CN101367865B - 一种高纯度猪血白蛋白的生产工艺及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高纯度猪血清白蛋白的生产提取工艺，它由以下步骤组成：在猪血中加入枸橼酸钠、氯化钠，分离血浆与红细胞，血浆经离心，膜过滤提取后，放入夹层反应罐内，加热加入醇、辛酸钠、氯化钠，缓慢搅拌，分两次加入盐酸调pH值，离心，上清液加沉淀试剂磨成糊状，搅拌，冷藏过夜后离心分离沉淀，沉淀加水溶解，以氢氧化钠溶液调pH后静置，离心分离上清液，膜过滤和病毒灭活，冻干为成品。本工艺用料少，工艺流程短，生产效率高，操作容易，生产成本低，产品质量好，适合大批量生产。本产品可用作纤维蛋白胶封闭剂制备的辅料，生化原料，也可用作其它白蛋白的替代品。
Description
技术领域
本发明涉及一种从猪血清中提取高纯度白蛋白的工艺方法及猪血白蛋白用途；具体是一种猪血清白蛋白醇提复合沉淀精制工艺，获取的高纯度白蛋白用作纤维蛋白胶封闭剂制备的辅料，也可用作生化原料或其它白蛋白的替代品，属生物技术领域。
背景技术
血清白蛋白是一种蛋白质，在血液循环、解毒、脂类代谢等方面执行着多种重要的生物功能。在生物化学与免疫学研究中广泛用作生物大分子(酶、抗原)的稳定剂、模型抗原以及半抗原的载体。由于白蛋白是一种蛋白质，易受温度、有机溶剂和pH等影响而变性，其分离纯化要严格控制条件，难度大。最早，普遍应用硫酸铵重结晶法从血清中分离白蛋白，但此法的选择性极差。
人血清白蛋白(HSA)是人血中最丰富的蛋白质，其作用为维持渗透压，结合并运输营养物和代谢物；HSA有很大的药用价值，可作为药物治疗因白蛋白损失、合成和失血造成的白蛋白含量下降引起的低蛋白血症。获得白蛋白的方法多是从人血液中纯化，如中国专利CN1055095C、CN1313493C等公开了从人血液中分离纯化人血白蛋白的方法；然而这些方法存在一些问题，例如：血源的缺乏，不经济，以及受乙肝病毒、AIDS病毒等物质的污染的可能。为避免这些问题，另一基于重组DNA技术方法生产重组人血清白蛋白(rHSA)的多种方法最近已经得到了开发。如中国专利CN1496993A公开了一种适合于规模操作的重组人白蛋白的纯化方法，其方法通过以下步骤达到：含rHSA的发酵液上清液经：(a)具双重功能的耐高盐材料为基质的阳离子交换层析；(b)疏水层析(HIC)；(c)阴离子交换层析；中国专利CN101260145A公开了用无机盐培养基获得的含目标蛋白的基因工程酵母菌发酵上清液和使用无血清培养基获得的重组脊椎动物细胞培养液用一种耐高盐、高载量离子交换型亲和柱层析介质填料来分离纯化。然而，这些重组人白蛋白的纯化方法专利仍然存在一些相似的问题：纯化过程太复杂，周期长，成本高。为了获得生产周期短，成本低，适合于大规模生产的白蛋白或HAS(白蛋白)的替代品，从动物血中纯化生产白蛋白的工艺方法越来越受重视，中国专利CN100387620C公开了一种牛血清白蛋白热乙醇法提取工艺，该方法用料少、工艺流程短、收率高、产品质量较好。但是，该方法提取工艺中只包含了从牛血清中除去球蛋白的工艺，没有包含将白蛋白与血清单独分离的工艺步聚，产品中有包含其它成分的可能。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的之一是提供一种适合于大规模生产的猪血清白蛋白的分离纯化工艺方法，以获得高纯度猪血白蛋白产品。它不仅工艺相对简单，而且用料少，收率高，产品纯度高；可较大幅度的降低成本。
