CN104379598A - 高度糖基化的长效人生长激素蛋白及其生产方法 - Google Patents
高度糖基化的长效人生长激素蛋白及其生产方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104379598A CN104379598A CN201380029894.0A CN201380029894A CN104379598A CN 104379598 A CN104379598 A CN 104379598A CN 201380029894 A CN201380029894 A CN 201380029894A CN 104379598 A CN104379598 A CN 104379598A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- growth hormone
- human growth
- long
- hgh
- nexp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 title claims abstract description 198
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 title claims abstract description 198
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 8
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims abstract description 197
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 122
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 122
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 claims abstract description 80
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 claims abstract description 77
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 claims abstract description 67
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 66
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 34
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 96
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 55
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 55
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 48
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 45
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 27
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 24
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 21
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 19
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 13
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 12
- 101000823116 Homo sapiens Alpha-1-antitrypsin Proteins 0.000 claims description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 10
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 9
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 9
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 9
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 7
- 229920000869 Homopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 5
- -1 sec.-propyl Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 claims description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 2
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 2
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 2
- UOXHUUWVKCDOBO-BXRBKJIMSA-N (2s)-2-aminobutanedioic acid;(2s)-2-amino-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O UOXHUUWVKCDOBO-BXRBKJIMSA-N 0.000 claims 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 15
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 13
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 abstract description 8
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 abstract 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 abstract 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 abstract 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 abstract 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 abstract 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 26
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 13
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 13
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 230000001475 anti-trypsic effect Effects 0.000 description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 10
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 9
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 8
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 7
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 7
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 7
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 7
- 101100230376 Acetivibrio thermocellus (strain ATCC 27405 / DSM 1237 / JCM 9322 / NBRC 103400 / NCIMB 10682 / NRRL B-4536 / VPI 7372) celI gene Proteins 0.000 description 6
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- OUCUOMVLTQBZCY-BYPYZUCNSA-N (2s)-1-azaniumylpyrrolidine-2-carboxylate Chemical compound NN1CCC[C@H]1C(O)=O OUCUOMVLTQBZCY-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 3
