CN109810185A

CN109810185A - 一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法

Info

Publication number: CN109810185A
Application number: CN201910276004.5A
Authority: CN
Inventors: 钱小红; 张养军; 余谦; 张普民; 高方圆; 焦丰龙; 夏朝双; 张汉卿
Original assignee: BEIJING PROTEOME RESEARCH CENTER
Current assignee: BEIJING PROTEOME RESEARCH CENTER
Priority date: 2019-04-08
Filing date: 2019-04-08
Publication date: 2019-05-28

Abstract

本发明公开了一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法。该方法首先采用热乙醇沉淀法从转基因猪血浆中对重组人白蛋白进行粗提纯，再利用两种色谱方法以串联方式进一步精纯化，即先用阴离子交换色谱法进行第一步精纯化，再采用反相色谱法或者凝胶色谱法进行二次精纯化。结果表明，本发明能从转基因猪血浆中分离纯化出高纯度的重组人血清白蛋白，并有望替代人血清白蛋白用于临床用药和生化研究中。

Description

一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法

技术领域

本发明属于生物领域，涉及一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法。

背景技术

人血清白蛋白(HSA)具有重要的应用价值，不仅在临床上用于治疗出血性休克、烧伤、肝硬化或者肾病引起的腹水等疾病；还应用于药剂辅料、诊断试剂、手性物质分离剂、培养基添加剂等的研究。目前，仅从人血液中提取HSA难以满足市场的需求，且人血来源极其复杂，存在血源污染等潜在威胁。因此，迫切需要一种安全可靠、成本相对低廉的HSA替代品。随着基因重组技术飞速发展，通过基因工程获得重组人血清白蛋白(rHSA)并进一步通过纯化获取rHSA可能是一条有效的解决途径。常用白蛋白提取方法可以分为较传统的蛋白沉淀法和新技术发展而来层析色谱法。沉淀法是通过沉淀的方式来实现目标蛋白与杂质的分离。一般为了使蛋白质发生沉淀，可以通过降低静电力或蛋白质水溶液的稳定性来达到，其中降低蛋白质水溶液的稳定性是通过破坏蛋白质分子周围的水化层来实现。常用的白蛋白的沉淀方法有：低温乙醇沉淀法、盐析法、利凡诺沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、热乙醇沉淀法等。液相色谱法是通过待分离物与固定相之间的物理化学性质以及生物学性质的相互作用的不同来进行分离纯化目标产物。随着材料新技术的发展，液相色谱技术的分离性能更高，适用范围更广，已成为蛋白分离纯化的常用方法。目前液相色谱法主要有凝胶色谱、离子交换色谱、疏水色谱、亲和色谱和反相色谱等。

发明内容

本发明的目的是提供一种分离纯化高纯度重组人血清白蛋白的方法。

本发明提供的对含有重组人血清白蛋白的血浆中的重组人血清白蛋白进行分离纯化方法，包括：

1)去除含有重组人血清白蛋白的血浆中的凝血因子和纤维蛋白原后，将所得血浆上清液用热乙醇沉淀法进行粗提纯，得到rHSA粗提取液；

2)将所述rHSA粗提取液脱盐浓缩后，用阴离子交换色谱柱洗脱，收集洗脱液即为第一步精纯化rHSA溶液；

3)将所述第一步精纯化rHSA溶液脱盐浓缩后，用反相色谱柱或凝胶色谱柱进行二次精纯化，即得到rHSA溶液，完成所述重组人血清白蛋白的分离纯化。

上述方法中，所述含有重组人血清白蛋白的血浆按照如下步骤制得：对含有人血清白蛋白的血进行血浆抗凝处理后离心，收集上清液而得；

具体的，所述血浆抗凝处理步骤中，所用抗凝剂为柠檬酸钠水溶液；所述含有重组人血清白蛋白的血与抗凝剂的体积比为15:1～20:1；所述抗凝剂的浓度为70g/L～90g/L；

所述离心步骤中，离心力为1500-2500×g；具体为2000×g；时间为20-40min；具体为30min。

所述步骤1)去除含有重组人血清白蛋白的血浆中的凝血因子和纤维蛋白原的方法包括：将所述含有重组人血清白蛋白的血浆冷冻沉淀，解冻后离心，收集上清液，即为所述血浆上清液；

具体的，所述冷冻沉淀步骤中，温度为-30--10℃；具体为-20℃；

所述解冻步骤中，温度为0-10℃；具体为4℃；

所述离心步骤中，离心力为4500-5500×g；具体为5000×g；时间为10-20min；具体为15min。

所述步骤1)热乙醇沉淀法包括：将所述血浆上清液与由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液混匀后，调节pH至5.0～7.0，在55℃～80℃，恒温保持20～60min，冷却至室温后调节pH至4.0～5.0，静置，一次离心，收集上清，淋洗所得沉淀，再进行二次离心，收集上清，合并两次上清，即为所述rHSA粗提取液。

具体的，所述蛋白保护剂为辛酸钠；所述辛酸钠在由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液中的浓度为5～10g/L；具体为6g/L；

所述变性剂为有机溶剂；具体为乙醇；所述氯化钠在由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液中的浓度为5～9g/L；具体为8g/L；所述由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液的体积用量与所述血浆上清液相同；

所述变性剂的用量为所述血浆上清液体积的8％～12％；具体为10％；

所述静置步骤中，温度为室温；时间为1-3h；具体为2h；

所述淋洗步骤中，所用淋洗液为pH值为4.8的蒸馏水；

所述一次离心和二次离心步骤中，离心力为4500-5000×g；具体为5000×g；时间为50-70min；具体为60min。

所述步骤2)中，所用流动相A为0.02mol/L Tris-HCl(pH值为8.8)，流动相B为0.02mol/L Tris-HCl(pH值为8.8)+0.3mol/L NaCl；

所用阴离子交换色谱柱为DEAE弱阴离子交换色谱柱；流速为1mL/min；柱温为室温；检测波长为280nm；

梯度洗脱程序为：0～第5min末，100％A；第6min起～第50min末，100％A～0％A；第51min起～第60min末，0％A。

所述步骤3)中，所述反相色谱柱为C4-C18反相色谱柱；

所述凝胶色谱柱为SEC柱。

所述步骤3)用反相色谱柱进行二次精纯化步骤中，流动相A为由乙腈和三氟乙酸及水组成的混合液，其中，乙腈的体积百分浓度为2％，三氟乙酸的体积百分浓度为0.1％；流动相B为98％乙腈-0.1％三氟乙酸溶液(也即由乙腈和三氟乙酸及水组成的混合液，其中，乙腈的体积百分浓度为98％，三氟乙酸的体积百分浓度为0.1％)；

流速为0.7mL/min；柱温为35℃；检测波长为280nm；

梯度洗脱程序为：0～第10min末，100％A；第11min起～45min末，100％A～5％A；第46min起～第50min末，5％A；第51min起～第53min末，5％A～100％A；第54min起～第60min末，100％A。

所述步骤3)用凝胶色谱柱进行二次精纯化步骤中，流动相为pH 7.0的0.15mol/L磷酸盐缓冲液；

流速为0.35mL/min；柱温为25℃；检测波长为214nm。

上述步骤2)和3)中，脱盐浓缩为各种常规方法，如具体可为利用规格为30kD超滤管离心管脱盐浓缩，离心力为4500-5500×g，时间为50-70min；离心次数为2-4次；具体为2次。

上述方法中，所用含有重组人血清白蛋白的血浆可按照如下方法获得：利用CRISPR/Cas9技术对猪受精卵的基因组进行编辑，在猪白蛋白基因区域插入人血清白蛋白基因，使猪血中只产生rHSA，通过纯化猪血浆即可获得大量高纯度的rHSA；或者参照如下文献方法获得：Production of Human Albumin in Pigs Through CRISPR/Cas9-MediatedKnockin of Human cDNA into Swine Albumin Locus in the Zygotes，Jin Peng1,*,Yong Wang2,*,SCIENTIFIC REPORTS，5:16705，DOI:10.1038/srep16705。

本发明的优点：

1、本发明采用热乙醇沉淀法进行rHSA粗提取，这是一种低温乙醇沉淀法的改进方法，相较于低温乙醇沉淀法较多提取步骤、更严格的低温生产环境和长达一周的生产周期，本发明的方法操作简便、耗时更短，纯化成本较低。

2、本发明采用热乙醇沉淀法与液相色谱法相结合进行rHSA的纯化，既利用了热乙醇沉淀法操作简便和适用大量血浆粗提取的优点，又可利用色谱方法的高分离性能的优点进行精纯化，得到更高纯度的rHSA产品。

3、本发明阴离子交换色谱后，又采用反相色谱或凝胶色谱对粗提取rHSA产物进行二次精纯化，充分利用了这两种分离原理不同的色谱方法的优点，为不同用途和性能要求提供了更多分离纯化方法的选择。

附图说明

图1为实施例2-4中各步骤色谱纯化制备色谱图(a)rHSA的阴离子离子交换色谱制备色谱图；(b)rHSA的反相色谱制备色谱图；(c)rHSA的凝胶色谱制备色谱图。