本发明另一个目的是将制备的猪血白蛋白产品作为生物辅料应用于纤维蛋白胶封闭剂产品生产，提高纤维蛋白胶封闭剂的质量和应用效果；还可用作生化原料，也可用作其它白蛋白的替代品。
本发明的目的是这样实现的：
一种高纯度猪血清白蛋白的生产工艺，其特征在于包括以下步骤：
A、取新鲜猪血加入血量的0.38％的枸橼酸钠、0.09％氯化钠，将血液于0-I0℃冷库中静置，待血浆与红细胞分层后，用虹吸法吸取血浆，下层血球另用；
B、取上述分离血浆，置于具有制冷装置的离心系统中，设定冷冻系统的温度为2℃-8℃，开启离心机离心，收集血浆，血浆再用0.22μm的滤器过滤，得精制血浆；
C、将精制血浆放入夹层反应罐内，夹层罐加热至65℃～80℃；取猪血浆容积的0.28-0.38％的辛酸钠、0.9％氯化钠，加入到与血浆等体积量的纯化水中溶解，溶解后溶液加入到血浆中，再加入醇溶液，使醇的体积浓度达到5.0％-10.0％，搅拌均匀，加入盐酸调pH值并保温后，将溶液加入到搅拌罐中，降温，再次用盐酸调pH值，密封放置；
D、取上述溶液，置离心系统中离心，收集上清液，加入沉淀试剂，使其浓度为20％-25％，用胶体磨边加上清液边加沉淀试剂打磨成糊状，搅拌后于2～8℃冷库保存过夜；
E、取上述混合溶液，置高速冷冻离心系统中，设定冷冻系统的温度为2℃-10℃，离心分取沉淀，-20℃冷库中保存备用；
F、跟据血浆量称取注射用水，加入到上述沉淀中，搅拌至完全溶解，用氢氧化钠溶液调节pH值，室温放置；置高速冷冻离心系统中，设定冷冻系统的温度为8℃-10℃，离心收集上清液；上清液用洁净的0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液备用；
G、病毒灭活：通过水浴对上述滤液进行病毒灭活，然后用0.22μm的滤膜过滤，取样检测蛋白质含量；
H、冻干，将病毒灭活滤液按冻干曲线冻干，得到成品。
本发明具有如下优点：
1.本发明是一种高纯度猪血白蛋白的生产，制备工艺简单，生产易实现规模化、自动化控制；
2.本发明利用猪血作为原料进行猪血清白蛋白提纯。由于猪的基因序列同人的基因序列极为相似，而携带人类的传染性疾病传播风险极小，避免了人类血源性疾病的传播机会；
3.本发明在制备工艺中包括了病毒灭活等工艺方法，使产品具有更高的可靠性与安全性；
4.本发明与传统工艺相比其用料少、工艺流程短，工艺流程操作容易、产品收率高、成本低、产品质量好；其质量检测结果见表1；
5.本发明生产安全环保。制备工艺的操作过程中对人员和周围环境不产生危害，符合国家的环保要求。
表1本发明的猪血白蛋白的质检结果与行业质量标准比较
本发明的成品白蛋白经检验，质量完全符合行业质量标准。
具体实施方式
猪血白蛋白是猪血清中主要的蛋白质，其含量约占血清中蛋白质总量的一半左右，猪血在我国资源极其丰富，猪血清白蛋白与人血清白蛋白非常相似，分子量67000，等电点为4.7，其性质比较稳定。本发明利用猪血白蛋白性质较稳定，血中含量高等特点，以猪血作为原料，以独特的提取分离工艺制备一种高纯度猪血白蛋白，并适合于大规模化生产，生产产品具有较高的可靠性与安全性。
本发明的高纯度猪血清白蛋白的生产工艺，包括以下步骤：
A、分离血浆：取新鲜猪血加入血量的0.38％的枸橼酸钠(抗凝剂)、0.09％氯化钠，将血液于0-10℃冷库中静置，待血浆与红细胞分层后，用虹吸法吸取血浆，下层血球另用；