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 206010056438 Growth hormone deficiency Diseases 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 2
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 210000004349 growth plate Anatomy 0.000 description 2
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 229940063149 nutropin Drugs 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000012609 strong anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 208000031648 Body Weight Changes Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000004579 body weight change Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 230000037182 bone density Effects 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012539 chromatography resin Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000010376 human cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 150000003147 proline derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000001814 protein method Methods 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 1
- 239000012610 weak anion exchange resin Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormones [GH] (Somatotropin)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
- C07K14/8125—Alpha-1-antitrypsin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
Abstract
本发明涉及一种高度糖基化并在体内高度长效的长效人生长激素NexP-hGH蛋白，以及涉及其制备方法。更具体地，本发明涉及长效人生长激素NexP-hGH蛋白的具体同种型，其中人生长激素与高度糖基化的α-1抗胰蛋白酶突变体融合，从而增加体内长效性能，并涉及其生产方法。在考虑持续性人生长激素产生方法的范围内，本发明也涉及用于NexP-hGH的高纯度纯化方法，该方法具体包含以下步骤：(a)对包含其中人生长激素与α-1抗胰蛋白酶突变体融合的长效人生长激素NexP-hGH的生物乳液进行阴离子交换树脂色谱；(b)对该包含NexP-hGH的生物乳液或步骤(a)中产生的洗脱物进行疏水树脂色谱；和(c)对该包含长效人生长激素NexP-hGH的生物乳液和步骤(a)或步骤(b)中产生的洗脱物进行亲合色谱，该亲合色谱装填了附着抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂。
Description
技术领域
本发明涉及在体内被高度糖基化并高度长效的长效人生长激素NexP-hGH蛋白，及其制备方法。更具体地，本发明涉及长效人生长激素NexP-hGH蛋白的一种具体同种型，其中人生长激素与高度糖基化的α-1抗胰蛋白酶突变体融合，及其制备方法。
该长效人生长激素的制备方法也涉及一种高纯度纯化NexP-hGH的方法，具体地包括：(a)将包含长效人生长激素NexP-hGH蛋白——其中人生长激素与α-1抗胰蛋白酶突变体融合——的生物流体施加到阴离子交换树脂色谱；(b)将包含NexP-hGH蛋白的生物流体或步骤(a)中产生的洗脱物施加到疏水树脂色谱；和(c)将包含该长效人生长激素NexP-hGH蛋白的生物流体或步骤(a)或步骤(b)中产生的洗脱物施加到填充了附着抗-α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂的亲合色谱柱。
背景技术
通常，天然型人生长激素(hGH)由191个共具有约21500道尔顿的分子量的氨基酸组成。人生长激素从垂体前叶分泌，并且在体内促进骨和软骨生长。生长激素缺乏可造成身材矮小、增加心血管疾病的风险、降低肌肉和骨密度等。
为治疗生长激素缺乏，源自人脑下垂体或通过遗传工程技术生产的生长激素自20世纪50年代起被使用，全球人生长激素市场在2009年已达到约3万亿韩元。然而，上述生长激素存在缺点，因为它们必须通过每天皮下注射给药，因而存在改善和增加患者依从度的需求。为满足此需求，开发了长效人生长激素，并且为改善其长效性能，使用了缓释制剂和诸如与蛋白质或糖类融合、糖基化技术等的改造。例如，2007年，Genetech公司(Genentech Inc.)推出了作为第一种缓释人生长激素产品的NutropinLG生命科学公司(LG Life Sciences LTD.)(韩国)推出了Declage(韩国专利号10-0236771和10-0329336)。然而，缓释治疗仍有问题，因为它们在体内引起不希望的免疫应答、由于使用相当厚的注射器针导致疼痛并具有低产量。特别地，由于与其他第一代产品相比的低效力，Nutropin退出了市场。
为改善除了缓释制剂之外的蛋白的持续活性，可使用诸如与聚乙二醇融合成聚合物糖(Sada等人，发酵生物工程杂志71,137-139,1991)(Sada et al.,J.Ferment Bioeng 71,137-139,1991)、糖基化改造(美国专利号7,217,689)和与其他蛋白质融合(WO 93/15199)的方法以促进体内吸收、代谢和排出。然而，上述方法未被用作常规的增加半衰期的方法，这是由于各种原因，包括由于低产量的低成本效益、长期使用中引起免疫应答、缀合中使用的化学物质的毒性等。因此，存在用改善其长效性能同时最小化上述问题的方法开发长效人生长激素的需求。韩国专利号10-1183262公开了以作为体内蛋白的α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的突变体和人生长激素之间的缀合物的形式开发长效人生长激素蛋白，尝试通过蛋白尺寸增加改善半衰期。此外，韩国专利申请公开号10-2013-0029713公开了通过α-1抗胰蛋白酶上至少一个突变加入N-糖基，尝试增加体内半衰期的方法。
本发明人使用的α-1抗胰蛋白酶(A1AT)突变体是其中特定氨基酸被突变以移除α-1抗胰蛋白酶作为蛋白酶抑制剂的固有体内活性，同时增加其半衰期的突变体。其作为蛋白酶抑制剂的固有活性被移除的α-1抗胰蛋白酶的蛋白质序列及其制备方法在韩国专利申请公开号10-2010-01165中公开。
长效人生长激素是融合蛋白，其中α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的突变体通过遗传重组与人生长激素的N端或C端融合，是与第一代人生长激素相比具有改善的半衰期的材料。该长效人生长激素被制备，使得它在CHO细胞中表达以被糖基化，而大部分第一代人生长激素药物是在大肠杆菌(E.coli)中生产的。
α-1抗胰蛋白酶的纯化是通过用聚乙二醇和pH(EP专利号0097274)以及阳离子交换树脂(EP专利号96929430和95112630)将杂质选择性沉淀而常规进行的。此外，第一代人生长激素通常是通过在大肠杆菌中以包涵体的形式过表达，然后重折叠并用阴离子交换树脂纯化制备的(韩国专利1998-0003752和Patra AK,Mukhopadhyay R,Mukhija R,Krishnan A,Garg LC,Panda AK.(2000)18,182-192,200；蛋白质实验纯化(Protein Expr.Purif.))。
同时，该长效人生长激素NexP-hGH是一种具有约70至90kDa的分子量的新材料，它与第一代人生长激素或α-1抗胰蛋白酶在生理化学性质方面例如分子量、等电点、多糖模式等不同，具有高纯度的长效人生长激素不能由与用于第一代人生长激素或α-1抗胰蛋白酶的相同/相似的纯化方法获得。此外，该长效人生长激素的纯化方法在专利或科学文献中未被公开。
在此情况下，在致力于发现其高纯度尚未被认为可能的长效人生长激素的有效纯化方法时，本发明人发现高纯度长效人生长激素可通过阴离子交换树脂、疏水树脂、附着抗体片段的树脂等获得。
