CN103827141A - 新型α-1抗胰蛋白酶变体及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种新型α-1抗胰蛋白酶变体及其制备方法和用途。根据本发明，血液半衰期（t1/2）和血药浓度-时间曲线下面积（AUC）通过N-末端第1位至第25位之间的氨基酸突变以在动物细胞中添加N-糖基化位点而得到显著增加，因此，所述α-1抗胰蛋白酶变体具有非常好的体内稳定性并且保留了对弹性蛋白酶活性的抑制作用。因此，本发明的α-1抗胰蛋白酶变体可用于预防或治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏。
Description
技术领域
本发明涉及新型α-1抗胰蛋白酶变体及其制备方法和用途。
背景技术
α-1抗胰蛋白酶是一种由394个氨基酸残基构成的蛋白质，其分子量为约50,000道尔顿（Da），并且其存在于哺乳动物的血液中。α-1抗胰蛋白酶是主要的血液蛋白质之一，其在血液中的浓度为约2mg/mL（Robin W.C.等人,Nature,298,329-334,1982），并且α-1抗胰蛋白酶也被称为α-1蛋白酶抑制剂。α-1抗胰蛋白酶具有至少约100个天然生成的等位基因，并且根据等电聚焦（IEF）曲线将α-1抗胰蛋白酶的表型分为A类至Z类。本领域已知，在A类至Z类中，最丰富的M型等位基因存在于大多数人类的血液中，并且具有至少大约75种不同的同种型（Brantley,M.等人,Am.J.Med.,84(suppl.6A),13-31,1988），而且该M型等位基因保留了作为蛋白酶抑制剂的主要功能。
总体而言，本领域已知晓的是，大约90%的α-1抗胰蛋白酶的同种型存在于五种PiM亚型中，例如，M1、M2、M3、M4和M5。在这些亚型中，M1、M2和M3分别占约67%、约16%和约11%（Cox D.W.&Billingsley D.G.,FEBSLett.,231,327-330,1986）。本领域已知，在这些亚型中，在M2和M3亚型的N末端起的第101位分别具有组氨酸（His）和精氨酸（Arg），并且已知这些氨基酸的差别不会影响α-1抗胰蛋白酶的固有活性。
α-1抗胰蛋白酶是一种在3个位点上被糖基化的糖蛋白（Mega,T.等人,J.Biol.Chem.,255,4057-4061,1980）。X-射线晶体结构显示α-1抗胰蛋白酶由3个β片层和8个α螺旋构成，与存在于血液中的其他蛋白酶抑制剂（丝氨酸蛋白酶抑制剂）类似（Elliot P.R.,等人,JMB,275,419-425,1988）。α-1抗胰蛋白酶起到抑制体内各种不同类型的蛋白酶的作用，并且其在体内所起到的与目前相关领域已知的疾病有关的主要作用是抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的活性（Beatty等人,J.Biol.Chem.,255,3931～3934,1980）。α-1抗胰蛋白酶的缺乏引起诸如肺气肿之类的严重疾病，在肺气肿这种疾病中，肺部功能由于弹性蛋白的分解而被削弱。而且，已有临床报告表明修饰的α-1抗胰蛋白酶的蛋白质不由肝脏正常分泌，而在肝脏中积累，这引起肝硬化的发作。
近年来，美国食品与药品管理局（FDA）已批准了几种从人类血液中提取的产品，并且这几种产品已作为用于治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏的治疗剂上市销售。这些产品的代表性的实例包括：Prolastin（由Talecris Plasma Resources Inc销售），Aralast（由Baxter Inc销售）以及Zemaira（由CSL Behring Inc销售），这些产品一般以60mg/kg的剂量通过静脉注射每周一次给药于人体。因此，蛋白质应当以4g至5g的大剂量每周一次给药于成人患者持续一段较长的时间。
根据数据监控（DMHC2364）分析可知，在美国和欧洲大约有200,000位患者具有与α-1抗胰蛋白酶有关的遗传问题，但是因为没有得到适当的诊断，这些患者中仅有一些已得到治疗。目前为医用目的而研发的所有产品均为从人类血液中提取的α-1抗胰蛋白酶。这种从人类血液中提取的α-1抗胰蛋白酶可能带有来自人体的病毒的风险，即使在生产过程中完全消除所述病毒，也有可能带有来自人体的病毒，所述病毒可对人体引起致命性疾病，所述病毒例如，人免疫缺乏病毒（HIV），乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒。甚至当α-1抗胰蛋白酶经过检测几种病原体的血液筛选测试和病毒灭活过程时，也不可能彻底根除非常罕见的还不知晓的病原体。因此，在使用血液提取的α-1抗胰蛋白酶时总是有感染人体内未知的病原体的风险。而且，稳定提供未污染的血液用于生产商业需求量的α-1抗胰蛋白酶也遇到了问题。
作为解决上述问题的一个可选的方案，重组DNA技术可用于研发作为治疗剂的α-1抗胰蛋白酶。因此，已对重组DNA技术进行持续性研究，但是由于各种不同的限制因素，目前还没有可商售的重组α-1抗胰蛋白酶。
本领域已知，因为在人α-1抗胰蛋白酶的三个位点（第46位的天冬酰胺，第83位的天冬酰胺，第247位的天冬酰胺）进行了糖基化，所以人α-1抗胰蛋白酶具有3个N-多糖基团。因为通过重组DNA方法，使用诸如大肠杆菌之类的微生物生成的α-1抗胰蛋白酶未被糖基化，所以当将这样生成的α-1抗胰蛋白酶给药于人体时，其在体内具有较短的半衰期（Karnaukhova等人,Amino Acids,30,317-332,2006,Garver Jr.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,84,1050-1054,1987）。为了解决这个问题并且为了有效生成大量α-1抗胰蛋白酶，通过使α-1抗胰蛋白酶在植物中表达展开研究。然而，有报道称，虽然在植物中表达的重组α-1抗胰蛋白酶具有源于植物的糖基化，但是其体内半衰期比人α-1抗胰蛋白酶的半衰期短（Huang等人,Biotechnol.Prog.,17,126-133,2001）。
为了增加α-1抗胰蛋白酶的体内半衰期，Cantin等人报道了通过将聚乙二醇结合至在微生物中表达的α-1抗胰蛋白酶的半胱氨酸残基得到的融合蛋白（Cantin等人,Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.,27,659-665,2002）。这篇文章说明当分子量为20kDa至40kDa的聚乙二醇结合至在微生物中表达的α-1抗胰蛋白酶的半胱氨酸残基时，与在微生物中表达的α-1抗胰蛋白酶相比，结合聚乙二醇后的α-1抗胰蛋白酶具有增加的体内半衰期，从而使该半衰期与人α-1抗胰蛋白酶的半衰期基本类似。然而，当聚乙二醇结合至蛋白质时，各种异相反应产物可通过化学副反应形成。因此，需要额外的处理方法将这些异相反应产物除去。而且，因为在结合了PEG的α-1抗胰蛋白酶中没有N-多糖基团，所以，这可能会在用于治疗人类时由暴露的氨基酸序列引起免疫原性问题。
本领域已知，来自动物细胞的α-1抗胰蛋白酶的体内半衰期与人α-1抗胰蛋白酶的体内半衰期基本相同（Garver Jr.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,84,1050-1054,1987）。因此，在动物细胞中生产具有与人α-1抗胰蛋白酶类似的结构的α-1抗胰蛋白酶的方法可为优选的。虽然来自动物细胞的α-1抗胰蛋白酶具有优势，但是使用动物细胞生产α-1抗胰蛋白酶具有如下问题：一般而言，使用动物细胞生产α-1抗胰蛋白酶的方法比在微生物中生产α-1抗胰蛋白酶的方法更昂贵。
