CN104327178B

CN104327178B - 一种1‑1型人血浆结合珠蛋白提取液的制备方法

Info

Publication number: CN104327178B
Application number: CN201410613876.3A
Authority: CN
Inventors: 刘良明; 臧家涛; 李涛
Original assignee: Research Institute of Field Surgery TMMU
Current assignee: Research Institute of Field Surgery TMMU
Priority date: 2014-10-31
Filing date: 2014-10-31
Publication date: 2017-12-22
Anticipated expiration: 2034-10-31
Also published as: CN104327178A

Abstract

本发明公开了一种1‑1型人血浆结合珠蛋白提取液的制备方法，将低温保存的含1‑1型结合珠蛋白的人血浆离心上清依次进行硫酸铵分级沉淀和聚乙二醇沉淀，以提取1‑1型人血浆结合珠蛋白供精细纯化使用。本方法制备的提取液中1‑1型人血浆结合珠蛋白纯度大于50％，低温操作、方法温和，非常适合作为从人血浆中大规模纯化1‑1型结合珠蛋白的粗提取方法。

Description

一种1-1型人血浆结合珠蛋白提取液的制备方法

技术领域

本发明属于蛋白质分离纯化工艺技术领域，具体地说，涉及蛋白质分离纯化工艺中一种1-1型人血浆结合珠蛋白提取液的制备方法。

背景技术

结合珠蛋白(haptoglobin，Hp)又称触珠蛋白,是一种广泛存在于哺乳动物血液等体液的酸性糖蛋白，主要通过肝脏合成和降解，其含量受脂多糖、细胞因子、激素等调节，属于急性期反应蛋白。结合珠蛋白分子由a、β亚基组成，在多数哺乳动物中以(aβ)₂的构型存在，而人结合珠蛋白存在1-1、2-1、2-2三种主要亚型，这主要是由a亚基的多样性造成的。人结合珠蛋白a亚基由等位基因Hp1、Hp2编码，Hp1编码a₁亚基(分子量约9.1kDa)，Hp2编码a₂亚基(分子量约16kDa)。人结合珠蛋白1-1型是由2个a₁亚基、2个β亚基组成的呈哑铃状的四聚体分子[(a₁β)₂]；人结合珠蛋白2-1型是由a₁亚基、a₂亚基、β亚基组成的多聚体分子[(a₁β)₂(a₂β)_n]；人结合珠蛋白2-2型是由a₂亚基、β亚基组成的多聚体分子[(a₂β)_n]。结合珠蛋白与游离血红蛋白紧密结合形成蛋白复合物，引导血红蛋白进入降解代谢程序，阻止游离血红蛋白损伤机体；另外越来越多的研究表明结合珠蛋白亚型与感染、糖尿病、肿瘤、心血管疾病等病理状态存在相关性，有的亚型具有作为疾病治疗蛋白质药物的潜力。

进行结合珠蛋白相关研究，尤其是以人血浆结合珠蛋白为材料的药物开发研究，需要大量高纯度人血浆结合珠蛋白，然而人血浆结合珠蛋白的分离提取一直面临效率低、成本高等问题，一直没有能够实现高效率、低成本的大规模纯化。最早的人血浆结合珠蛋白纯化方法由Jayle、Boussier、Tonnelat等人于1956年建立，他们利用盐析和制备电泳分离结合珠蛋白，由于制备电泳的产量非常低，此方法制备的结合珠蛋白仅适于研究使用。CBLaurell于1959年建立了包括硫酸铵沉淀、冷丙酮沉淀、冷乙醇沉淀等方法在内的纯化方法，该方法提高了产量，但丙酮、乙醇等有机溶剂可能对结合珠蛋白得结构造成破坏，残留的丙酮、乙醇可能危害人体健康。GE Connell等、Hideo Hamaguchi分别于1961年、1969年建立了以阴离子交换层析为核心的纯化方案，包括硫酸铵分级沉淀、分子排阻层析、多次阴离子交换层析等众多步骤，效率低而耗时长：(1)分子排阻层析样品处理量小、耗时长，由于人结合珠蛋白分子量分布区间很宽，纯化效果不佳且回收率低；(2)多达4-6次阴离子交换层析增加了人力和时间成本，且进一步降低了回收率。抗体亲和层析技术的应用，大大提高了结合珠蛋白纯化效率，通过不同亚型结合珠蛋白抗体亲和填料可实现分型提取，但抗体亲和层析填料制备复杂、成本高、使用寿命短，不适于作为大量纯化提取方法。