此外，体内存在的蛋白的糖基化水平对半衰期和效力的影响程度多种多样，这取决于蛋白的类型，例如常规使用的蛋白药物促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子(GCSF)。促红细胞生成素——一种存在于体内的蛋白——的体内效力取决于其唾液酸含量而改变(JCEgrie和JK Browne，英国癌症杂志(British J.of Cancer)，84,3-10,2001)。具体地，促红细胞生成素在唾液酸含量和体内效力之间具有高度相关性，含有预定比例或更高的唾液酸含量的高度糖基化的多糖显示适当的效力。相反，取决于多糖的存在/不存在，GCSF的效力在体外效力方面显示了高达25％的差异，但在体内效力方面没有差异(H Bonig等人.骨髓移植(Bone marrow transplantation)，28,259-264,2001)。
因此，在致力于开发在体外和体内条件下都显示长效药物学活性，同时具有较低的免疫原性风险的人生长激素时，本发明人发现具有特定pI的NexP-hGH蛋白的一个同种型在上述在动物细胞中产生的蛋白中具有卓越的体内长效效果和生长效果，因而完成了本发明。
发明内容
技术问题
因此，本发明是在考虑了现有技术中发生的上述问题后作出的。本发明的一个目的是提供一种在动物细胞中产生的长效人生长激素NexP-hGH蛋白，其中α-1抗胰蛋白酶突变体(NexP)与人生长激素(hGH)融合，具有5.2或更小的等电点(pI)。
本发明的另一个目的是提供制备长效人生长激素NexP-hGH蛋白的方法，该方法包括：(a)将包含长效人生长激素NexP-hGH蛋白——其中α-1抗胰蛋白酶突变体(NexP)与人生长激素(hGH)融合——的生物流体施加到填充了附着抗-α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂的亲合色谱柱；以及(b)根据等电点(pI)差异，分离具有5.2或更低的等电点(pI)的长效生长激素NexP-hGH蛋白。
本发明的进一步的目的是提供一种纯化高纯度长效人生长激素NexP-hGH的方法。
技术方案
为实现上述目的，一方面，本发明提供一种在动物细胞中产生的长效人生长激素NexP-hGH蛋白，其中α-1抗胰蛋白酶突变体(NexP)与人生长激素(hGH)融合，具有5.2或更小的等电点(pI)。
另一方面，本发明提供一种纯化长效人生长激素NexP-hGH的方法，所述方法包括：(a)将包含长效人生长激素NexP-hGH蛋白——其中人生长激素与α-1抗胰蛋白酶突变体融合——的生物流体施加到阴离子交换树脂色谱；(b)将该包含NexP-hGH蛋白的生物流体或步骤(a)中产生的洗脱物施加到疏水树脂色谱；和(c)将该包含长效人生长激素NexP-hGH蛋白的生物流体或步骤(a)或步骤(b)中产生的洗脱物施加到填充了附着抗-α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂的亲合色谱柱。
如本文所用，术语“人生长激素(hGH)”指允许人中生长、细胞增殖或再生的肽激素。人生长激素可包括任何可刺激生长板中体内细胞分化，以促进生长的蛋白，而不限于本发明。人生长激素包含天然产生的生长激素和通过遗传改造技术生产的，但不限于此。此外，关于人生长激素的信息可从公众可获得的数据库，例如由美国健康研究院(National Institute of Health(NIH))国立生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)(NCBI)提供的GenBank获得，例如登录号为AAA98618的人生长激素等，但不限于此。
由于人生长激素能在体内通过刺激骺板的细胞分化促进生长，它被视为重要的治疗蛋白以用于体内合成或分泌有困难的对象中。然而，从对患者用药方便和治疗效果方面一直有开发具有与常规生长激素相比增加的半衰期的长效人生长激素的需求。因此，本发明人开发了一种α-1抗胰蛋白酶突变体，与人生长激素融合，将获得的结果在动物细胞中表达，从而开发高度糖基化的人生长激素NexP-hGH。该高度糖基化的人生长激素NexP-hGH是动物细胞中产生的蛋白，具有5.2或更小的等电点(pI)。它比pI超过5.2时具有更高程度的糖基化，从而实现高长效性能和效力。
如本文所用，术语“长效人生长激素”指一种蛋白，其中人生长激素(hGH)和α-1抗胰蛋白酶突变体(NexP)融合，可与术语“NexP-hGH”互换使用。NexP是本发明人命名的术语，指α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的一个突变体，是一种体内蛋白，通过保留体内长效性能具有增长的半衰期，由本发明人开发。移除了其蛋白酶抑制剂活性的α-1抗胰蛋白酶的蛋白序列及其制备方法等在韩国专利号10-1183262和韩国专利申请号10-2013-0029713中公开，韩国专利号10-1183262或韩国专利申请号10-2013-0029713的全部内容作为引文使用，但不限于此。
α-1抗胰蛋白酶是一种存在于哺乳动物血液中的蛋白，具有约50000 Da的分子量，也称为α-1蛋白酶抑制剂。从血液中提取的α-1抗胰蛋白酶被FDA批准，已经以的名称作为治疗肺气肿的治疗剂上市。通常以60mg/kg的剂量通过静脉内注射以一周的间隔给药，是一种其临床安全性已被确认的蛋白。此外，α-1抗胰蛋白酶作为蛋白酶抑制剂的功能和结构众所周知(Elliott,P.等人，JMB 275,419-425,1998)。此外，α-1抗胰蛋白酶以超过100种不同的等位基因存在，其表型根据其等电聚焦(IEF)类型分类为‘A’至‘Z’(Stoller等人，The Lancet，365,2225-2236,2005)。其中，最普遍的M型等位基因是正常型，又基于氨基酸序列的突变分类为亚型例如M1(Val 213)、M2和M3。因此，用于本发明的α-1抗胰蛋白酶是一种天然存在的特定亚型，可对其它亚型具有相同效果。关于α-1抗胰蛋白酶的信息可从公众可获得的数据库例如由美国健康研究院(NIH)的国立生物技术信息中心(NCBI)提供的Genbank获得，例如登录号为AAH11991的野生型α-1抗胰蛋白酶蛋白等，但不限于此。野生型α-1抗胰蛋白酶蛋白的序列如SEQ ID NO:1所示。
α-1抗胰蛋白酶可通过经由位点定向诱变修饰至少一个其氨基酸残基移除其体内固有活性，从而增加其半衰期。通过上述氨基酸残基(一个或多个)的修饰，产生α-1抗胰蛋白酶的N-糖基化区域，从而通过氨基酸替换最小化在注射入体内时的免疫原性，同时中和α-1抗胰蛋白酶的蛋白酶抑制剂活性，并可防止游离半胱氨酸形成二聚体。具体地，至少一个氨基酸中的突变的特征可在于SEQ ID NO:1所表示的α-1抗胰蛋白酶的第357个氨基酸脯氨酸(P)上的突变，该脯氨酸是该α-1抗胰蛋白酶中的P2位，更具体地，是脯氨酸至天冬酰胺(N)的转变。此外，该α-1抗胰蛋白酶突变体可包含SEQ ID NO:1所表示的α-1抗胰蛋白酶的第9个氨基酸谷氨酰胺(Q)上突变为天冬酰胺(N)；第232个氨基酸半胱氨酸(C)上突变为丝氨酸(S)；或第359个氨基酸丝氨酸(S)突变为苏氨酸(T)等的突变，该突变体也可包含至少一个上述突变，以及第357个氨基酸脯氨酸(P)即P2位上突变为天冬酰胺(N)的突变，但不限于此。
该长效人生长激素NexP-hGH是一种蛋白质，其中任何上述α-1抗胰蛋白酶(A1AT)突变体通过遗传重组与人生长激素的N端或C端融合。具体地，该长效人生长激素NexP-hGH可以是一种融合蛋白(hGH-A1AT(Q9N，P357N))，其中该α-1抗胰蛋白酶突变体——其中第9个氨基酸谷氨酰胺和第357个氨基酸脯氨酸都突变为天冬酰胺——与人生长激素的N端融合，但不限于此。
如本文所用，术语“高度糖基化的长效人生长激素”指一种包含α-1抗胰蛋白酶突变体和人生长激素的形式的长效人生长激素，它与天然状态下存在的野生型蛋白相比具有较高程度的糖基化，并具有5.2或更低的等电点。
在本发明中，确认了长效活性随着该长效人生长激素的糖基化程度变高而变高。具体地，确认了当该长效人生长激素的等电点为5.2或更小时，体内的长效活性和药物活性在体外和体内都极高。
该高度糖基化的长效人生长激素具有5.2或更低的等电点，优选地在3.5至5.2的范围内，但不限于此。
具体地，糖基化的区域是多肽内的氨基酸残基或区域，其中可发生糖基化例如碳水化合物结构的附着，例如N-糖基化的区域或O-糖基化的区域。保守的N-糖基化区域可以是Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中X是任何氨基酸，但不限于此。
该高度糖基化的长效人生长激素可通过培养引入包含编码该长效人生长激素的多核苷酸的表达载体的动物细胞产生。
如本文所用，术语“动物细胞”指能表达本发明的长效人生长激素的细胞，只要它们能引起糖基化，可不具体限制，例如CHO细胞、BHK细胞、Vero细胞、HeLa细胞、MDCK细胞、293细胞和3T3细胞，但不限于此。
在本发明的一个实施方式中，制备了与其中第9个氨基酸谷氨酰胺和第357个氨基酸脯氨酸都用天冬酰胺取代的α-1抗胰蛋白酶突变体融合的人生长激素蛋白，包含编码上述蛋白的多核苷酸的载体被引入CHO细胞，从而构建一个稳定细胞系(实施例1)。此外，在依次进行阴离子交换树脂色谱、疏水色谱和其中用附着了抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂填充用于亲合色谱的柱的亲合色谱后，根据等电点的差异获得NexP-hGH蛋白。确定了在同种型1-3中具有最低的pI的同种型1具有比同种型2和同种型3高的糖基化程度，而具有比同种型3低的pI的同种型2具有比同种型3高的糖基化程度(图1和图2)。此外，从药物动力学角度确定了随着糖基化程度的增加，本发明的长效人生长激素具有优秀的药物动力学性质，并且具体地，等于或超出阳性对照组(图3)。此外，确定了与阳性对照组中的实验动物相比，同种型2和同种型3显著增加了实验动物的体长。即，本发明的高度糖基化的长效人生长激素显示与阳性对照组相比显著高的有效性。