B、精制血浆：取上述分离血浆，置具制冷装置的离心系统中，设定冷冻系统的温度为2℃-8℃，开启离心机离心，转速为3000转/分钟—5000转/分钟，离心30min-60min，收集血浆。血浆再用0.22μm的滤器过滤，得精制血浆；
C、分除球蛋白等：将精制血浆放入夹层反应罐内，夹层罐加热至65℃～80℃；取猪血浆容积的0.28-0.38％的辛酸钠(白蛋白的保护剂)、0.9％氯化钠，加入到与血浆等体积量的纯化水中溶解，溶解后溶液加入到血浆中，再加入醇溶液(醇溶液可为乙醇或甲醇)，使醇溶液的浓度达到5.0％-10.0％(V/V)，搅拌均匀，加入盐酸调pH值至5.5～6.5，保温20min-60min。将溶液加入到搅拌罐中，降温，使溶液降温到室温，测pH值。用盐酸调PH值至3.8～4.5，密封，在室温放置3小时；
D、离心、沉淀白蛋白：取上述溶液，置离心系统中，以转速为3000转/分钟—5000转/分钟，离心30min-60min，收集上清液。加入沉淀试剂，例如聚乙二醇6000、聚乙二醇4000或聚乙二醇5000，使其浓度为20％-25％，用胶体磨边加上清液边加沉淀试剂打磨成糊状，搅拌30分钟，2～8℃冷库保存过夜；
E、离心：取上述混合溶液，置高速冷冻离心系统中，设定冷冻系统的温度为2℃-8℃，以转速为5000转/分钟—10000转/分钟，离心30min-60min，分取沉淀，-20℃冷库中保存备用；
F、分离纯化：跟据血浆量称取注射用水，加入到上述沉淀中，搅拌至完全溶解，用氢氧化钠溶液调节PH值为6.0-7.5，室温放置4小时；置高速冷冻离心系统中，设定冷冻系统的温度为8℃-10℃，以转速为5000转/分钟—10000转/分钟，离心30min-60min，收集上清液；上清液用洁净的0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液备用；
G、病毒灭活：设定水浴的温度为60℃，将过滤后的溶液放至水浴中，待溶液的温度达到60℃，保温放置10小时；用0.22μm的滤膜过滤，取样检测蛋白质含量；
H、冻干：将病毒灭活滤液按冻干曲线冻干，即将病毒灭活滤液迅速冷却至-45℃，持续1-2小时，升到-20℃，持续10-20小时，再缓慢升温到0℃，再持续4-8小时升到室温25℃，为成品。
本发明制备的猪血白蛋白产品作为生物辅料应用于纤维蛋白胶封闭剂产品，具有极佳的封闭、止血效果，使纤维蛋白胶封闭剂的溶解时间明显缩短，其封闭凝固时间为3—5秒，较目前同类中封闭凝固时间最快的产品(专利CN1214446C)9—12秒时间更短，具有非常好的应用前景。另外还可用作生化原料，也可用作其它白蛋白的替代品。
实施例1
取经严格的检疫，无感染疾病猪群的新鲜猪血56000ml，加入到6220ml含3.8％枸橼酸钠、0.9％氯化钠溶液中，将血液于3℃冷库中静置10小时后，血浆与红细胞分层，用虹吸法吸取血浆，下层血球另用；将上述分离血浆，置具制冷装置的离心系统中，设定冷冻系统的温度为5℃，开启离心机离心，以转速为5000转/分钟，离心50min，收集血浆。血浆再用0.22μm的滤器过滤，得精制血浆约28000ml；
