CN109762061A - 一种简单高效的单克隆抗体的纯化方法 - Google Patents
一种简单高效的单克隆抗体的纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109762061A CN109762061A CN201910197627.3A CN201910197627A CN109762061A CN 109762061 A CN109762061 A CN 109762061A CN 201910197627 A CN201910197627 A CN 201910197627A CN 109762061 A CN109762061 A CN 109762061A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- purification process
- mobile phase
- process according
- purified
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 55
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims abstract description 26
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 24
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 18
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 24
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 claims description 20
- 101000777550 Homo sapiens CCN family member 2 Proteins 0.000 claims description 19
- 102100031168 CCN family member 2 Human genes 0.000 claims description 17
- 101710199268 Periostin Proteins 0.000 claims description 17
- 102100037765 Periostin Human genes 0.000 claims description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 17
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000005185 salting out Methods 0.000 claims description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 9
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 5
- 239000013622 capto Q Substances 0.000 claims description 4
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 32
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 34
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 101001095308 Homo sapiens Periostin Proteins 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 2
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000005660 chlorination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- 102000047612 human CCN2 Human genes 0.000 description 2
- 102000048431 human POSTN Human genes 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 2
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 2
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- -1 trihydroxy methyl amino Chemical group 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039419 Connective Tissue Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015225 Connective Tissue Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 206010054949 Metaplasia Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000015689 metaplastic ossification Effects 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229940125645 monoclonal antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种简单高效的单克隆抗体的纯化方法，所述纯化方法包括：对含有单克隆抗体的样品进行粗提纯；对所述粗提纯的产物进行透析；利用HPLC法对所述透析的产物进行纯化，其中，所述纯化采用阴离子交换介质，以流动相A和流动相B为洗脱液，流速为1～3ml/min，利用梯度洗脱模式进行洗脱，柱温35～40℃，检测波长280nm；所述流动相A为三羟甲基氨基甲烷缓冲液，所述流动相B为三羟甲基氨基甲烷缓冲液和氯化钠的混合溶液。本发明提供的单克隆抗体的纯化方法简单易行，蛋白回收率高、重复性好，适用于批量制备单克隆抗体。
Description
技术领域
本发明涉及单克隆抗体纯化技术领域，尤其涉及一种方法简单、回收纯度高的单克隆抗体的纯化方法。
背景技术