在本发明的另一方面，提供了制备长效人生长激素NexP-hGH蛋白的方法，包括：(a)将包含长效人生长激素NexP-hGH蛋白——其中α-1抗胰蛋白酶突变体(NexP)与人生长激素(hGH)融合——的生物流体施加到填充了附着抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂的亲合色谱柱；以及(b)根据等电点(pI)差异，分离具有5.2或更低的等电点(pI)的长效生长激素NexP-hGH蛋白。
该α-1抗胰蛋白酶突变体、人生长激素和该长效人生长激素与上文所解释的相同。
上述制备方法的每个步骤可详细说明如下。
首先，步骤(a)涉及将包含长效人生长激素NexP-hGH蛋白的生物流体施加到填充了附着抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂的亲合色谱柱。
上述步骤是通过NexP和抗体片段之间的亲和性将NexP-hGH附着到柱的步骤。
如本文所用，术语“包含长效人生长激素NexP-hGH的生物流体”可指生产长效人生长激素NexP-hGH蛋白的细胞的细胞培养物上清、其细胞提取物或其部分纯化形式，但不限于此。具体地，该生物流体优选地是通过培养引入包含编码该长效人生长激素的多核苷酸的表达载体的动物细胞获得的细胞的细胞培养物上清或细胞培养物提取物，或其细胞提取物，但不限于此。
如本文所用，术语“部分纯化”指在进行至少一个纯化过程例如色谱后，显示除了具有意欲的pI值的蛋白外其他蛋白也存在的状态。上述部分纯化过程不具体限制其类型，但可以是例如疏水色谱或阴离子交换树脂色谱，但不限于此。该部分纯化可用至少一种选自疏水色谱和阴离子交换树脂色谱的方法进行，优选地，通过将产生长效人生长激素NexP-hGH蛋白的细胞的细胞培养物上清或其细胞提取物施加到阴离子交换树脂色谱或疏水树脂色谱，从而从其产生洗脱物，并且更优选地，依次实施阴离子交换树脂色谱和疏水树脂色谱并从其产生洗脱物，但不限于此。
步骤(b)涉及根据pI差异分离具有5.2或更小的等电点(pI)的长效人生长激素NexP-hGH蛋白。
在从附着了抗体片段的树脂分离时，具有不同多糖模式和等电点的长效人生长激素NexP-hGH的结构同种型可根据MgCl2浓度分离和洗脱。
因此，在步骤(b)中，为分离和洗脱该具有5.2或更小的等电点的长效人生长激素，可使用包含0至1,000mM MgCl2、优选地0至300mMMgCl2、更优选地0至200mM MgCl2、甚至更优选地200mM MgCl2的Tris缓冲液，但不限于此。
在该用于分离和洗脱的Tris缓冲液中，MgCl2可任选地添加或不需要添加。
在本发明的一个进一步的方面，提供了制备长效人生长激素的方法。
在本发明的一个示例性实施方式中，培养用人生长激素/α-1抗胰蛋白酶突变体转化的CHO细胞，并通过超滤用20mM磷酸钠缓冲液透析过滤该细胞培养物的上清。将韩国专利申请号10-2010-0037496作为引文以其整体包括。
该制备方法详细说明如下。
步骤(a)涉及将包含其中人生长激素与α-1抗胰蛋白酶突变体融合的长效人生长激素NexP-hGH蛋白的生物流体施加到用树脂填充的亲合色谱柱到阴离子交换树脂色谱，优选地，将包含长效人生长激素的培养物液体培养基或通过将培养物液体培养基用具有pH 6至9、包含0至100mM NaCl的缓冲液透析过滤获得的培养物液体培养基施加到平衡的阴离子交换树脂以吸附于其上；用具有pH 6至9、包含0至1,00mM NaCl的缓冲液冲洗生成物；并用具有pH 6至9、包含100至1,000mM NaCl的缓冲液洗脱包含该长效人生长激素NexP-hGH的部分。使用阴离子交换树脂，可移除细胞培养物中的染料和核酸例如DNA/RNA，并可浓缩该生物流体中含有的长效人生长激素。
如本文所用，术语“阴离子交换树脂色谱”指将带负电(或酸性)的分子缀合到带正电的载体，从而根据电荷分离该分子，该分子的同系物(酸性、碱性和中性)可用该技术方便地分离。用于本发明的阴离子交换色谱的树脂可包括但不限于强阴离子交换树脂和弱阴离子交换树脂，例如(GEhealthcare)等，也可使用其官能团是季胺(Q)、二乙基氨乙基(DEAE)和季氨基乙基(QAE)的树脂，但不限于此。优选地，树脂的官能团可以是Q或DEAE，更优选地是Q Sepharose，它是强阴离子交换树脂。
阴离子交换树脂色谱可通过柱色谱或间歇方式进行。对于商业制造，可优选间歇方式。在冲洗阴离子交换树脂后，通过分步盐梯度或连续盐梯度进行洗脱。可使用任何适当的分步盐梯度或连续盐梯度，只要它们能从该长效人生长激素分离杂质。
此外，用于本发明的阴离子交换树脂色谱的阴离子交换树脂在向其吸附培养物液体培养基前可用水性缓冲液平衡。当培养物液体培养基在吸附到阴离子交换树脂前用具有pH 6至9、包含0至100mM NaCl的缓冲液稀释或浓缩或透析时，纯化效力可大大提高。以上可通过使用超滤进行透析过滤实现。透析过滤能移除培养物液体培养基中具有30000或更小的截留分子量(MWCO)的低分子量材料(例如表面活性剂、染料、小肽、糖组分等)，并通过用一种用于阴离子交换树脂色谱的平衡缓冲液进行缓冲液交换增强柱吸附效力。
同时，超滤能够根据颗粒尺寸分级溶解或分散在液体中的材料，并且通常，它能够分离、浓缩和纯化具有数千至数十万的分子量的分子或胶体颗粒。超滤膜的功能由MWCO指示，并且具有大于该膜的MWCO的分子量的材料被从过滤排除。通常，MWCO由其中90％可被排除的球形蛋白的分子量代表。超滤膜的主要功能是透析过滤、纯化和浓缩。
待用于相应的冲洗和洗脱步骤的缓冲液包括磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液或Tris缓冲液。
在本发明的一个示例性实施方式中，由表达长效人生长激素NexP-hGH从CHO细胞获得的培养物液体培养基用20mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)通过超滤透析过滤。该样品然后通过以20mL/min的流速施加，结合到用20mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)平衡的Q-Sepharose树脂填充的XK-50柱，用3倍柱体积的作为洗脱溶剂的含100mM NaCl的20mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)以20mL/min的流速冲洗以移除杂质，最后以约85％的纯度洗脱该长效人生长激素(图5)。
步骤(b)可涉及将包含该长效人生长激素NexP-hGH的培养物液体培养基或步骤(a)中产生的洗脱物施加到疏水树脂色谱中，优选地，从阴离子交换树脂色谱回收的溶液加到平衡的疏水树脂并吸附于其上，用具有6至8的pH、包含1至3M NaCl的缓冲液冲洗，以用具有6至8的pH、包含0至1M NaCl的缓冲液洗脱包含该长效人生长激素NexP-hGH的部分。疏水树脂能够更好地移除未从该阴离子交换树脂纯化的源自细胞的杂质。上述结果可通过比较约80％纯度的阴离子交换树脂和图6中约90％或更高纯度的疏水树脂确认。
因此，本发明与常规纯化方法不同的在纯化中在步骤(a)后进行步骤(b)的构成特征基于以下关于色谱组合的发现：
(1)由于阴离子交换树脂(约10-20mg NexP-hGH/树脂1mL)具有比疏水树脂(约6mg NexP-hGH/树脂1mL)高的结合容量，阴离子交换树脂适于第一柱，其主要目标是捕获培养物液体培养基中的NexP-hGH。
(2)在工艺效率方面，在阴离子交换树脂工艺完成时，从该阴离子交换树脂获得的洗脱物可直接施加到疏水树脂工艺而不需要对从阴离子交换树脂获得的该洗脱物进行浓缩/透析。
当步骤(b)疏水树脂工艺首先进行时，来自疏水树脂的洗脱物应当用一种用于阴离子交换树脂的平衡缓冲液浓缩/透析，然后用阴离子交换树脂工艺处理，因此具有需要额外的浓缩/透析工艺的缺点。
(3)此外，由于阴离子交换树脂在移除培养物液体培养基中所含的染料和移除DNA方面有效，本发明的在第一柱中使用阴离子交换树脂的方法可显示优于常规纯化方法的纯化结果。
如本文所用，术语“疏水树脂色谱”指在具有缀合于多种市售基质、不带电的疏水性——更适当地芳香族或脂肪族的——配体的凝胶中进行的色谱。待用作上述凝胶的树脂优选地具有相对小的微珠尺寸用于高分辨率，例如Source(GE healthcare)、Resource(GE healthcare)等，但不限于此。优选地，待用作配体的树脂的官能团可以是苯基、辛基、异丙基、丁基、乙基等，以及更优选地是苯基树脂。
待用于本发明的疏水色谱的洗脱液可不具体限制，但优选地是具有6至8的pH、包含0至1M NaCl的缓冲液。
在本发明中，可通过在将阴离子交换树脂洗脱物吸附到疏水树脂前用具有6至8的pH、包含3至4M NaCl的缓冲液稀释，或用具有6至8的pH、包含1至3M NaCl的缓冲液浓缩/透析该阴离子交换树脂洗脱物，从而将该阴离子交换树脂洗脱物中的NaCl浓度增加到2M或更高，以提高纯化效力。
用于上述相应的冲洗和洗脱的缓冲液的实例优选地是磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液或Tris缓冲液。
此外，优选地使用该缓冲液，以线性浓度梯度洗脱从将阴离子交换树脂色谱洗脱物施加到疏水色谱树脂获得的结合于疏水色谱树脂的长效人生长激素。
在本发明的一个示例性实施方式中，长效人生长激素是如下洗脱的：通过将含4M NaCl的20mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)加到Q-Spharose柱洗脱物，以获得包含2.5M NaCl的20mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)，制备苯基Sepharose的装填溶液；将该溶液以20mL/min的流速施加到用苯基Sepharose填充、用含2.5M NaCl的20mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)平衡的XK-50柱；用3倍柱体积的含2.5M NaCl的20mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)冲洗；然后用4倍柱体积的含0.5MNaCl的20mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)洗脱该长效人生长激素。结果，获得的长效人生长激素的纯度是约96％(图6)。