同时，在α-1抗胰蛋白酶的环区域添加糖基化位点的技术已被认为会使α-1抗胰蛋白酶的体内半衰期增加。总体而言，可以推测，当在动物细胞中表达的蛋白质被糖基化时，由于当将糖基化的蛋白质给药于人体时其流体力学体积增大，因此与未糖基化的蛋白质相比，糖基化的蛋白质可被认为具有增加的体内半衰期。然而，从促红细胞生成素的实例中可见，基于糖基化的位置的不同，向生理学活性蛋白质中添加糖基化位点或改变糖基化位点对蛋白质的体内半衰期产生很大影响（Eliott等人,Nat.Biotechnol.,21,414-421,2003）。因此，为了增加体内半衰期和生理稳定性而向α-1抗胰蛋白酶中添加糖基化位点时，本领域技术人员需要广泛地证明向α-1抗胰蛋白酶的哪个或哪几个位置添加糖基化位点。
综上所述，为了提高α-1抗胰蛋白酶的体内稳定性，本领域已有多种不同的使用重组DNA技术制备α-1抗胰蛋白酶的方法。然而，由于存在上述各种各样的问题，这些现有方法并不适用于作为药物的α-1抗胰蛋白酶的研发。因此，本领域亟需一种新的用于研发在体内具有非常好的稳定性的重组α-1抗胰蛋白酶的方法。
发明内容
[技术问题]
为了制备具有临床效用的重组α-1抗胰蛋白酶，本发明的发明人通过在α-1抗胰蛋白酶的各个不同的特定位置添加糖基化位点以制备α-1抗胰蛋白酶变体，发现该α-1抗胰蛋白酶变体在体内具有非常好的稳定性并且该α-1抗胰蛋白酶变体保留了对弹性蛋白酶的抑制作用，具有显著增加的血液半衰期（t1/2）以及显著增加的血药浓度-时间曲线下面积（AUC）。因此，本发明是基于上述这些事实完成的。
[技术方案]
根据本发明的一个方面，本发明提供一种通过取代α-1抗胰蛋白酶的N-末端的第1位至第25位之间的特定位点上的氨基酸以添加糖基化位点而制备的α-1抗胰蛋白酶变体。
根据本发明的一种示例性的实施方式，所述α-1抗胰蛋白酶变体可具有添加于其上的1至3个糖基化位点。
根据本发明的另一示例性的实施方式，所述特定位点可存在于N-末端的第3位至第13位之间。
根据本发明的又一示例性的实施方式，所述特定位点可存在于N-末端的第9位或第12位。
根据本发明的再一示例性的实施方式，所述特定位点可位于第4位和第9位，第4位和第12位或第9位和第12位。
根据本发明的另一方面，本发明提供一种制备α-1抗胰蛋白酶变体的方法，所述方法包括取代α-1抗胰蛋白酶的N-末端的第1位至第25位之间的特定位点上的氨基酸以添加糖基化位点，在培养基中培养由具有添加于其上的糖基化位点的α-1抗胰蛋白酶表达载体转化的细胞，通过所述细胞表达α-1抗胰蛋白酶变体蛋白，以及纯化并回收表达的α-1抗胰蛋白酶变体蛋白。
根据本发明的又一方面，本发明提供一种用于预防或治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏的组合物，所述组合物包含作为活性成分的α-1抗胰蛋白酶变体，其中，所述α-1抗胰蛋白酶变体通过取代α-1抗胰蛋白酶的N-末端的第1位至第25位之间的特定位点上的氨基酸以添加糖基化位点来制备。
根据本发明的一种示例性的实施方式，所述α-1抗胰蛋白酶缺乏可为慢性阻塞性肺病或肝硬化。
根据本发明的再一方面，本发明提供一种预防或治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏的方法，所述方法包括将治疗有效量的α-1抗胰蛋白酶变体给药于患者，其中，所述α-1抗胰蛋白酶变体通过取代α-1抗胰蛋白酶的N-末端的第1位至第25位之间的特定位点上的氨基酸以添加糖基化位点来制备。
根据本发明的再一方面，本发明提供一种具有增加的体内半衰期的α-1抗胰蛋白酶变体融合蛋白，其中，所述融合蛋白通过连接两个α-1抗胰蛋白酶变体制备，其中每个α-1抗胰蛋白酶变体通过取代α-1抗胰蛋白酶的N-末端的第1位至第25位之间的特定位点上的氨基酸以添加糖基化位点来制备。
根据本发明的再一方面，本发明提供一种α-1抗胰蛋白酶变体融合蛋白，所述融合蛋白包括具有增加的体内半衰期的异质蛋白，其中，所述融合蛋白通过将α-1抗胰蛋白酶变体连接至所述异质蛋白制备，并且所述α-1抗胰蛋白酶变体通过取代α-1抗胰蛋白酶的N-末端第1位至第25位之间的特定位点上的氨基酸以添加糖基化位点来制备。
根据本发明的一种示例性的实施方式，所述α-1抗胰蛋白酶变体在357位（P2位）上可具有氨基酸脯氨酸，该脯氨酸进一步被天冬酰胺取代。
[有益效果]
根据本发明的α-1抗胰蛋白酶变体，由于其血液半衰期（t1/2）和血药浓度-时间曲线下面积（AUC）通过在α-1抗胰蛋白酶的N-末端的第1位和第25位之间的氨基酸突变添加N-糖基化位点而得到显著增加，因此具有非常好的体内稳定性并且保留了对弹性蛋白酶活性的抑制作用。因此，根据本发明的α-1抗胰蛋白酶变体在预防或治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏方面有用。而且，根据本发明的α-1抗胰蛋白酶变体可用于治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏，并且当异质蛋白连接至α-1抗胰蛋白酶变体时，根据本发明的α-1抗胰蛋白酶变体可用于提高异质蛋白的体内半衰期。
附图说明
在下面的具体实施方式以及附图中对本发明的优选实施方式的这些特征、方面和优势以及其他特征、方面和优势进行更加详细的描述。在附图中：
图1为表示根据本发明的α-1抗胰蛋白酶载体（pT003）的示意图。
图2为表示根据本发明的α-1抗胰蛋白酶变体的序列和位点的图。
图3为表示根据本发明的纯化的α-1抗胰蛋白酶及其变体的SDS-PAGE结果的图。
图4为根据本发明绘制的在皮下给药之后血浆衍生的α-1抗胰蛋白酶和在动物细胞内表达的重组α-1抗胰蛋白酶的药代动力学图。
图5为根据本发明绘制的在皮下给药之后α-1抗胰蛋白酶及其变体的药代动力学图。
图6为根据本发明绘制的在皮下给药之后血浆衍生的α-1抗胰蛋白酶和重组α-1抗胰蛋白酶变体的药代动力学图。
图7为根据本发明绘制的在皮下给药和静脉内给药之后α-1抗胰蛋白酶变体的药代动力学图。
图8为根据本发明绘制的在静脉内给药之后α-1抗胰蛋白酶及其二聚体的药代动力学图。
图9为根据本发明绘制的在皮下给药之后人生长激素/α-1抗胰蛋白酶变体融合物的药代动力学图。
图10为根据本发明绘制的在皮下给药之后粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶变体融合物的药代动力学图。
具体实施方式
本发明涉及通过取代α-1抗胰蛋白酶的N-末端的第1位至第25位之间的特定位点上的氨基酸以添加糖基化位点而制备的α-1抗胰蛋白酶变体。
根据本发明的α-1抗胰蛋白酶变体的特征在于：除了α-1抗胰蛋白酶的三个糖基化位点（第46位的天冬酰胺、第83位的天冬酰胺和第247位的天冬酰胺）之外，对α-1抗胰蛋白酶的N-末端的第1位至第25位之间的特定位点上的氨基酸进行取代以添加N-糖基化位点。所添加的糖基化位点的数目不受限制。例如，糖基化位点的数目可为1至3。
可在人α-1抗胰蛋白酶的N-末端的特定位点添加N-糖基化位点以形成序列Asn-X-Thr/Ser，该序列是编码N-末端的第1位至第25位之间的N-多糖结合位点的序列。优选地，用天冬酰胺取代存在于人α-1抗胰蛋白酶的N-末端的第3位至第13位之间的氨基酸谷酰胺（优选地，存在于N-末端的第9位或第12位的氨基酸谷酰胺）以添加糖基化位点。通过添加糖基化位点而形成的变体可具有如下结构：在该结构的第4位和第9位、第4位和第12位或第9位和第12位添加糖类。除了本文所述的特定位点之外，α-1抗胰蛋白酶变体可在N-末端的25位之内的另一位点上被糖基化。
本发明还涉及制备α-1抗胰蛋白酶变体的方法，所述方法包括取代α-1抗胰蛋白酶的N-末端的第1位至第25位之间的特定位点上的氨基酸以添加糖基化位点，在培养基内培养由具有添加于其上的糖基化位点的α-1抗胰蛋白酶表达载体转化的细胞，在培养溶液中表达α-1抗胰蛋白酶变体蛋白，以及纯化并回收表达的α-1抗胰蛋白酶变体蛋白。
