WO2013039295A1 - 신규한 알파-1 안티트립신 변이체, 이의 제조방법 및 용도 - Google Patents

신규한 알파-1 안티트립신 변이체, 이의 제조방법 및 용도 Download PDF

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정혜신
이상미
김지선
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Definitions

  • the present invention relates to novel alpha-1 antitrypsin variants, methods for their preparation and uses.
  • Alpha-1 antitrypsin is one of the proteins present in the blood of mammals with a molecular weight of about 50,000 Daltons consisting of 394 amino acids, and its concentration in blood is one of the main blood proteins of about 2 mg / mL ( Robin WC et. Al ., Nature, 298, 329-334, 1982), also called alpha-1 protease inhibitors.
  • Alpha-1 antitrypsin has more than 100 alleles in nature, and phenotypes are classified from A to Z according to the type of isoelectric focusing (IEF). Most of the M-type alleles are present in the blood of most people, with at least about 75 isoforms known to be present (Brantley, M. et. Al ., Am. J. Med., 84 (suppl. 6A). ), 13-31, 1988), the main function as a protease inhibitor is also maintained.
  • IEF isoelectric focusing
  • alpha-1 antitrypsin In general, about 90% of alpha-1 antitrypsin is known to have five PiM subtypes of M1, M2, M3, M4 and M5. Among them, M1 is about 67%, M2 is about 16%, and M3 is about 11% (Cox D. W. & Billingsley D. G., FEBS Lett., 231, 327-330, 1986). Among the M2 type, His exists at position 101 and Arg exists at position 101, and it is known that it does not affect the intrinsic activity of alpha-1 antitrypsin.
  • Alpha-1 antitrypsin has the structure of glycoproteins that are commonly glycosylated in three of the proteins (Mega, T. et. Al ., J. Biol. Chem., 255, 4057-4061, 1980), X According to the ray crystal structure, alpha-1 antitrypsin, like other protease inhibitors in the blood (Serpins), has three beta-sheets and eight alpha-helical structures. (Elliot PR, et. Al ., JMB, 275, 419-425, 1988).
  • Alpha-1 antitrypsin inhibits various types of proteolytic enzymes in the body, and the main function in vivo associated with currently known diseases is by inhibiting the activity of neutrophil elastase (Beatty et. Al ., J. Biol. Chem., 255, 3931-3934, 1980), deficiency of alpha-1 antitrypsin causes severe diseases such as emphysema, which results in decreased lung function due to the breakdown of elastin.
  • the modified protein of alpha-1 antitrypsin is not properly secreted by the liver, and the modified alpha-1 antitrypsin accumulates in the liver, resulting in cirrhosis.
  • Typical products include Tlastcris Prolastin, Baxter Aralast, and CSL Behring Zemaira, which are typically administered at 60 mg / kg intravenously at weekly intervals. Administered. Therefore, large amounts of 4-5 g of protein per week per adult should be administered to the patient for a long time.
  • Human alpha-1 antitrypsin is known to have three N-glycans due to glycosylation at a total of three sites (46 asparagine, 83 asparagine, and 247 asparagine).
  • Alpha-1 antitrypsin produced by microorganisms such as E. coli by genetic recombination method is not glycosylated, unlike human-derived alpha-1 antitrypsin, and has a short half-life when administered in vivo (Karnaukhova et. . al., Amino Acids, 30 , 317-332, 2006, Garver Jr. et. al., Proc.. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 1050-1054, 1987).
  • alpha-1 antitrypsin In order to overcome this problem and economically obtain a large amount of alpha-1 antitrypsin, studies have been conducted to express alpha-1 antitrypsin in plants. However, although plant-derived glycosylation occurred in recombinant alpha-1 antitrypsin expressed in plants, the half-life in the body was reported to be shorter than that of human alpha-1 antitrypsin (Huang et. Al. , Biotechnol. Prog., 17, 126-133, 2001).
  • Alpha-1 antitrypsin from animal cells is known to have a half-life in vivo similar to human alpha-1 antitrypsin (Garver Jr. et. Al ., Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 84, 1050-1054). , 1987). Therefore, it can be said that it is a preferable method to manufacture using animal cells similar in sugar structure to human alpha-1 antitrypsin.
  • a production method using animal cells has a disadvantage in that manufacturing costs are generally higher than that of producing alpha-1 antitrypsin using microorganisms.
  • the inventors have prepared alpha-1 antitrypsin variants by adding glycosylation to several specific sites of alpha-1 antitrypsin in order to construct clinically useful recombinant alpha-1 antitrypsin, and half-life in blood (t 1/2 ).
  • the area under the drug concentration-time curve (AUC) was significantly increased to identify the alpha-1 antitrypsin variant having excellent body stability and maintaining the inhibitory effect of elastase.
  • the present invention provides an alpha-1 antitrypsin variant wherein a glycosylation site is added by substituting an amino acid at a specific site between positions 1 to 25 of the N-terminus of alpha-1 antitrypsin.
  • the alpha-1 antitrypsin variant is characterized in that the addition of one to three glycosylation sites.
  • the specific site is characterized in that it is located between positions 3 to 13 of the N-terminus.
  • the specific site is characterized in that the 9 or 12 position of the N-terminal.
  • the specific site is characterized in that the position 4 and 9, or 4 and 12, or 9 and 12 of the N-terminal.
  • the present invention comprises the steps of adding a glycosylation site by substituting an amino acid at a specific site between positions 1 to 25 of the N-terminus of alpha-1 antitrypsin; Culturing the cells transfected with the alpha-1 antitrypsin variant expression vector to which the glycosylation site is added on a culture medium; Expressing alpha-1 antitrypsin variant protein from said cells; And it provides a method for producing an alpha-1 antitrypsin variant comprising the step of purifying and recovering the expressed alpha-1 antitrypsin variant protein.
  • the present invention is an alpha-1 antitrypsin mutant containing an amino acid at a specific site between the 1 and 25 positions of the N-terminal of alpha-1 antitrypsin to add a glycosylation site as an active ingredient, alpha -1
  • a composition for preventing or treating antitrypsin deficiency is provided.
  • the alpha-1 antitrypsin deficiency is characterized by chronic obstructive pulmonary disease or cirrhosis.
  • the present invention is administered to the patient in a therapeutically effective amount of the alpha-1 antitrypsin mutant having a glycosylation site added by replacing the amino acid at a specific site between the 1 and 25 positions of the alpha-1 antitrypsin
  • a method for preventing or treating alpha-1 antitrypsin deficiency is provided.
  • the present invention connects two alpha-1 antitrypsin variants in which a glycosylation site is added by substituting an amino acid at a specific site between positions 1 to 25 of the N-terminus of alpha-1 antitrypsin, and thus the half-life of the body is A fusion of increased alpha-1 antitrypsin variants.
  • the present invention is heterologous by connecting another heterologous protein to the alpha-1 antitrypsin variant in which the glycosylation site is added by substituting an amino acid at a specific site between positions 1 to 25 of the N-terminal of alpha-1 antitrypsin.
  • the glycosylation site is added by substituting an amino acid at a specific site between positions 1 to 25 of the N-terminal of alpha-1 antitrypsin.
  • the alpha-1 antitrypsin variant is further characterized in that the proline, which is the 357th amino acid at the P2 position, is substituted with asparagine.
  • Alpha-1 antitrypsin variant according to the present invention adds an N-glycosylation site through amino acid variation between positions 1 to 25 at the N-terminus, thereby reducing blood half-life (t 1/2 ) and drug concentration-time curve
  • the lower area (AUC) is significantly increased, so the stability in the body is excellent, and the effect of inhibiting elastase activity is maintained. Therefore, the alpha-1 antitrypsin variant of the present invention can be usefully used for the prevention or treatment of alpha-1 antitrypsin deficiency. It can also be used to increase the half-life of the heterologous protein by binding the heterologous protein to the alpha-1 antitrypsin variant according to the present invention.
  • 1 is a schematic diagram of the alpha-1 antitrypsin vector (pT003) of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing the sequence and position of the alpha-1 antitrypsin variant of the present invention.
  • Figure 3 is a diagram showing the SDS-PAGE results of the purified alpha-1 antitrypsin and variants thereof of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing a subcutaneous administration pharmacokinetic graph of plasma-derived alpha-1 antitrypsin and recombinant alpha-1 antitrypsin expressed in animal cells of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing a subcutaneous administration pharmacokinetic graph of alpha-1 antitrypsin and variants thereof of the present invention.
  • Figure 6 is a diagram showing the subcutaneous administration pharmacokinetics graph of plasma-derived alpha-1 antitrypsin, recombinant alpha-1 antitrypsin variants.
  • Figure 7 is a diagram showing the subcutaneous and intravenous administration pharmacokinetic graph of the alpha-1 antitrypsin variants of the present invention.
  • FIG. 8 is a graph showing intravenous pharmacokinetic graphs of alpha-1 antitrypsin and dimer of the present invention.
  • FIG. 9 is a diagram showing a subcutaneous administration pharmacokinetic graph of the fusion of the phosphorus growth hormone / alpha-1 antitrypsin variant of the present invention.
  • FIG. 10 is a diagram showing a subcutaneous administration pharmacokinetic graph of the granulocyte stimulator / alpha-1 antitrypsin variant fusion of the present invention.
  • the present invention provides an alpha-1 antitrypsin variant in which a glycosylation site is added by substituting an amino acid at a specific site between positions 1 to 25 of the N-terminus of alpha-1 antitrypsin.
  • Alpha-1 antitrypsin variants according to the present invention are located between positions 1 to 25 at the N-terminus in addition to the three glycosylation sites of alpha-1 antitrypsin (46 asparagine, 83 asparagine, 247 asparagine)
  • the N-glycosylation site is added by substituting amino acids at specific sites.
  • an N-glycosylation site to a specific site of the N-terminal of the human alpha-1 antitrypsin may include the Asn-X-Thr, which is an N-glycan attachment site sequence between positions 1 to 25 of the N-terminal Create / Ser.
  • the glycosylation site is substituted by asparagine with glutamine, an amino acid at positions 3 to 13 of the N-terminus of human alpha-1 antitrypsin, most preferably at positions 9 or 12 of the N-terminus.
  • Add The variant by glycosylation may obtain a structure in which sugars are simultaneously added to positions 4 and 9, 4 and 12, or 9 and 12, and the N-terminus in addition to the specific region described in this embodiment. It may also include additional glycosylation at other sites within 25 of.