步骤(c)涉及将包含该长效人生长激素NexP-hGH的生物流体或步骤(a)或步骤(b)中产生的洗脱物施加到填充了附着抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂的亲合色谱柱。优选地，步骤(c)可涉及将包含长效人生长激素NexP-hGH的培养物液体培养基、步骤(a)或步骤(b)中产生的洗脱物加样到附着抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的平衡的亲合色谱树脂以吸附于其上；用具有6.5至8.5的pH、包含0至200mM NaCl的Tris缓冲液冲洗；和用具有6.5至8.5的pH、包含0至1M MgCl2的Tris缓冲液洗脱包含该长效人生长激素NexP-hGH的部分。
本发明的具有高纯度和高产量的高级纯化方法的重点在于涉及进行抗体片段附着于其上的树脂的工艺的步骤(c)作为最终步骤进行。本发明人首先确认了如果将含有大量留在透析过滤后仍留在培养物液体培养基中的去垢剂、染料、其他杂质等的培养物液体培养基直接加载到步骤(c)的色谱工艺作为第一工艺，能获得具有90％或更高纯度的长效人生长激素NexP-hGH，但它降低结合容量，从而减少产量。
本发明人发现了首先进行在去垢剂、染料和其他杂质存在下对该长效人生长激素NexP-hGH具有高结合容量(10mg/mL或更高)的步骤(a)以部分移除杂质，然后依次进行步骤(b)和步骤(c)，其是确保98％或更高的纯度和25％或更高的产量的纯化工艺，从而完成本发明的构成特征。
从上述阴离子交换树脂和疏水树脂工艺能获得具有90％至95％纯度的长效人生长激素NexP-hGH，并且为获得具有99％或更高纯度的长效人生长激素NexP-hGH，可进一步使用附着了抗体片段的树脂。此外，确认了当只使用该附着了抗体片段的树脂进行纯化时，获得的产量与上述工艺相比减少约20％，但能获得具有约90％至95％的纯度的长效人生长激素。
优选地，将从该疏水树脂获得的包含长效人生长激素NexP-hGH的洗脱物浓缩并用具有7至9的pH、包含0至100mM NaCl的Tris缓冲液透析，或稀释使得该溶液中NaCl浓度变为200mM或更低。经浓缩并透析的溶液或经稀释的溶液吸附于附着了抗体片段的树脂中，具体地，吸附了抗α-1抗胰蛋白酶的树脂，用具有6.5至8.5的pH、包含0至200mM NaCl的Tris缓冲液冲洗，并用具有6.5至8.5的pH、包含0至1M MgCl2的Tris缓冲液洗脱。
优选地，用于相应的冲洗和洗脱的缓冲液可是磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液或Tris缓冲液。
在本发明的一个示例性实施方式中，该从步骤(b)获得的包含该长效人生长激素NexP-hGH的溶液通过超滤系统用含150mM NaCl的Tris缓冲液(pH 7.4)透析过滤。通过允许足量的含150mM NaCl的Tris缓冲液(pH 7.4)流入柱中，平衡了用附着了抗α-1抗胰蛋白酶(A1AT，下文)抗体片段的树脂填充的XK-50柱(GE Healthcare)，并以20mL/min的流速允许经透析过滤的液体流入柱中，再次允许用约3倍柱体积的含150mM NaCl的Tris缓冲液(pH 7.4)流入柱中以冲洗该柱。然后用含50mM MgCl2的Tris缓冲液(pH 7.4)冲洗柱，随后依次允许含100mM MgCl2的Tris缓冲液(pH 7.4)、含200mMMgCl2的Tris缓冲液(pH 7.4)、含300mM MgCl2的Tris缓冲液(pH 7.4)流入柱中以洗脱包含该长效人生长激素NexP-hGH的部分。将包含该长效人生长激素NexP-hGH的洗脱物通过超滤系统(MWCO为30000)用含150mM NaCl的PBS缓冲液(pH 7.45)透析过滤。回收的洗脱物的纯度显示约为99％(图7)。
优选地，上述方法可进一步包括步骤(d)，在通过用附着了抗-α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂填充的亲合色谱柱的纯化步骤中，用0至1000mM MgCl2分离和洗脱具有不同多糖模式和等电点的该长效人生长激素NexP-hGH的结构同种型。步骤(d)可使用NaCl代替MgCl2，优选地，代替MgCl2使用的NaCl的量是0至2000mM，并且可以是用于分离和洗脱具有不同多糖模式和等电点的该长效人生长激素NexP-hGH的结构同种型的步骤。
在分离附着了抗体片段的树脂时，具有不同多糖模式和等电点的该长效人生长激素NexP-hGH的结构同种型可根据MgCl2的浓度分离和洗脱。例如，100mM MgCl2缓冲液可比200mM MgCl2缓冲液选择性洗脱具有更多多糖模式和更低等电点的结构同种型(图8)。
从附着了抗体片段的树脂获得的包含该长效人生长激素NexP-hGH的洗脱物可经受进一步的缓冲液交换工艺。缓冲液交换工艺可通过凝胶层析或浓缩和透析过滤等进行。
在本发明的另一个方面，提供了用上述方法制备的长效人生长激素NexP-hGH蛋白。
该方法和该长效人生长激素NexP-hGH蛋白与以上说明的相同。
有益效果
根据本发明的高度糖基化的长效人生长激素及其制备方法与常规人生长激素相比显示了糖基化的显著增加，因而具有与市售人生长激素例如Diclase相比大幅改善的长效性能和药学效力，因此可用于需要人生长激素的领域。
此外，本发明的方法能够用阴离子交换树脂、疏水树脂和附着抗体片段的树脂从细胞培养物获得具有99％或更高纯度的重组长效人生长激素NexP-hGH。当应用于制造工艺时，本发明的高纯度纯化方法可大规模纯化长效人生长激素以具有高纯度，因此可用于制造蛋白治疗剂。
附图说明
图1和图2显示了长效人生长激素的根据等电点(pI)差异的部分。
图3显示了确认本发明的高度糖基化的长效人生长激素的同种型1至3对体重的影响的曲线。
图4显示了本发明的高度糖基化的长效人生长激素的同种型1至3体长的测量结果。
图5显示了通过阴离子交换树脂色谱分离并通过SDS-PAGE和C4HPLC分析色谱测量的长效人生长激素的纯度的测量结果。
图6显示了通过疏水树脂色谱分离并通过SDS-PAGE和C4 HPLC分析色谱测量的长效人生长激素的纯度的测量结果。
图7显示了通过用附着了抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂填充的亲合色谱柱分离并通过SDS-PAGE和C4 HPLC分析色谱测量的长效人生长激素的纯度的测量结果。
图8显示了说明根据MgCl2浓度分离和洗脱的长效人生长激素的多肽模式和等电点的差异的图片。左图中，第1道：疏水树脂洗脱物；第2道：用100mM MgCl2/Tris缓冲液(pH 7.4)洗脱的长效人生长激素NexP-hGH；第3道：用200mM MgCl2/Tris缓冲液(pH 7.4)洗脱的长效人生长激素；和第4道：用300mM MgCl2/Tris缓冲液(pH 7.4)洗脱的长效人生长激素。右图中，第1道：用50mM MgCl2/Tris缓冲液(pH7.4)洗脱的长效人生长激素NexP-hGH；第2道：用100mM MgCl2/Tris缓冲液(pH 7.4)洗脱的长效人生长激素NexP-hGH；第3道：用200mMMgCl2/Tris缓冲液(pH 7.4)洗脱的长效人生长激素NexP-hGH；和第4道：用300mM MgCl2/Tris缓冲液(pH 7.4)洗脱的长效人生长激素NexP-hGH。
最佳实施方式
下文中，将参考以下的实施例和实验实施例更详细地说明本发明。然而，以下实施例和实验实施例仅供说明目的，本发明的范围不以任何方式受其限制。本领域技术人员可根据给定环境适当地选择常规使用的载体和培养条件。
实施例1：制备人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合蛋白和用于表达该融合蛋白的细胞系
用源自pSGHV0(GenBank登记号AF285183)、通过从其移除shGH、His标签和TEV位点改进的载体pAV1克隆人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合蛋白，并且将其设计以能够使用蛋白的固有信号序列进行细胞外分泌。
此外，引入DHFR系统作为构建组成型表达该融合蛋白的稳定细胞系的选择标记，并且为此目的，将IRES-DHFR基因插入pAV1载体。为增加表达量，在该信号序列中额外插入了Kozac序列。靶蛋白hGH-A1AT(Q9N，P357N)被引入以便它能与hGH在A1AT的N端融合。
然后将如此制备的克隆引入CHO DG44细胞系，并选择高达4μM，同时允许其进行从50nM甲氨蝶呤(MTX)开始的两倍增加，从而建立稳定细胞系。
然而，本领域技术人员可根据给定情况适当地选择常规使用的载体和细胞系并相应地应用。
实验实施例1：培养表达长效人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合蛋白的细胞系并产生该融合蛋白
为从如上建立的细胞系以高产量获得高度糖基化的生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合蛋白，在常规细胞培养条件下表达该生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合蛋白，即本发明的长效生长激素。然而，本领域技术人员可根据给定情况适当地选择常规使用的培养条件并相应地应用。