重组DNA技术可用作上述添加N-糖基化位点的技术，并且氨基酸可通过基因操纵被取代、插入和除去以添加N-糖基化位点。人α-1抗胰蛋白酶的N-末端的大约20个氨基酸构成α-1抗胰蛋白酶的X-射线晶体结构中不易被检测到的区域（PDB编码：1QLP,2QUG,3CWL,1PSI,7API,1KCT(www.pdb.org)）。在这种情况下，α-1抗胰蛋白酶的N-末端区域具有非常灵活且不被结构化的三维结构。
根据本发明的α-1抗胰蛋白酶变体可通过使用定点诱变法使至少一个氨基酸发生突变来制备。例如，当人α-1抗胰蛋白酶的第9位上的谷酰胺被天冬酰胺取代或第148位上的甘氨酸被天冬酰胺取代时，并且当修饰的人α-1抗胰蛋白酶在动物细胞中表达时，在取代谷酰胺（第9位）或甘氨酸（第148位）的天冬酰胺残基上形成糖基化位点。而且，当第148位上的甘氨酸被苏氨酸取代时，在第146位的天冬酰胺上形成新的糖基化位点。糖基化位点可以这种方式添加至α-1抗胰蛋白酶的各个不同的位置。
在本发明中，α-1抗胰蛋白酶变体通过在人α-1抗胰蛋白酶的N-末端的第1位至第25位之间的特定位点上进行氨基酸取代而添加除了人α-1抗胰蛋白酶的三个糖基化位点（第46位的天冬酰胺、第83位的天冬酰胺和第247位的天冬酰胺）之外的N-糖基化位点来制备，所述α-1抗胰蛋白酶的N-末端在α-1抗胰蛋白酶（A1AT）的X-射线晶体结构中未被结构化。随后，所述α-1抗胰蛋白酶变体在中国仓鼠卵巢细胞中表达，并且使用色谱法纯化至高纯度。
在SDS-PAGE测试中，在比野生型α-1抗胰蛋白酶更高的位置上出现的染色带上观察到纯化的具有添加于其上的N-糖基化位点的α-1抗胰蛋白酶变体。这个结果说明α-1抗胰蛋白酶变体的分子量通过糖基化作用而提高。
而且，纯化的α-1抗胰蛋白酶变体由于血药浓度-时间曲线下面积（AUC）和体内半衰期（t1/2）的显著提高而在体内具有非常好的稳定性。然而，在用苏氨酸取代α-1抗胰蛋白酶第26位上的氨基酸的变体（I26T）的情况下，体内稳定性没有改善，甚至通过添加N-糖基化位点也没有使体内稳定性得到改善。而且，如WO2008/151845中所描述的将糖基化位点添加至环区域（环A、环B、环C、环D或环E）或环区域附近的α-1抗胰蛋白酶变体未对体内稳定性产生显著的改善作用。此外，因为环区域的糖基化可影响实质上作为蛋白酶抑制剂起作用的α-1抗胰蛋白酶的活性，所以，选择不影响α-1抗胰蛋白酶活性的糖基化位点非常重要。
本发明还确认了纯化的α-1抗胰蛋白酶变体保留了对弹性蛋白酶的抑制作用。此外，本领域已知人α-1抗胰蛋白酶的结合速率常数通常为1.0±0.2×105M-1s-1（Boudier C.,1994）至1.67×106M-1s-1（Terashima M,等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.,52(4),516-523,1999）。根据本发明，野生型人α-1抗胰蛋白酶及其变体的结合速率常数和平衡常数与人α-1抗胰蛋白酶的结合速率常数和平衡常数类似。由此可见，α-1抗胰蛋白酶的N-末端的糖基化不影响对弹性蛋白酶活性的抑制作用。
本发明还涉及具有增加的体内半衰期的α-1抗胰蛋白酶变体融合蛋白。在本文中，融合蛋白通过将两个α-1抗胰蛋白酶变体彼此连接来制备。
本发明的发明人制备了α-1抗胰蛋白酶双变体，在该双变体中，357位（α-1抗胰蛋白酶变体的P2位置）的氨基酸脯氨酸被天冬酰胺进一步取代，本发明的发明人制备了融合蛋白，在该融合蛋白中，粒细胞集落刺激因子与α-1抗胰蛋白酶的双变体连接，本发明的发明人进行了药代动力学测试并确定融合蛋白具有提高的体内稳定性（请参见实验实施例5）。从这些结果可知，当将生理活性蛋白连接至α-1抗胰蛋白酶的双变体时，诸如生理活性蛋白之类的异质蛋白的体内半衰期增加。
因此，本发明涉及α-1抗胰蛋白酶变体融合蛋白，在该融合蛋白中，另一异质蛋白的体内半衰期通过将所述异质蛋白连接至α-1抗胰蛋白酶变体而增加。所述异质蛋白的种类不受限制，但是可为生理活性肽或生理活性蛋白。
具有增加的半衰期的α-1抗胰蛋白酶变体融合蛋白可通过将两个或两个以上纯化的α-1抗胰蛋白酶变体连接来制备。在先前的研究中，Sytkowski,A.J.等人报道了当使用合适的连接体连接促红细胞生成素（EPO）以制备EPO-EPO融合蛋白时，所述融合蛋白相对于EPO单体具有显著增加的活性和较长的体内半衰期（Sytkowski,A.J.,等人,J.Biol.Chem.,274,24773-24778,1999）。因此，当将两个或两个以上本发明的α-1抗胰蛋白酶变体彼此连接时，可预见到，融合蛋白的半衰期相对于α-1抗胰蛋白酶变体单体增加。进一步地，当具有较短的体内半衰期的生理活性肽或免疫调节因子或细胞因子等与根据本发明的α-1抗胰蛋白酶变体连接时，可预见到，体内半衰期显著增加，从而显示出充分的稳定作用。
本发明还涉及用于预防或治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏的组合物，所述组合物包含作为活性成分的α-1抗胰蛋白酶变体。
此外，本发明涉及预防或治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏的方法，所述方法包括将治疗有效量的α-1抗胰蛋白酶变体给药于患者。
如上所述，根据本发明的α-1抗胰蛋白酶变体，由于通过在α-1抗胰蛋白酶的N-末端的第1位至第25位之间进行氨基酸突变而添加N-糖基化位点使血液半衰期（t1/2）和血药浓度-时间曲线下面积（AUC）显著增加，具有非常好的体内稳定性并且保留了对弹性蛋白酶的抑制作用。因此，根据本发明的α-1抗胰蛋白酶变体在预防或治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏方面有用。α-1抗胰蛋白酶缺乏包括慢性阻塞性肺病（COPD）或肝硬化，优选地包括肺气肿，但是本发明不限于此。
除了α-1抗胰蛋白酶变体之外，根据本发明的组合物还可包括至少一种已知的具有预防或治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏作用的活性成分。
根据本发明的组合物可被制成除了上述用于给药的活性成分之外还进一步包括至少一种药学上可用的载体。所述药学上可用的载体可与选自盐水、无菌水、林格氏（Ringer’s）溶液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、丙三醇、乙醇及其混合物中的至少一种联合使用。在需要时，可添加诸如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂之类的另一常规添加剂。稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂也可加至组合物中，所述组合物随后可被配制成注射用制剂、丸剂、胶囊、颗粒或片剂。进一步地，根据疾病或成分，所述组合物可通过使用相关领域已知的合适方法或在Remington’s PharmaceuticalScience（最新版本，Mack Publishing Company,Easton PA）中公开的方法被配制成理想的剂型。
根据本发明的组合物可根据期望的方法口服给药或肠胃外给药（例如，静脉注射、皮下注射或腹膜内注射、吸入给药或局部施用），并且通过使用根据本发明的α-1抗胰蛋白酶变体可将本发明的组合物用于基因疗法。组合物的剂量可根据患者的体重、年龄、性别和健康状况、饮食、给药时间、给药方法、释放速率以及疾病的严重程度而发生改变。虽然每周给药一次的α-1抗胰蛋白酶变体的剂量低于60mg/kg（α-1抗胰蛋白酶的剂量），但是该剂量能够使组合物表现出基本相同的临床疗效。而且，当以与野生型α-1抗胰蛋白酶相同的剂量给药α-1抗胰蛋白酶变体时，可预见到的是，所述组合物表现出相同的临床疗效，甚至当给药持续期进一步延长时，所述组合物也表现出相同的临床疗效。