  • the present invention is to replace the amino acid at a specific site between the position 1 to 25 of the N- terminal of alpha-1 antitrypsin to add a glycosylation site, the alpha-1 antitrypsin to which the glycosylation site is added Culturing the cells transfected with the variant expression vector on a culture medium, expressing the alpha-1 antitrypsin variant protein from the culture medium; And it provides a method for producing an alpha-1 antitrypsin variant comprising the step of purifying and recovering the expressed alpha-1 antitrypsin variant protein.
  • N-glycosylation site uses genetic recombination technology, and the N-glycosylation site may be added by substitution, insertion and removal of amino acids through genetic engineering.
  • N-terminal about 20 amino acids of the human alpha-1 antitrypsin are poorly detected in the X-ray crystal structure of alpha-1 antitrypsin (PDB code: 1QLP, 2QUG, 3CWL, 1PSI, 7API, 1KCT ( www.pdb.org )) has a tertiary structure that is not very flexible.
  • Alpha-1 antitrypsin variants according to the invention can be prepared by mutating one or more amino acids using a site-directed mutagenesis method. For example, in human alpha-1 antitrypsin, when glutamine at position 9 is replaced with asparagine or glycine at position 148 with asparagine and expressed in animal cells, glycosylation sites are generated in the substituted asparagine. Alternatively, replacing 148 glycine with threonine creates a new glycosylation site in 146 asparagine. In this way, glycosylation sites can be added at a wide variety of positions of alpha-1 antitrypsin.
  • the N-terminal 1 which does not show a structure in the X-ray crystal structure of A1AT Alpha-1 antitrypsin variants were prepared by adding N-glycosylation sites through substitution of amino acids at specific sites between positions 25 and 25, which were then expressed in Chinese Hamster Ovary cells and chromatographed. Obtained by high purity using the method.
  • the alpha-1 antitrypsin variant to which the purified N-glycosylation site was added shows a staining band at a relatively high position in the SDS-PAGE test compared to wild type alpha-1 antitrypsin. It is judged that the molecular weight rose due to glycation.
  • the purified alpha-1 antitrypsin variant has an excellent stability in the body by significantly increasing the area under the curve (AUC) value and half-life (t 1/2 ) in the blood.
  • AUC area under the curve
  • t 1/2 half-life
  • the persistence in the body was not improved by the addition of the N-glycosylation site, and the loop region described in WO 2008/151845 A, loop B, loop C, loop D, loop E) or alpha-1 antitrypsin mutant with a glycosylation site in the vicinity did not have a significant effect on improving the sustainability.
  • glycosylation of the loop region may affect the activity of alpha-1 antitrypsin, which has a unique function as a protease, and thus the selection of glycosylation sites that do not affect the activity of alpha-1 antitrypsin. very important.
  • the purified alpha-1 antitrypsin variant was confirmed to maintain the inhibitory effect of elastase activity.
  • the binding rate constant of human alpha-1 antitrypsin is generally 1.0 ⁇ 0.2 ⁇ 10 5 (Boudier C., 1994) to 1.67 ⁇ 10 6 M ⁇ 1 s ⁇ 1 (Terashima M, et. Al. , Appl. Microbiol.Biotechnol., 52 (4), 516-523, 1999), wherein the binding rate constants and equilibrium constants of the wild-type human alpha-1 antitrypsin of the present invention and variants thereof are similar.
  • glycosylation of the N-terminal region of alpha-1 antitrypsin does not affect the inhibition of elastase activity of alpha-1 antitrypsin.
  • the present invention also provides a fusion of alpha-1 antitrypsin variants with increased half-life in the body by linking the two alpha-1 antitrypsin variants.
  • the present inventors prepared an alpha-1 antitrypsin double variant in which proline, which is the 357th amino acid of the P2 position of the alpha-1 antitrypsin variant, was further substituted with asparagine, and a fusion conjugated with the granulocyte stimulating factor was prepared.
  • proline which is the 357th amino acid of the P2 position of the alpha-1 antitrypsin variant
  • asparagine asparagine
  • the present invention provides a fusion of alpha-1 antitrypsin variants with increased half-life of the heterologous proteins by linking other heterologous proteins to the alpha-1 antitrypsin variants.
  • the heterologous protein is preferably a bioactive peptide or a bioactive protein.
  • the purified alpha-1 antitrypsin variant can be linked to two or more to prepare a fusion of alpha-1 antitrypsin variant with increased half-life in the body.
  • Sytkowski, AJ, et al. Found that erythrocyte growth factor (EPO) was transformed into a fusion protein of EPO-EPO using an appropriate linker, resulting in significantly increased activity and an increase in body half-life than EPO monomers.
  • EPO erythrocyte growth factor
  • alpha-1 antitrypsin variants of the present invention when two or more alpha-1 antitrypsin variants of the present invention are linked, it is expected that the half-life of the body will be increased compared to the monomer of the alpha-1 antitrypsin variant. Furthermore, when the alpha-1 antitrypsin variant of the present invention is linked to a biologically active peptide, an immunomodulator, a cytokine, etc. having a short half-life in the body, the half-life in the body is significantly increased, and thus, it is expected to exhibit a long-lasting effect.
  • the present invention also provides a composition for the prevention or treatment of alpha-1 antitrypsin deficiency containing the alpha-1 antitrypsin variant as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method of preventing or treating alpha-1 antitrypsin deficiency by administering to the patient a therapeutically effective amount of alpha-1 antitrypsin variant.
  • the alpha-1 antitrypsin variant according to the present invention adds an N-glycosylation site through amino acid variation between positions 1 to 25 at the N-terminus, thereby reducing blood half-life (t1 / 2) and The area under the drug concentration-time curve (AUC) is significantly increased, so that the stability in the body is excellent and the inhibitory effect of elastase activity is maintained. Therefore, the alpha-1 antitrypsin variant of the present invention can be usefully used for the prevention or treatment of alpha-1 antitrypsin deficiency.
  • the alpha-1 antitrypsin deficiency includes chronic obstructive pulmonary disease (COPD) or cirrhosis, and preferably includes but is not limited to emphysema.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • cirrhosis preferably includes but is not limited to emphysema.
  • composition of the present invention may contain one or more known active ingredients having a prophylactic or therapeutic effect of alpha-1 antitrypsin deficiency together with alpha-1 antitrypsin variant.
  • composition of the present invention can be prepared by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above-described active ingredients for administration.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may be used in combination with saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components, if necessary, antioxidants, buffers And other conventional additives such as bacteriostatic agents can be added.
  • Diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may also be added in addition to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • it may be preferably formulated according to each disease or component by a suitable method in the art or using a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, Easton PA.
  • composition of the present invention may be administered orally or parenterally (eg, applied intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, inhaled or topically) according to the desired method, or the alpha-1 antitrypsin variant according to the present invention. It can be used for Gene Therapy. Dosage varies depending on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, rate of excretion and severity of the patient.
  • the weekly dose of the alpha-1 antitrypsin variant is equivalent to less than 60 mg / kg of the alpha-1 antitrypsin dose, or equivalent dose, or the same dose as the wild type alpha-1 antitrypsin dose. If used, it is expected that the same clinical efficacy will be achieved even with longer administration periods.
  • composition of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, hormone therapy, drug treatment and biological response modifiers for the prevention or treatment of alpha-1 antitrypsin deficiency.
  • the expression vector cloning required for the present invention used pSGHV0 (GenBank Accession No. AF285183), which is a parent vector, and used a pAV1 vector that was improved and developed for use in industry.
  • the parental vector expresses a human-derived protein using a bacterium such as E. coli, the protein is overexpressed in the cell, but most of them are not active. Because it has the properties to make, it is a research vector produced for the purpose of easily purifying the protein with physiological activity.
  • the one of the biggest advantages of pSGHV0 vector, which has high expression level has been modified to be used in industry to use in production.
  • an alpha-1 antitrypsin vector (pT003) was prepared by cloning an alpha-1 antitrypsin (M3) gene with hMU001448 (KRIBB) into a pAV1 vector.
  • M3 alpha-1 antitrypsin
  • KRIBB alpha-1 antitrypsin
  • two primers XhoAT forward primer (5'-CCC TCC TCG AGA ATG CCG TCT TCT GTC TCG-3 ', SEQ ID NO: 1) and ATNot reverse primer (5'-GGG) were used as templates for hMU001448 (KRIBB).
  • PCR was amplified using CCC GCG GCC GCA GTT ATT TTT GGG TGG G-3 ', SEQ ID NO: 2).
  • the amplified nucleotides were cleaved with two restriction enzymes, XhoI and NotI, present at the ends, and conjugated with an expression vector pAV1 having an XhoI / NotI cleavage to prepare an alpha-1 antitrypsin vector (pT003, SEQ ID NO: 39).
  • pT003 A schematic diagram of the alpha-1 antitrypsin vector (pT003) is shown in FIG. 1.
  • alpha-1 antitrypsin variants In order to prepare several alpha-1 antitrypsin variants to which glycosylation sites were added, each of the two forward primers described in Table 1 using the alpha-1 antitrypsin vector (pT003) prepared in Example 1-2 as a template Alpha-1 antitrypsin variants were prepared using reverse primers and variant generation kit (Enzynomix, EZchangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit). The sequence and position of the alpha-1 antitrypsin variant are shown in FIG. 2.
  • an alpha-1 antitrypsin gene with pEAT8 (encoding a1-AT (M2) cDNA) as a template was cloned into a pAV1 vector to prepare an alpha-1 antitrypsin vector (pT006).
  • XhoAT forward primers (5'-CCC TCC TCG AGA ATG CCG TCT TCT GTC TCG-3 ', SEQ ID NO: 1) and ATNot using pEAT8 (encoding a1-AT (M2) cDNA) as a template PCR was amplified using reverse primers (5′-GGG CCC GCG GCC GCA GTT ATT TTT GGG TGG G-3 ′, SEQ ID NO: 2).
  • the amplified nucleotides were cleaved with two restriction enzymes, XhoI and NotI, present at the ends, and conjugated with an expression vector pAV1 having an XhoI / NotI cleavage to prepare an alpha-1 antitrypsin vector (pT006, SEQ ID NO: 40). .
  • alpha-1 antitrypsin (M2) variant to which the glycosylation site was added, the following two primers were prepared using the alpha-1 antitrypsin vector (pT006) prepared in Example 1-4 as a template.
  • Alpha-1 antitrypsin (M2) variant vector (AT9N (M2)) was prepared using a variant generation kit (Enzynomix, EZchangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit) using 5) and a reverse primer (SEQ ID NO: 6).