单克隆抗体纯化是单克隆抗体研究和单克隆抗体药物制备过程中必须涉及和应用的基本技术。常见的单克隆抗体纯化通常是从细胞培养基中或者动物腹水中纯化药物级单克隆抗体蛋白质包括收获和净化，接着通过一系列的柱层析步骤或者膜超滤和渗滤结合而纯化。在纯化之后，期望的抗体制剂经适当配制并且存储在合适的条件中。然而，在柱层析纯化期间，有时可观察到工艺相关的和产物相关的杂质与期望的抗体一起共洗脱；同时，在各种柱层析联用技术中往往会出现溶剂置换等问题，不仅会打破蛋白在溶液中的稳态环境，还可能导致蛋白失活变性，也会无形中增加了纯化分析的难度与繁复程度，不利于商业化生产以及车间放大生产。因此，这种纯化过程相对复杂、回收率比较低，且无法提供具有其药物应用所需的期望水平的纯度和质量的抗体。
此外，现有的抗体纯化或者其他蛋白纯化过程中经常采用至少三种纯化技术(例如，亲和、离子交换、疏水相互作用等)相结合的方式使用来纯化样品，后期还要经过超滤/微滤等渗透方法结束工艺步骤，然而，多种纯化技术中的每一步纯化都会造成目的蛋白的流失，严重影响收率，尤其是药用领域的抗体类蛋白样品，由于本身稀少难得，再经过多步纯化就会导致所剩无几，还有可能因为繁复的操作而造成其他的不良影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单高效的单克隆抗体的纯化方法，该纯化方法分离效果好、回收纯度高。
为了达到上述目的，本发明提供一种简单高效的单克隆抗体的纯化方法，包括：对含有单克隆抗体的样品进行粗提纯；对所述粗提纯的产物进行透析；利用HPLC法对所述透析的产物进行纯化，其中，所述纯化采用阴离子交换介质，以流动相A和流动相B为洗脱液，流速为1～3mL/min，利用梯度洗脱模式进行洗脱，柱温35～40℃，检测波长280nm；所述流动相A为三羟甲基氨基甲烷缓冲液，所述流动相B为三羟甲基氨基甲烷缓冲液和氯化钠的混合溶液。
进一步的，所述流动相A的pH值为6.5～8.5；所述流动相B的pH值为6.5～8.5。
进一步的，所述三羟甲基氨基甲烷缓冲液的终浓度为10～50mmol/L；所述氯化钠的终浓度为0.5～1mol/L。
进一步的，所述含有单克隆抗体的样品包括：含有单克隆抗体的小鼠腹水、含有单克隆抗体的杂交瘤细胞的培养上清、重组单克隆抗体的发酵上清。
进一步的，所述单克隆抗体包括：抗人CTGF单克隆抗体或抗人periostin单克隆抗体。
进一步的，所述阴离子交换介质是Q Sepharose FF系列、Capto Q系列、SOURCE Q系列、Propac-wax系列的阴离子交换凝胶。
进一步的，选用长度为20～30cm的色谱柱，填料粒径为2～10μm。
进一步的，对含有单克隆抗体的样品进行粗提纯的步骤包括：基于盐析法采用饱和硫酸铵溶液对含有单克隆抗体的样品进行盐析。
更进一步的，所述盐析法包括：于含有单克隆抗体的样品中先后加入饱和硫酸铵溶液至终浓度分别为体积百分浓度为40％～60％和30％～40％，分别于4℃盐析2小时，离心。
进一步的，对所述粗提纯的产物进行透析的步骤包括：采用三羟甲基氨基甲烷缓冲液对所述粗提纯的产物进行透析。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的简单高效的单克隆抗体的纯化方法，对含有单克隆抗体的样品进行盐析粗提纯和透析，再经过高效液相色谱法进一步精提纯，具有分离效果好、回收纯度高的优点。在高效液相色谱法中，采用阴离子交换介质，可以使单克隆抗体与阴离子交换介质结合紧密，梯度洗脱可以使单克隆抗体和杂质有效的分离，从而使提高回收纯度。此外，设置的梯度洗脱的采集时间可以显著提高纯化效率；选用的色谱柱可以保证分离效果；选用的填料可以在更节约成本的同时保证较低柱压和较长的色谱柱使用寿命。
附图说明
图1为本发明实施例的单克隆抗体的纯化方法的流程图。
图2为本发明实施例1获得的单克隆抗体的还原电泳检测图；
其中：Marker为蛋白质分子质量，大小分别为97.4kD、66.2kD、43kD、31kD、22kD和14.4kD；1为HPLC纯化后得到的单克隆抗体；2为盐析法所获得的粗提纯样品。
图3为本发明实施例1中HPLC纯化后得到的单克隆抗体的洗脱峰。
图4为本发明实施例1中HPLC纯化后得到的单克隆抗体的分子筛高效液相检测图谱。
图5为本发明实施例2获得的单克隆抗体的非还原电泳检测图；
其中，1为盐析法所获得的粗提纯样品；2为HPLC纯化后得到的单克隆抗体。
图6为本发明实施例2中HPLC纯化后得到的单克隆抗体的洗脱峰。
图7为本发明实施例2中HPLC纯化后得到的单克隆抗体的分子筛高效液相检测图谱。
具体实施方式
现在，将参照附图更充分地描述不同的示例实施例，其中，一些示例性实施例在附图中示出。
实施例1。
本发明的实施例1以含有抗人CTGF单克隆抗体的小鼠腹水为样品。
参照图1，本实施例1提供一种抗人CTGF单克隆抗体的纯化方法，包括：
在步骤S10，对含有单克隆抗体的样品进行粗提纯。
作为示例，基于盐析法采用饱和硫酸铵溶液对含有单克隆抗体的样品进行盐析。
优选地，所述盐析法包括：于含有单克隆抗体的样品中先后加入饱和硫酸铵溶液至终浓度分别为体积百分浓度为40％～60％和30％～40％，分别于4℃盐析2小时，离心。
作为示例，采用盐析法对含有抗人CTGF单克隆抗体的小鼠腹水进行粗提纯。具体地，将含有抗人CTGF单克隆抗体的小鼠腹水原液进行第一次低温离心处理(4℃，10000rpm，15min)，从而除去细胞残渣及颗粒物等，将第一次低温离心所得上清液用0.02mol/L、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液稀释至5倍(即，所述第一次低温离心所得上清液与所述磷酸盐缓冲液的体积比为1:4，这里，稀释至5倍后的总体积记为样品体积)后，加入饱和硫酸铵溶液至终浓度为50％(v/v)(即，所述样品体积与所述饱和硫酸铵溶液的体积比为1:1)，于4℃盐析2小时，并进行第二次低温离心(4℃，10000rpm，15min)处理，弃上清液取固体物。采用0.02mol/L、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液溶解第二次低温离心所得固体物，所述磷酸盐缓冲液的体积与所述样品体积相等。在冰浴搅拌下，逐滴加入饱和硫酸铵溶液至终浓度为33.33％(v/v)(即，溶解后的总体积与所述饱和硫酸铵溶液的体积比为2:1)，于4℃盐析2小时，并进行第三次低温离心(4℃，10000rpm，15min)处理，弃上清液取固体物，将第三次低温离心所得固体物作为盐析所得粗提纯样品，即粗提纯的产物。
作为示例，可通过下述步骤制备含有抗人CTGF单克隆抗体的小鼠腹水：
通过生物信息学方法，在NCBI数据库中检索获得CTGF核酸序列如SEQ ID NO:1。根据此核酸序列信息，人工合成CTGF的DNA序列。
以所述DNA序列为模板，进行PCR扩增。PCR条件：变性温度93℃，退火温度55℃，延伸温度72℃，30～40个循环，时间为2～3小时。
将得到的PCR产物以EcoR/Not I双酶切法链接到pATX2上，同时加入6*His标签，构建重组质粒。
将所述重组质粒转染HEK293细胞后进行培养，六天后收集样品并进行SDS-PAGE电泳检测和蛋白质免疫印迹(western blotting)检测，检测成果获得表达株。