本发明的组合物可单独使用或与手术、激素疗法、药物治疗以及使用生物反应调节剂的方法联合使用。
下文提供优选的实施例和实验实施例以有助于理解本发明。然而，应当理解的是，本文提供的详细描述仅仅意在更好地理解本发明，而无意限定本发明的范围。
实施例1：α-1抗胰蛋白酶及其变体和二聚体的制备
1-1.构建表达载体pAV1
将基于工业使用目的通过对母体载体pSGHV0（GenBank登录号：AF285183）进行合适地修饰研制得到的pAV1载体用作本发明克隆所需的表达载体。所述母体载体是实验室载体，在源于人的蛋白质以高浓度过表达且从动物细胞中释放出来，但所述蛋白质在诸如大肠杆菌之类的细菌中表达时不表现出活性的情况下，将所述实验室载体构建为易于纯化具有生理活性的蛋白质。然而，因为母体载体在用于工业生产时受到各种限制，所以对母体载体进行修饰以在具有高蛋白质表达水平的工业中使用，这是pSGHV0载体的最大的优点。
1-2.构建α-1抗胰蛋白酶（亚型M3）载体（pT003）
为了构建α-1抗胰蛋白酶载体，通过将α-1抗胰蛋白酶（M3）基因克隆至pAV1载体中，使用hMU001448（KRIBB）作为模板构建α-1抗胰蛋白酶载体（pT003）。具体而言，hMU001448（KRIBB）模板通过使用两个引物（XhoAT正向引物(5’-CCC TCC TCG AGA ATG CCG TCT TCT GTC TCG-3’,SEQ IDNO:1)和ATNot反向引物(5’-GGG CCC GCG GCC GCA GTT ATT TTTGGG TGG G-3’,SEQ ID NO:2)）的聚合酶链反应（PCR）进行扩增。扩增的核苷酸的两端由两种限制性酶XhoI和NotI消化，并且与具有XhoI/NotI限制性位点的表达载体pAV1融合，从而构建α-1抗胰蛋白酶载体（pT003,SEQ ID NO:39）。该α-1抗胰蛋白酶载体（pT003）示例性地显示于图1。
1-3.α-1抗胰蛋白酶（M3）变体的制备
为了制备具有添加于其上的糖基化位点的多种α-1抗胰蛋白酶变体，将实施例1-2中制备的α-1抗胰蛋白酶载体（pT003）用作模板。下表1中所列的正向引物和反向引物对以及诱变试剂盒（Enzynomix,EZchangeTM定点诱变试剂盒）用于制备α-1抗胰蛋白酶变体。α-1抗胰蛋白酶变体的序列和位点如图2所示。
因为所有α-1抗胰蛋白酶变体的突变目的是为了添加N-糖基化位点，所以，原始氨基酸通常被天冬酰胺取代以形成序列Asn-X-Thr，已知序列Asn-X-Thr为动物细胞中的N-糖基化位点。然而，在一些情况下，为了使用在原始DNA序列中出现的天冬酰胺残基，用苏氨酸取代与天冬酰胺残基相邻的氨基酸。
表1
| 引物 | 序列 |
| Q4N-F(SEQ ID NO:3) | 5’-AAC GGA ACT GCT GCC CAG AAG ACA GAT ACA-3’ |
| Q4N-R(SEQ ID NO:4) | 5’-GGG ATC CTC AGC CAG GGA GAC-3’ |
| Q9N-F(SEQ ID NO:5) | 5’-AAC AAG ACA GAT ACA TCC CAC-3’ |
| Q9N-R(SEQ ID NO:6) | 5’-GGC AGC ATC TCC CTG GGG ATC-3’ |
| D12N-F(SEQ ID NO:7) | 5’-AAT ACA ACC CAC CAT GAT CAG GAT CAC-3’ |
| D12N-R(SEQ ID NO:8) | 5’-TGT CTT CTG GGC AGC ATC TCC-3’ |
| I26T-F(SEQ ID NO:9) | 5’-ACT ACC CCC AA CCT GGC TG-3’ |
| I26T-R(SEQ ID NO:10) | 5’-CTT GTT GAA GGT TGG GTG ATC C-3’ |
| A31T-F(SEQ ID NO:11) | 5’-ACT GAG TTC GCC TTC AGC CTA TAC-3’ |
| A31T-R(SEQ ID NO:12) | 5’-CAG GTT GGG GGT GAT CTT GTT G-3’ |
| L66N-F(SEQ ID NO:13) | 5’-AAC GGG ACC AAG GCT GAC AC-3’ |
| L66N-R(SEQ ID NO:14) | 5’-GGA GAG CAT TGC AAA GGC TGT A-3’ |
| A70N-F(SEQ ID NO:15) | 5’-AAC GAC ACT CAC GAT GAA ATC CTG-3’ |
| A70N-R(SEQ ID NO:16) | 5’-CTT GGT CCC CAG GGA GAG-3’ |
| G148N-F(SEQ ID NO:17) | 5’-AAC GAC ACC GAA GAG GCC AAG-3’ |
| G148N-R(SEQ ID NO:18) | 5’-GAA GTT GAC AGT GAA GGC TTC TG-3’ |
| G148T-F(SEQ ID NO:19) | 5’-ACT GAC ACC GAA GAG GCC AAG-3’ |
| G148T-R(SEQ ID NO:20) | 5’-GAA GTT GAC AGT GAA GGC TTC TG-3’ |
| R178N-F(SEQ ID NO:21) | 5’-AAC GAC ACA GTT TTT GCT CTG GTG-3’ |
| R178N-R(SEQ ID NO:22) | 5’-GTC AAG CTC CTT GAC CAA ATC CA-3’ |
| K201N-F(SEQ ID NO:23) | 5’-AAC GAC ACC GAG GAA GAG GAC-3’ |
| K201N-R(SEQ ID NO:24) | 5’-GAC TTC AAA GGG TCT CTC CCA TT-3’ |
| Q212N-F(SEQ ID NO:25) | 5’-AAC GTG ACC ACC GTG AAG GTG-3’ |
| Q212N-R(SEQ ID NO:26) | 5’-GTC CAC GTG GAA GTC CTC TTC-3’ |
| E266N-F(SEQ ID NO:27) | 5’-AAC CTC ACC CAC GAT ATC ATC AC-3’ |
| E266N-R(SEQ ID NO:28) | 5’-ATT TTC CAG GTG CTG TAG TTT CCC-3’ |
| K343N-F(SEQ ID NO:29) | 5’-AAC GGG ACT GAA GCT G-3’ |
| K343N-R(SEQ ID NO:30) | 5’-CTC GTC GAT GGT CAG C-3’ |
1-4.构建α-1抗胰蛋白酶（亚型M2）载体（pT006）
为了构建α-1抗胰蛋白酶载体，通过将α-1抗胰蛋白酶基因克隆至pAV1载体中，使用pEAT8（编码a1-AT（M2）cDNA）作为模板构建α-1抗胰蛋白酶载体（pT006）。具体而言，pEAT8（编码a1-AT（M2）cDNA）模板通过使用两个引物（XhoAT正向引物(5’-CCC TCC TCG AGA ATG CCG TCT TCTGTC TCG-3’,SEQ ID NO:1)和ATNot反向引物(5’-GGG CCC GCG GCCGCA GTT ATT TTT GGG TGG G-3’,SEQ ID NO:2)）的PCR进行扩增。扩增的核苷酸的两端被两种限制性酶XhoI和NotI消化并且与具有XhoI/NotI限制性位点的表达载体pAV1融合，从而构建α-1抗胰蛋白酶载体（pT006,SEQ ID NO:40）。