图2为实施例1，2，3，4中各步骤产物经RP-HPLC进行纯度表征色谱图(a)热乙醇沉淀后的rHSA纯度表征；(b)阴离子交换色谱后的rHSA纯度表征；(c)反相色谱后的rHSA纯度表征；(d)凝胶色谱后的rHSA纯度表征。

图3为实施例5中各步骤产物与对照品(商品化的白蛋白)用SDS-PAGE凝胶电泳进行纯度表征的胶图。所表征的样本分别是猪血浆(泳道2)、热乙醇沉淀后rHSA(泳道3)、阴离子交换色谱后rHSA(泳道4)、反相色谱后rHSA(泳道5)、SEC后rHSA(泳道6)，以及对照品禾元rHSA(泳道7)和Baxter HSA(泳道8)。泳道2的蛋白上样量均为20μg，泳道3～8的蛋白上样量均为5μg。

图4为本发明提供的重组人血清白蛋白的分离纯化方法流程。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

实施例1、利用热乙醇沉淀法对转基因猪血浆中rHSA进行粗纯化，包括如下步骤：

A)对血浆抗凝处理并离心去除血细胞：取新鲜转基因猪血若干毫升，与80g/L的柠檬酸钠溶液按体积比19：1混匀，2000×g离心30min，获取上清，即转基因猪血浆，-20℃冻存备用。

B)冷冻沉淀：将步骤A中冻存的血浆在4℃缓慢解冻后，5000×g离心15min，去除少许黄白色沉淀得到血浆上清液。

C)热乙醇沉淀法：取100mL步骤B中血浆上清液置于反应釜内，先加入100mL含有0.6g辛酸钠、0.8g氯化钠的水溶液，再加入10mL乙醇，混匀后调节pH至6.5，在机械搅拌条件下，加热溶液至65℃，恒温保持40min；移至冰水浴，不断搅拌，待溶液冷却至室温后，调节酸度至pH 4.5，室温静置2h。在5000×g条件下离心60min，收取上清和沉淀；沉淀用pH 4.8的蒸馏水淋洗，在相同离心条件下再次离心，取上清，两次上清合并即为rHSA粗提取液。经测定此rHSA粗提取液的纯度为69.5％(RP-HPLC表征见附图2a)，回收率为51.3％。

实施例2、利用阴离子交换色谱法对上述含rHSA粗提取液进行第一步精纯化，包括如下步骤：

将实施例1中rHSA粗提取液，脱盐浓缩后阴离子交换色谱上样。所用色谱柱为DEAE弱阴离子交换色谱柱，其色谱条件：流动相A为0.02mol/L Tris-HCl(pH 8.8)，流动相B为0.02mol/L Tris-HCl(pH值为8.8)，0.3mol/L NaCl(pH 8.8)；流速1mL/min；检测波长280nm；柱温25℃(室温)；线性梯度洗脱程序为：0～第5min末，100％A；第6min起～第50min末，100％A～0％A；第51min起～第60min末，0％A。(制备色谱图见附图1a)。收集目标组分洗脱液。经RP-HPLC表征rHSA的纯度为85.0％。

实施例3、利用反相色谱法对阴离子交换色谱后产物进行第二步精纯化，包括如下步骤：

将实施例2中洗脱液，脱盐浓缩后平均分为两等份DEAE后样本；取其中一份用反相色谱进行二次精纯化；所用色谱柱为C4反相色谱柱，其色谱条件为：流动相A为2％(体积比)乙腈-0.1％三氟乙酸溶液，流动相B为98％乙腈-0.1％三氟乙酸溶液；流速0.7mL/min；检测波长280nm；柱温35℃；线性梯度洗脱程序为：0～第10min末，100％A；第11min起～45min末，100％A～5％A；第46min起～第50min末，5％A；第51min起～第53min末，5％A～100％A；第54min起～第60min末，100％A(制备色谱图见附图1b)。收集目标组分洗脱液，脱盐浓缩后冷冻干燥得rHSA冻干粉。经阴离子交换色谱和反相色谱纯化后，rHSA的纯度达100.0％；经测定，此两步色谱法rHSA综合回收率约为80.1％，故总回收率约为41.1％。

