CN105384791B

CN105384791B - 一种高纯度牦牛血清白蛋白的生产工艺

Info

Publication number: CN105384791B
Application number: CN201510903035.0A
Authority: CN
Inventors: 许卫红
Original assignee: Qingdao Arctic Yak Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Qingdao Arctic Yak Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2015-12-09
Filing date: 2015-12-09
Publication date: 2016-07-06
Anticipated expiration: 2035-12-09
Also published as: CN105384791A

Abstract

本发明公开了一种高纯度牦牛血清白蛋白的生产工艺，由以下步骤组成：在牦牛血中加入柠檬酸钠和氯化钠，分离血浆与红细胞，血浆经离心、过滤提取后，放入夹层反应罐内，加热并加入辛酸钠、氯化钠、乙醇或甲醇，缓慢搅拌，分两次加入盐酸调pH值，离心，上清液加沉淀试剂磨成糊状，搅拌，冷藏过夜后离心分离沉淀，沉淀加水溶解，以氢氧化钠溶液调pH后静置，离心分离上清液，过滤和病毒灭活，冻干为成品。本发明制备工艺简单，用料少、工艺流程短，工艺流程操作容易、产品收率高、成本低、产品质量好；生产易实现规模化、自动化控制；使产品具有更高的可靠性与安全性。

Description

一种高纯度牦牛血清白蛋白的生产工艺

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种高纯度牦牛血清白蛋白的生产工艺。

背景技术

牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin,BSA)是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.43kDa，等电点为4.7，含氮量为16％，含糖量为0.08％，含脂量只有0.2％；白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合，BSA是生物学诸多学科及医、药学各领域广泛应用的生化试剂，例如在westernblot中作为封闭试剂，血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、pH缓冲作用、载体作用和营养作用；在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。

BSA的制备方法较多，但多数尚处于实验阶段，目前市场上的BSA主要采用以下两种方法制得：(1)盐析法，用硫酸铵分级沉淀后，经辛酸处理精制而得；(2)有机溶剂沉淀法，以E.J.Cohn氏法最常用，最早用于人血液制品的生产，利用乙醇的低介电常数性质以及蛋白质在一定温度、pH、离子强度及浓度条件下在不同浓度乙醇中溶解度不同分离血浆蛋白质,可以生产出多种血浆蛋白。

盐析法为最传统的生产方法，此法原理较为简单，但是硫酸铵对设备有一定的腐蚀性，整个工艺比较耗时，且硫酸铵用量很多，所得产品纯度只有80％～90％，收率一般为0.8～1.0％，以上导致此法生产效率低，成本偏高；利用冷乙醇沉淀法也有一些不足：乙醇是一种非特异性沉淀剂，尽管BSA生产效率显著，但产品纯度不是很高，作为有机溶剂的乙醇还可能使蛋白质发生聚集或变性，为了避免蛋白质变性，必须在－20℃的低温环境中进行，设备与厂房的投入很大，乙醇易燃，给生产带来安全隐患，单程需7日，能源消耗巨大，费时费力，生产不易实现自动化，有机溶剂沉淀法所得BSA纯度在90％～95％，收率在10％左右，相对而言成本比较高，从而使其产品因在市场中售价偏高而降低了竞争力。

青藏高原牦牛生活在海拔3000米以上的高原地区，为了适应高海拔地区的缺氧环境，其血液中红细胞数量相比普通牛血红细胞高很多，简单套用传统牛血清白蛋白生产方法会使产品中杂蛋白含量较高，传统牛血清白蛋白生产方法对牦牛血白蛋白不适用。因此，一种针对高原牦牛血白蛋白的生产方法对开发青藏高原特有牦牛血白蛋白的意义很大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适合于大规模生产的高纯度牦牛血清白蛋白的生产工艺，此方法不仅工艺相对简单，而且用料少，收率高，产品纯度高；可较大幅度的降低成本。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种高纯度牦牛血清白蛋白的生产工艺，由以下步骤组成：