实验实施方式2：根据pI分离人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合蛋白
将从以上实施例获得的表达细胞系进行悬浮培养，并且纯化从细胞培养物液体培养基获得的本发明的新型长效生长激素。
具体地，过滤细胞培养物液体培养基以移除细胞，因此获得细胞上清。通过超滤系统(MWCO为30,000)，使用平衡缓冲液(20mM磷酸钠，pH 8.0)，透析过滤该上清。然后，将生成物注射到Q-Sepharose(GE Healthcare，美国)柱，用含50mM NaCl的20mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)移除蛋白杂质，并允许含190mM NaCl的20mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)流入其中，并且回收包含长效生长激素的溶液。
通过将4M NaCl/20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)添加到Q-Sepharose柱洗脱物从而将溶液调整至约2.5M NaCl/20mM磷酸钠(pH 7.5)，制备苯基-Sepharose(GE Healthcare，美国)的装填溶液。然后将装填溶液施加到苯基-Sepharose柱中，用含2.5M NaCl的20mM磷酸钠缓冲液冲洗该柱。然后，用20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)回收包含该长效人生长激素的溶液。
将该苯基-Sepharose柱洗脱物通过超滤系统(MWCO为30000)，用含150mM NaCl的Tris缓冲液(pH 7.4)透析过滤。然后，将生成物施加到附着了抗α-1抗胰蛋白酶(A1AT)抗体片段的树脂中，并结合于其上，并用含50mM MgCl2的Tris缓冲液(pH 7.4)冲洗。然后，依次允许含100mM MgCl2的Tris缓冲液(pH 7.4)、含200mM MgCl2的Tris缓冲液(pH 7.4)和含300mM MgCl2的Tris缓冲液(pH 7.4)流入其中，从而根据pI差异分离和洗脱本发明的长效生长激素。
具体地，用100mM MgCl2/Tris缓冲液(pH 7.4)、200mM MgCl2缓冲液(pH7.4)和300mM MgCl2/Tris缓冲液(pH7.4)洗脱的本发明的长效生长激素分别指定为同种型1、同种型2和同种型3(图1和图2)。
除了以上方法，本领域技术人员可适当地选择根据等电点分离蛋白质的常规方法。
实验实施例3：人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合蛋白的药物动力学实验
为确认根据本发明的长效生长激素的分级的药物动力学，进行了如下的实验。
通过皮下注射以0.6mg/kg的浓度向切除垂体的大鼠给药上述同种型1至3，并测量其体重和体长改变，直至第14天，结果分别如图3和图4所示。
结果，如图3所示，用PBS处理的阴性对照组未显示体重改变，但用同种型1至3处理的组和用和处理的阳性对照组显示了显著的体重增加。具体地，与阳性对照组相比，用同种型1和2处理的组在第10天显示了体重增加的显著差异，而用同种型3处理的组显示了低于阳性对照组的体重增加。
此外，体长测量的结果显示用同种型1和2处理的组显示比用处理的组高的体重增加速度，而用同种型3处理的组显示略低的增加(图4)。
上述结果说明，取决于多糖程度，即使相同类型的长效激素也可显示不同的效力，并且特别地，可暗示根据本发明的方法制造的具有5.2或更低的pI的NexP-hGH蛋白是高度糖基化的蛋白，并且在体内具有长效性能和高生长效果。
实施例2：通过阴离子交换树脂和疏水树脂色谱纯化长效人生长激素NexP-hGH的方法
通过超滤系统(MWCO为30000)用20mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)透析过滤在实施例1中制备的表达该长效人生长激素NexP-hGH的转化的CHO细胞获得的约2L培养物液体培养基。
XK-50柱(GE Healthcare)用约250mL Q-Sepharose(GE Healthcare)树脂填充并通过允许足量的20mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)流入其中而平衡。允许约1L经透析过滤的液体以20mL/min的流速流入如此制备的Q-sepharose，并且再次通过允许约3倍柱体积(CV)的20mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)流入其中以冲洗该柱。
在通过允许约3CV的含100mM NaCl的20mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)以20mL/min的流速流动而移除蛋白杂质后，允许约3CV的含200mM NaCl的200mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)以20mL/min的流速流动以回收包含该长效人生长激素NexP-hGH的溶液。
回收的洗脱物的纯度通过C4 HPLC分析色谱测量，并且结果在图5中显示。结果，确认了该长效人生长激素NexP-hGH的纯度是约85％。
通过将4M NaCl/20mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)添加到Q-Sepharose柱洗脱物从而将溶液调整至约2.5M NaCl/20mM磷酸钠(pH 8.0)，制备苯基-Sepharose装填溶液。
XK-50柱(GE Healthcare)用约250mL Q-Sepharose(GE Healthcare)树脂填充并通过允许足量的含2.5M NaCl的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)流入其中而平衡。允许约1.2L该苯基-Sepharose装填溶液以20mL/min的流速流入如此制备的苯基-Sepharose柱，并且再次通过允许约3倍柱体积(CV)的含2.5M NaCl的20mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)流入其中以冲洗该柱。
通过允许约4CV的含0.5M NaCl的20mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)以20mL/min的流速流动以回收包含该长效人生长激素NexP-hGH的溶液。
回收的洗脱物的纯度通过C4 HPLC分析色谱测量，并且结果在图6中显示。结果，确认了该长效人生长激素NexP-hGH的纯度是约96％。
实施例3：使用吸附了抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂的纯化方法
通过超滤系统(MWCO为30000)使用含150mM NaCl的Tris缓冲液(pH7.4)透析过滤约1L实施例2中制备的包含该长效人生长激素NexP-hGH的溶液。
XK-50柱(GE Healthcare)用约250mL吸附了抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂(GE Healthcare)(“AIAT”，下文)填充并通过允许足量的含150mM NaCl的Tris缓冲液(pH 7.4)以平衡。
允许约1L该透析过滤的液体以20mL/min的流速流入如此制备的A1AT柱，并且再次通过允许约3倍柱体积的含150M NaCl的Tris缓冲液(pH 7.4)流入其中以冲洗该柱。然后用含50mM MgCl2的Tris缓冲液(pH 7.4)冲洗该柱，随后允许含100mM MgCl2的Tris缓冲液(pH 7.4)、含200mM MgCl2的Tris缓冲液(pH 7.4)和含300mM MgCl2的Tris缓冲液(pH 7.4)依次流入其中，从而洗脱包含该长效人生长激素NexP-hGH的部分。
将包含该长效人生长激素NexP-hGH的洗脱物通过超滤系统(MWCO为30000)用含150mM NaCl的PBS(pH 7.45)透析过滤。
回收的洗脱物的纯度通过C4 HPLC分析色谱测量，并且结果在图7中显示。因此，确认了该长效人生长激素NexP-hGH的纯度是约99％。
实施例4：根据多糖模式和等电点分离长效人生长激素NexP-hGH
在实施例3中，可根据MgCl2的浓度分离和洗脱该具有不同的多糖模式和等电点的长效人生长激素NexP-hGH的结构同种型。用含100mM MgCl2的Tris缓冲液(pH 7.4)、含200mM MgCl2的Tris缓冲液(pH7.4)和含300mM MgCl2的Tris缓冲液(pH 7.4)分离和洗脱的该长效人生长激素NexP-hGH的多糖模式和等电点的差异如图8所示。
以上结果支持，当依次使用阴离子交换树脂、疏水树脂和附着抗体片段的树脂填充的柱时，本发明的长效人生长激素可分离和纯化成99％或更高的纯度，并且具有所需的糖基化的该长效人生长激素可根据糖基化的差异分离和纯化。
根据上文，本发明所属领域的技术人员将能理解，本发明可在不改变本发明的技术理念或基本特征的前提下以其他具体形式实施。在此方面，本文公开的示例性实施方式仅用于说明目的，并且不应被理解为限制本发明范围。相反，本发明意欲不仅覆盖示例性实施方式，也覆盖包含在如权利要求书所限定的本发明的精神和范围内的各种替代方案、改进、等效和其他实施方式。
Claims (18)
1.一种在动物细胞中产生的长效人生长激素NexP-hGH蛋白，其中α-1抗胰蛋白酶突变体(NexP)与人生长激素(hGH)融合，具有5.2或更低的等电点(pI)。