  • SEQ ID NO: 42 The amino acid sequence of the prepared alpha-1 antitrypsin variant is shown in SEQ ID NO: 42.
  • alpha-1 antitrypsin variants used pAT9N (subtype M2).
  • XhoAT forward primer 2 5'-GGG CCC CTC GAG GCC ACC ATG CCG TCT TCT GTC TCG TGG GGC ATC CTC CTG CTG GCA GGC CTG TGC TGC
  • M2 pAT9N
  • ATBam reverse primer 2 (5'-GGG GGG ATC CTC TTT TTG GGT GGG ATT CAC -3', SEQ ID NO: 32) Amplification by PCR.
  • the amplified nucleotide was cleaved with two restriction enzymes, XhoI and BamHI, present at the terminal, and conjugated with an expression vector pAT9N (M2) having an XhoI / BamHI cleavage region to produce an alpha-1 antitrypsin duplex vector (pAT9N (M2)).
  • pAT9N (M2) was prepared.
  • alpha-1 antitrypsin T003, T006
  • CHO-K1 Chinese hamster ovary cells
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • the expression vectors of the variants and duplexes thereof were mixed and maintained at room temperature for 1 minute, followed by mixing with 20 ⁇ g of PEI (Polyethylenimine, linear, Polysciences Inc. (Cat. No: 23966, MW ⁇ 25,000)). It was left at room temperature for 15 minutes. At this time, cells cultured one day ago were washed with PBS, and 6 mL of DMEM was added thereto. After 10 to 15 minutes, each of the expression vectors of alpha-1 antitrypsin and its variants and duplexes which were left at room temperature was added to the culture dish. The next day, washed with PBS and the protein expression was confirmed by the addition of IMBS (Cat. No 12200-028, Gibco, Iscove's Modified Dulbecco's Medium) medium without FBS.
  • IMBS Cat. No 12200-028, Gibco, Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • Alpha-1 antitrypsin expressed in Example 1-7 and its variants and duplexes were purified as follows. Specifically, in order to purify the alpha-1 antitrypsin and its variants and duplexes secreted into the cell culture, the culture medium is centrifuged to remove the cells, and then only the supernatant is taken and the cell supernatant is equilibrated with a buffer solution (20 mM sodium phosphate, pH 8.0). Dilution).
  • the cell supernatant diluted with the equilibration buffer was injected into the Q-Sepharose (GE Healthcare, USA) column equilibrated with the equilibration buffer, washed well with the equilibration buffer, and the concentration of sodium chloride was increased (0 to 400 mM NaCl). , 20 mM sodium phosphate, pH 8.0) to elute the protein.
  • the eluted protein is injected into an Alpha-1 Antitrypsin Select (GE Healthcare, USA) column equilibrated with equilibration buffer (Tris 50 mM, sodium chloride 0.15M, pH 7.5), washed thoroughly with equilibration buffer and the concentration of MgCl 2 increased. Protein was eluted.
  • Alpha-1 antitrypsin variant was used as pAT9N (subtype M2) to prepare a fusion of phosphorus growth hormone / alpha-1 antitrypsin variant (AT9N).
  • XhoGH forward primer (5'-GGG CCC CTC GAG GCC ACC ATG GCT ACA GGC TCC CGG-3 ', SEQ ID NO: 33) were used as a template for phosphorus growth hormone gene (IOH45734 (invitrogen)).
  • GHBam reverse primer 5'-GGG GGG ATC CTC GAA GCC ACA GCT GCC CTC-3 ', SEQ ID NO: 34).
  • the amplified nucleotides were cleaved with two restriction enzymes, XhoI and BamHI, and conjugated with an expression vector pAT9N (M2) having an XhoI / BamHI cleavage chain to form a phosphorus growth hormone / alpha-1 antitrypsin variant fusion vector ( phGH-AT9N (M2), SEQ ID NO: 43) was prepared.
  • alpha-1 antitrypsin variant (AT9N) vector prepared in the same manner as in Example 1-5, the following two primers forward primers (5'-CCA TGT TTT TAG AGG CCA TAA ACA TGT CTA TCC CCC CC-3) ', SEQ ID NO: 35) and reverse primer (5'-GGG GGG GAT AGA CAT GTT TAT GGC CTC TAA AAA CAT GG-3', SEQ ID NO: 36) and variant generation kit (Enzynomix, EZchangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit) Glutamin at position 9 at alpha-1 antitrypsin N-terminus is replaced with asparagine, and proline at position 357 is replaced with asparagine.
  • Vector pT004N (Q9N, P357N) containing variants was prepared.
  • the amino acid sequence of the prepared alpha-1 antitrypsin bivariate is shown in SEQ ID NO: 44.
  • pT004N (Q9N, P357N) comprising alpha-1 antitrypsin bivariate prepared by the method of Example 3-1 was used.
  • XhoCSF forward primer (5'-GGG CCC CTC GAG ATG GCT GGA CCT GCC ACC-3), were prepared using granulocyte colony stimulating factor (IHS1380-97652343 (Open biosystems)) as a template.
  • CSFBam reverse primers (5'-GGG GGG ATC CTC GGG CTG GGC AAG GTG GCG-3', SEQ ID NO: 38) were amplified by PCR.
  • the amplified nucleotides were cleaved with two restriction enzymes, XhoI and BamHI, and conjugated with an expression vector pT004N having an XhoI / BamHI cleavage to obtain granulocyte stimulator / alpha-1 antitrypsin bivariate fusion vector (pT603N, SEQ ID NO: 45) was prepared. Then, using the prepared vector (pT603N) was expressed and purified granulocyte stimulator / alpha-1 antitrypsin bivariate in the same manner as in Examples 1-7 and 1-8.
  • Sprague-Dawley male rats were used as experimental animals, and 3 to 5 animals were allocated to each experimental group.
  • Sprague-Dawley rats in each group were injected subcutaneously or intravenously with plasma-derived human alpha-1 antitrypsin (Calbiochem, USA), recombinant alpha-1 antitrypsin and variants thereof at a dose of 445 ⁇ g per kg rat, respectively.
  • Phosphate buffer solution was used. After administration, blood was collected by centrifugation and serum was obtained. Serum obtained at each blood collection time was stored frozen until analysis, and blood concentrations of alpha-1 antitrypsin and its variants were measured using enzyme immunoassay. Enzyme immunoassay was performed in two ways. The first method is as follows.
  • Monoclonal antibodies against human alpha-1 antitrypsin (Medix Biochemica, Finland) were coated onto plates (Nunc, Denmark) and treated with phosphate buffer in which 1% bovine serum albumin was dissolved. The samples were diluted with phosphate buffer containing 1% bovine serum albumin, and alpha-1 antitrypsin monoclonal antibody-biotin conjugate and streptavidin conjugated using sulfo-NHS-biotin (Pierce biotechnology, USA). Alpha-1 antitrypsin was detected using -HRP. The color reaction was performed using TMB (3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine) and hydrogen peroxide coloring solution.
  • TMB 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine
  • the second method was a monoclonal antibody against human alpha-1 antitrypsin (Medix Biochemica, Finland) coated on a plate (Nunc, Denmark) and treated with phosphate buffer in 1% bovine serum albumin. Samples were diluted with phosphate buffer containing 1% bovine serum albumin, and alpha-1 antitrypsin using alpha-1 antitrypsin polyclonal antibody-biotin conjugate (Abcam, UK) and streptavidin-HRP. Detected.
  • the color reaction was performed using TMB (3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine) and hydrogen peroxide coloring solution. After adding sulfuric acid to each well to terminate the reaction, 450nm with a microplate reader (Molecular Device, USA). Absorbance was measured at. Plates were washed with wash solution (0.05% Tween 20, phosphate buffer) at each stage. Quantitative values of each sample were obtained by regression analysis after preparing a standard curve for the standard.
  • Subcutaneous administration pharmacokinetic graphs and intravenous administration pharmacokinetic graphs of alpha-1 antitrypsin derived from plasma-derived alpha-1 antitrypsin and Chinese hamster ovary cells and variants thereof are shown in FIGS. 4, 5, 6 and 7, respectively. .
  • plasma-derived alpha-1 antitrypsin, recombinant alpha-1 antitrypsin and its variants showed various pharmacokinetics upon subcutaneous administration.
  • the plasma-derived alpha-1 antitrypsin showed a half-life (t 1/2 ) in the body of about 15.2 hours, a Tmax of 16.8 hours, and an AUC (hr * ⁇ g / mL) value of 113.1.
  • 1 Antitrypsin (T003) had a half-life (t 1/2 ) of about 16.5 hours, a Tmax of 20.8 hours, and an AUC (hr * ⁇ g / mL) value of 156.6 hours.
  • alpha-1 antitrypsin prepared from Chinese hamster ovary cells was not significantly different from plasma-derived alpha-1 antitrypsin, and recombinant alpha-1 antitrypsin had a half-life (t 1 / t) compared to plasma-derived alpha-1 antitrypsin. 2 ) and Tmax were slightly longer, and AUC (hr * ⁇ g / mL) was increased by about 40%.
  • M2 type (His101) and M3 type (Arg101), which are isoforms of alpha-1 antitrypsin showed no difference within the test error range in animal pharmacokinetic tests.
  • variants of alpha-1 antitrypsin prepared in Chinese hamster ovary cells showed various pharmacokinetic patterns depending on the glycosylation site added.
  • AT70N, AT178N, AT201N, and AT212N showed AUCINF_obs (hr * ⁇ g / mL) as low as about 50-70% of alpha-1 antitrypsin (T003) prepared in Chinese hamster ovary cells.
  • alpha-1 antitrypsin T003
  • the variants were about 15-90% longer than wild-type alpha-1 antitrypsin prepared in Chinese hamster ovary cells, indicating that the addition of glycosylation site influenced the half-life of the body.
  • AUC (hr * ⁇ g / mL) was similar to that of alpha-1 antitrypsin prepared in Chinese hamster ovary cells, but the half-life of the body increased by about 50% to 24.6 hours. This indicates that the pharmacokinetic pattern was improved by adding the glycosylation site of AT148T.
  • the half-life of AT26T is slightly longer than alpha-1 antitrypsin (T003) prepared in Chinese hamster ovary cells, whereas AUC (hr * ⁇ g / mL) is alpha-1 antitrypsin prepared in Chinese hamster ovary cells. It is only about 17% of (T003), and the excretion rate (CL / F; mL / hr / kg) is about 6 times higher, so adding the glycosylation site at position 26 is the worst in terms of pharmacokinetics. Indicated.