1)、取新鲜牦牛血，再加入柠檬酸钠、氯化钠，其中柠檬酸钠与牦牛血的质量体积比为0.43％(w/v)，氯化钠与牦牛血的质量体积比为0.09％(w/v)，然后牦牛血于0～10℃冷库中静置，待血浆与红细胞分层后，用虹吸法吸取血浆，下层血球另用；

2)、取上述分离血浆，置于具有制冷装置的离心系统中，设定离心系统的温度为2℃～8℃，开启离心机离心，收集血浆，血浆再用0.22μm的微孔滤膜过滤，得精制血浆；

3)、将精制血浆放入夹层反应罐内，夹层罐加热至65℃～80℃；取辛酸钠、氯化钠加入到与精制血浆等体积的纯化水中溶解，溶解后的溶液加入到精制血浆中，得到的混合溶液，其中辛酸钠与混合溶液的质量体积比为0.28～0.43％(w/v)，氯化钠与混合溶液的质量体积比为0.9％(w/v)；再加入乙醇或甲醇溶液，使乙醇或甲醇的体积浓度达到5.0％～10.0％(V/V)，搅拌均匀，加入盐酸调pH值为5.5～6.5，并在温度为65℃～80℃下保温20min～60min后，将溶液加入到搅拌罐中，使溶液降温到室温，再次用盐酸调pH值为3.8～4.5，密封放置；

4)、取上述溶液，置于离心系统中离心，收集上清液，加入沉淀试剂，使其体积浓度为20％～25％，用胶体磨边加上清液边加沉淀试剂打磨成糊状，搅拌后于2～8℃冷库保存过夜；

5)、取上述混合溶液，置于离心系统中，设定离心系统的温度为2℃～10℃，离心分离取沉淀物，-20℃冷库中保存备用；

6)、根据血浆量称取注射用水，加入到上述沉淀物中，搅拌至完全溶解，用氢氧化钠溶液调节pH值为6.0～7.5，室温放置；置于离心系统中，设定离心系统的温度为8℃～10℃，离心收集上清液；上清液用洁净的0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液备用；

7)、病毒灭活：设定水浴的温度为60℃，将过滤后的滤液放至水浴中，待滤液的温度达到60℃，保温放置10小时，进行病毒灭活，然后用0.22μm的微孔滤膜过滤，制得病毒灭活滤液，取样检测蛋白质含量；

8)、冻干，将病毒灭活滤液按冻干曲线冻干，得到成品，冻干曲线为：将病毒灭活滤液迅速冷却至-45℃，持续1～2小时，升到-20℃，持续10～20小时，再缓慢升温到0℃，再持续4～8小时升到室温25℃。

作为本发明进一步的方案：所述步骤2)的离心机离心的转速为3000转/分钟～5000转/分钟，离心时间为30min～60min。

作为本发明进一步的方案：所述步骤4)中离心系统离心的转速为3000转/分钟～5000转/分钟，离心时间为30min～60min。

作为本发明进一步的方案：所述步骤5)中离心系统离心的转速为5000转/分钟～10000转/分钟，离心时间为30min～60min。

作为本发明进一步的方案：所述步骤6)中离心系统离心的转速为5000转/分钟～10000转/分钟，离心时间为30min～60min。

作为本发明进一步的方案：沉淀试剂采用聚乙二醇6000、聚乙二醇4000或聚乙二醇5000。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明是一种高纯度牦牛血白蛋白的生产，制备工艺简单，生产易实现规模化、自动化控制；

2.本发明利用牦牛血作为原料进行牦牛血清白蛋白提纯。由于牦牛携带人类的传染性疾病传播风险极小，避免了人类血源性疾病的传播机会；

3.本发明在制备工艺中包括了病毒灭活等工艺方法，使产品具有更高的可靠性与安全性；

4.本发明与传统工艺相比其用料少、工艺流程短，工艺流程操作容易、产品收率高、成本低、产品质量好；

5.本发明生产安全环保。制备工艺的操作过程中对人员和周围环境不产生危害，符合国家的环保要求。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