实施例4、利用凝胶色谱法对阴离子交换色谱后产物进行第二步精纯化，包括如下步骤：

取实施例3中另一份DEAE后样本用凝胶色谱进行二次精纯化。所用色谱柱为SEC色谱柱，其色谱条件为：流动相0.15mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)；流速0.35mL/min；检测波长214nm；柱温25℃；梯度洗脱程序：0～20min,100％A(制备色谱图见附图1c)。收集目标组分洗脱液，脱盐浓缩后冷冻干燥得rHSA冻干粉。经阴离子交换色谱和凝胶色谱纯化后，rHSA的纯度达100.0％；经测定，此两步色谱法rHSA综合回收率约为75.2％，故总回收率约为38.6％。

实施例5、采用RP-HPLC和10％SDS-PAGE凝胶电泳各步骤产物进行纯度表征。

A)采用反相色谱柱BEH C₄对收集的各步骤产物进行纯度表征，所用色谱条件为：流动相A为2％乙腈-0.1％三氟乙酸溶液，流动相B为98％乙腈-0.1％三氟乙酸溶液；流速0.7mL/min；检测波长280nm；柱温35℃；线性梯度洗脱程序为：0～第10min末，100％A；第11min起～45min末，100％A～5％A；第46min起～第50min末，5％A；第51min起～第53min末，5％A～100％A；第54min起～第60min末，100％A。各步骤产物RP-HPLC纯度表征色谱图见附图2。

B)采用10％SDS-PAGE凝胶对收集的目标组分以及对照品(商品化的白蛋白：植物源重组人血清白蛋白注射液(禾元rHSA)，武汉禾元生物科技有限公司；人血白蛋白注射液(Baxter HSA)，美国Baxter公司)进行纯度表征。凝胶制备方法：分离胶为10％丙烯酰胺，0.1％十二烷基硫酸钠，0.1％过硫酸铵，0.01％四甲基乙二胺，40％1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)；浓缩胶为5％丙烯酰胺，0.1％十二烷基硫酸钠，0.1％过硫酸铵，0.01％四甲基乙二胺，10％1mol/L Tris-HCl(pH 6.8)。凝胶电泳纯度表征结果见附图3，该结果该纯化方法所得重组rHSA与对照品纯度一致。

Claims

1.一种对含有重组人血清白蛋白的血浆中的重组人血清白蛋白进行分离纯化方法，包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含有重组人血清白蛋白的血浆按照如下步骤制得：对含有重组人血清白蛋白的血进行血浆抗凝处理后离心，收集上清液而得；

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)去除含有重组人血清白蛋白的血浆中的凝血因子和纤维蛋白原的方法包括：将所述含有重组人血清白蛋白的血浆冷冻沉淀，解冻后离心，收集上清液，即为所述血浆上清液；

所述解冻步骤中，温度为0-10℃；具体为4℃；

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤1)热乙醇沉淀法包括：将所述血浆上清液与由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液混匀后，调节pH至5.0～7.0，在55℃～80℃，恒温保持20～60min，冷却至室温后调节pH至4.0～5.0，静置，一次离心，收集上清，淋洗所得沉淀，再进行二次离心，收集上清，合并两次上清，即为所述rHSA粗提取液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述蛋白保护剂为辛酸钠；所述辛酸钠在由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液中的浓度为5～10g/L；

所述变性剂为有机溶剂；具体为乙醇；所述氯化钠在由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液中的浓度为5～9g/L；所述由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液的体积用量与所述血浆上清液相同；

所述变性剂的用量为所述血浆上清液体积的8％～12％；

所述静置步骤中，温度为室温；时间为1-3h；具体为2h；

所述淋洗步骤中，所用淋洗液为pH值为4.8的蒸馏水；

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所用流动相A为0.02mol/L Tris-HCl，流动相B为0.02mol/L Tris-HCl+0.3mol/L NaCl；

线性梯度洗脱程序为：0～第5min末，100％A；第6min起～第50min末，100％A～0％A；第51min起～第60min末，0％A。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述反相色谱柱为C4-C18反相色谱柱；

所述凝胶色谱柱为SEC柱。

8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)用反相色谱柱进行二次精纯化步骤中，流动相A为由乙腈和三氟乙酸及水组成的混合液，其中，乙腈的体积百分浓度为2％，三氟乙酸的体积百分浓度为0.1％；流动相B为98％乙腈-0.1％三氟乙酸溶液；

流速为0.7mL/min；柱温为35℃；检测波长为280nm；

线性梯度洗脱程序为：0～第10min末，100％A；第11min起～45min末，100％A～5％A；第46min起～第50min末，5％A；第51min起～第53min末，5％A～100％A；第54min起～第60min末，100％A。

9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)用凝胶色谱柱进行二次精纯化步骤中，流动相为pH7.0的0.15mol/L磷酸盐缓冲液；

流速为0.35mL/min；柱温为25℃；检测波长为214nm。