将精制血浆放入夹层反应罐内，夹层罐加热至70℃；取93.1g辛酸钠、252g氯化钠，加入到28000ml纯化水中溶解，溶解后溶液加入到血浆中，再加入95％乙醇溶液3200ml，使乙醇溶液的浓度达到5.4％(V/V)，搅拌均匀，加入盐酸调pH值至6.20，65℃保温40min后，将溶液加入到搅拌罐中，降温，使溶液降温到室温(20℃)，测pH值为6.25，再用盐酸调PH值至4.10，密封，在室温20℃放置3小时；将溶液置离心系统中，以转速为5000转/分钟，离心60min，收集上清液；加入聚乙二醇4000，使其浓度为25％，用胶体磨边加上清液边加沉淀试剂打磨成糊状，搅拌30分钟，2～8℃冷库保存过夜；取上述过液的混合溶液，置高速冷冻离心系统中，设定冷冻系统的温度为8℃，以转速为10000转/分钟，离心40min，分取沉淀；取注射用水28000ml，加入到沉淀中，搅拌至完全溶解，用氢氧化钠溶液调节PH值为6.5，室温放置4小时；置高速冷冻离心系统中，设定冷冻系统的温度为8℃，以转速为5000转/分钟离心60min，收集上清液；上清液用洁净的0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液置设定温度为60℃的水浴中，待溶液的温度达到60℃，保温放置10小时；再用0.22μm的滤膜过滤，滤液分装至冻干瓶中，再置冷冻干燥机中，迅速冷却至-45℃，持续2小时，升到-20℃，持续20小时，再缓慢升温到0℃，再持续4小时，升到室温25℃，持续8小时，真空压盖，得成品约1118g。
实施例2
取经严格的检疫，无感染疾病猪群的新鲜猪血40000ml，加入到4450ml含3.8％枸橼酸钠、0.9％氯化钠溶液中，将血液于8℃冷库中静置8小时后，血浆与红细胞分层，用虹吸法吸取血浆，下层血球另用；将上述分离血浆，置具制冷装置的离心系统中，设定冷冻系统的温度为8℃，开启离心机离心，以转速为5000转/分钟，离心45min，收集血浆。血浆再用0.22μm的滤器过滤，得精制血浆约20000ml；
将精制血浆放入夹层反应罐内，夹层罐加热至70℃；取66.5g辛酸钠、180g氯化钠，加入到20000ml纯化水中溶解，溶解后溶液加入到血浆中，再加入95％乙醇溶液2225ml，使乙醇溶液的浓度达到5.0％(V/V)，搅拌均匀，加入盐酸调pH值至6.25，70℃保温30min后，将溶液加入到搅拌罐中，降温，使溶液降温到室温(20℃)，测pH值为6.30，再用盐酸调PH值至4.20，密封，在室温20℃放置3小时；将溶液置离心系统中，以转速为5000转/分钟，离心60min，收集上清液；加入聚乙二醇6000，使其浓度为22％，用胶体磨边加上清液边加沉淀试剂打磨成糊状，搅拌30分钟，2～8℃冷库保存过夜；取上述过液的混合溶液，置高速冷冻离心系统中，设定冷冻系统的温度为8℃，以转速为10000转/分钟，离心30min，分取沉淀；取注射用水20000ml，加入到沉淀中，搅拌至完全溶解，用氢氧化钠溶液调节PH值为6.7，室温放置4小时；置高速冷冻离心系统中，设定冷冻系统的温度为6℃，以转速为5000转/分钟离心60min，收集上清液；上清液用洁净的0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液置设定温度为60℃的水浴中，待溶液的温度达到60℃，保温放置10小时；再用0.22μm的滤膜过滤，滤液分装至冻干瓶中，再置冷冻干燥机中，迅速冷却至-45℃，持续2小时，升到-20℃，持续20小时，再缓慢升温到0℃，再持续8小时，升到室温25℃，持续2小时，真空压盖，得成品约797g。
实施例3