牦牛血白蛋白是牦牛血清中主要的蛋白质，其含量约占血清中蛋白质总量的一半左右，牦牛血在青藏高原资源极其丰富，牦牛血清白蛋白与人血清白蛋白非常相似，分子量67000，等电点为4.7，其性质比较稳定。本发明利用牦牛血白蛋白性质较稳定，血中含量高等特点，以牦牛血作为原料，以独特的提取分离工艺制备一种高纯度牦牛血白蛋白，并适合于大规模化生产，生产产品具有较高的可靠性与安全性。

实施例1

取经严格的检疫，无感染疾病牦牛群的新鲜牦牛血56000mL，加入到6220mL含4.2％柠檬酸钠、0.9％氯化钠溶液中，将血液于3℃冷库中静置10小时后，血浆与红细胞分层，用虹吸法吸取血浆，下层血球另用；将上述分离血浆，置于具有制冷装置的离心系统中，设定离心系统的温度为5℃，开启离心机离心，以转速为5000转/分钟，离心50min，收集血浆。血浆再用0.22μm的微孔滤膜过滤，得精制血浆约28000mL；

将精制血浆放入夹层反应罐内，夹层罐加热至70℃；取93.1g辛酸钠、252g氯化钠，加入到28000mL纯化水中溶解，溶解后溶液加入到精制血浆中，再加入95％乙醇溶液3200mL，使乙醇溶液的浓度达到5.4％(V/V)，搅拌均匀，加入盐酸调pH值至6.20，65℃保温40min后，将溶液加入到搅拌罐中，降温，使溶液降温到室温(20℃)，测pH值为6.25，再用盐酸调pH值至4.10，密封，在室温20℃放置3小时；将溶液置于离心系统中，以转速为5000转/分钟，离心60min，收集上清液；加入聚乙二醇4000，使其体积浓度为25％，用胶体磨边加上清液边加沉淀试剂打磨成糊状，搅拌30分钟，2～8℃冷库保存过夜；取上述过夜的混合溶液，置于离心系统中，设定离心系统的温度为8℃，以转速为10000转/分钟，离心40min，分取沉淀物；取注射用水28000mL，加入到沉淀物中，搅拌至完全溶解，用氢氧化钠溶液调节pH值为6.5，室温放置4小时；置于离心系统中，设定离心系统的温度为8℃，以转速为5000转/分钟离心60min，收集上清液；上清液用洁净的0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液置设定温度为60℃的水浴中，待溶液的温度达到60℃，保温放置10小时；再用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液分装至冻干瓶中，再置冷冻干燥机中，迅速冷却至-45℃，持续2小时，升到-20℃，持续20小时，再缓慢升温到0℃，再持续4小时，升到室温25℃，持续8小时，真空压盖，得成品约1118g。

实施例2

取经严格的检疫，无感染疾病牦牛群的新鲜牦牛血40000mL，加入到4450mL含4.2％柠檬酸钠、0.9％氯化钠溶液中，将血液于8℃冷库中静置8小时后，血浆与红细胞分层，用虹吸法吸取血浆，下层血球另用；将上述分离血浆，置于具有制冷装置的离心系统中，设定离心系统的温度为8℃，开启离心机离心，以转速为5000转/分钟，离心45min，收集血浆。血浆再用0.22μm的微孔滤膜过滤，得精制血浆约20000mL；