1-5.α-1抗胰蛋白酶（M2）变体的制备
为了制备具有添加于其上的糖基化位点的α-1抗胰蛋白酶（M2）变体，将实施例1-4中制备的α-1抗胰蛋白酶载体（pT006）用作模板。将两个引物的引物对（即，正向引物（SEQ ID NO:5）和反向引物（SEQ ID NO:6））以及诱变试剂盒（Enzynomix,EZchangeTM定点诱变试剂盒）用于制备α-1抗胰蛋白酶（M2）变体载体（AT9N（M2））。得到的α-1抗胰蛋白酶变体的氨基酸序列在SEQ ID NO:42中列出。
1-6.α-1抗胰蛋白酶及其变体的二聚体的制备
为了制备α-1抗胰蛋白酶变体的二聚体，将pAT9N（亚型M2）用作α-1抗胰蛋白酶变体。为了构建二聚体载体，将用作模板的pAT9N（M2）通过使用两个引物（XhoAT正向引物2(5’-GGG CCC CTC GAG GCC ACC ATG CCGTCT TCT GTC TCG TGG GGC ATC CTC CTG CTG GCA GGC CTG TGCTGC CTG GTC CCT GTC TCC CTG GCT GAA GAT CCC CAG GGA-3’,SEQID NO:31)和ATBam反向引物2(5’-GGG GGG ATC CTC TTT TTG GGTGGG ATT CAC-3’,SEQ ID NO:32)）的PCR进行扩增。扩增的核苷酸的两端被两种限制性酶XhoI和BamHI消化，并与具有XhoI/BamHI限制性位点的表达载体pAT9N（M2）融合，从而构建α-1抗胰蛋白酶二聚体载体（pAT9N(M2)-AT9N(M2)）。
1-7.α-1抗胰蛋白酶及其变体的二聚体的表达
中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1）用于表达实施例1-2、实施例1-3、实施例1-4、实施例1-5和实施例1-6中制备的α-1抗胰蛋白酶（T003，T006）的蛋白质、其变体的蛋白质以及二聚体的蛋白质。CHO-K1在5%CO2和37℃条件下，在补充有10%胎牛血清（FBS）和抗生素的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中孵育。在引入含有α-1抗胰蛋白酶及其变体的表达载体前一天，将细胞以5×106个细胞的密度种植于100mm培养皿中，并进行培养。随后，将800μL不含FBS和抗生素的DMEM和10μg含有α-1抗胰蛋白酶、其变体以及二聚体的各表达载体混合，并在室温下静置1分钟。随后将得到的混合物与20μg聚乙烯亚胺（PEI，线性，Polysciences Inc.(产品目录号：23966，分子量：约25,000)）混合，并在室温下静置约10分钟至15分钟。在这种情况下，用PBS洗涤一天前培养的细胞，并加入6mL新鲜的DMEM培养肉汤。10分钟至15分钟之后，将在室温下静置的含有α-1抗胰蛋白酶、其变体以及二聚体的各表达载体加至培养皿中。第二天，用PBS洗涤细胞，并将细胞放置于不含FBS的Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM，产品目录号：12200-028,Gibco）中，并且确定蛋白质的表达。
1-8.α-1抗胰蛋白酶及其变体以及二聚体的纯化
如下对在实施例1-7中表达的α-1抗胰蛋白酶、其变体以及二聚体进行纯化。更加具体而言，为了纯化在细胞培养肉汤中分泌的α-1抗胰蛋白酶、其变体以及二聚体，对培养肉汤进行离心以除去细胞，仅回收细胞上清液，并用平衡缓冲液（20mM磷酸钠，pH8.0）稀释上清液。随后，将用平衡缓冲液稀释的细胞上清液置于用平衡缓冲液平衡过的Q-Sepharose（GE Healthcare，US）柱中，并用平衡缓冲液彻底洗涤。随后，以递增浓度（0mM至400mMNaCl，20mM磷酸钠，pH8.0）的氯化钠洗脱蛋白质。将洗脱的蛋白质置于用平衡缓冲液（50mM Tris,0.15M氯化钠,pH7.5）平衡过的α-1抗胰蛋白酶选择（GE Healthcare,US）柱中，然后用平衡缓冲液彻底洗涤。随后，以递增浓度的MgCl2洗脱蛋白质。得到的溶液在磷酸盐缓冲盐水中进行透析，随后使用Vivaspin20（GE Healthcare,US）进行浓缩，从而得到纯化的具有高纯度的蛋白质。纯化的α-1抗胰蛋白酶、其变体以及二聚体的SDS-PAGE结果在图3中显示。
如图3所示，确定了在比野生型α-1抗胰蛋白酶（T003或T006）相对更高的位置观察到了具有添加于其上的N-糖基化位点的α-1抗胰蛋白酶变体，这说明α-1抗胰蛋白酶变体的分子量通过糖基化作用得到提高。而且，这还揭示了在对应于二聚体的分子量的位置观察到了二聚体，根据糖基化作用的水平分子量位置略有差别。
实施例2：人生长激素/α-1抗胰蛋白酶变体的融合蛋白的制备
为了制备人生长激素/α-1抗胰蛋白酶变体（AT9N）的融合蛋白，将pAT9N（亚型M2）用作α-1抗胰蛋白酶变体。为了构建融合载体，将用作模板的人生长激素基因（IOH45734，Invitrogen）通过使用两个引物（XhoGH正向引物(5’-GGG CCC CTC GAG GCC ACC ATG GCT ACA GGC TCC CGG-3’,SEQID NO:33)和GHBam反向引物(5’-GGG GGG ATC CTC GAA GCC ACAGCT GCC CTC-3’,SEQ ID NO:34)）的PCR进行扩增。扩增的核苷酸的两端被两种限制性酶XhoI和BamHI消化，并且随后与具有XhoI/BamHI限制性位点的表达载体pAT9N（M2）融合，从而构建人生长激素/α-1抗胰蛋白酶变体融合载体（phGH-AT9N(M2),SEQ ID NO:43）。
实施例3：粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体的融合蛋白的制备
3-1.α-1抗胰蛋白酶双变体的制备
将以与实施例1-5相同的方法构建的α-1抗胰蛋白酶变体（AT9N）载体用作模板，随后将如下两个引物（正向引物(5’-CCA TGT TTT TAG AGG CCATAA ACA TGT CTA TCC CCC CC-3’,SEQ ID NO:35)和反向引物(5’-GGGGGG GAT AGA CAT GTT TAT GGC CTC TAA AAA CAT GG-3’,SEQ ID NO:36）和诱变试剂盒（Enzynomix,EZchangeTM定点诱变试剂盒）用于构建含有α-1抗胰蛋白酶双变体的载体pT004N（Q9N,P357N），在所述双变体中，α-1抗胰蛋白酶的N-末端的第9位的谷酰胺被天冬酰胺取代，并且第357位的脯氨酸也被天冬酰胺取代。得到的α-1抗胰蛋白酶双变体的氨基酸序列在SEQ IDNO:44中列出。
3-2.粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体的融合蛋白的制备
为了制备粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体的融合蛋白，使用含有通过实施例3-1的方法制备的α-1抗胰蛋白酶双变体的pT004N（Q9N,P357N）。为了构建融合载体，将用作模板的粒细胞集落刺激因子（IHS1380-97652343,Open Biosystems）通过使用两个引物（XhoCSF正向引物(5’-GGG CCC CTC GAG ATG GCT GGA CCT GCC ACC-3’,SEQ ID NO:37)和CSFBam反向引物(5’-GGG GGG ATC CTC GGG CTG GGC AAGGTG GCG-3’,SEQ ID NO:38)）的PCR进行扩增。扩增的核苷酸的两端用两种限制性酶XhoI和BamHI消化，并且与具有XhoI/BamHI限制性位点的表达载体pT004N融合，从而构建粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合载体（pT603N,SEQ ID NO:45）。随后，以与实施例1-7和1-8相同的方式通过得到的融合载体（pT603N）表达并纯化粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体的融合蛋白。