  • FIG. 6 shows pharmacokinetic graphs upon subcutaneous administration of plasma-derived alpha-1 antitrypsin and recombinant alpha-1 antitrypsin variants.
  • Plasma-derived alpha-1 antitrypsin had a half-life (t 1/2 ) of about 15.2 hours
  • AT148T had a half-life of 24.6 hours
  • AT9N of 37.7 hours
  • AT212N of 19.1 hours.
  • Various aspects were shown depending on the added glycosylation site.
  • alpha-1 antitrypsin mutants (AT26T, AT148T, AT178N, AT201N, AT212N), in which the loop region of alpha-1 antitrypsin was mutated for additional glycosylation, did not further glycosylate. Although there was a slight increase in half-life compared to -1 antitrypsin, other pharmacokinetics showed inferior results than wild type recombinant alpha-1 antitrypsin (T003), which resulted in clinically wild type alpha- 1 There is no superiority to antitrypsin.
  • glycosylation site at the N-terminus 9 of the variants further glycosylated with recombinant alpha-1 antitrypsin significantly improves body persistence as well as significantly lowers body excretion compared to other sugar-added variants. Able to know. Therefore, we examined whether pharmacokinetic parameters change when sugar is added at the position below amino acid 25 of the N-terminal peptide structure of alpha-1 antitrypsin.
  • FIG. 7 shows the results of pharmacokinetic experiments of variants glycosylated at the N-terminal 4, 9 and 12 positions of alpha-1 antitrypsin.
  • AUC area under the curve
  • Association rate constant (ka) was calculated using the activity of porcine pancreatic elastase remaining at each reaction time, and the results are shown in Table 2.
  • Ka (M -1 ) [EI] / [E] f / [I] f ⁇ 10 9
  • the binding rate constants and equilibrium constants of wild type human alpha-1 antitrypsin (T003) and the variant of alpha-1 antitrypsin AT9N are the binding rate constants of plasma-derived human alpha-1 antitrypsin. And values similar to the equilibrium constants.
  • T003 and the variant of alpha-1 antitrypsin AT9N are the binding rate constants of plasma-derived human alpha-1 antitrypsin.
  • AT148T affects the half-life of the body due to the addition of glycosylation
  • sugar added at position 148 of alpha-1 antitrypsin affects the binding of alpha-1 antitrypsin and proteolytic enzyme. It can be seen that.
  • Variants such as AT70N and AT178N also showed significantly lower binding capacity than wild-type plasma-derived alpha-1 antitrypsin in binding to elastase. This suggests that adding glycosylation at specific positions of alpha-1 antitrypsin may affect the pharmacokinetics of the body, but selection of glycosylation sites that do not affect the activity of alpha-1 antitrypsin is very important.
  • Sprague-Dawley rats were used as experimental animals, and three mice were assigned to the phosphorus growth hormone administration group and five to the fusion administration group.
  • Sprague-Dawley rats were injected subcutaneously with a phosphorus growth hormone / alpha-1 antitrypsin fusion prepared in Example 2 at a dose of 720 ⁇ g per kg of rat, respectively, and dilutions were used with phosphate buffer solution, 0, 1, 2 , 4, 8, 12, 16, 24, 30, 48 hours after the blood was collected to obtain a serum after centrifugation.
  • Scitropin (SciGen, Singapore), a phosphorus growth hormone, was injected subcutaneously at a dose of 200 ⁇ g / kg, and a diluent was used as a phosphate buffer solution, and 0, 0.33, 1, 2, 5, 8, 12, 18 After 24, 30 and 48 hours, blood was collected and centrifuged to obtain serum. Each sample was analyzed using the following enzyme immunoassay method. Monoclonal antibodies against phosphorus growth hormone (Medix Biochemica, Finland) were diluted in phosphate buffer at a concentration of 1-5 ⁇ g / mL, and 100 ⁇ L was dispensed into 96-well plates (Nunc, Denmark) for 15-18 hours at room temperature. It was left.
  • phosphate buffer solution in which 1% bovine serum albumin was dissolved was dispensed and left at room temperature for 2 hours, and washed three times with a washing solution (0.05% Tween 20, phosphate buffer solution). The solution was then removed. Samples were diluted with phosphate buffer solution in which 1% bovine serum albumin was dissolved, and added to a 96-well plate and reacted at room temperature for 2 hours.
  • the phosphorus growth hormone monoclonal antibody-biotin conjugate conjugated using sulfo-NHS-biotin (Pierce biotechnology, USA) was diluted in diluent solution and 100 ⁇ L was dispensed into the 96-well plate. . Subsequently, the plate was allowed to react at room temperature for 2 hours, and then washed 5 times with a washing solution, and then streptavidin-HRP solution was added and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • TMB 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine
  • hydrogen peroxide coloring solution was added to each well and allowed to react in the dark for 30 minutes.
  • 100 ⁇ L of 1 M sulfuric acid was added to each well to terminate the reaction, and the absorbance was measured at 450 nm with a VersaMax microplate reader (Molecular Device, USA). Quantitative values of each sample were obtained by regression analysis after preparing a standard curve for the standard.
  • the pharmacokinetic graph of the fusion of phosphorus growth hormone / alpha-1 antitrypsin variant according to the present invention is shown in FIG. 9.
  • the blood half-life (t 1/2 ) of the fusion of the phosphorus growth hormone / alpha-1 antitrypsin variant of the present invention is about 6 hours, which is 4 times higher than that of the phosphorus growth hormone. It was confirmed that it has.
  • Sprague-Dawley rats were used as experimental animals. Five mice were assigned to the granulocyte stimulator-administered group and three mice to the fusion-administered group. Sprague-Dawley rats were injected subcutaneously with granulocyte stimulating factor / alpha-1 antitrypsin bivariate fusion (pT603N) prepared by the method of Example 3 at a dose of 340 ⁇ g / kg of rat, respectively, and as a diluent phosphate buffer solution (phosphate).
  • pT603N granulocyte stimulating factor / alpha-1 antitrypsin bivariate fusion
  • PBS buffered saline
  • granulocyte stimulator Grasine Grasin, Filgrastim
  • ELISA enzyme immunoassay method
  • Monoclonal antibodies against granulocyte stimulating factors were diluted in a phosphate buffer solution at a concentration of 1-10 ⁇ g / mL, and 100 ⁇ L were dispensed into 96-well plates (Nunc, Denmark) and left at room temperature for 15-18 hours. Then, after removing the remaining antibody that is not attached to the well plate, disperse 250 ⁇ L of phosphate buffer solution in which 1% bovine serum albumin is dissolved, and leave it at room temperature for 2 hours and wash it with washing solution (0.05% Tween 20, phosphate buffer solution) three times. The solution was then removed.
  • Samples were diluted with phosphate buffer solution in which 1% bovine serum albumin was dissolved, and added to a 96-well plate and reacted at room temperature for 2 hours. After washing the 96 well plate five times with the washing solution, the granulocyte stimulator polyclonal antibody-biotin conjugate (R & D systems) was diluted in the diluent solution and 100 ⁇ L was dispensed into the 96 well plate. Subsequently, the plate was allowed to react at room temperature for 2 hours, and then washed 5 times with a washing solution. Streptavidin-HRP solution was added thereto for 30 minutes at room temperature, followed by washing 5 times with washing solution and TMB (3,3 ', 5,5).
  • phosphate buffer solution in which 1% bovine serum albumin was dissolved
  • the blood half-life (t 1/2 ) of the granulocyte stimulator / alpha-1 antitrypsin bivariate fusion of the present invention is about 7.3 hours, which is about 3 times higher than that of 2.7 hours of granulocyte stimulator, and AUC is It was confirmed that the body stability was significantly increased more than three times. Through the above results, it was confirmed that the binding of heterologous proteins such as bioactive proteins to the alpha-1 antitrypsin double variant can increase the half-life of the heterologous protein.
  • the alpha-1 antitrypsin variant in which the N-glycosylation site is added through amino acid mutations between the 1 and 25 positions of the N-terminus of the present invention, is used for the prevention or treatment of alpha-1 antitrypsin deficiency
  • the half-life (t 1/2 ) and the area under the drug concentration-time curve (AUC) are significantly increased, so that the stability in the body is excellent and the inhibitory effect of elastase activity is maintained. Therefore, the use of the alpha-1 antitrypsin variant according to the present invention can be used for alpha-1 antitrypsin deficiency, and can be used to bind the heterologous protein to the alpha-1 antitrypsin variant to increase the half-life of the heterologous protein. It can be usefully used as a therapeutic agent.
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Abstract

본 발명은 신규한 알파-1 안티트립신 변이체, 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 알파-1 안티트립신 변이체는 N-말단의 1번 위치에서 25번 위치 사이의 아미노산 변이를 통해 동물세포에서 N-당화 부위를 추가시킴으로써, 혈중 반감기 (t1/2)와 약물농도-시간 곡선하 면적(AUC)이 현저히 증가하여 체내 안정성이 우수하고, 엘라스타제 활성 억제 효과가 유지된다. 따라서, 본 발명의 알파-1 안티트립신 변이체는 알파-1 안티트립신 결핍증의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 알파-1 안티트립신 변이체, 이의 제조방법 및 용도
본 발명은 신규한 알파-1 안티트립신 변이체, 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
알파-1 안티트립신(alpha-1 antitrypsin)은 394개의 아미노산으로 구성된 분자량 약 50,000달톤의 포유류의 혈액 내에 존재하는 단백질 중의 하나로서, 혈액 내 농도는 약 2mg/mL에 달하는 주 혈액 단백질 중의 하나이며(Robin W.C. et. al., Nature, 298, 329-334, 1982), 알파-1 프로테아제 억제제(alpha-1 protease inhibitor)라고도 불리운다. 알파-1 안티트립신은 자연계에 100여 종 이상의 대립유전자(allele)가 존재하고, 표현형(phenotype)은 IEF(isoelectric focusing) 유형에 따라 A에서 Z로 구분된다. 이중 가장 많은 M 형 대립 유전자가 대부분의 사람들의 혈액 내에 존재하며, 적어도 약 75개의 isoform이 존재하는 것으로 알려져 있고 (Brantley, M. et. al., Am. J. Med., 84(suppl. 6A), 13-31, 1988), 단백질 분해 효소 억제제로서의 주 기능도 유지되고 있다.