将精制血浆放入夹层反应罐内，夹层罐加热至70℃；取66.5g辛酸钠、180g氯化钠，加入到20000mL纯化水中溶解，溶解后溶液加入到精制血浆中，再加入95％乙醇溶液2225mL，使乙醇溶液的浓度达到5.0％(V/V)，搅拌均匀，加入盐酸调pH值至6.25，70℃保温30min后，将溶液加入到搅拌罐中，降温，使溶液降温到室温(20℃)，测pH值为6.30，再用盐酸调pH值至4.20，密封，在室温20℃放置3小时；将溶液置于离心系统中，以转速为5000转/分钟，离心60min，收集上清液；加入聚乙二醇6000，使其体积浓度为22％，用胶体磨边加上清液边加沉淀试剂打磨成糊状，搅拌30分钟，2～8℃冷库保存过夜；取上述过夜的混合溶液，置于离心系统中，设定离心系统的温度为8℃，以转速为10000转/分钟，离心30min，分取沉淀物；取注射用水20000mL，加入到沉淀物中，搅拌至完全溶解，用氢氧化钠溶液调节pH值为6.7，室温放置4小时；置于离心系统中，设定离心系统的温度为6℃，以转速为5000转/分钟离心60min，收集上清液；上清液用洁净的0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液置设定温度为60℃的水浴中，待溶液的温度达到60℃，保温放置10小时；再用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液分装至冻干瓶中，再置冷冻干燥机中，迅速冷却至-45℃，持续2小时，升到-20℃，持续20小时，再缓慢升温到0℃，再持续8小时，升到室温25℃，持续2小时，真空压盖，得成品约797g。

实施例3

取经严格的检疫，无感染疾病牦牛群的新鲜牦牛血50000mL，加入到5560mL含3.8％柠檬酸钠、0.9％氯化钠溶液中，将血液于5℃冷库中静置8小时后，血浆与红细胞分层，用虹吸法吸取血浆，下层血球另用；将上述分离血浆，置于具有制冷装置的离心系统中，设定离心系统的温度为10℃，开启离心机离心，以转速为3000转/分钟，离心60min，收集血浆。血浆再用0.22μm的微孔滤膜过滤，得精制血浆约25000mL；

将精制血浆放入夹层反应罐内，夹层罐加热至70℃；取83.2g辛酸钠、225.0g氯化钠，加入到25000mL纯化水中溶解，溶解后溶液加入到精制血浆中，再加入甲醇溶液3800mL，使醇溶液的浓度达到7.0％(V/V)，搅拌均匀，加入盐酸调pH值至6.30，75℃保温30min后，将溶液加入到搅拌罐中，降温，使溶液降温到室温(20℃)，测pH值为6.35，再用盐酸调pH值至4.50，密封，在室温20℃放置3小时；将溶液置于离心系统中，以转速为5000转/分钟，离心60min，收集上清液；加入聚乙二醇5000，使其体积浓度为25％，用胶体磨边加上清液边加沉淀试剂打磨成糊状，搅拌30分钟，2～8℃冷库保存过夜；取上述过夜的混合溶液，置于离心系统中，设定离心系统的温度为5℃，以转速为50000转/分钟，离心60min，分取沉淀物；取注射用水25000mL，加入到沉淀物中，搅拌至完全溶解，用氢氧化钠溶液调节pH值为7.0，室温放置4小时；置于离心系统中，设定离心系统的温度为8℃，以转速为10000转/分钟离心40min，收集上清液；上清液用洁净的0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液置设定温度为60℃的水浴中，待溶液的温度达到60℃，保温放置10小时；再用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液分装至冻干瓶中，再置冷冻干燥机中，迅速冷却至-45℃，持续2小时，升到-20℃，持续20小时，再缓慢升温到0℃，再持续6小时，升到室温25℃，持续3小时，真空压盖，得成品约998g。

将实施例3制得的牦牛血白蛋白进行检测，结果如表1所示。

表1本发明的牦牛血白蛋白的质检结果与行业质量标准比较表

检验项目	本发明的白蛋白	行业标准
			外观	白色粉末	白色或结晶粉末
溶解时间	47秒	2分钟
			纯度	97.6％	90％
1％浓度蛋白溶液403nm吸光度	0.12	0.35
			水分	2.4％	5.0％
功能试验	合格	包被功能

本发明的牦牛血白蛋白产品完全符合行业标准。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims

1.一种高纯度牦牛血清白蛋白的生产工艺，其特征在于，由以下步骤组成：

1)取新鲜牦牛血，再加入柠檬酸钠、氯化钠，其中柠檬酸钠与牦牛血的质量体积比为0.43％(w/v)，氯化钠与牦牛血的质量体积比为0.09％(w/v)，然后牦牛血于0～10℃冷库中静置，待血浆与红细胞分层后，用虹吸法吸取血浆，下层血球另用；

2)取上述分离血浆，置于具有制冷装置的离心系统中，设定离心系统的温度为2℃～8℃，开启离心机离心，收集血浆，血浆再用0.22μm的微孔滤膜过滤，得精制血浆；

3)将精制血浆放入夹层反应罐内，夹层罐加热至65℃～80℃；取辛酸钠、氯化钠加入到与精制血浆等体积的纯化水中溶解，溶解后的溶液加入到精制血浆中，得到混合溶液，其中辛酸钠与混合溶液的质量体积比为0.28～0.43％(w/v)，氯化钠与混合溶液的质量体积比为0.9％(w/v)；再加入乙醇或甲醇溶液，使乙醇或甲醇的体积浓度达到5.0％～10.0％(V/V)，搅拌均匀，加入盐酸调pH值为5.5～6.5，并在温度为65℃～80℃下保温20min～60min后，将溶液加入到搅拌罐中，使溶液降温到室温，再次用盐酸调pH值为3.8～4.5，密封放置；

4)取上述溶液，置于离心系统中离心，收集上清液，加入沉淀试剂，使其体积浓度为20％～25％，用胶体磨边加上清液边加沉淀试剂打磨成糊状，搅拌后于2～8℃冷库保存过夜；沉淀试剂采用聚乙二醇6000、聚乙二醇4000或聚乙二醇5000；

5)取上述混合溶液，置于离心系统中，设定离心系统的温度为2℃～10℃，离心分离取沉淀物，-20℃冷库中保存备用；

6)根据血浆量称取注射用水，加入到上述沉淀物中，搅拌至完全溶解，用氢氧化钠溶液调节pH值为6.0～7.5，室温放置；置于离心系统中，设定离心系统的温度为8℃～10℃，离心收集上清液；上清液用洁净的0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液备用；

7)病毒灭活：设定水浴的温度为60℃，将过滤后的滤液放至水浴中，待滤液的温度达到60℃，保温放置10小时，进行病毒灭活，然后用0.22μm的微孔滤膜过滤，制得病毒灭活滤液，取样检测蛋白质含量；

8)冻干，将病毒灭活滤液按冻干曲线冻干，得到成品，冻干曲线为：将病毒灭活滤液迅速冷却至-45℃，持续1～2小时，升到-20℃，持续10～20小时，再缓慢升温到0℃，再持续4～8小时升到室温25℃。

2.根据权利要求1所述的高纯度牦牛血清白蛋白的生产工艺，其特征在于，所述步骤2)的离心机离心的转速为3000转/分钟～5000转/分钟，离心时间为30min～60min。

3.根据权利要求1所述的高纯度牦牛血清白蛋白的生产工艺，其特征在于，所述步骤4)中离心系统离心的转速为3000转/分钟～5000转/分钟，离心时间为30min～60min。

4.根据权利要求1所述的高纯度牦牛血清白蛋白的生产工艺，其特征在于，所述步骤5)中离心系统离心的转速为5000转/分钟～10000转/分钟，离心时间为30min～60min。

5.根据权利要求1所述的高纯度牦牛血清白蛋白的生产工艺，其特征在于，所述步骤6)中离心系统离心的转速为5000转/分钟～10000转/分钟，离心时间为30min～60min。