取经严格的检疫，无感染疾病猪群的新鲜猪血50000ml，加入到5560ml含3.8％枸橼酸钠、0.9％氯化钠溶液中，将血液于5℃冷库中静置8小时后，血浆与红细胞分层，用虹吸法吸取血浆，下层血球另用；将上述分离血浆，置具制冷装置的离心系统中，设定冷冻系统的温度为10℃，开启离心机离心，以转速为3000转/分钟，离心60min，收集血浆。血浆再用0.22μm的滤器过滤，得精制血浆约25000ml；
将精制血浆放入夹层反应罐内，夹层罐加热至70℃；取83.2g辛酸钠、225.0g氯化钠，加入到25000ml纯化水中溶解，溶解后溶液加入到血浆中，再加入甲醇溶液3800ml，使醇溶液的浓度达到7.0％(V/V)，搅拌均匀，加入盐酸调pH值至6.30，75℃保温30min后，将溶液加入到搅拌罐中，降温，使溶液降温到室温(20℃)，测pH值为6.35，再用盐酸调PH值至4.50，密封，在室温20℃放置3小时；将溶液置离心系统中，以转速为5000转/分钟，离心60min，收集上清液；加入聚乙二醇5000，使其浓度为25％，用胶体磨边加上清液边加沉淀试剂打磨成糊状，搅拌30分钟，2～8℃冷库保存过夜；取上述过液的混合溶液，置高速冷冻离心系统中，设定冷冻系统的温度为5℃，以转速为50000转/分钟，离心60min，分取沉淀；取注射用水25000ml，加入到沉淀中，搅拌至完全溶解，用氢氧化钠溶液调节PH值为7.0，室温放置4小时；置高速冷冻离心系统中，设定冷冻系统的温度为8℃，以转速为10000转/分钟离心40min，收集上清液；上清液用洁净的0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液置设定温度为60℃的水浴中，待溶液的温度达到60℃，保温放置10小时；再用0.22μm的滤膜过滤，滤液分装至冻干瓶中，再置冷冻干燥机中，迅速冷却至-45℃，持续2小时，升到-20℃，持续20小时，再缓慢升温到0℃，再持续6小时，升到室温25℃，持续3小时，真空压盖，得成品约998g。
实施例4猪血白蛋白在纤维蛋白胶封闭剂中的应用实施例
业已发现，采用一种含纤维蛋白原与凝血酶的生物胶的成功涂敷，取决于所形成生物胶的质地、凝固时间等。因此，人们希望能够提供一种用于制备具有一定质地、凝固时间短的生物胶，特别是对于制备适合于含纤维蛋白原与凝血酶涂敷的生物胶，从而得到一种用于治疗和密封伤口的医用止血材料。本申请人的纤维蛋白胶封闭剂.它由主体胶冻干粉、催化剂冻干粉、主体胶溶解液和催化剂溶解液四个组分构成。
对比试验：
按照本申请人纤维蛋白胶封闭剂的配方生产工艺分别制备主体胶冻干粉、催化剂冻干粉、主体胶溶解液和催化剂溶解液，分以下6种：
I：主体胶冻干粉，不加猪血白蛋白，其它配方不变；
II：主体胶冻干粉，加入10％实施例2制备的猪血白蛋白，其它配方不变；
III：催化剂冻干粉，不加猪血白蛋白，其它配方不变；
IV：催化剂冻干粉，加入8％实施例2制备的猪血白蛋白，其它配方不变；
V：主体胶溶解液，按原工艺配方不变；
VI：催化剂溶解液，按原工艺配方不变；
(1).溶解时间对比：将I的主体胶冻干粉溶解于V的主体胶溶解液制成组份A1，III的催化剂冻干粉溶解于VI催化剂溶解液制成组份B1，溶解时间约12分钟；将II的主体胶冻干粉溶解于V的主体胶溶解液制成组份A2，IV的催化剂冻干粉溶解于VI催化剂溶解液制成组份B2，溶解时间约2分钟。