实验实施例1：血浆衍生的α-1抗胰蛋白酶、在中国仓鼠卵巢细胞中制备的α-1抗胰蛋白酶以及它们的变体的药代动力学
为了确定血浆衍生的α-1抗胰蛋白酶和根据本发明的在中国仓鼠卵巢细胞中制备的α-1抗胰蛋白酶的药代动力学，进行如下实验。
将雄性Sprague-Dawley大鼠用作实验动物，并将该大鼠分配至若干个实验组（N=3至5）中。将血浆衍生的人α-1抗胰蛋白酶（Calbiochem,US）、重组α-1抗胰蛋白酶及其变体以每只大鼠445μg的剂量皮下注射或静脉注射于每组中的Sprague-Dawley大鼠，并且将磷酸盐缓冲盐水用作稀释溶液。每次给药之后进行抽血，随后进行离心，获得血清。将每次给药之后得到的血清储存于冰箱中，直至进行分析，α-1抗胰蛋白酶及其变体的血药浓度使用酶联免疫吸附分析（ELISA）进行测试。ELISA使用两种方法进行。如下所述进行一种方法：用抗人α-1抗胰蛋白酶的单克隆抗体（Medix Biochemica,Finland）包被平板（Nunc,Denmark），并且用其中溶解有1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水处理该平板。用其中溶解有1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水稀释样品，待用。将使用sulfo-NHS-生物素（Pierce biotechnology,US）融合的抗α-1抗胰蛋白酶单克隆抗体-生物素偶联物和链霉亲和素-HRP用于检测α-1抗胰蛋白酶。使用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）和过氧化氢比色溶液进行比色反应。随后将硫酸加至每个孔中以停止反应，使用酶标仪（Molecular Device,US）测量反应溶液450nm的吸光度。如下进行另一方法：用抗人α-1抗胰蛋白酶的单克隆抗体（Medix Biochemica,Finland）包被平板（Nunc,Denmark），随后用溶解有1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水处理该平板。用溶解有1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水稀释样品，待用。将抗-α-1抗胰蛋白酶多克隆抗体-生物素偶联物（Abcam,United Kingdom）和链霉亲和素-HRP用于检测α-1抗胰蛋白酶。使用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）和过氧化氢比色溶液进行比色反应。随后将硫酸加至每个孔中以停止反应，使用酶标仪（Molecular Device,US）测量反应溶液450nm的吸光度。在每个步骤中，用洗涤溶液（0.05%Tween20,磷酸盐缓冲盐水）洗涤平板。在绘制标准参比材料的标准曲线之后通过回归分析计算每一样品的定量值。
在皮下给药和静脉给药之后，血浆衍生的α-1抗胰蛋白酶、来自中国仓鼠卵巢细胞中的α-1抗胰蛋白酶以及它们的变体的药代动力学曲线如图4至图7所示。
如图4和图5所示，皮下给药之后，从各个不同的方面观察血浆衍生的α-1抗胰蛋白酶、重组α-1抗胰蛋白酶以及它们的变体的药代动力学。如图4所示，该图表明血浆衍生的α-1抗胰蛋白酶的体内半衰期（t1/2）为大约15.2小时，Tmax为16.8小时，并且AUC（hr*μg/mL）值为113.1，并且重组α-1抗胰蛋白酶（T003）的体内半衰期（t1/2）为大约16.5小时，Tmax为20.8小时，AUC（hr*μg/mL）值为156.6小时。因此，在中国仓鼠卵巢细胞中制备的α-1抗胰蛋白酶显示出与血浆衍生的α-1抗胰蛋白酶类似的药代动力学曲线。相对于血浆衍生的α-1抗胰蛋白酶，重组α-1抗胰蛋白酶的半衰期（t1/2）和Tmax略有增加，并且AUC（hr*μg/mL）增加了大约40%。图4还揭示了α-1抗胰蛋白酶的同种型M2型（His101）和M3型（Arg101）在使用动物的药代动力学测试中，在实验误差范围内显示出类似的曲线。
另一方面，在中国仓鼠卵巢细胞中制备的α-1抗胰蛋白酶变体的药代动力学基于所添加的糖基化位点的不同表现出不同的曲线。
如图5所示，该图揭示了AT70N，AT178N，AT201N和AT212N的AUCINF_obs（hr*μg/mL）比在中国仓鼠卵巢细胞中制备的α-1抗胰蛋白酶（T003）的AUC INF_obs（hr*μg/mL）低大约50%至70%。然而，该图揭示了变体的体内半衰期相对于在中国仓鼠卵巢细胞中制备的野生型α-1抗胰蛋白酶的半衰期增加了大约15%至90%，这说明糖基化位点的加入对体内半衰期产生影响。另一方面，AT148T的AUC（hr*μg/mL）与在中国仓鼠卵巢细胞中制备的α-1抗胰蛋白酶的AUC类似，但是AT148T的体内半衰期为24.6小时，相对于重组α-1抗胰蛋白酶增加了大约50%。这说明AT148T的药代动力学由于糖基化位点的加入而得到改善。
如图5所示，该图揭示了AT26T的体内半衰期相对于在中国仓鼠卵巢细胞中制备的α-1抗胰蛋白酶（T003）的体内半衰期略有增加，但是AT26T的AUC（hr*μg/mL）仅为中国仓鼠卵巢细胞中制备的α-1抗胰蛋白酶（T003）的AUC的约17%，并且AT26T的体内清除率（CL/F;mL/hr/kg）比α-1抗胰蛋白酶（T003）的体内清除率高约6倍，这说明在第26位加入糖基化位点对药代动力学产生最坏的影响。
图6是皮下给药之后血浆衍生的α-1抗胰蛋白酶和重组α-1抗胰蛋白酶变体的药代动力学曲线。如图6所示，该图揭示了血浆衍生的α-1抗胰蛋白酶的体内半衰期（t1/2）大约为15.2小时，并且在α-1抗胰蛋白酶变体中，AT148T的体内半衰期为24.6小时，AT9N的体内半衰期为37.7小时，AT212N的体内半衰期为19.1小时，这说明α-1抗胰蛋白酶变体的药代动力学基于添加的糖基化位点的不同而显示出各种不同的曲线。
从上述结果可知，本发明确定了通过在α-1抗胰蛋白酶的环区域进行突变而进一步被糖基化的α-1抗胰蛋白酶变体（AT26T,AT148T,AT178N,AT201N和AT212N）的半衰期相对于没有被进一步糖基化的重组α-1抗胰蛋白酶略有增加，但是其他药代动力学曲线却比野生型重组α-1抗胰蛋白酶（T003）差得多。由此可知，这些在环区域糖基化的变体在临床上并不优于野生型α-1抗胰蛋白酶。
然而，可得知的是，在通过对重组α-1抗胰蛋白酶进行额外糖基化而得到的变体中，在N-末端的第9位添加糖基化位点的变体相对于在其他位置添加糖基化位点的变体具有显著改善的体内持续性，并且具有显著较低的体内清除率。因此，通过在α-1抗胰蛋白酶的N-末端肽结构中的第25位氨基酸残基的下游位置添加糖基化确定了药代动力学参数的改变。
图7显示了通过在α-1抗胰蛋白酶的N-末端的第4位、第9位和第12位添加糖基化位点获得的变体的药代动力学测试结果。如图7所示，该图显示当在第9位或第12位添加糖基化位点时，变体相对于在第4位添加糖基化位点的变体而言，具有非常好的体内半衰期或曲线下面积（AUC）。在X-射线晶体结构中没有观察到α-1抗胰蛋白酶的N-末端区域，因此，α-1抗胰蛋白酶的N-末端区域在溶液中具有无定形结构，并且自由移动。当所述N-末端区域被糖基化时，可推断出，流体力学体积的增加导致α-1抗胰蛋白酶体内半衰期的增加，并且这些变体在注射之后具有提高的体内生物利用度。