大量培养所述表达株并经亲和层析纯化获得重组人CTGF抗原蛋白。
以获得的重组人CTGF抗原蛋白免疫8周龄Balb/c小鼠，首次按每只小鼠50μg进行抗原蛋白免疫注射，注射于小鼠的颈背部皮下多点。按每只小鼠25μg计量进行抗原蛋白加强免疫，加强免疫3～4次后，分离获得小鼠脾细胞。采用杂交瘤细胞融合技术，将分离获得的1×108个小鼠脾细胞与3×107个同系骨髓瘤细胞进行混合，利用PEG进行膜融合，形成杂交瘤细胞。筛选成功膜融合的杂交瘤细胞，体外增殖培养并及时对小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞，1～2周后获得含有抗人CTGF单克隆抗体的小鼠腹水。
例如，可在1～2周后抽取腹水，从而获得含有抗人CTGF单克隆抗体的小鼠腹水。
应当理解，以上制备含有抗人CTGF单克隆抗体的小鼠腹水的步骤仅是示例性的，也可采用其他本领域常规技术来获得含有抗人CTGF单克隆抗体的小鼠腹水，本发明对此不作限定。
在步骤S20，对所述粗提纯的产物进行透析。
作为示例，采用三羟甲基氨基甲烷缓冲液对所述粗提纯的产物进行透析。
优选地，所述三羟甲基氨基甲烷缓冲液的浓度为0.02～0.03mol/L、pH值为7～7.5。
作为示例，采用0.025mol/L、pH值为7.2的三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解盐析后所得粗提纯样品，所述三羟甲基氨基甲烷缓冲液的体积与所述样品体积相等；然后利用浓度为0.025mol/L、pH值为7.2的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，于4℃透析过夜，期间需更换3次三羟甲基氨基甲烷缓冲液，截留分子量为150KD，从而获得透析的产物。
在步骤S30，利用HPLC法(High Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱法)对所述透析的产物进行纯化。
在步骤S30的一个实施例中，采用阴离子交换介质，以流动相A和流动相B为洗脱液，流速为1～3ml/min，利用梯度洗脱模式进行洗脱，柱温35～40℃，检测波长280nm；所述流动相A是pH值为6.5～8.5，浓度为10～50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液；所述流动相B是pH值为6.5～8.5，三羟甲基氨基甲烷终浓度为10～50mmol/L和氯化钠终浓度为0.5～1mol/L的混合溶液。优选地，选用长度为20～30cm的色谱柱，填料粒径为2～10μm，可以节约成本、同时保证了较低柱压和较长的色谱柱使用寿命。
应当理解，氯化钠浓度越高，洗脱能力越强，样品(例如，透析的产物)中的所有物质(例如，目的蛋白和杂质)出峰越快；氯化钠浓度越低，洗脱能力越弱，样品中的所有物质出峰越慢，这会浪费物料和时间且目的蛋白不稳定。本发明实施例采用浓度为0.5～1mol/L的氯化钠，可以保证目的蛋白(即纯化得到的单克隆抗体)的纯度，且节约时间和物料。
作为示例，选用Thermo Propac-wax-10色谱柱，填料的颗粒度为10μm，色谱柱规格为250mm×4.6mm。以流动相A和流动相B为洗脱液，流速为1ml/min，利用梯度洗脱模式进行洗脱，柱温40℃，检测波长280nm；所述流动相A是pH值为7，浓度为40mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液；所述流动相B是pH值为7，三羟甲基氨基甲烷缓冲液终浓度为30mmol/L和氯化钠终浓度为1mol/L的混合溶液。连接色谱柱，用流动相A对色谱柱进行平衡。上样，上样后执行梯度程序对样品进行分离纯化。
在目的蛋白(即纯化得到的单克隆抗体)与阴离子交换介质结合发生在流动相中盐浓度相对较低且pH值在6.5～8.5之间，在平衡完毕后上样，含有目的蛋白和杂质的样品与阴离子交换介质结合(即，基线平稳无波动，未发现流穿)，再走5分钟流动相A，以保证样品中不与阴离子交换剂结合的杂质首先被洗脱出去，在洗脱中采用梯度洗脱，这样可以最大程度的使目的蛋白与样品中其他的杂质在与介质发生作用的过程中被分离开来，即，梯度洗脱可以使目的蛋白和杂质有效的分离，从而使回收的目的蛋白纯度更高，因此，确定了如表1所示的梯度洗脱程序，在表1中，流动相A和流动相B均为体积百分比。采集时间设为30min，可以显著节约纯化时间，提高纯化效率。
表1：梯度洗脱程序
| 时间(min) | 流速(ml/min) | A％ | B％ |
| 0 | 1 | 100 | 0 |
| 5 | 1 | 100 | 0 |
| 15 | 1 | 40 | 60 |
| 25 | 1 | 20 | 80 |
| 29 | 1 | 100 | 0 |
| 30 | 1 | 100 | 0 |
收集保留时间22～24min的样品得到纯化后的单克隆抗体。具体地，收率为85.2％，纯度为97.4％。
此外，目的蛋白含有赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等，这三种氨基酸在检测波长280nm处有最大吸收，所以出峰明显，从而可以简化色谱图中峰的数量。
应当理解，目的蛋白在酸性条件下不稳定，考虑流动相pH值需要高于目的蛋白等电点，所以在分离纯化过程中采用阴离子交换介质，可以使目的蛋白与阴离子交换介质结合紧密。也就是说，根据目的蛋白等电点确认采用阴离子交换更为合适。
优选地，所述阴离子交换介质选自GE公司的Q Sepharose FF系列、Capto Q系列、SOURCE Q系列、Thermo公司的Propac-wax系列的阴离子交换凝胶。
下面详细描述本发明实施例中pH值的影响和检测实验。
(一)pH值的影响。
分别配制三份不同pH值范围的流动相：第一份为流动相A是pH值为5.5、浓度为40mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液；所述流动相B是pH值为5.5，三羟甲基氨基甲烷缓冲液终浓度为30mmol/L和氯化钠终浓度为1mol/L的混合溶液。
第二份为流动相A是pH值为7、浓度为40mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液；所述流动相B是pH值为7，三羟甲基氨基甲烷缓冲液终浓度为30mmol/L和氯化钠终浓度为1mol/L的混合溶液。
第三份为流动相A是pH值为8.5、浓度为40mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液；所述流动相B是pH值为8.5，三羟甲基氨基甲烷缓冲液终浓度为30mmol/L和氯化钠终浓度为1mol/L的混合溶液。
通过实验可知，对于pH值偏小在4.5～6.0范围，目的蛋白不会带有足够的负电荷，这样就很有可能导致目的蛋白与介质之间的结合较弱，最终会导致目的蛋白的流失，回收不回来足够的目的蛋白；如果pH偏高在8.5～9.0范围，目的蛋白会带上过多的负电荷，这样就会导致目的蛋白与介质之间的结合过于紧密，导致不容易被洗脱，这样同样会导致收率偏低。