일반적으로 약 90%의 알파-1 안티트립신은 M1, M2, M3, M4, M5의 다섯 가지 PiM subtype이 존재하는 것으로 알려져 있다. 이중에서 M1이 약 67%, M2가 약 16%, 그리고 M3가 약 11%의 분포를 나타내고 있다(Cox D.W. & Billingsley D.G., FEBS Lett., 231, 327-330, 1986). 이중 M2 type은 101번 위치에 His가 존재하며, M3 subtype 은 101번 위치에 Arg이 존재하며, 알파-1 안티트립신 고유의 활성에는 영향을 끼치지 않는 것으로 알려져 있다.
알파-1 안티트립신은 공통적으로 단백질의 3곳에 당화가 되어있는 당 단백질의 구조를 가지고 있으며(Mega, T. et. al., J. Biol. Chem., 255, 4057-4061, 1980), X-ray 결정구조에 의하면 알파-1 안티트립신은 혈액에 존재하는 다른 단백질 분해 효소 억제제(Serpin 류)와 마찬가지로 3개의 베타-시트(beta-sheet)와 8개의 알파-나선형(alpha-helical) 구조를 가지고 있다(Elliot P.R., et. al., JMB, 275, 419-425, 1988). 알파-1 안티트립신은 체내에서 여러 종류의 단백질 분해 효소를 억제하는데, 현재 알려진 질환과 관련된 생체 내 주된 기능은 호중구 엘라스타제(neutrophil elastase)의 활성을 억제하여서(Beatty et. al., J. Biol. Chem., 255, 3931~3934, 1980), 알파-1 안티트립신이 결핍되면 엘라스틴의 분해로 인해 폐 기능이 저하되는 폐기종(emphysema)과 같은 심각한 질병이 유발된다. 또한, 알파-1 안티트립신의 변형된 단백질은 간(liver)에서 제대로 분비가 되지 못하고, 변형된 알파-1 안티 트립신이 간에 축적이 되어서 급기야는 간경변(Cirrhosis)이 일어난다는 임상적 보고도 있다.
현재 알파-1 안티트립신 결핍증 치료제로, 사람 혈액에서 추출한 몇 가지 제품이 미국 FDA에서 의약품으로 허가를 받아 시판되고 있다. 대표적인 제품들로는 Talecris 사의 프로라스틴(Prolastin), Baxter 사의 아랄라스트(Aralast), 그리고, CSL Behring 사의 제마이라(Zemaira)가 있으며, 통상적으로 60mg/kg의 용량으로 1주 간격으로 정맥 주사로 인체에 투여된다. 따라서, 성인 1인당 1주에 4-5g의 다량의 단백질을 환자에게 오랫동안 투여하여야 한다.
Data Monitor(DMHC2364) 분석에 따르면 미국과 유럽에서 유전적으로 알파-1 안티트립신에 문제가 있는 환자 수가 20만 명에 이를 것으로 추측되나, 적절한 진단이 이루어지지 않기 때문에 일부 환자들만이 치료를 받고 있다. 현재까지 의약품으로 개발된 제품들은 모두 인간 혈액에서 추출한 알파-1 안티트립신이다. 이러한 인간 혈액에서 추출한 알파-1 안티 트립신은 제조 과정에서 철저히 차단을 하여도 인간면역결핍 바이러스(human immunodeficient virus), B형 간염 바이러스(hepatitis B virus), C형 간염 바이러스(hepatitis C virus) 등 사람에게 치명적인 질병을 유발시킬 수 있는 인체에 유해한 바이러스 등이 상존할 가능성이 존재하며, 몇 가지 병원체에 대한 혈액 선별 검사와 바이러스 불활성화 과정을 사용한다 하더라도 아직까지 알려지지 않은 희소성 있는 병원체의 원천적 근절이 불가능하기 때문에 미지의 병원체에 의한 인체 감염 우려는 항상 존재할 수밖에 없다. 또한, 상업적으로 필요한 알파-1 안티트립신을 제조하기 위한 오염되지 않은 혈액의 원활한 공급 또한 항상 문제가 되어왔다.
이와 같은 문제점을 해결하기 위한 방안으로는 유전자 재조합 기술을 이용하여 알파-1 안티트립신을 치료제로 개발하는 것이다. 따라서, 이와 관련된 여러 가지 연구가 진행되어 왔으나 여러 가지 제한적인 요인으로 인하여 아직까지 상업적으로 성공하지 못하고 있다.
인간 알파-1 안티트립신은 총 3개의 부위(46번 아스파라진, 83번 아스파라진, 247번 아스파라진)에서 당화가 일어나 3개의 N-글리칸을 갖는 것으로 알려져 있다. 유전자 재조합 방법으로 E.coli와 같은 미생물을 이용하여 생성된 알파-1 안티트립신의 경우 인간 유래의 알파-1 안티트립신과는 달리 당화가 되지 않아 체내 투여 시에 반감기가 짧은 것으로 알려져 있다(Karnaukhova et. al., Amino Acids, 30, 317-332, 2006, Garver Jr. et. al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 84, 1050-1054, 1987). 이러한 문제점을 극복하고 다량의 알파-1 안티트립신을 경제적으로 얻기 위하여, 알파-1 안티트립신을 식물에서 발현시키는 연구를 하였다. 그러나 식물에서 발현된 재조합 알파-1 안티트립신의 경우 식물 유래의 당화가 일어났지만, 체내 반감기가 인간 알파-1 안티트립신에 비해 짧은 것으로 보고되었다(Huang et. al., Biotechnol. Prog., 17, 126-133, 2001).
알파-1 안티트립신의 체내 반감기를 개선하기 위하여, Cantin 등은 미생물에서 발현시킨 알파-1 안티트립신의 시스테인 잔기에 폴리에틸렌글리콜을 접합시킨 융합체에 대해 보고하였다(Cantin et. al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 27, 659-665, 2002). 상기 논문에 의하면, 미생물에서 발현시킨 알파-1 안티트립신의 시스테인 잔기에 20KDa과 40KDa의 폴리에틸렌글리콜을 접합시키면 미생물에서 발현된 알파-1 안티트립신에 비해 체내 반감기가 개선되어 인간 알파-1 안티트립신과 유사한 수준에 도달하는 것으로 나타난다. 그러나 단백질에 폴리에틸렌글리콜을 접합시키면 화학적인 부반응에 의해 여러 가지 산물이 만들어지고, 이를 제거하기 위한 추가 공정이 필요하게 된다. 또한, 인간 알파-1 안티트립신이 가지고 있는 당 구조상 N-글리칸이 없기 때문에 노출된 아미노산 서열에 대한 면역원성 문제가 야기될 가능성이 있다.
동물세포 유래의 알파-1 안티트립신은 인간 알파-1 안티트립신과 유사한 체내 반감기를 갖는 것으로 알려져 있다(Garver Jr. et. al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 84, 1050-1054, 1987). 따라서 인간 알파-1 안티트립신과 당 구조가 유사한 동물세포를 이용하여 제조하는 것이 바람직한 방법이라고 할 수 있다. 그러나, 동물세포를 이용한 제조 방법은 일반적으로 미생물을 이용하여 알파-1 안티트립신을 생산하는 것에 비하여 제조 비용이 많이 든다는 단점이 있다.
한편, 알파-1 안티트립신의 체내 반감기를 증가시키기 위하여, 알파-1 안티트립신의 loop 지역 등에 당화 부위를 추가하는 기술이 연구되었다. 일반적으로 동물세포에서 발현된 단백질에 당화를 추가할 경우 당화가 추가된 단백질의 hydrodynamic volume이 증가되어서 당화가 추가되지 않은 단백질에 비하여 인체 내에 투여될 경우 체내 반감기가 증가 된다고 생각할 수 있다. 그러나 일반적으로 생리활성 단백질에 당화를 변경 또는 추가하는 방법은 적혈구생성촉진인자(erythropoietin)의 예에서 알 수 있듯이 당화가 추가된 위치에 따라서 체내 반감기에 큰 영향을 끼치게 된다(Eliott et. al., Nat. Biotechnol., 21, 414-421, 2003). 따라서 체내 반감기를 증가시키기 위하여 알파-1 안티트립신에 당화를 추가 할 경우, 알파-1 안티트립신의 어떠한 위치에 당화 부위를 추가해야 체내 안정성과 같은 생리 활성의 개선이 이루어지는지에 대한 연구 결과가 구체적으로 증명되어야 할 것이다.
결론적으로 알파-1 안티트립신의 체내 안정성을 증가시키기 위하여, 알파-1 안티트립신을 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조하려는 다양한 방법이 시도되어 왔지만, 이러한 방법들은 앞에 기술한 여러 가지 문제로 인하여 의약용으로 개발하기에 적합하지 못하였다. 따라서 체내 안정성이 우수한 재조합 알파-1 안티트립신을 개발하기 위한 새로운 방법에 대한 연구의 필요성이 절실히 요구되고 있다.
본 발명자들은 임상적으로 유용한 재조합 알파-1 안티트립신을 구성하기 위하여, 알파-1 안티트립신의 여러 특정 부위에 당화를 추가하여 알파-1 안티트립신 변이체를 제조하였으며, 혈중 반감기(t1/2)와 약물농도-시간 곡선하 면적(AUC)이 현저히 증가하여 체내 안정성이 우수하고, 엘라스타제 활성 억제 효과가 유지되는 알파-1 안티트립신 변이체를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 알파-1 안티트립신의 N-말단의 1번 위치에서 25번 위치 사이의 특정 부위에 있는 아미노산을 치환하여 당화 부위를 추가시킨, 알파-1 안티트립신 변이체를 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 알파-1 안티트립신 변이체는 당화 부위를 하나 내지 세 개 이하로 추가시킨 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 특정 부위는 N-말단의 3번 위치에서 13번 위치 사이인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 특정 부위는 N-말단의 9번 혹은 12번 위치인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 특정 부위는 N-말단의 4번과 9번, 혹은 4번과 12번, 혹은 9번과 12번 위치인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 알파-1 안티트립신의 N-말단의 1번 위치에서 25번 위치 사이의 특정 부위에 있는 아미노산을 치환하여 당화 부위를 추가시키는 단계; 상기 당화 부위가 추가된 알파-1 안티트립신 변이체 발현벡터를 전이시킨 세포를 배양 배지 상에서 배양하는 단계; 상기 세포로부터 알파-1 안티트립신 변이체 단백질을 발현시키는 단계; 및 상기 발현된 알파-1 안티트립신 변이체 단백질을 정제하고 회수하는 단계를 포함하는, 알파-1 안티트립신 변이체의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 알파-1 안티트립신의 N-말단의 1번 위치에서 25번 위치 사이의 특정 부위에 있는 아미노산을 치환하여 당화 부위를 추가시킨 알파-1 안티트립신 변이체를 유효성분으로 함유하는, 알파-1 안티트립신 결핍증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 알파-1 안티트립신 결핍증은 만성 폐쇄성 폐질환 혹은 간경변인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 알파-1 안티트립신의 N-말단의 1번 위치에서 25번 위치 사이의 특정 부위에 있는 아미노산을 치환하여 당화 부위를 추가시킨 알파-1 안티트립신 변이체를 치료적 유효량으로 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 알파-1 안티트립신 결핍증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한 본 발명은 알파-1 안티트립신의 N-말단의 1번 위치에서 25번 위치 사이의 특정 부위에 있는 아미노산을 치환하여 당화 부위를 추가시킨 알파-1 안티트립신 변이체 두 개를 연결하여 체내 반감기가 증가된 알파-1 안티트립신 변이체의 융합체를 제공한다.