实验实施例2：血浆衍生的α-1抗胰蛋白酶、在中国仓鼠卵巢细胞中制备的α-1抗胰蛋白酶及其二聚体的药代动力学
为了确定根据本发明的在中国仓鼠卵巢细胞中制备的α-1抗胰蛋白酶二聚体的药代动力学，进行如下实验。将编码在α-1抗胰蛋白酶的第9位添加糖基化位点的蛋白质的序列平行连接，并克隆。随后，纯化在CHO细胞中表达的二聚体AT9N（M2）-AT9N（M2）和单体T003，并进行药代动力学测试。
如图8所示，该图显示AT9N（M2）-AT9N（M2）二聚体的体内半衰期为32.8小时，这为T003的体内半衰期（16.5小时）的两倍，并且AT9N（M2）-AT9N（M2）二聚体的AUC值也增加了两倍。该图还揭示了AT9N（M2）-AT9N（M2）二聚体的清除率值显著下降。通过这些结果可知，本发明确定了α-1抗胰蛋白酶变体单体和具有提高的体内稳定性的α-1抗胰蛋白酶变体二聚体能够用作药物。
实验实施例3：α-1抗胰蛋白酶及其变体对弹性蛋白酶活性的抑制作用
为了确定根据本发明的α-1抗胰蛋白酶及其变体对弹性蛋白酶活性的抑制作用，进行如下实验。
将猪胰腺弹性蛋白酶（Calbiochem,产品目录号：324682）和AAA-pNA（N-琥珀酰基-Ala-Ala-Ala-p-硝基苯胺，Sigma，S4760）分别用作酶和底物，以测试α-1抗胰蛋白酶及其变体的速率常数。更加具体而言，猪胰腺弹性蛋白酶和α-1抗胰蛋白酶及其变体以相同的摩尔比例混合，并在25℃下反应120秒、300秒和600秒。随后，将AAA-pNA加至得到的反应混合物中，并以1分钟为间隔测量动力学持续5分钟。在最后的反应中，猪胰腺弹性蛋白酶和α-1抗胰蛋白酶及其变体的浓度为20nM，AAA-pNA的浓度为1mM。
因为猪胰腺弹性蛋白酶与α-1抗胰蛋白酶及其变体的反应是不可逆的二级反应（Levenspiel O.Chemical reaction engineering,第二版.1972,Wiley,NewYork），所以速率常数通过如下方程计算：1/R=kaCE0t+1[R=剩余的PPE活性,ka=速率常数(M-1s-1),CE0=AAT的初始浓度(M),并且t=反应时间(秒)]。结合速率常数（ka）使用每一反应时间下剩余的猪胰腺弹性蛋白酶的活性来计算。结果在表2中列出。
α-1抗胰蛋白酶及其变体的平衡常数使用下列方程计算。结果在表3中列出。
Ka(M-1)=[EI]/[E]f/[I]f×109
[E]T=酶的初始浓度
[I]T=抑制剂的初始浓度
[E]f=[E]T×(A测试/A对照)
[EI]=[E]T–[E]f=[E]T×(1–A测试/A对照)
[I]f=[I]T–[EI]
A=t(测量时间)vs.吸光度的斜率
表2
| 弹性蛋白酶抑制剂 | 结合速率常数(ka(m-1s-1)) |
| 血浆α-1抗胰蛋白酶 | 5.4×105 |
| T003 | 6.5×105 |
| AT9N | 6.0×105 |
表3
| 弹性蛋白酶抑制剂 | 平衡常数(ka(M-1)) |
| 血浆α-1抗胰蛋白酶 | 2.60×109 |
| T003 | 3.56×109 |
| AT9N | 3.04×109 |
如表2和表3所列出的，观察到野生型人α-1抗胰蛋白酶（T003）和α-1抗胰蛋白酶变体AT9N的结合速率常数和平衡常数与血浆衍生的人α-1抗胰蛋白酶的结合速率常数和平衡常数基本类似。因此，本发明确定了α-1抗胰蛋白酶的N-末端糖基化对α-1抗胰蛋白酶的弹性蛋白酶抑制剂活性不产生影响。然而，当将AT148T和血浆衍生的α-1抗胰蛋白酶对弹性蛋白酶的抑制作用进行比较时，AT148T的结合亲和性为野生型α-1抗胰蛋白酶的结合亲和性的一半。由此可见，即使AT148T由于增加了糖基化作用而对体内半衰期产生影响，但是在α-1抗胰蛋白酶的第148位的糖基化作用对α-1抗胰蛋白酶与蛋白质水解酶（即，蛋白酶）的结合有负面影响。
诸如AT70N和AT178N之类的变体相对于野生型血浆衍生的α-1抗胰蛋白酶对弹性蛋白酶具有显著降低的结合亲和性。从这些事实可知，虽然糖基化作用能够影响体内药代动力学，但是当在α-1抗胰蛋白酶的特定位置添加糖基化位点时，选择不影响α-1抗胰蛋白酶活性的糖基化位置非常重要。
实验实施例4：对人生长激素/α-1抗胰蛋白酶变体融合物的药代动力学测试
为了确定根据本发明的人生长激素/α-1抗胰蛋白酶变体的融合蛋白的药代动力学，进行如下实验。Sprague-Dawley大鼠用作实验动物，并且将其分为给药人生长激素组（N=3）和给药融合蛋白组（N=5）。将实施例2中制备的人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合蛋白以每只大鼠720μg的剂量皮下注射于Sprague-Dawley大鼠，并将磷酸盐缓冲盐水用作稀释溶液。在0小时、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、24小时、30小时和48小时的时间点之后抽血，随后进行离心，得到血清。以每只大鼠200μg的剂量皮下注射作为对照的人生长激素（Scitropin(SciGen,Singapore)），并将磷酸盐缓冲盐水用作稀释溶液。在0小时、0.33小时、1小时、2小时、5小时、8小时、12小时、18小时、24小时、30小时和48小时的时间点之后，进行抽血，随后进行离心，得到血清。如下所述的，使用ELISA分析每个样品。用磷酸盐缓冲盐水将抗人生长激素的单克隆抗体（Medix Biochemica,Finland）稀释至浓度为1μg/mL至5μg/mL，并以100μL的量将其分配至96孔平板（Nunc,Denmark）的每个孔中。随后，使得到的溶液在室温下静置15小时至18小时。除去没有附着在孔板上的抗体，以250μL的量分配其中溶解有1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水，在室温下静置2小时，然后，用洗涤溶液（0.05%Tween20,磷酸盐缓冲盐水）洗涤3次以除去溶液。用其中溶解有1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水稀释样品，加至96孔平板中，并在室温下反应2小时。用洗涤溶液洗涤96孔平板5次，使用稀释剂溶液稀释使用sulfo-NHS-生物素（Pierce biotechnology,US）连接的抗人生长激素单克隆抗体-生物素偶联物，并以100μL的量分配至96孔平板的每个孔中。随后，96孔平板在室温下反应2小时，用洗涤溶液洗涤5次。随后，将链霉亲和素-HRP溶液加至96孔平板中，在室温下反应30分钟。用洗涤溶液洗涤96孔平板5次，将100μL3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）和过氧化氢的比色溶液加至每个孔中，并在黑暗处反应30分钟。将100μL1M的硫酸加至每个孔中以停止反应，并使用VersaMax酶标仪（Molecular Device,US）测量450nm的吸光度。在绘制标准参比材料的标准曲线之后通过回归分析计算每一样品的定量值。
根据本发明的人生长激素/α-1抗胰蛋白酶变体融合蛋白的药代动力学图如图9所示。
如图9所示，从该图中可见，根据本发明的人生长激素/α-1抗胰蛋白酶变体融合蛋白的血液半衰期（t1/2）大约为6小时，这是人生长激素的血液半衰期的4倍，这说明变体融合蛋白具有显著提高的体内稳定性。