本发明实施例优选pH值为7～7.5。
(二)纯化后的抗人CTGF单克隆抗体进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图2。由图2可见，纯化后的单克隆抗体较纯化前的，无明显杂蛋白。
(三)抗人CTGF单克隆抗体的HPLC的洗脱峰，结果如图3所示。由图3可见，目的蛋白在保留时间22～24min出峰，主峰与其他杂质峰分离良好，峰型理想。
(四)纯化后的抗人CTGF单克隆抗体的HPLC凝胶分析：
配制20mmol/L磷酸二氢钠溶液，用20mmol/L磷酸氢二钠溶液调节溶液pH值至7.0～8.0，然后采用0.22μm微孔滤膜过滤、超声，得到流动相。采用科思美析5Diol-120-Ⅱ7.5×300凝胶柱，流速0.2～0.8ml/min，柱温35～40℃，检测波长280nm。结果如图4所示。
由图4可见，回收目的蛋白样品中杂质含量极少，分离效果良好。
实施例2。
本发明的实施例2以含有抗人periostin单克隆抗体的小鼠腹水为样品。
返回参照图1，本实施例2提供一种抗人periostin单克隆抗体的纯化方法，包括：
在步骤S10，对含有单克隆抗体的样品进行粗提纯。
作为示例，基于盐析法采用饱和硫酸铵溶液对含有单克隆抗体的样品进行盐析。
优选地，所述盐析法包括：于含有单克隆抗体的样品中先后加入饱和硫酸铵溶液至终浓度分别为体积百分浓度为40％～60％和30％～40％，分别于4℃盐析2小时，离心。
作为示例，采用盐析法对含有抗人periostin单克隆抗体的小鼠腹水进行粗提纯。具体地，将含有抗人periostin单克隆抗体的小鼠腹水原液进行第一次低温离心处理(4℃，10000rpm，15min)，从而除去细胞残渣及颗粒物等，将第一次低温离心所得上清液用0.02mol/L、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液稀释至5倍后(这里，稀释至5倍后的总体积记为样品体积)，加入饱和硫酸铵溶液至终浓度为50％(v/v)，于4℃盐析2小时，并进行第二次低温离心(4℃，10000rpm，15min)处理，弃上清液取固体物。采用0.02mol/L、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液溶解第二次低温离心所得固体物，所述磷酸盐缓冲液的体积与所述样品体积相等。在冰浴搅拌下，逐滴加入饱和硫酸铵溶液至终浓度为33.33％(v/v)，于4℃盐析2小时，并进行第三次低温离心(4℃，10000rpm，15min)处理，弃上清液取固体物，将第三次低温离心所得固体物作为粗提纯样品，即粗提纯的产物。
作为示例，可通过下述步骤制备含有抗人periostin单克隆抗体的小鼠腹水：
通过生物信息学方法，在NCBI数据库中检索获得periostin核酸序列如SEQ IDNO:2。根据此核酸序列信息，人工合成periostin的DNA序列。
以上述DNA序列为模板，进行PCR扩增，PCR条件：变性温度93℃，退火温度55℃，延伸温度72℃，30～40个循环，时间为2～3小时。
将得到的PCR产物以ScaI/Not I双酶切法链接到pATX2上，同时加入6*His标签，构建重组质粒。
将所述重组质粒转染HEK293细胞后进行培养，六天后收集样品并进行SDS-PAGE电泳检测和蛋白质免疫印迹(western blotting)检测，检测成果获得表达株。
大量培养所述表达株并经亲和层析纯化获得重组人periostin抗原蛋白。
以获得的重组人periostin抗原蛋白免疫8周龄Balb/c小鼠，首次按每只小鼠50μg进行抗原蛋白免疫注射，注射于小鼠的颈背部皮下多点。按每只小鼠25μg计量进行抗原蛋白加强免疫，加强免疫3～4次后，分离获得小鼠脾细胞。采用杂交瘤细胞融合技术，将分离获得的1×108个小鼠脾细胞与3×107个同系骨髓瘤细胞进行混合，利用PEG进行膜融合，形成杂交瘤细胞。筛选成功膜融合的杂交瘤细胞，体外增殖培养并及时对小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞，1～2周后抽取腹水，获得含有抗人periostin单克隆抗体的小鼠腹水。
应当理解，以上制备含有抗人periostin单克隆抗体的小鼠腹水的步骤仅是示例性的，也可采用本领域常规技术获得含有抗人periostin单克隆抗体的小鼠腹水，本发明对此不作限定。
在步骤S20，对所述粗提纯的产物进行透析。
也就是说，利用透析法对盐析后的产物进行透析。
作为示例，采用三羟甲基氨基甲烷缓冲液对所述粗提纯的产物进行透析。
优选地，所述三羟甲基氨基甲烷缓冲液的浓度为0.02～0.03mol/L，pH值为7～7.5。
作为示例，采用0.025mol/L，pH值为7.2的三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解盐析后所得粗提纯样品，所述三羟甲基氨基甲烷缓冲液的体积与所述样品体积相等；然后利用浓度为0.025mol/L，pH值为7.2的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，于4℃透析过夜，期间需更换3次三羟甲基氨基甲烷缓冲液，截留分子量为150KD，从而获得透析的产物。
在步骤S30，利用HPLC法对所述透析后的产物进行纯化。
作为示例，选用Thermo Propac-wax-10色谱柱，填料的颗粒度为10μm，色谱柱规格为250mm×4.6mm。以流动相A和流动相B为洗脱液，流速为1ml/min，利用梯度洗脱模式进行洗脱，柱温40℃，检测波长280nm；所述流动相A是pH值为7，浓度为30mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，所述流动相B是pH值为7，三羟甲基氨基甲烷缓冲液终浓度为30mmol/L和氯化钠终浓度为0.5mol/L的混合溶液。连接色谱柱，用流动相A对色谱柱进行平衡。上样，上样后执行梯度程序对样品进行分离纯化，梯度洗脱程序如表2所示。
表2：梯度洗脱程序
| 时间(min) | 流速(ml/min) | A％ | B％ |
| 0 | 1 | 100 | 0 |
| 5 | 1 | 100 | 0 |
| 15 | 1 | 35 | 65 |
| 25 | 1 | 15 | 85 |
| 29 | 1 | 100 | 0 |
| 30 | 1 | 100 | 0 |
收集保留时间10～11min的样品得到纯化后的单克隆抗体。具体地，收率为76.3％，纯度为97.2％。
优选地，所述阴离子交换介质选自GE公司的Q Sepharose FF系列、Capto Q系列、SOURCE Q系列、Thermo公司的Propac-wax系列的阴离子交换凝胶。
下面详细描述本发明实施例中的检测实验。
(一)纯化后的抗人periostin单克隆抗体进行非还原SDS-PAGE电泳检测，结果如图5。由图5可见，纯化后的单克隆抗体较纯化前的，无明显杂蛋白。
(二)抗人periostin单克隆抗体的HPLC的洗脱峰，结果如图6所示。由图6可见，目的蛋白在保留时间10～11min出峰，主峰与其他杂质峰分离良好，峰型理想。
(三)纯化后的抗人periostin单克隆抗体的HPLC凝胶分析：
配制20mmol/L磷酸二氢钠溶液，用25mmol/L磷酸氢二钠溶液调节溶液pH值至6.0～8.0，然后采用0.22μm微孔滤膜过滤、超声，得到流动相。采用科思美析5Diol-120-Ⅱ7.5×300凝胶柱，流速0.2～1.0ml/min，柱温35～40℃，检测波长280nm。结果如图7所示。
由图7可见，回收目的蛋白样品中杂质含量极少，分离效果良好。
应当理解，本实施例2中与实施例1相同的部分，不再赘述。
尽管已经参照其示例性实施例具体显示和描述了本发明，但是本领域的技术人员应该理解，在不脱离权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对其进行形式和细节上的各种改变。
<110> 辽宁何氏医学院
<120> 一种简单高效的单克隆抗体的纯化方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2339
<212> DNA
<213> 人CTGF（Connective tissue growth factor）
<400> 1
CACACAACAA CTCTTCCCCG CTGAGAGGAG ACAGCCAGTG CGACTCCACC CTCCAGCTCG 60
ACGGCAGCCG CCCCGGCCGA CAGCCCCGAG ACGACAGCCC GGCGCGTCCC GGTCCCCACC 120
TCCGACCACC GCCAGCGCTC CAGGCCCCGC CGCTCCCCGC TCGCCGCCAC CGCGCCCTCC 180
GCTCCGCCCG CAGTGCCAAC CATGACCGCC GCCAGTATGG GCCCCGTCCG CGTCGCCTTC 240
GTGGTCCTCC TCGCCCTCTG CAGCCGGCCG GCCGTCGGCC AGAACTGCAG CGGGCCGTGC 300
CGGTGCCCGG ACGAGCCGGC GCCGCGCTGC CCGGCGGGCG TGAGCCTCGT GCTGGACGGC 360
TGCGGCTGCT GCCGCGTCTG CGCCAAGCAG CTGGGCGAGC TGTGCACCGA GCGCGACCCA 420
TGCGACCCGC ACAAGGGCCT ATTCTGTCAC TTCGGCTCCC CGGCCAACCG CAAGATCGGC 480
GTGTGCACCG CCAAAGATGG TGCTCCCTGC ATCTTCGGTG GTACGGTGTA CCGCAGCGGA 540
GAGTCCTTCC AGAGCAGCTG CAAGTACCAG TGCACGTGCC TGGACGGGGC GGTGGGCTGC 600
ATGCCCCTGT GCAGCATGGA CGTTCGTCTG CCCAGCCCTG ACTGCCCCTT CCCGAGGAGG 660
GTCAAGCTGC CCGGGAAATG CTGCGAGGAG TGGGTGTGTG ACGAGCCCAA GGACCAAACC 720
GTGGTTGGGC CTGCCCTCGC GGCTTACCGA CTGGAAGACA CGTTTGGCCC AGACCCAACT 780
ATGATTAGAG CCAACTGCCT GGTCCAGACC ACAGAGTGGA GCGCCTGTTC CAAGACCTGT 840
GGGATGGGCA TCTCCACCCG GGTTACCAAT GACAACGCCT CCTGCAGGCT AGAGAAGCAG 900
AGCCGCCTGT GCATGGTCAG GCCTTGCGAA GCTGACCTGG AAGAGAACAT TAAGAAGGGC 960
AAAAAGTGCA TCCGTACTCC CAAAATCTCC AAGCCTATCA AGTTTGAGCT TTCTGGCTGC 1020
ACCAGCATGA AGACATACCG AGCTAAATTC TGTGGAGTAT GTACCGACGG CCGATGCTGC 1080
ACCCCCCACA GAACCACCAC CCTGCCGGTG GAGTTCAAGT GCCCTGACGG CGAGGTCATG 1140
AAGAAGAACA TGATGTTCAT CAAGACCTGT GCCTGCCATT ACAACTGTCC CGGAGACAAT 1200
GACATCTTTG AATCGCTGTA CTACAGGAAG ATGTACGGAG ACATGGCATG AAGCCAGAGA 1260
GTGAGAGACA TTAACTCATT AGACTGGAAC TTGAACTGAT TCACATCTCA TTTTTCCGTA 1320
AAAATGATTT CAGTAGCACA AGTTATTTAA ATCTGTTTTT CTAACTGGGG GAAAAGATTC 1380
CCACCCAATT CAAAACATTG TGCCATGTCA AACAAATAGT CTATCAACCC CAGACACTGG 1440
TTTGAAGAAT GTTAAGACTT GACAGTGGAA CTACATTAGT ACACAGCACC AGAATGTATA 1500
TTAAGGTGTG GCTTTAGGAG CAGTGGGAGG GTACCAGCAG AAAGGTTAGT ATCATCAGAT 1560
AGCATCTTAT ACGAGTAATA TGCCTGCTAT TTGAAGTGTA ATTGAGAAGG AAAATTTTAG 1620
CGTGCTCACT GACCTGCCTG TAGCCCCAGT GACAGCTAGG ATGTGCATTC TCCAGCCATC 1680
AAGAGACTGA GTCAAGTTGT TCCTTAAGTC AGAACAGCAG ACTCAGCTCT GACATTCTGA 1740
TTCGAATGAC ACTGTTCAGG AATCGGAATC CTGTCGATTA GACTGGACAG CTTGTGGCAA 1800
GTGAATTTGC CTGTAACAAG CCAGATTTTT TAAAATTTAT ATTGTAAATA TTGTGTGTGT 1860
GTGTGTGTGT GTATATATAT ATATATGTAC AGTTATCTAA GTTAATTTAA AGTTGTTTGT 1920
GCCTTTTTAT TTTTGTTTTT AATGCTTTGA TATTTCAATG TTAGCCTCAA TTTCTGAACA 1980
CCATAGGTAG AATGTAAAGC TTGTCTGATC GTTCAAAGCA TGAAATGGAT ACTTATATGG 2040
AAATTCTGCT CAGATAGAAT GACAGTCCGT CAAAACAGAT TGTTTGCAAA GGGGAGGCAT 2100
CAGTGTCCTT GGCAGGCTGA TTTCTAGGTA GGAAATGTGG TAGCCTCACT TTTAATGAAC 2160
AAATGGCCTT TATTAAAAAC TGAGTGACTC TATATAGCTG ATCAGTTTTT TCACCTGGAA 2220
GCATTTGTTT CTACTTTGAT ATGACTGTTT TTCGGACAGT TTATTTGTTG AGAGTGTGAC 2280
CAAAAGTTAC ATGTTTGCAC CTTTCTAGTT GAAAATAAAG TGTATATTTT TTCTATAAA 2339
<210> 2
<211> 3214
<212> DNA
<213> 人periostin（Osteoblast-specific factor 2）
<400> 2
AGACTCTCAG GTTGATGCAG TGTTCCCTCC CACAACTCTG ACATGTATAT AAATTCTGAG 60
CTCTCCAAAG CCCACTGCCA GTTCTCTTCG GGGACTAACT GCAACGGAGA GACTCAAGAT 120
GATTCCCTTT TTACCCATGT TTTCTCTACT ATTGCTGCTT ATTGTTAACC CTATAAACGC 180
CAACAATCAT TATGACAAGA TCTTGGCTCA TAGTCGTATC AGGGGTCGGG ACCAAGGCCC 240
AAATGTCTGT GCCCTTCAAC AGATTTTGGG CACCAAAAAG AAATACTTCA GCACTTGTAA 300
GAACTGGTAT AAAAAGTCCA TCTGTGGACA GAAAACGACT GTGTTATATG AATGTTGCCC 360
TGGTTATATG AGAATGGAAG GAATGAAAGG CTGCCCAGCA GTTTTGCCCA TTGACCATGT 420
TTATGGCACT CTGGGCATCG TGGGAGCCAC CACAACGCAG CGCTATTCTG ACGCCTCAAA 480
ACTGAGGGAG GAGATCGAGG GAAAGGGATC CTTCACTTAC TTTGCACCGA GTAATGAGGC 540
TTGGGACAAC TTGGATTCTG ATATCCGTAG AGGTTTGGAG AGCAACGTGA ATGTTGAATT 600
ACTGAATGCT TTACATAGTC ACATGATTAA TAAGAGAATG TTGACCAAGG ACTTAAAAAA 660
TGGCATGATT ATTCCTTCAA TGTATAACAA TTTGGGGCTT TTCATTAACC ATTATCCTAA 720
TGGGGTTGTC ACTGTTAATT GTGCTCGAAT CATCCATGGG AACCAGATTG CAACAAATGG 780
TGTTGTCCAT GTCATTGACC GTGTGCTTAC ACAAATTGGT ACCTCAATTC AAGACTTCAT 840
TGAAGCAGAA GATGACCTTT CATCTTTTAG AGCAGCTGCC ATCACATCGG ACATATTGGA 900
GGCCCTTGGA AGAGACGGTC ACTTCACACT CTTTGCTCCC ACCAATGAGG CTTTTGAGAA 960
ACTTCCACGA GGTGTCCTAG AAAGGATCAT GGGAGACAAA GTGGCTTCCG AAGCTCTTAT 1020
GAAGTACCAC ATCTTAAATA CTCTCCAGTG TTCTGAGTCT ATTATGGGAG GAGCAGTCTT 1080
TGAGACGCTG GAAGGAAATA CAATTGAGAT AGGATGTGAC GGTGACAGTA TAACAGTAAA 1140
TGGAATCAAA ATGGTGAACA AAAAGGATAT TGTGACAAAT AATGGTGTGA TCCATTTGAT 1200
TGATCAGGTC CTAATTCCTG ATTCTGCCAA ACAAGTTATT GAGCTGGCTG GAAAACAGCA 1260
AACCACCTTC ACGGATCTTG TGGCCCAATT AGGCTTGGCA TCTGCTCTGA GGCCAGATGG 1320
AGAATACACT TTGCTGGCAC CTGTGAATAA TGCATTTTCT GATGATACTC TCAGCATGGA 1380
TCAGCGCCTC CTTAAATTAA TTCTGCAGAA TCACATATTG AAAGTAAAAG TTGGCCTTAA 1440
TGAGCTTTAC AACGGGCAAA TACTGGAAAC CATCGGAGGC AAACAGCTCA GAGTCTTCGT 1500
ATATCGTACA GCTGTCTGCA TTGAAAATTC ATGCATGGAG AAAGGGAGTA AGCAAGGGAG 1560
AAACGGTGCG ATTCACATAT TCCGCGAGAT CATCAAGCCA GCAGAGAAAT CCCTCCATGA 1620
AAAGTTAAAA CAAGATAAGC GCTTTAGCAC CTTCCTCAGC CTACTTGAAG CTGCAGACTT 1680
GAAAGAGCTC CTGACACAAC CTGGAGACTG GACATTATTT GTGCCAACCA ATGATGCTTT 1740
TAAGGGAATG ACTAGTGAAG AAAAAGAAAT TCTGATACGG GACAAAAATG CTCTTCAAAA 1800
CATCATTCTT TATCACCTGA CACCAGGAGT TTTCATTGGA AAAGGATTTG AACCTGGTGT 1860
TACTAACATT TTAAAGACCA CACAAGGAAG CAAAATCTTT CTGAAAGAAG TAAATGATAC 1920
ACTTCTGGTG AATGAATTGA AATCAAAAGA ATCTGACATC ATGACAACAA ATGGTGTAAT 1980
TCATGTTGTA GATAAACTCC TCTATCCAGC AGACACACCT GTTGGAAATG ATCAACTGCT 2040
GGAAATACTT AATAAATTAA TCAAATACAT CCAAATTAAG TTTGTTCGTG GTAGCACCTT 2100
CAAAGAAATC CCCGTGACTG TCTATAGACC CACACTAACA AAAGTCAAAA TTGAAGGTGA 2160
ACCTGAATTC AGACTGATTA AAGAAGGTGA AACAATAACT GAAGTGATCC ATGGAGAGCC 2220
AATTATTAAA AAATACACCA AAATCATTGA TGGAGTGCCT GTGGAAATAA CTGAAAAAGA 2280