또한 본 발명은 알파-1 안티트립신의 N-말단의 1번 위치에서 25번 위치 사이의 특정 부위에 있는 아미노산을 치환하여 당화 부위를 추가시킨 알파-1 안티트립신 변이체에 다른 이종 단백질을 연결하여 이종 단백질의 체내 반감기가 증가된 알파-1 안티트립신 변이체의 융합체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 알파-1 안티트립신 변이체는 추가적으로 P2 위치인 357번째 아미노산인 프롤린(proline)이 아스파라진(asparagine)으로 치환된 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 알파-1 안티트립신 변이체는 N-말단의 1번 위치에서 25번 위치 사이의 아미노산 변이를 통해 N-당화 부위를 추가시킴으로써, 혈중 반감기(t1/2)와 약물농도-시간 곡선하 면적(AUC)이 현저히 증가하여 체내 안정성이 우수하고, 엘라스타제 활성 억제 효과가 유지된다. 따라서, 본 발명의 알파-1 안티트립신 변이체는 알파-1 안티트립신 결핍증의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 알파-1 안티트립신 변이체에 이종 단백질을 결합시켜 이종 단백질의 체내 반감기를 증가시키는데 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 알파-1 안티트립신 벡터(pT003)의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 알파-1 안티트립신 변이체의 서열과 위치를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 정제된 알파-1 안티트립신 및 이의 변이체의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 혈장 유래 알파-1 안티트립신 및 본 발명의 동물세포에서 발현시킨 재조합 알파-1 안티트립신의 피하 투여 약물동태 그래프를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 알파-1 안티트립신 및 이의 변이체들의 피하 투여 약물동태 그래프를 나타낸 도이다.
도 6은 혈장 유래 알파-1 안티트립신, 재조합 알파-1 안티트립신 변이체들의 피하 투여 약물동태 그래프를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 알파-1 안티트립신 변이체들의 피하 및 정맥 투여 약물동태 그래프를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 알파-1 안티트립신 및 이중체(dimer)의 정맥 투여 약물동태 그래프를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 인 성장 호르몬/알파-1 안티트립신 변이체의 융합체의 피하 투여 약물동태 그래프를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 변이체 융합체의 피하 투여 약물동태 그래프를 나타낸 도이다.
본 발명은 알파-1 안티트립신의 N-말단의 1번 위치에서 25번 위치 사이의 특정 부위에 있는 아미노산을 치환하여 당화 부위를 추가시킨 알파-1 안티트립신 변이체를 제공한다.
본 발명에 따른 알파-1 안티트립신 변이체는 알파-1 안티트립신의 세 개의 당화 부위(46번 아스파라진, 83번 아스파라진, 247번 아스파라진) 이외에 N-말단의 1번 위치에서 25번 위치 사이의 특정 부위에 있는 아미노산을 치환하여 N-당화 부위를 추가하는 것을 특징으로 한다. 추가할 수 있는 당화 부위의 숫자에는 제한이 없다. 바람직하게는 하나 내지 세 개 이하이다.
상기 인간 알파-1 안티트립신의 N-말단의 특정 부위에 N-당화 부위를 추가하는 것은, N-말단의 1번 위치에서 25번 위치 사이에서 N-글리칸 부착 부위 서열인 Asn-X-Thr/Ser을 생성시키는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 인간 알파-1 안티트립신의 N-말단의 3번 위치에서 13번 위치 사이, 가장 바람직하게는 N-말단의 9번, 혹은 12번 위치의 아미노산인 글루타민을 아스파라진으로 치환하여 당화 부위를 추가한다. 당화 추가에 의한 변이체는 4번과 9번, 혹은 4번과 12번, 혹은 9번과 12번의 위치에 당이 동시에 추가된 구조를 얻을 수도 있으며, 본 실시예에서 기술한 특정 부위 외에 N-말단의 25번 이내의 다른 부위에서의 추가 당화를 포함하기도 한다.
또한, 본 발명은 알파-1 안티트립신의 N-말단의 1번 위치에서 25번 위치 사이의 특정 부위에 있는 아미노산을 치환하여 당화 부위를 추가시키는 단계, 상기 당화 부위가 추가된 알파-1 안티트립신 변이체 발현벡터가 전이된 세포를 배양 배지 상에서 배양하는 단계, 상기 배양액으로부터 알파-1 안티트립신 변이체 단백질을 발현시키는 단계; 및 상기 발현된 알파-1 안티트립신 변이체 단백질을 정제하고 회수하는 단계를 포함하는, 알파-1 안티트립신 변이체의 제조방법을 제공한다.
상기 N-당화 부위를 추가하는 기술은 유전자 재조합 기술을 이용하며, 유전자 조작을 통해 아미노산을 치환, 삽입, 제거하여 N-당화 부위를 추가할 수 있다. 상기 인간 알파-1 안티트립신의 N-말단의 20개 정도의 아미노산은 알파-1 안티 트립신의 X-ray 결정구조에서 검출이 잘 되지 않는 지역(PDB code: 1QLP, 2QUG, 3CWL, 1PSI, 7API, 1KCT(www.pdb.org))으로서 3차 구조가 매우 유연한 정형화 되어있지 않은 구조를 가지고 있다.
본 발명에 따른 알파-1 안티트립신 변이체는 특정부위 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis) 방법을 이용하여 하나 이상의 아미노산을 변이시켜 제조될 수 있다. 예를 들어, 인간 알파-1 안티트립신에서 9번 위치의 글루타민을 아스파라진으로 치환하거나 148번 위치의 글리신을 아스파라진으로 치환하여 동물 세포에서 발현시키면 치환된 아스파라진에 당화 부위가 생성된다. 또는, 148번의 글리신을 트레오닌으로 치환하면 146번의 아스파라진에 새로운 당화 부위가 생성된다. 이와 같은 방식으로 알파-1 안티트립신의 매우 다양한 위치에서 당화 부위를 추가할 수 있다.
본 발명에서는 인간 알파-1 안티트립신의 3개의 당화 부위(46번 아스파라진, 83번 아스파라진, 247번 아스파라진) 이외에 A1AT의 X-ray 결정 구조에서 정형화된 구조가 나타나지 않는 N-말단의 1번 위치에서 25번 위치 사이의 특정 부위에 있는 아미노산의 치환을 통해 N-당화 부위를 추가하여 알파-1 안티트립신 변이체를 제조하고, 이를 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary) 세포에서 발현시킨 후 크로마토그래피 방법을 이용하여 고순도로 정제하여 얻는다.
상기 정제된 N-당화 부위가 추가된 알파-1 안티트립신 변이체는 야생형 알파-1 안티트립신에 비해 SDS-PAGE 시험에서 상대적으로 높은 위치에서 염색띠가 나타난다. 이는 당화에 의해 분자량이 상승하였다고 판단된다.
또한, 상기 정제된 알파-1 안티트립신 변이체는 혈중 약물농도-시간 곡선하 면적(AUC, area under the curve) 값과 체내 반감기(t1/2)가 현저히 증가하여 체내 안정성이 우수하다. 그러나, 알파-1 안티트립신의 26번 위치의 아미노산을 트레오닌으로 치환한 변이체(I26T)의 경우 N-당화 부위의 추가에 의해 체내 지속성이 개선되지 않았으며, WO 2008/151845에 기재된 loop 지역(loop A, loop B, loop C, loop D, loop E)이나 그 부근에 당화 부위를 추가한 알파-1 안티트립신 변이체의 경우에도 체내 지속성 개선에 큰 효과가 없었다. 아울러, loop 지역에 당화를 시키게 되면 단백질 분해 효소로서의 고유한 기능을 가지는 알파-1 안티트립신의 활성에 영향을 미칠 수 있기 때문에 알파-1 안티트립신의 활성에 영향을 끼치지 않는 당화 위치의 선택이 매우 중요하다.
또한, 상기 정제된 알파-1 안티트립신 변이체는 엘라스타제 활성 억제 효과가 유지됨을 확인하였다. 또한, 일반적으로 인간 알파-1 안티트립신의 결합 속도상수는 1.0 ± 0.2 × 105(Boudier C., 1994) ~ 1.67 × 106 M-1s-1(Terashima M, et. al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 52(4), 516-523, 1999)의 범위를 갖는 것으로 알려져 있는데, 본 발명의 야생형 인간 알파-1 안티트립신과 이의 변이체의 결합 속도상수 및 평형상수가 유사하게 나타난다. 따라서, 알파-1 안티트립신의 N-말단 부위의 당화가 알파-1 안티트립신의 엘라스타제 활성 억제에 영향을 주지 않는다는 것을 알 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 알파-1 안티트립신 변이체를 두 개를 연결하여 체내 반감기가 증가된 알파-1 안티트립신 변이체의 융합체를 제공한다.
본 발명자들은 상기 알파-1 안티트립신 변이체의 P2 위치인 357번째 아미노산인 프롤린을 아스파라진으로 추가적으로 치환시킨 알파-1 안티트립신 이중변이체를 제조하고, 상기 이중변이체에 과립구 자극인자를 결합시킨 융합체를 제조하여 약물동태 실험을 진행한 결과, 상기 융합체의 체내 지속성이 증가된 것을 확인하였다(실험예 5 참조). 상기 결과를 통하여 상기 이중변이체에 생리활성 단백질과 같은 이종 단백질을 결합시키면 상기 생리활성 단백질의 반감기를 증가시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 상기 알파-1 안티트립신 변이체에 다른 이종 단백질을 연결하여 이종 단백질의 체내 반감기가 증가된 알파-1 안티트립신 변이체의 융합체를 제공한다. 상기 이종 단백질의 종류에는 제한이 없으나, 바람직하게는 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질이다.