2.权利要求1所述的长效人生长激素NexP-hGH蛋白，其中所述α-1抗胰蛋白酶突变体(NexP)包含至少一个选自下述的突变：野生型α-1抗胰蛋白酶蛋白第9个残基上谷氨酰胺至天冬酰胺的突变、野生型α-1抗胰蛋白酶蛋白第232个残基上半胱氨酸至丝氨酸的突变、野生型α-1抗胰蛋白酶蛋白第357个残基上脯氨酸至天冬氨酸的突变和野生型α-1抗胰蛋白酶蛋白第359个残基上丝氨酸至苏氨酸的突变。
3.一种制备长效人生长激素NexP-hGH蛋白的方法，所述方法包括：
(a)将包含长效人生长激素NexP-hGH蛋白——其中α-1抗胰蛋白酶突变体(NexP)与人生长激素(hGH)融合——的生物流体施加到填充了附着抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂的亲合色谱柱；以及
(b)根据等电点(pI)差异分离具有5.2或更低的等电点(pI)的所述长效人生长激素NexP-hGH蛋白。
4.权利要求3所述的方法，其中步骤(b)包括用含0至1000mMMgCl2的Tris缓冲液洗脱所述长效生长激素NexP-hGH蛋白。
5.权利要求4所述的方法，其中所述Tris缓冲液包含200mMMgCl2。
6.权利要求3所述的方法，其中步骤(a)是通过将包含所述长效人生长激素NexP-hGH蛋白的样品施加到阴离子交换树脂色谱或疏水树脂色谱而产生的洗脱物施加到所述填充了附着抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂的亲合色谱柱的步骤。
7.权利要求3所述的方法，其中步骤(a)是通过将包含所述长效人生长激素NexP-hGH蛋白的样品依次施加到阴离子交换树脂色谱和疏水树脂色谱而产生的洗脱物施加到所述填充了附着抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂的亲合色谱柱的步骤。
8.根据权利要求3至7任一项制备的长效人生长激素NexP-hGH蛋白。
9.一种纯化长效人生长激素NexP-hGH的方法，所述方法包括：
(a)将包含长效人生长激素NexP-hGH蛋白——其中人生长激素与α-1抗胰蛋白酶突变体融合——的生物流体施加到阴离子交换树脂色谱；
(b)将所述包含NexP-hGH蛋白的生物流体或步骤(a)中产生的洗脱物施加到疏水树脂色谱；和
(c)将所述包含长效人生长激素NexP-hGH蛋白的生物流体或步骤(a)或步骤(b)中产生的洗脱物施加到填充了附着抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂的亲合色谱柱。
10.权利要求9所述的方法，其中步骤(a)是以下的步骤：将包含长效人生长激素的培养物液体培养基或通过将所述培养物液体培养基用具有6至9的pH、包含0至100mM NaCl的缓冲液透析过滤获得的经透析过滤的培养物液体培养基施加到平衡的阴离子交换树脂以吸附于其上；用具有pH 6至9、包含0至100mM NaCl的缓冲液冲洗所述树脂；和用具有pH 6至9、包含100至1,000mM NaCl的缓冲液洗脱包含所述长效人生长激素NexP-hGH的部分。
11.权利要求9所述的方法，其中步骤(b)是以下的步骤：将包含长效人生长激素的培养物液体培养基或从所述阴离子交换树脂色谱回收的溶液施加到平衡的疏水树脂以吸附于其上；用具有pH 6至8、包含1至3M NaCl的缓冲液冲洗所述树脂；和用具有pH 6至8、包含0至1MNaCl的缓冲液洗脱包含所述长效人生长激素NexP-hGH的部分。
12.权利要求9所述的方法，其中步骤(c)是以下的步骤：将包含长效人生长激素的培养物液体培养基或步骤(a)或步骤(b)中产生的洗脱物施加到平衡的附着了抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂以吸附于其上；用具有6.5至8.5的pH、包含0至200mM NaCl的Tris缓冲液冲洗所述树脂；和用具有6.5至8.5的pH、包含0至1M MgCl2的缓冲液洗脱包含所述长效人生长激素NexP-hGH的部分。
13.权利要求9所述的方法，进一步包括步骤(d)，在用所述填充了附着抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂的亲合色谱柱的纯化工艺中，用0至1000mM MgCl2分离和洗脱具有不同多糖模式和等电点的所述长效人生长激素NexP-hGH的结构同种型。
14.权利要求13所述的方法，其进一步包括用0至2000mM NaCl代替MgCl2分离和洗脱具有不同多糖模式和等电点的所述长效人生长激素NexP-hGH的结构同种型。
15.权利要求10至12任一项所述的方法，其中用于冲洗或洗脱的所述缓冲液是磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液或Tris缓冲液。
16.权利要求9所述的方法，其中所述生物流体是动物细胞的培养物液体培养基。
17.权利要求9所述的方法，其中所述阴离子交换树脂的官能团是选自季胺(Q)、二乙基氨乙基(DEAE)和季氨基乙基(QAE)的任一个。
18.权利要求9所述的方法，其中所述疏水树脂色谱的官能团是选自苯基、辛基、异丙基、丁基和乙基的任一个。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2012-0060641 | 2012-06-05 | ||
| KR1020120060641A KR101460266B1 (ko) | 2012-06-05 | 2012-06-05 | 신규한 지속형 인간 성장호르몬의 정제 방법 |
| KR10-2013-0063053 | 2013-05-31 | ||
| KR1020130063053A KR101504824B1 (ko) | 2013-05-31 | 2013-05-31 | 고당화된 지속형 인간 성장호르몬 단백질 및 이의 제조방법 |
| PCT/KR2013/004985 WO2013183948A1 (ko) | 2012-06-05 | 2013-06-05 | 고당화된 지속형 인간 성장호르몬 단백질 및 이의 제조방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104379598A true CN104379598A (zh) | 2015-02-25 |
| CN104379598B CN104379598B (zh) | 2017-04-05 |
Family
ID=49712282
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201380029894.0A Active CN104379598B (zh) | 2012-06-05 | 2013-06-05 | 高度糖基化的长效人生长激素蛋白及其生产方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9902753B2 (zh) |
| EP (1) | EP2857417B1 (zh) |
| JP (1) | JP6231559B2 (zh) |
| CN (1) | CN104379598B (zh) |
| WO (1) | WO2013183948A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111601818A (zh) * | 2017-12-20 | 2020-08-28 | 阿特根公司 | 新型生长激素受体拮抗剂及其融合蛋白 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101402702B1 (ko) * | 2011-09-15 | 2014-06-05 | (주)알테오젠 | 신규한 알파-1 안티트립신 변이체, 이의 제조방법 및 용도 |
| WO2018011803A1 (en) | 2016-07-11 | 2018-01-18 | The National Institute for Biotechnology in the Negev Ltd. | Fusion proteins with extended serum half life |
| WO2019077432A1 (en) * | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Intas Pharmaceuticals Ltd. | IMPROVED PURIFICATION METHOD OF RECOMBINANT PTH (1-34) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995016701A1 (en) * | 1993-12-13 | 1995-06-22 | Genentech, Inc. | Method for purifying polypeptides |
| CN1882685A (zh) * | 2003-09-30 | 2006-12-20 | 斯特林贝尔德生物技术北美公司 | 在转基因哺乳动物的奶中生产外源蛋白的方法以及从其中纯化蛋白的方法 |
| US20110288005A1 (en) * | 2010-04-02 | 2011-11-24 | Amunix Operating Inc. a Delware Corporation | Alpha 1-antitrypsin compositions and methods of making and using same |
| CN102439044A (zh) * | 2009-04-22 | 2012-05-02 | 阿特根公司 | 通过体内持续释放维持的体内半衰期增加的融合蛋白质或融合肽以及使用所述融合蛋白质或融合肽增加体内半衰期的方法 |