充分利用粗提取工艺去除杂蛋白，再通过单次阴离子交换层析、疏水层析等效率高、成本低的工艺进行精细纯化，是大规模纯化人血浆结合珠蛋白的理想方式。选择粗提取工艺时，应尽量选择不损伤蛋白质、对人体无毒性、对环境无污染的方法。盐析是常用的蛋白质粗提取方法，蛋白质在盐析过程中空间结构、功能基团不受破坏，发生可逆沉淀。硫酸铵沉淀是应用最普遍的盐析方法，但Jayle、CB Laurell、Hideo Hamaguchi等人的研究已经证实仅仅通过硫酸铵沉淀无法充分去除杂蛋白，必须引入其他的蛋白质粗提取工艺。

聚乙二醇是经美国食品药品监督管理局(FDA)批准的蛋白质表面修饰剂，其生物毒性很低，也有将其用于蛋白质粗纯化的报道。聚乙二醇沉淀蛋白质的机制尚不明确，没有特定的规律可循，需要考虑的因素包括温度、酸碱度、聚乙二醇分子量、聚乙二醇含量等，一般需经精密设计的实验来确定目的蛋白质能否通过聚乙二醇沉淀进行粗提取。Lijing Sun等曾报道通过聚乙二醇10000从冷乙醇沉淀的人血浆组分IV中粗提取结合珠蛋白的方法，其主要过程包括：(1)将人血浆冷乙醇沉淀组分用生理盐水溶解，离心取上清并调节酸度值至6.5；(2)边搅拌边缓慢加入聚乙二醇10000至质量体积比(m/v)10％，室温静置30min；(3)高速离心，将沉淀以缓冲液重悬浮。该方法的不足之处在于，冷乙醇沉淀法可能对蛋白质结构、功能基团造成破坏，应尽量避免采用，而上述聚乙二醇10000粗提取方法正是建立在冷乙醇沉淀的基础上；另外该方法提取前，体系中杂蛋白种类已经很少，不能用于从血浆中直接提取结合珠蛋白，因此应用范围受到很大限制。

发明内容

本发明的目的是提供一种1-1型人血浆结合珠蛋白提取液的制备方法，该方法利用硫酸铵沉淀、聚乙二醇沉淀依次对含有1-1型人结合珠蛋白的血浆进行分级沉淀，可以满足阴离子交换层析、疏水层析等大规模精细纯化工艺要求，通过该方法制备的1-1型人血浆结合珠蛋白提取液，其结合珠蛋白含量显著提高，符合大规模精细纯化要求。

为实现上述目的，本发明所述的1-1型人血浆结合珠蛋白提取液的制备方法，在0℃环境条件下按照以下步骤进行：

1)将一份低温冷藏的含有1-1型结合珠蛋白的人血浆充分冰浴，高速离心取上清液；

2)步骤1)所得上清液中加入硫酸铵至0℃时终饱和度35～40％，冰浴20～30min后高速离心，取上清液加入硫酸铵至0℃时终饱和度65％～70％，冰浴20～30min后高速离心，取沉淀；

3)步骤2)所得沉淀用双蒸水溶解，加入pH5.0～6.0缓冲盐溶液使缓冲盐溶液的最终浓度为50～100毫摩尔，用双蒸水补足至与步骤1)中离心上清液相同的体积；

4)步骤3)所得溶液中加入以pH5.0～6.0缓冲盐溶液溶解的分子量为3000～4500的聚乙二醇，使缓冲盐溶液最终浓度为50～100毫摩尔，聚乙二醇的最终质量体积比浓度为15～20％，冰浴20～30min后，高速离心取上清液，得到1-1型人血浆结合珠蛋白提取液。