(2).凝固时间对比：取组份A1与组份B1分别吸入到组合式推液支架(本公司的专利CN2553815Y产品)双腔推液器的无菌注射器内，通过双腔推液器的锥头均匀混合二种溶液，同时喷涂到玻璃板面上，用秒表计时，凝固时间19-22秒；取组份A2与组份B2分别吸入到组合式推液支架(本公司的专利CN2553815Y产品)双腔推液器的无菌注射器内，通过双腔推液器的锥头均匀混合二种溶液，同时喷涂到玻璃板面上，用秒表计时，凝固时间3-5秒。
实验结果证明，在纤维蛋白胶封闭剂的制备中加入适量的猪血白蛋白辅料，可大大缩短溶解时间和成胶凝固时间，极大地提高了产品的质量。
Claims (2)
1.一种高纯度猪血清白蛋白的生产工艺，其特征在于包括以下步骤：
A、取新鲜猪血加入血量的0.38％的枸橼酸钠、0.09％氯化钠，将血液于0-10℃冷库中静置，待血浆与红细胞分层后，用虹吸法吸取血浆，下层血球另用；
B、取上述分离血浆，置于具有制冷装置的离心系统中，设定冷冻系统的温度为2℃-8℃，开启离心机离心，收集血浆，血浆再用0.22μm的滤器过滤，得精制血浆；
C、将精制血浆放入夹层反应罐内，夹层罐加热至65℃～80℃；取猪血浆容积的0.28-0.38％的辛酸钠、0.9％氯化钠，加入到与血浆等体积量的纯化水中溶解，溶解后溶液加入到血浆中，再加入乙醇或甲醇溶液，使醇的体积浓度达到5.0％-10.0％，搅拌均匀，加入盐酸调pH值为5.5～6.5，并在温度为65℃～80℃下保温20min-60min后，将溶液加入到搅拌罐中，使溶液降温到室温，再次用盐酸调pH值为3.8～4.5，密封放置；
D、取上述溶液，置离心系统中离心，收集上清液，加入选自聚乙二醇6000、聚乙二醇4000或聚乙二醇5000的沉淀试剂，使其浓度为20％-25％，用胶体磨边加上清液边加沉淀试剂打磨成糊状，搅拌后于2～8℃冷库保存过夜；
E、取上述混合溶液，置高速冷冻离心系统中，设定冷冻系统的温度为2℃-10℃，离心分取沉淀，-20℃冷库中保存备用；
F、根据血浆量称取注射用水，加入到上述沉淀中，搅拌至完全溶解，用氢氧化钠溶液调节pH值为6.0-7.5，室温放置；置高速冷冻离心系统中，设定冷冻系统的温度为8℃-10℃，离心收集上清液；上清液用洁净的0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液备用；
G、病毒灭活：设定水浴的温度为60℃，将过滤后的溶液放至水浴中，待溶液的温度达到60℃，保温放置10小时，进行病毒灭活，然后用0.22μm的滤膜过滤，取样检测蛋白质含量；
H、冻干，将病毒灭活滤液按冻干曲线冻干，得到成品，冻干曲线为：将病毒灭活滤液迅速冷却至-45℃，持续1-2小时，升到-20℃，持续10-20小时，再缓慢升温到0℃，再持续4-8小时升到室温25℃。
2.根据权利要求1所述一种高纯度猪血白蛋白的生产工艺，其特征在于：所述步骤B的离心机离心，转速为3000转/分钟-5000转/分钟，离心30min-60min；所述步骤D的离心系统离心，以转速为3000转/分钟-5000转/分钟，离心30min-60min；所述步骤E的离心系统离心，转速为5000转/分钟-10000转/分钟，离心30min-60min；所述步骤F的离心系统离心，以转速为5000转/分钟-10000转/分钟，离心30min-60min。
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