| CN103827141A (zh) * | 2011-09-15 | 2014-05-28 | 阿特根公司 | 新型α-1抗胰蛋白酶变体及其制备方法和用途 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4439358A (en) | 1982-06-17 | 1984-03-27 | Miles Laboratories, Inc. | Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor |
| CA1267615A (en) | 1984-08-27 | 1990-04-10 | Dan Hadary | Method for recovering purified growth hormones from genetically engineered microorganisms |
| IT1228925B (it) * | 1987-08-07 | 1991-07-10 | Eniricerche Spa | Procedimento per la preparazione dell'ormone della crescita umano |
| US5268277A (en) * | 1987-08-07 | 1993-12-07 | Eniricerche S.P.A. | Method for the preparation of human growth hormone |
| DD285113A5 (de) * | 1989-06-21 | 1990-12-05 | Akad Wissenschaften Ddr | Verfahren zur gewinnung von reinem menschlichen wachstumshormon (hgh) |
| US7217689B1 (en) | 1989-10-13 | 2007-05-15 | Amgen Inc. | Glycosylation analogs of erythropoietin |
| FR2686899B1 (fr) | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| KR100236771B1 (ko) | 1997-04-01 | 2000-02-01 | 성재갑 | 히아루론산을 이용한 약물의 서방성 미세입자 제형 |
| KR100329336B1 (ko) | 1999-01-18 | 2002-03-22 | 성재갑 | 히아루론산을 이용한 단백질 약물의 서방성 미세 입자 제형 |
| US20050176108A1 (en) * | 2003-03-13 | 2005-08-11 | Young-Min Kim | Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life |
| JP2007507232A (ja) | 2003-09-30 | 2007-03-29 | スターンベルド バイオテクノロジー ノース アメリカ， インコーポレイテッド | 乳汁中に外因性タンパク質を産生するトランスジェニック哺乳動物を作製するプロセスおよびそれによって産生されるトランスジェニック哺乳動物 |
| MX2007007591A (es) * | 2004-12-22 | 2007-07-25 | Ambrx Inc | Metodos para expresion y purificacion de hormona de crecimiento humano recombinante. |
| KR100977200B1 (ko) | 2008-06-26 | 2010-08-20 | 충주대학교 산학협력단 | 은나노입자의 제조방법과 이에 의해 제조된 은나노입자가도입된 세제용 첨가제 |
| KR20100037496A (ko) | 2008-10-01 | 2010-04-09 | 주식회사 대우일렉트로닉스 | 광정보 저장매체용 노광장치, 광정보 기록장치 |
-
2013
- 2013-06-05 JP JP2015515950A patent/JP6231559B2/ja active Active
- 2013-06-05 WO PCT/KR2013/004985 patent/WO2013183948A1/ko active Application Filing
- 2013-06-05 US US14/406,192 patent/US9902753B2/en active Active
- 2013-06-05 EP EP13800310.8A patent/EP2857417B1/en active Active
- 2013-06-05 CN CN201380029894.0A patent/CN104379598B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995016701A1 (en) * | 1993-12-13 | 1995-06-22 | Genentech, Inc. | Method for purifying polypeptides |
| CN1882685A (zh) * | 2003-09-30 | 2006-12-20 | 斯特林贝尔德生物技术北美公司 | 在转基因哺乳动物的奶中生产外源蛋白的方法以及从其中纯化蛋白的方法 |
| CN102439044A (zh) * | 2009-04-22 | 2012-05-02 | 阿特根公司 | 通过体内持续释放维持的体内半衰期增加的融合蛋白质或融合肽以及使用所述融合蛋白质或融合肽增加体内半衰期的方法 |
| US20110288005A1 (en) * | 2010-04-02 | 2011-11-24 | Amunix Operating Inc. a Delware Corporation | Alpha 1-antitrypsin compositions and methods of making and using same |
| CN103827141A (zh) * | 2011-09-15 | 2014-05-28 | 阿特根公司 | 新型α-1抗胰蛋白酶变体及其制备方法和用途 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111601818A (zh) * | 2017-12-20 | 2020-08-28 | 阿特根公司 | 新型生长激素受体拮抗剂及其融合蛋白 |
| CN111601818B (zh) * | 2017-12-20 | 2024-04-30 | 阿特根公司 | 生长激素受体拮抗剂及其融合蛋白 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2015518882A (ja) | 2015-07-06 |
| EP2857417A1 (en) | 2015-04-08 |
| CN104379598B (zh) | 2017-04-05 |
| US9902753B2 (en) | 2018-02-27 |
| EP2857417B1 (en) | 2018-02-14 |
| JP6231559B2 (ja) | 2017-11-15 |
| US20150126715A1 (en) | 2015-05-07 |
| EP2857417A4 (en) | 2016-01-06 |
| WO2013183948A1 (ko) | 2013-12-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3230091B2 (ja) | ヒト血清アルブミンの着色抑制方法 | |
| CN106536565A (zh) | 一种用于纯化TNFR‑Fc融合蛋白的方法 | |
| EP2632944B1 (en) | Method for purifying human granulocyte-colony stimulating factor from recombinant e. coli | |
| EP2138505B1 (en) | Method for producing soluble thrombomodulin of high purity | |
| CN1130353A (zh) | 蛋白质的纯化 | |
| CN104379598A (zh) | 高度糖基化的长效人生长激素蛋白及其生产方法 | |
| JP3360315B2 (ja) | ヒト血清アルブミンの高度精製方法 | |
| RU2643365C2 (ru) | Способ очистки дарбэпоетина альфа | |
| CN104292341B (zh) | 一种凝血八因子融合蛋白及其制备方法和用途 | |
| KR101460266B1 (ko) | 신규한 지속형 인간 성장호르몬의 정제 방법 | |
| WO2017154869A1 (ja) | 変異型ヒトエリスロポエチンの製造方法 | |
| CN104854239A (zh) | 蛋白质纯化 | |
| KR101516054B1 (ko) | 신규한 지속형 인간 성장호르몬 단량체를 제조하는 방법 | |
| KR101504824B1 (ko) | 고당화된 지속형 인간 성장호르몬 단백질 및 이의 제조방법 | |
| TW201723174A (zh) | 重組蛋白質的製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |