：4℃，转速：14000rpm，时间：15min），去除上清液，保留离心管底的沉淀蛋白，备用；
（4）尿液微量蛋白重悬：使用200μL去离子蒸馏水对步骤（3）中的沉淀蛋白进行溶解、重悬，移液器吹打混匀，得到重悬液；
（5）尿液微量蛋白脱盐：取200μL步骤（4）重悬液在交联羟丙基葡聚糖分子筛（Sephadex LH-20）上进行脱盐过滤（温度：4℃，转速：50rpm，时间：1min），得到脱盐微量蛋白液。
（6）尿液微量蛋白保护：取200μL步骤（5）中的脱盐微量蛋白液加入100μL蛋白保护剂（0.1g/mL叠氮化钠和0.5g/mL蔗糖）混匀进行保护处理，即得到待检测的尿液微量蛋白溶液。
对比例3
和实施例1的区别仅在于尿液微量蛋白脱盐步骤中采用的交联葡聚糖分子筛柱（Sephadex G-25），其他步骤及操作实施例1相同；具体为：
（1）尿液样品除杂：取5-10ml尿液样品进行离心（温度：25℃，转速：2000rpm，时间：10min），去除尿液中的残渣，保留上清液备用；
（2）尿液微量蛋白盐析沉淀：取步骤（1）得到的上清液1ml，加入硫酸铵饱和盐溶液2ml，静置10min，得到固液分离的尿液；
（3）尿液沉淀样本离心：取步骤（2）中固液分离的尿液离心（温度：4℃，转速：14000rpm，时间：15min），去除上清液，保留离心管底的沉淀蛋白，备用；
（4）尿液微量蛋白重悬：使用200μL去离子蒸馏水对步骤（3）中的沉淀蛋白进行溶解、重悬，移液器吹打混匀，得到重悬液；
（5）尿液微量蛋白脱盐：取200μL步骤（4）重悬液在交联葡聚糖分子筛柱（SephadexG-25）上进行脱盐过滤（温度：4℃，转速：50rpm，时间：1min），得到脱盐微量蛋白液；
（6）尿液微量蛋白保护：取200μL步骤（5）中的脱盐微量蛋白液加入100μL蛋白保护剂（1.0g/mL羟乙基淀粉、0.001g/mL EATD-2Na和0.02g/mL Bis-Tris）混匀进行保护处理，即得到待检测的尿液微量蛋白溶液。
对比例4
和阳性对照例的区别仅在于采用作为交联葡聚糖分子筛柱（Sephadex-20）脱盐，具体如下：
（1）取0.01g牛血清白蛋白加入10mL正常志愿者的尿液中混匀，制备成为蛋白尿阳性标本；
（2）尿液样品除杂：取5-10ml尿液样品进行离心（温度：25℃，转速：2000rpm，时间：10min），去除尿液中的残渣，保留上清液备用；
（3）尿液微量蛋白盐析沉淀：取步骤（1）得到的上清液1ml，加入硫酸铵饱和盐溶液2ml，静置10min，得到固液分离的尿液；
（4）尿液沉淀样本离心：取步骤（2）中固液分离的尿液离心（温度：4℃，转速：14000rpm，时间：15min），去除上清液，保留离心管底的沉淀蛋白，备用；
（5）尿液微量蛋白重悬：使用200μL去离子蒸馏水对步骤（3）中的沉淀蛋白进行溶解、重悬，移液器吹打混匀，得到重悬液；
（6）尿液微量蛋白脱盐：取200μL步骤（4）重悬液在交联葡聚糖分子筛（Sephadex-20）上进行脱盐过滤（温度：4℃，转速：50rpm，时间：1min），得到脱盐微量蛋白液；
（7）尿液微量蛋白保护：取200μL步骤（5）中的脱盐微量蛋白液加入100μL蛋白保护剂（1.0g/mL羟乙基淀粉、0.001g/mL EATD-2Na和0.02g/mL Bis-Tris）混匀进行保护处理，即得到待检测的尿液微量蛋白溶液。
效果测试
试验例1尿液微蛋白富集效果
测定尿液微量蛋白的富集效果，采用同一份糖尿病肾病蛋白尿的志愿者尿液样本（已知尿液总蛋白浓度为200 mg/L），采用实施例1-4的方法进行富集，采用Qubit3设备按照使用说明书的蛋白检测方法进行蛋白测量，重复检测5次，计算均值±标准差，结果如下表1：
表1尿液微蛋白富集结果
根据上表1的数据可以看出，采用本申请实施例1-4中公开的方法对尿液微量蛋白进行富集，可以使微量蛋白含量达到245mg/L以上，最高可以达到270mg/L，说明本申请提供的蛋白富集纯化方法能够更好的对微量蛋白进行提取。
试验例2尿液微蛋白回收效果
测定蛋白的回收效果，采用阳性对照例和对比例4方法进行富集和脱盐处理，对回收的蛋白进行定量分析，采用Qubit3设备按照使用说明书的蛋白检测方法进行蛋白测量，重复检测5次，计算均值，结果如下表2：
表2尿液微蛋白回收结果
| 实例 | 蛋白含量（mg/mL） | 蛋白回收率 |
| BSA | 0.001 | —— |
| 阳性对照例 | 0.00099 | 99% |
| 对比例4 | 0.00070 | 70% |
根据上表2的数据可以看出，采用本申请阳性对照例和对比例4中公开的方法对尿液微量蛋白进行富集回收，采用交联羟丙基葡聚糖分子筛（Sephadex LH-20）蛋白回收率为99%，采用时交联葡聚糖分子筛（Sephadex -20）时蛋白回收率为70%，而采用说明本申请提供的蛋白富集纯化方法能够更好的对微量蛋白进行提取。
试验例3尿液微量蛋白纯化效果
测定尿液微量蛋白的纯化效果，同一份糖尿病肾病蛋白尿的志愿者尿液样本，采用实施例1-4、阳性对照和阴性对照的富集纯化方法进行纯化，采用聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳仪对尿液微量蛋白进行检测，结果如下表3所示：
表3尿液微量蛋白纯化结果
| 实例 | α1-微 球蛋白 | α2-微 球蛋白 | β1-微 球蛋白 | β2-微 球蛋白 | BSA蛋白 | IgA | 白蛋白 | 血红蛋 白 |
| 实施例1 | √ | √ | √ | -- | -- | -- | √ | √ |
| 实施例2 | √ | √ | √ | -- | -- | -- | √ | √ |
| 实施例3 | √ | √ | √ | -- | -- | -- | √ | √ |
| 实施例4 | √ | √ | √ | -- | -- | -- | √ | √ |
| 阳性对照 | -- | -- | -- | -- | √ | -- | √ | -- |
| 阴性对照 | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
注：“√”表示能够检出；“--”表示未检出。
根据上表3的检测结果可以看出，采用本申请实施例1-4的方法得到的蛋白的纯化结果一致；且阳性对照和阴性对照结果与发明设计的预期一致，由此说明该种蛋白的纯化效果满足临床样本检测要求。
采用离子色谱仪测定尿液微量蛋白的纯化分子筛脱盐后的重悬蛋白溶液的Na+和NH4 +的离子浓度；实施例1-4和对比例4的蛋白脱盐效果见表4；
表4尿液微量蛋白纯化液Na+和NH4 +浓度
| 实例 | Na+浓度 | NH4+浓度 |
| 实施例1 | 0.00012mol/L | 0.000081mol/L |
| 实施例2 | 0.00014mol/L | 0.000083mol/L |
| 实施例3 | 0.00011mol/L | 0.000085mol/L |
| 实施例4 | 0.00012mol/L | 0.000081mol/L |
| 对比例3 | 0.00252mol/L | 0.000156mol/L |
根据上表4的检测结果可以看出，采用本申请实施例1-4的方法得到的蛋白的纯化脱盐结果一致，而常见脱盐分子筛柱的脱盐效果明显不如实施例的效果。
试验例3尿液微量蛋白稳定性测试
测定尿液微量蛋白的稳定性结果，在实施例中，同一份糖尿病肾病蛋白尿的志愿者尿液样本（已知尿液总蛋白浓度为200 mg/L），采用实施例1-4和对比例1-2的进行富集纯化和保护，在37℃的恒温条件下24小时，对富集纯化的蛋白进行热破坏测试；通过高效液相色谱仪对蛋白进行图谱分析以确定其稳定性，结果如下表5所示：
表5尿液微量蛋白的稳定性检测
| 实例 | 液相色谱图 |
| 实施例1 | 色谱峰正常，理论踏板数10000 |
| 实施例2 | 色谱峰正常，理论踏板数 12000 |
| 实施例3 | 色谱峰正常，理论踏板数 8000 |
| 实施例4 | 色谱峰正常，理论踏板数 9000 |
| 对比例1 | 蛋白色谱峰变型，理论踏板数为0 |
| 对比例2 | 蛋白色谱峰变型，理论踏板数为0 |
由上表5的检测结果可知，实施例1-4加入蛋白保护试剂可以保护尿液微量蛋白结构和活性稳定，该蛋白保护方法效果良好，而对比例1中没有添加蛋白保护剂，而对比例2中加入常规的蛋白保护剂；在对比例1和2中实验结果显示：尿液微量蛋白结构改变和活性明显降低，各微量蛋白色谱峰变型，不能满足临床样本检测要求。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (13)
1.一种尿液微量蛋白的富集、纯化和保护方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）尿液样品除杂：取尿液样品进行离心，去除尿液中的残渣，保留上清液备用；
（2）尿液微量蛋白盐析沉淀：取步骤（1）得到的上清液加入蛋白盐析沉淀饱和盐溶液，静置，得到固液分离的尿液；
（3）尿液沉淀样本离心：取步骤（2）中固液分离的尿液离心，去除上清液，保留离心管底的沉淀蛋白，备用；
（4）尿液微量蛋白重悬：使用去离子蒸馏水对步骤（3）中的沉淀蛋白进行溶解、重悬，移液器吹打混匀，得到重悬液；
（5）尿液微量蛋白脱盐：取步骤（4）重悬液在分子筛柱上进行脱盐过滤；得到脱盐微量蛋白液；
（6）尿液微量蛋白保护：取步骤（5）中的脱盐微量蛋白液加入蛋白保护剂进行保护处理，即得到待检测的尿液微量蛋白溶液。
2.根据权利要求1所述的富集、纯化和保护方法，其特征在于：步骤（1）中所述的离心温度为20-25℃，转速为1500-2000rpm，时间为5-10min。
3.根据权利要求1所述的富集、纯化和保护方法，其特征在于：步骤（2）中所述的蛋白盐析沉淀饱和盐溶液选自硫酸铵饱和盐溶液、氯化铵饱和盐溶液、氯化钠饱和盐溶液和硫酸钠饱和盐溶液的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的富集、纯化和保护方法，其特征在于：步骤（2）所述的蛋白盐析沉淀饱和盐溶液为硫酸铵饱和盐溶液。
5.根据权利要求1所述的富集、纯化和保护方法，其特征在于：步骤（2）中所述的上清液与蛋白盐析沉淀饱和盐溶液的体积比为1:2；所述的静置时间为10min。
6.根据权利要求1所述的富集、纯化和保护方法，其特征在于：步骤（3）中所述的离心温度为2-8℃，转速为12000-14000rpm，时间为10-20min。
7.根据权利要求1所述的富集、纯化和保护方法，其特征在于：步骤（5）中所述的分子筛选自交联羟丙基葡聚糖分子筛Sephadex LH-20、4%聚丙烯酰胺分子筛和琼脂糖分子筛Sepharose 6FF的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的富集、纯化和保护方法，其特征在于：步骤（5）中所述的分子筛为交联羟丙基葡聚糖分子筛Sephadex LH-20。
9.根据权利要求1所述的富集、纯化和保护方法，其特征在于：步骤（5）中所述的脱盐过滤的温度为2-8℃，转速为转速为30-50rpm，时间为1min。
10.根据权利要求1所述的富集、纯化和保护方法，其特征在于：步骤（6）中所述的蛋白保护剂选自葡萄糖、羟乙基淀粉、EATD-2Na、硫酸庆大霉素和Bis-Tris的一种或多种。
11.根据权利要求10所述的富集、纯化和保护方法，其特征在于：步骤（6）中所述的蛋白保护剂选自羟乙基淀粉、EATD-2Na和Bis-Tris的混合物。
12.根据权利要求11所述的富集、纯化和保护方法，其特征在于：所述的蛋白保护剂为的浓度比为1.0g/mL：0.001g/mL：0.02g/mL的羟乙基淀粉、EATD-2Na和Bis-Tris的混合物。
13.根据权利要求1所述的富集、纯化和保护方法，其特征在于：步骤（6）中所述的脱盐微量蛋白液与蛋白保护剂的体积比为2:1。
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