步骤3)、4)所述的缓冲盐溶液为磷酸盐溶液或柠檬酸盐溶液或醋酸盐溶液。

人血浆中含有冷凝蛋白质，低温冷藏时冷凝蛋白质将从血浆中沉淀析出。将冷藏的人血浆充分冰浴一段时间，可以使血浆中冷凝蛋白质的析出更充分，并在0℃高速离心过程中沉淀到离心管底部而去除。去除的冷凝蛋白质可作为结合珠蛋白纯化的副产物，产生更高的经济效益。

人结合珠蛋白是酸性蛋白质，其等电点约为4.8-5.3，本发明在选择的pH 5.0-6.0之间的缓冲体系，更容易使人结合珠蛋白在等电点附近析出。另外，同一硫酸铵溶液的饱和度随着温度的降低而升高，本发明采用0℃的沉淀温度，可以减少硫酸铵的用量，提高了经济效益。

聚乙二醇沉淀工艺中的影响因素包括蛋白质性质、温度、酸碱度、聚乙二醇分子量、聚乙二醇含量等。申请人对上述影响因素进行研究，发现1-1型结合珠蛋白纯化时，聚乙二醇分子量介于3000-4500之间最合适——分子量小的聚乙二醇需要增加用量，分子量大的聚乙二醇粘度大，离心时沉淀的蛋白质不易沉降到离心管底部。温度下降时，1-1型结合珠蛋白的溶解度降低，申请人选择0℃的沉淀温度，减少了聚乙二醇的使用量，提高了经济效益；本发明将体系的pH控制在5-6之间，与1-1型结合珠蛋白的等电点接近，此时更容易发生沉淀，从而减少聚乙二醇的使用量，进一步提高经济效益。通过硫酸铵沉淀得到的1-1型人结合珠蛋白粗提液中还含有以白蛋白、免疫球蛋白等为主的大量杂蛋白，再以聚乙二醇沉淀工艺进行一次提取，去除了大部分杂蛋白，经SDS-PAGE鉴定1-1型结合珠蛋白纯度大于50％，已经满足阴离子交换层析、疏水层析纯化等大规模纯化工艺的要求。

本发明所述的制备方法具备以下优势：(1)所有操作在低温下进行，减少结合珠蛋白降解、微生物繁殖的发生率；(2)利用硫酸铵沉淀、聚乙二醇沉淀依次对含有1-1型人结合珠蛋白的血浆进行分级沉淀，提取方法温和，最大限度的保护1-1型人血浆结合珠蛋白的结构与功能；(3)体系中未引入可能具有毒性的物质。

本方法适用于从新鲜采集或过期人血浆中直接提取1-1型结合珠蛋白，所制备的人血浆结合珠蛋白提取液中1-1型结合珠蛋白含量得到显著提高，可以满足阴离子交换层析、疏水层析等大规模精细纯化工艺要求，非常适合作为从人血浆中大规模纯化结合珠蛋白的粗提取方法。

附图说明

图1和图2分别是含1-1型结合珠蛋白的人血浆按照本发明方法制备的硫酸铵分级沉淀提取液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图和免疫印迹图；图中，M为蛋白质分子量标准品；1为sigma公司各型结合珠蛋白混合物标准品；2为1-1型人血浆冰浴离心上清液；3为人血浆冰浴离心沉淀；4为硫酸铵终饱和度40％(0℃)时离心沉淀；5为硫酸铵终饱和度65％(0℃)时离心沉淀；6为硫酸铵终饱和度65％(0℃)时离心上清。