상기 정제된 알파-1 안티트립신 변이체를 둘 또는 그 이상으로 연결하여 체내 반감기가 증가된 알파-1 안티트립신 변이체의 융합체를 제조할 수 있다. 이전 연구에서, Sytkowski, A.J. 등은 적혈구 성장인자(EPO)를 적절한 링커를 이용하여 EPO-EPO의 융합 단백질로 만들었을 경우 활성이 현저히 증가함은 물론 체내 반감기가 EPO 단량체(monomer)보다도 더 증가함을 보여주었다(Sytkowski, A.J., et. al., J. Biol. Chem., 274, 24773-24778, 1999). 따라서 본 발명의 알파-1 안티트립신 변이체를 둘 또는 그 이상으로 연결할 경우 알파-1 안티트립신 변이체의 단량체에 비해 체내 반감기가 증가될 것으로 기대된다. 더 나아가서, 체내 반감기가 짧은 생리활성 펩티드, 면역조절 인자, 사이토카인 등에 본 발명의 알파-1 안티트립신 변이체를 연결할 경우 체내 반감기가 현저히 증가하여 지속성 효과를 충분히 나타낼 것으로 기대된다.
또한, 본 발명은 상기 알파-1 안티트립신 변이체를 유효성분으로 함유하는 알파-1 안티트립신 결핍증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 알파-1 안티트립신 변이체를 치료적 유효량으로 환자에게 투여하여 알파-1 안티트립신 결핍증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 기재한 바와 같이, 본 발명에 따른 알파-1 안티트립신 변이체는 N-말단의 1번 위치에서 25번 위치 사이의 아미노산 변이를 통해 N-당화 부위를 추가시킴으로써, 혈중 반감기(t1/2)와 약물농도-시간 곡선하 면적(AUC)이 현저히 증가하여 체내 안정성이 우수하고, 엘라스타제 활성 억제 효과가 유지된다. 따라서, 본 발명의 알파-1 안티트립신 변이체는 알파-1 안티트립신 결핍증의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 상기 알파-1 안티트립신 결핍증으로는 만성 폐쇄성 폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease; COPD)이나 간경변을 포함하며, 바람직하게는 폐기종을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물은 알파-1 안티트립신 변이체와 함께 알파-1 안티트립신 결핍증의 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내, 흡입 또는 국소 등에 적용)할 수 있으며, 혹은 본 발명에 의한 알파-1 안티트립신 변이체의 유전자 치료법(Gene Therapy)에 이용할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 알파-1 안티트립신 변이체의 주 1회 투여량은 알파-1 안티트립신의 투여용량인 60mg/kg 보다 적은 양으로 동등한 임상 효능을 나타내거나, 혹은 야생형 알파-1 안티트립신 투여용량과 동일한 용량을 사용할 경우 투여 기간을 더 연장하여도 동일한 임상적 효능이 나타날 것으로 예상된다.
본 발명의 조성물은 알파-1 안티트립신 결핍증의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 알파-1 안티트립신 및 이의 변이체와 이중체의 제조
1-1. 발현 벡터 pAV1의 제조
본 발명에 필요한 발현벡터 클로닝은 모벡터인 pSGHV0(GenBank Accession No. AF285183)를 이용하여 산업체에서 사용 가능하도록 목적에 맞게 개량시켜 개발한 pAV1 벡터를 이용하였다. 모벡터는 대장균과 같은 박테리아를 이용하여 인체 유래 단백질을 발현시킬 경우에는 단백질이 세포 내에서 과량 발현되지만 대부분 활성을 가지지 못하며, 동물세포를 이용한 경우에는 세포 외로 생리활성을 가진 관심 단백질을 고농도로 발현시키는 특성을 가지고 있기 때문에, 생리활성을 가진 단백질을 손쉽게 정제할 목적으로 제작된 연구용 벡터이다. 그러나 산업체에서 생산용으로 사용하기에는 여러 가지로 제한이 있으므로 pSGHV0 벡터의 가장 큰 장점인 발현량이 높은 것을 생산에 이용하기 위하여 산업체에서 사용가능하도록 개량한 것이다.
1-2. 알파-1 안티트립신(subtype M3) 벡터(pT003)의 제조
알파-1 안티트립신 벡터를 제조하기 위하여, hMU001448(KRIBB)을 주형으로 한 알파-1 안티트립신(M3) 유전자를 pAV1 벡터에 클로닝하여 알파-1 안티트립신 벡터(pT003)를 제조하였다. 구체적으로는, hMU001448(KRIBB)을 주형으로 하여 2개의 프라이머인 XhoAT 정방향 프라이머(5'-CCC TCC TCG AGA ATG CCG TCT TCT GTC TCG-3', 서열번호 1)와 ATNot 역방향 프라이머(5'-GGG CCC GCG GCC GCA GTT ATT TTT GGG TGG G-3', 서열번호 2)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 상기 증폭된 뉴클레오티드를 말단에 존재하는 두 개의 제한효소인 XhoI과 NotI으로 절단하고, XhoI/NotI 절단부를 가지고 있는 발현 벡터 pAV1과 접합하여 알파-1 안티트립신 벡터(pT003, 서열번호 39)를 제조하였다. 상기 알파-1 안티트립신 벡터(pT003)의 모식도는 도 1에 나타내었다.
1-3. 알파-1 안티트립신(M3) 변이체의 제조
당화 부위가 추가된 여러 알파-1 안티트립신 변이체를 제조하기 위하여, 상기 실시예 1-2에서 제조한 알파-1 안티트립신 벡터(pT003)를 주형으로 하여 하기 표 1에 기재된 각각의 2개의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머들과 변이체 생성 키트(Enzynomix, EZchangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit)를 이용하여 알파-1 안티트립신 변이체들을 제조하였다. 알파-1 안티트립신 변이체의 서열과 위치는 도 2에 나타내었다.
모든 알파-1 안티트립신 변이체들의 변이의 목적은 N-당화 부위를 증가시키는 것이므로, 동물세포에서 N-당화 된다고 알려져 있는 Asn-X-Thr을 만들기 위하여 주로 원래의 아미노산을 아스파라진으로 치환하였으나 몇 개의 경우는 원래 존재하는 아스파라진을 이용하기 위하여 인접한 아미노산을 트레오닌으로 변이시키기도 하였다.
표 1
프라이머 서열
Q4N-F(서열번호 3) 5'-AAC GGA ACT GCT GCC CAG AAG ACA GAT ACA-3'
Q4N-R(서열번호 4) 5'-GGG ATC CTC AGC CAG GGA GAC-3'
Q9N-F(서열번호 5) 5'-AAC AAG ACA GAT ACA TCC CAC-3'
Q9N-R(서열번호 6) 5'-GGC AGC ATC TCC CTG GGG ATC-3'
D12N-F(서열번호 7) 5'-AAT ACA ACC CAC CAT GAT CAG GAT CAC-3'
D12N-R(서열번호 8) 5'-TGT CTT CTG GGC AGC ATC TCC-3'
I26T-F(서열번호 9) 5'-ACT ACC CCC AA CCT GGC TG-3'
I26T-R(서열번호 10) 5'-CTT GTT GAA GGT TGG GTG ATC C-3'
A31T-F(서열번호 11) 5'-ACT GAG TTC GCC TTC AGC CTA TAC-3'
A31T-R(서열번호 12) 5'-CAG GTT GGG GGT GAT CTT GTT G-3'
L66N-F(서열번호 13) 5'-AAC GGG ACC AAG GCT GAC AC-3'
L66N-R(서열번호 14) 5'-GGA GAG CAT TGC AAA GGC TGT A-3'
A70N-F(서열번호 15) 5'-AAC GAC ACT CAC GAT GAA ATC CTG-3'
A70N-R(서열번호 16) 5'-CTT GGT CCC CAG GGA GAG-3'
G148N-F(서열번호 17) 5'-AAC GAC ACC GAA GAG GCC AAG-3'
G148N-R(서열번호 18) 5'-GAA GTT GAC AGT GAA GGC TTC TG-3'
G148T-F(서열번호 19) 5'-ACT GAC ACC GAA GAG GCC AAG-3'
G148T-R(서열번호 20) 5'-GAA GTT GAC AGT GAA GGC TTC TG-3'
R178N-F(서열번호 21) 5'-AAC GAC ACA GTT TTT GCT CTG GTG-3'
R178N-R(서열번호 22) 5'-GTC AAG CTC CTT GAC CAA ATC CA-3'
K201N-F(서열번호 23) 5'-AAC GAC ACC GAG GAA GAG GAC-3'
K201N-R(서열번호 24) 5'-GAC TTC AAA GGG TCT CTC CCA TT-3'
Q212N-F(서열번호 25) 5'-AAC GTG ACC ACC GTG AAG GTG-3'
Q212N-R(서열번호 26) 5'-GTC CAC GTG GAA GTC CTC TTC-3'
E266N-F(서열번호 27) 5'-AAC CTC ACC CAC GAT ATC ATC AC-3'
E266N-R(서열번호 28) 5'-ATT TTC CAG GTG CTG TAG TTT CCC-3'
K343N-F(서열번호 29) 5'-AAC GGG ACT GAA GCT G-3'
K343N-R(서열번호 30) 5'-CTC GTC GAT GGT CAG C-3'
1-4. 알파-1 안티트립신(subtype M2) 벡터(pT006)의 제조
알파-1 안티트립신 벡터를 제조하기 위하여, pEAT8(encoding a1-AT(M2) cDNA)을 주형으로 한 알파-1 안티트립신 유전자를 pAV1 벡터에 클로닝하여 알파-1 안티트립신 벡터(pT006)를 제조하였다. 구체적으로는, pEAT8(encoding a1-AT(M2) cDNA)을 주형으로 하여 2개의 프라이머인 XhoAT 정방향 프라이머(5'-CCC TCC TCG AGA ATG CCG TCT TCT GTC TCG-3', 서열번호 1)와 ATNot 역방향 프라이머(5'-GGG CCC GCG GCC GCA GTT ATT TTT GGG TGG G-3', 서열번호 2)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 상기 증폭된 뉴클레오티드를 말단에 존재하는 두 개의 제한효소인 XhoI과 NotI으로 절단하고, XhoI/NotI 절단부를 가지고 있는 발현 벡터 pAV1과 접합하여 알파-1 안티트립신 벡터(pT006, 서열번호 40)를 제조하였다.