GACACGAGAA GAACGAATCA TTACAGGTCC TGAAATAAAA TACACTAGGA TTTCTACTGG 2340
AGGTGGAGAA ACAGAAGAAA CTCTGAAGAA ATTGTTACAA GAAGACACAC CCGTGAGGAA 2400
GTTGCAAGCC AACAAAAAAG TTCAAGGATC TAGAAGACGA TTAAGGGAAG GTCGTTCTCA 2460
GTGAAAATCC AAAAACCAGA AAAAAATGTT TATACAACCC TAAGTCAATA ACCTGACCTT 2520
AGAAAATTGT GAGAGCCAAG TTGACTTCAG GAACTGAAAC ATCAGCACAA AGAAGCAATC 2580
ATCAAATAAT TCTGAACACA AATTTAATAT TTTTTTTTCT GAATGAGAAA CATGAGGGAA 2640
ATTGTGGAGT TAGCCTCCTG TGGTAAAGGA ATTGAAGAAA ATATAACACC TTACACCCTT 2700
TTTCATCTTG ACATTAAAAG TTCTGGCTAA CTTTGGAATC CATTAGAGAA AAATCCTTGT 2760
CACCAGATTC ATTACAATTC AAATCGAAGA GTTGTGAACT GTTATCCCAT TGAAAAGACC 2820
GAGCCTTGTA TGTATGTTAT GGATACATAA AATGCACGCA AGCCATTATC TCTCCATGGG 2880
AAGCTAAGTT ATAAAAATAG GTGCTTGGTG TACAAAACTT TTTATATCAA AAGGCTTTGC 2940
ACATTTCTAT ATGAGTGGGT TTACTGGTAA ATTATGTTAT TTTTTACAAC TAATTTTGTA 3000
CTCTCAGAAT GTTTGTCATA TGCTTCTTGC AATGCATATT TTTTAATCTC AAACGTTTCA 3060
ATAAAACCAT TTTTCAGATA TAAAGAGAAT TACTTCAAAT TGAGTAATTC AGAAAAACTC 3120
AAGATTTAAG TTAAAAAGTG GTTTGGACTT GGGAACAGGA CTTTATACCT CTTTTACTGT 3180
AACAAGTACT CATTAAAGGA AATTGAATGA AATT 3214
Claims (10)
1.一种简单高效的单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，包括：
对含有单克隆抗体的样品进行粗提纯；
对所述粗提纯的产物进行透析；
利用HPLC法对所述透析的产物进行纯化，
其中，所述纯化采用阴离子交换介质，以流动相A和流动相B为洗脱液，流速为1～3mL/min，利用梯度洗脱模式进行洗脱，柱温35～40℃，检测波长280nm；
所述流动相A为三羟甲基氨基甲烷缓冲液，所述流动相B为三羟甲基氨基甲烷缓冲液和氯化钠的混合溶液。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述流动相A的pH值为6.5～8.5；所述流动相B的pH值为6.5～8.5。
3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述三羟甲基氨基甲烷缓冲液的终浓度为10～50mmol/L；所述氯化钠的终浓度为0.5～1mol/L。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述含有单克隆抗体的样品包括：含有单克隆抗体的小鼠腹水、含有单克隆抗体的杂交瘤细胞的培养上清、重组单克隆抗体的发酵上清。
5.根据权利要求1或4所述的纯化方法，其特征在于，所述单克隆抗体包括：抗人CTGF单克隆抗体或抗人periostin单克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述阴离子交换介质是Q SepharoseFF系列、Capto Q系列、SOURCE Q系列、Propac-wax系列的阴离子交换凝胶。
7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，选用长度为20～30cm的色谱柱，填料粒径为2～10μm。
8.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，对含有单克隆抗体的样品进行粗提纯的步骤包括：
基于盐析法采用饱和硫酸铵溶液对含有单克隆抗体的样品进行盐析。
9.根据权利要求8所述的纯化方法，其特征在于，所述盐析法包括：于含有单克隆抗体的样品中先后加入饱和硫酸铵溶液至终浓度分别为体积百分浓度为40％～60％和30％～40％，分别于4℃盐析2小时，离心。
10.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，对所述粗提纯的产物进行透析的步骤包括：
采用三羟甲基氨基甲烷缓冲液对所述粗提纯的产物进行透析。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910197627.3A CN109762061A (zh) | 2019-03-15 | 2019-03-15 | 一种简单高效的单克隆抗体的纯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910197627.3A CN109762061A (zh) | 2019-03-15 | 2019-03-15 | 一种简单高效的单克隆抗体的纯化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109762061A true CN109762061A (zh) | 2019-05-17 |
Family
ID=66459166
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910197627.3A Pending CN109762061A (zh) | 2019-03-15 | 2019-03-15 | 一种简单高效的单克隆抗体的纯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109762061A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113281430A (zh) * | 2021-05-11 | 2021-08-20 | 苏州君盟生物医药科技有限公司 | 一种双特异性抗体的分离鉴定方法 |