图3和图4分别为对1-1型结合珠蛋白硫酸铵提取液进行聚乙二醇分级沉淀所得组分的聚丙烯酰胺凝胶电泳图和免疫印迹图；图中，M为蛋白质分子量标准品；1为sigma公司各型结合珠蛋白混合物标准品；2为1-1型结合珠蛋白血浆的硫酸铵终饱和度65％(0℃)时的离心沉淀；3为加入聚乙二醇4500至最终质量体积比浓度为15％后的离心沉淀；4为加入聚乙二醇4500至最终质量体积比浓度为15％后的离心上清。

具体实施方式

人血浆来自血站过期人血浆，采用SDS-PAGE电泳或PCR分型法进行分型,其它试剂均采用市售的分析纯产品。

在0℃环境条件下制备1-1型人血浆结合珠蛋白提取液：

1)将经鉴定含有1-1型结合珠蛋白的人血浆50毫升充分冰浴，8000转/分钟离心10分钟除去冷凝蛋白质，得到上清液49毫升；

2)步骤1)所得上清液中加入硫酸铵粉末11.074克，使0℃时硫酸铵终饱和度达到40％，冰浴20～30min后8000转/分钟离心10分钟，得到上清液46毫升，加入硫酸铵粉末7.038克，使0℃时硫酸铵终饱和度达到65％，冰浴20～30min后8000转/分钟离心20分钟，取沉淀；

参见图1和图2，当1-1型人血浆结合珠蛋白位于硫酸铵终饱和度65％(0℃)时离心沉淀中，经过硫酸铵分级沉淀提取，去除了大量杂蛋白，为后续的聚乙二醇分级沉淀奠定了基础。

3)步骤2)所得沉淀用双蒸水溶解，加入0.4M醋酸钠-醋酸pH5.0缓冲溶液6.25毫升，使醋酸盐溶液的最终浓度为50～100毫摩尔，用双蒸水补足溶液体积至50ml，得到溶解液；

4)将聚乙二醇4500加入0.4M醋酸钠-醋酸pH5.0溶液中，配成质量体积比为50％的溶液。取21.43毫升50％聚乙二醇溶液加入步骤3)所得溶解液中，使聚乙二醇的最终质量体积比浓度为15％，冰浴20～30min后，8000转/分钟离心10分钟取上清液，得到1-1型人血浆结合珠蛋白提取液。

参见图3和图4，通过聚乙二醇4500对1-1型结合珠蛋白人血浆硫酸铵沉淀提取物进行再次提纯得到的提取液，进一步去除了杂蛋白，使通过阴离子交换层析、疏水层析等精细工艺进行1-1型结合珠蛋白的低成本、高效率大量纯化成为现实。

所得1-1型人血浆结合珠蛋白提取液，经SDS-PAGE检测其提取液中含1-1型人血浆结合珠蛋白大于50％。参见图3。

Claims

1.一种1-1型人血浆结合珠蛋白提取液的制备方法，其特征在于，在0℃环境条件下按照以下步骤进行：

1）取低温冷藏的含有1-1型结合珠蛋白的人血浆充分冰浴，高速离心取上清液；

2）步骤1）所得上清液中加入硫酸铵，至0℃时硫酸铵的最终饱和度为35~40%，冰浴20~30 min后高速离心，取上清液加入硫酸铵，至0℃时硫酸铵的最终饱和度为65%~70%，冰浴20~30 min后高速离心，取沉淀；

3）步骤2）所得沉淀用双蒸水溶解，加入pH5.0~6.0缓冲盐溶液使缓冲盐溶液的最终浓度为50~100毫摩尔/升，用双蒸水补足至与步骤1）中离心上清液相同的体积；

4）步骤3）所得溶液中加入以pH5.0~6.0缓冲盐溶液溶解的分子量为3000~4500的聚乙二醇，使缓冲盐溶液最终浓度为50~100毫摩尔/升，聚乙二醇的最终质量体积比浓度为15~20%，冰浴20~30 min后，高速离心取上清液，得到1-1型人血浆结合珠蛋白提取液。

2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3）、4）所述的缓冲盐溶液为磷酸盐溶液或柠檬酸盐溶液或醋酸盐溶液。