实验实施例5：对粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合物的药代动力学测试
为了确定根据本发明的粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体的融合蛋白的药代动力学，进行如下实验。将Sprague-Dawley大鼠用作实验动物，并将其分为给药粒细胞集落刺激因子组（N=5）和给药融合蛋白组（N=3）。将实施例3中制备的粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合蛋白（pT603N）以每只大鼠340μg的剂量皮下注射于Sprague-Dawley大鼠，并将磷酸盐缓冲盐水（PBS）用作稀释溶液。在皮下注射之后0小时、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、24小时、36小时、48小时、60小时和72小时的时间点之后进行抽血，随后离心，获得血清。用磷酸盐缓冲盐水稀释粒细胞集落刺激因子（Grasin(Filgrastim)），并将其作为对照以每只大鼠100μg的剂量皮下注射于大鼠。在0小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、24小时、36小时和48小时的时间点之后，进行抽血，随后离心，得到血清。如下所述，使用ELISA分析每一样品。用磷酸盐缓冲盐水将抗粒细胞集落刺激因子的单克隆抗体（R&D Systems）稀释为1μg/mL至10μg/mL的浓度，并以100μL的量将其分配至96孔平板（Nunc,Denmark）的每个孔中。随后，将得到的溶液在室温下静置15小时至18小时。然后，除去未附着于孔板的抗体，并以250μL的量分配其中溶解有1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水，室温下静置2小时，然后，用洗涤溶液（0.05%Tween20,磷酸盐缓冲盐水）洗涤三次以除去溶液。用其中溶解有1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水稀释样品，加至96孔平板中，并在室温下反应2小时。用洗涤溶液洗涤96孔平板5次，用稀释剂溶液稀释抗-粒细胞集落刺激因子多克隆抗体-生物素偶联物（R&D Systems），并以100μL的量分配至96孔平板的每个孔中。随后，96-孔平板在室温下反应2小时，用洗涤溶液洗涤5次。然后，将链霉亲和素-HRP溶液加至96孔平板中，在室温下反应30分钟。用洗涤溶液洗涤96孔平板5次，并将100μL3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）和过氧化氢的比色溶液加至每个孔中，并在黑暗处反应30分钟。向每个孔中加入100μL1M硫酸以停止反应，并使用VersaMax酶标仪（Molecular Device,US）测量450nm的吸光度。在绘制标准参比材料的标准曲线之后通过回归分析计算每一样品的定量值。根据本发明的粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶变体融合蛋白的药代动力学图如图10所示。
如图10所示，本发明确定了根据本发明的粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合蛋白的血液半衰期（t1/2）大约为7.3小时，这是粒细胞集落刺激因子的血液半衰期（2.7小时）的大约3倍，并且AUC相对于粒细胞集落刺激因子的AUC显著增加至3倍或更多。从这些结果可知，当诸如生理活性蛋白之类的异质蛋白与α-1抗胰蛋白酶双变体连接时，异质蛋白的半衰期增加。
[工业实用性]
当根据本发明的通过在N-末端的第1位至第25位之间进行氨基酸突变而具有添加于其上的N-糖基化位点的α-1抗胰蛋白酶变体用于预防或治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏时，血液半衰期（t1/2）和血药浓度-时间曲线下面积（AUC）可显著增加，从而显示出非常好的体内稳定性，并且保留了对弹性蛋白酶活性的抑制作用。因此，根据本发明的α-1抗胰蛋白酶变体可用于治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏，并且当异质蛋白连接至α-1抗胰蛋白酶变体时，根据本发明的α-1抗胰蛋白酶变体在增加异质蛋白的体内半衰期方面有用。因此，根据本发明的α-1抗胰蛋白酶变体在预防或治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏方面有用。
已对本发明做了详细描述。然而，应当理解的是，说明本发明的优选实施方式的详细描述以及具体实施例仅仅是举例说明，对于本领域技术人员而言，显然可根据详细描述在本发明的实质和范围内对本发明作出各种改变和改良。
Claims (12)
1.一种α-1抗胰蛋白酶变体，该变体通过对α-1抗胰蛋白酶的N-末端的第1位至第25位之间的特定位点上的氨基酸进行取代以添加糖基化位点来制备。
2.如权利要求1所述的α-1抗胰蛋白酶变体，其中，所述α-1抗胰蛋白酶变体具有添加于其上的1个至3个糖基化位点。
3.如权利要求1所述的α-1抗胰蛋白酶变体，其中，所述特定位点存在于所述N-末端的第3位至第13位之间。
4.如权利要求1所述的α-1抗胰蛋白酶变体，其中，所述特定位点存在于所述N-末端的第9位或第12位。
5.如权利要求1所述的α-1抗胰蛋白酶变体，其中，所述特定位点存在于第4位和第9位、第4位和第12位或第9位和第12位。
6.一种制备α-1抗胰蛋白酶变体的方法，所述方法包括：
a）取代α-1抗胰蛋白酶的N-末端的第1位至第25位之间的特定位点上的氨基酸以添加糖基化位点；
b）在培养基中培养用其上添加有糖基化位点的α-1抗胰蛋白酶表达载体转化的细胞；
c）通过所述细胞表达α-1抗胰蛋白酶变体蛋白；以及
d）纯化并回收表达的α-1抗胰蛋白酶变体蛋白。
7.一种用于预防或治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏的组合物，所述组合物包含作为活性成分的α-1抗胰蛋白酶变体，其中，所述α-1抗胰蛋白酶变体通过取代α-1抗胰蛋白酶的N-末端的第1位至第25位之间的特定位点上的氨基酸以添加糖基化位点来制备。
8.如权利要求7所述的组合物，其中，所述α-1抗胰蛋白酶缺乏是慢性阻塞性肺病或肝硬化。
9.一种预防或治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏的方法，所述方法包括：
将治疗有效量的α-1抗胰蛋白酶变体给药于患者，其中，所述α-1抗胰蛋白酶变体通过取代α-1抗胰蛋白酶的N-末端的第1位至第25位之间的特定位点上的氨基酸以添加糖基化位点来制备。
10.一种具有增加的体内半衰期的α-1抗胰蛋白酶变体融合物，其中，所述融合物通过连接两个α-1抗胰蛋白酶变体来制备，每个α-1抗胰蛋白酶变体通过取代α-1抗胰蛋白酶的N-末端的第1位至第25位之间的特定位点上的氨基酸以添加糖基化位点来制备。
11.一种包含具有提高的体内半衰期的异质蛋白的α-1抗胰蛋白酶变体融合物，其中，所述融合物通过将α-1抗胰蛋白酶变体连接至所述异质蛋白来制备，并且，所述α-1抗胰蛋白酶变体通过取代α-1抗胰蛋白酶的N-末端的第1位至第25位之间的特定位点上的氨基酸以添加糖基化位点来制备。
12.如权利要求11所述的α-1抗胰蛋白酶变体融合物，其中，所述α-1抗胰蛋白酶变体在第357位具有氨基酸脯氨酸，该脯氨酸进一步被天冬酰胺取代，所述第357位为P2位置。
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