| CN114409763A (zh) * | 2022-03-15 | 2022-04-29 | 湖南华腾制药有限公司 | 一种重组纤连蛋白肽的纯化方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103792316A (zh) * | 2014-01-24 | 2014-05-14 | 南通市产品质量监督检验所 | 一种高效液相离子交换色谱法分析牛乳制品中未变性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分的方法 |
| CN109307771A (zh) * | 2018-09-14 | 2019-02-05 | 北京三元基因药业股份有限公司 | 亲和层析定量检测重组人α干扰素工艺中间体含量的方法 |
-
2019
- 2019-03-15 CN CN201910197627.3A patent/CN109762061A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103792316A (zh) * | 2014-01-24 | 2014-05-14 | 南通市产品质量监督检验所 | 一种高效液相离子交换色谱法分析牛乳制品中未变性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分的方法 |
| CN109307771A (zh) * | 2018-09-14 | 2019-02-05 | 北京三元基因药业股份有限公司 | 亲和层析定量检测重组人α干扰素工艺中间体含量的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JEFFREY R.DESCHAMPS，ET AL: "A high-performance liquid chromatographic procedure for the purification of mouse monoclonal antibodies", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 * |
| 商澎 等: "高效液相色谱法半制备级纯化单克隆抗体", 《第四军医大学学报》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113281430A (zh) * | 2021-05-11 | 2021-08-20 | 苏州君盟生物医药科技有限公司 | 一种双特异性抗体的分离鉴定方法 |
| CN114409763A (zh) * | 2022-03-15 | 2022-04-29 | 湖南华腾制药有限公司 | 一种重组纤连蛋白肽的纯化方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3768709B1 (en) | Microchip capillary electrophoresis assays and reagents | |
| BR112015027812B1 (pt) | Método para a purificação de uma proteína a partir de uma solução | |
| CN106536565A (zh) | 一种用于纯化TNFR‑Fc融合蛋白的方法 | |
| CN102190704B (zh) | 蛋白层析系统 | |
| KR20150138273A (ko) | 단백질의 피로글루타민산 형성을 증가시키기 위한 방법 | |
| EP3500586B1 (en) | Continuous process for reducing heterogeneity of therapeutic protein | |
| US6893639B2 (en) | Method for high yield purification of immune globulins from blood plasma and blood plasma intermediates | |
| CN109762061A (zh) | 一种简单高效的单克隆抗体的纯化方法 | |
| JP2019504060A (ja) | モノクローナル抗体のアイソフォームを分離するための方法 | |
| CN109879930A (zh) | 一种重组蛋白的纯化方法 | |
| CN113817686B (zh) | 一种杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体和应用 | |
| CN101367865B (zh) | 一种高纯度猪血白蛋白的生产工艺及其应用 | |
| CN104558145B (zh) | 一种胎球蛋白a重组蛋白及多克隆抗体的制备方法 | |
| Godavarti et al. | Scale-down models for purification processes: approaches and applications | |
| CN104379598A (zh) | 高度糖基化的长效人生长激素蛋白及其生产方法 | |
| Jack et al. | Immunoaffinity chromatography of clinical products | |
| CN103173478B (zh) | 一种携带ptd的抗人cd3单链抗体的制备方法 | |
| CA1335355C (en) | Anti-cpbii monoclonal antibody | |
| US4859766A (en) | Purified appetite-regulating substances of biological orgin, their antibodies, immunocomplexes of the appetite--regulating substances formed with the antibodies and processes for preparing same | |
| JPS61221128A (ja) | プラスミノ−ゲン活性化因子に対するモノクロ−ナル抗体とその調製方法及び該モノクロ−ナル抗体の使用方法 | |
| WO2022256383A1 (en) | Micropchip capillary electrophoresis assays and reagents | |
| Lane et al. | Department of Zoology, South Parks Road, Oxford, England | |
| CN112851822A (zh) | 一种人重组乙型干扰素融合蛋白 | |
| WO2022172284A1 (en) | Purification of a therapeutic protein | |
| CN114409798A (zh) | 制备包含两种或更多种抗体的组合物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190517 |