1-5. 알파-1 안티트립신(M2) 변이체의 제조
당화 부위가 추가된 알파-1 안티트립신(M2) 변이체를 제조하기 위하여, 상기 실시예 1-4에서 제조한 알파-1 안티트립신 벡터(pT006)를 주형으로 하여 하기 2개의 프라이머 정방향 프라이머(서열번호 5)와 역방향 프라이머(서열번호 6)를 이용하여 변이체 생성 키트(Enzynomix, EZchangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit)를 이용하여 알파-1 안티트립신(M2) 변이체 벡터(AT9N(M2))를 제조하였다. 제조된 알파-1 안티트립신 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 42에 나타내었다.
1-6. 알파-1 안티트립신 및 변이체의 이중체의 제조
알파-1 안티트립신 변이체의 이중체를 제조하기 위하여 알파-1 안티트립신 변이체는 pAT9N(subtype M2)을 사용하였다. 이중체 벡터를 제조하기 위하여 pAT9N(M2)을 주형으로 하여 2개의 프라이머인 XhoAT 정방향 프라이머 2(5'-GGG CCC CTC GAG GCC ACC ATG CCG TCT TCT GTC TCG TGG GGC ATC CTC CTG CTG GCA GGC CTG TGC TGC CTG GTC CCT GTC TCC CTG GCT GAA GAT CCC CAG GGA -3', 서열번호 31)와 ATBam 역방향 프라이머 2(5'-GGG GGG ATC CTC TTT TTG GGT GGG ATT CAC -3', 서열번호 32)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 상기 증폭된 뉴클레오티드를 말단에 존재하는 두 개의 제한효소인 XhoI과 BamHI으로 절단하고, XhoI/BamHI 절단부를 가지고 있는 발현 벡터 pAT9N(M2)과 접합하여 알파-1 안티트립신 이중체 벡터(pAT9N(M2)-AT9N(M2))를 제조하였다.
1-7. 알파-1 안티트립신 및 이의 변이체와 이중체의 발현
차이니즈 햄스터 난소세포(CHO-K1)를 이용하여 상기 실시예 1-2, 3, 4, 5 및 6에서 제조한 알파-1 안티트립신(T003, T006)과 이의 변이체 및 이중체의 단백질 발현을 확인하였다. CHO-K1은 10% FBS(Fetal Bovine Serum)와 항생제를 포함한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media)에 5% CO2와 37℃ 조건으로 배양하여 유지하였다. 알파-1 안티트립신 및 이의 변이체 발현벡터를 도입하기 하루 전, 100mm 배양접시에 세포를 5×106 cells로 접종하여 배양한 후, FBS와 항생제가 없는 800μL의 DMEM과 10μg의 알파-1 안티트립신과 이의 변이체 및 이중체의 발현벡터 각각을 혼합하여 상온에서 1분 동안 유지한 후, 20μg의 PEI(Polyethylenimine, linear, Polysciences Inc.(Cat. no: 23966, MW~25,000))와 혼합하여 10~15분 정도 상온에서 방치하였다. 이때 하루 전 배양하였던 세포를 PBS로 씻어내고 새로운 배양액 6mL의 DMEM을 첨가하였다. 10~15분 후, 상온에 방치한 알파-1 안티트립신과 이의 변이체 및 이중체의 발현벡터 각각을 상기 배양접시에 첨가하였다. 다음날 PBS로 씻어내고 FBS가 없는 IMDM(Cat. No 12200-028, Gibco, Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 배지를 첨가하여 단백질 발현을 확인하였다.
1-8. 알파-1 안티트립신과 이의 변이체 및 이중체의 정제
상기 실시예 1-7에 의하여 발현된 알파-1 안티트립신과 이의 변이체 및 이중체는 하기와 같이 정제하였다. 구체적으로는, 세포 배양액으로 분비된 알파-1 안티트립신과 이의 변이체 및 이중체를 정제하기 위하여, 배양액을 원심 분리하여 세포를 제거한 후 상등액만을 취하고 세포 상등액을 평형 완충용액(20mM sodium phosphate, pH 8.0)으로 희석하였다. 그 다음, 상기 평형 완충용액으로 희석된 세포 상등액을 평형 완충용액으로 평형화된 Q-Sepharose(GE Healthcare, 미국) 컬럼에 주입하고 평형 완충용액으로 충분히 세척한 후 염화나트륨의 농도를 증가(0~400mM NaCl, 20mM sodium phosphate, pH 8.0)시켜 단백질을 용출시켰다. 용출된 단백질을 평형 완충용액(트리스 50mM, 염화나트륨 0.15M, pH 7.5)으로 평형화된 Alpha-1 Antitrypsin Select(GE Healthcare, 미국) 컬럼에 주입한 후 평형 완충용액으로 충분히 세척하고 MgCl2의 농도를 증가시켜 단백질을 용출시켰다. 상기 용액을 인산염 완충용액으로 투석한 후 Vivaspin20(GE Healthcare, 미국)을 사용하여 농축하였고, 최종적으로 고순도로 정제된 단백질을 얻었다. 상기 정제된 알파-1 안티트립신과 이의 변이체 및 이중체의 SDS-PAGE 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 야생형 알파-1 안티트립신(T003 또는 T006)에 비해 N-당화 부위가 추가된 알파-1 안티트립신 변이체들이 상대적으로 높은 위치에서 염색띠가 나타남을 확인하였다. 이는 당화에 의해 분자량이 상승하였다고 판단된다. 또한 이중체의 경우는 이중체의 분자량 위치에서 나타났으며 당화 정도에 따라 조금씩 분자량 위치의 차이를 확인할 수 있었다.
실시예 2. 인 성장 호르몬/알파-1 안티트립신 변이체의 융합체 제조
인 성장 호르몬/알파-1 안티트립신 변이체(AT9N)의 융합체를 제조하기 위하여 알파-1 안티트립신 변이체는 pAT9N(subtype M2)을 사용하였다. 융합체 벡터를 제조하기 위하여 인 성장 호르몬 유전자(IOH45734(invitrogen))를 주형으로 하여 2개의 프라이머인 XhoGH 정방향 프라이머(5'-GGG CCC CTC GAG GCC ACC ATG GCT ACA GGC TCC CGG-3', 서열번호 33)와 GHBam 역방향 프라이머(5'-GGG GGG ATC CTC GAA GCC ACA GCT GCC CTC -3', 서열번호 34)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 상기 증폭된 뉴클레오티드를 말단에 존재하는 두 개의 제한효소인 XhoI과 BamHI으로 절단하고, XhoI/BamHI 절단부를 가지고 있는 발현 벡터 pAT9N(M2)과 접합하여 인 성장 호르몬/알파-1 안티트립신 변이체 융합체 벡터(phGH-AT9N(M2), 서열번호 43)를 제조하였다.
실시예 3. 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이체의 융합체 제조
3-1. 알파-1 안티트립신 이중변이체의 제조
실시예 1-5와 동일한 방법으로 제조된 알파-1 안티트립신 변이체(AT9N) 벡터를 주형으로 하여 하기 2개의 프라이머 정방향 프라이머(5'-CCA TGT TTT TAG AGG CCA TAA ACA TGT CTA TCC CCC CC-3', 서열번호 35)와 역방향 프라이머(5'-GGG GGG GAT AGA CAT GTT TAT GGC CTC TAA AAA CAT GG-3', 서열번호 36)와 변이체 생성 키트(Enzynomix, EZchangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit)를 이용하여 알파-1 안티트립신 N-말단의 9번 위치의 글루타민(glutamine)이 아스파라진(asparagine)으로, 또한 357번 위치의 프롤린(proline)이 아스파라진(asparagine)으로 치환된 알파-1 안티트립신 이중변이체를 포함하는 벡터 pT004N(Q9N, P357N)을 제조하였다. 제조된 알파-1 안티트립신 이중변이체의 아미노산 서열은 서열번호 44에 나타내었다.
3-2. 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이체의 융합체 제조
과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이체의 융합체를 제조하기 위하여, 실시예 3-1의 방법으로 제조된 알파-1 안티트립신 이중변이체를 포함하는 pT004N(Q9N, P357N)을 사용하였다. 융합체 벡터를 제조하기 위하여 과립구 자극인자(Granulocyte Colony Stimulating Factor, IHS1380-97652343(Open biosystems))를 주형으로 하여 2개의 프라이머인 XhoCSF 정방향 프라이머(5'-GGG CCC CTC GAG ATG GCT GGA CCT GCC ACC-3', 서열번호 37)와 CSFBam 역방향 프라이머(5'-GGG GGG ATC CTC GGG CTG GGC AAG GTG GCG-3', 서열번호 38)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 상기 증폭된 뉴클레오티드를 말단에 존재하는 두개의 제한효소인 XhoI과 BamHI으로 절단하고, XhoI/BamHI 절단부를 가지고 있는 발현 벡터 pT004N과 접합하여 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이체 융합체 벡터(pT603N, 서열번호 45)를 제조하였다. 이후 제조된 상기 벡터(pT603N)를 이용하여 실시예 1-7 및 1-8과 동일한 방법으로 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이체를 발현 및 정제하였다.
실험예 1. 혈장 유래 알파-1 안티트립신과 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 제조한 알파-1 안티트립신 및 이의 변이체의 약물동태
혈장 유래 알파-1 안티트립신과 본 발명의 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 제조한 알파-1 안티트립신의 약물동태를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
실험동물로 Sprague-Dawley 수컷 쥐(rat)를 사용하였으며, 각 실험군 당 3~5 마리씩 할당하였다. 각 군의 Sprague-Dawley 쥐에 혈장 유래 인간 알파-1 안티트립신(Calbiochem, 미국), 재조합 알파-1 안티트립신 및 이의 변이체를 각각 랫트 kg 당 445μg의 투여량으로 피하 주사 또는 정맥 주사하였고, 희석액은 인산염완충용액을 사용하였다. 투여 후 시간별로 채혈하여 원심분리한 후 혈청을 얻었다. 각 채혈 시간별로 얻은 혈청은 분석시까지 냉동 보관하였으며, 효소면역분석법을 이용하여 알파-1 안티트립신 및 이의 변이체의 혈중 농도를 측정하였다. 효소면역분석법은 두가지 방법으로 수행하였다. 첫 번째 방법은 다음과 같다. 인간 알파-1 안티트립신에 대한 단일클론항체(Medix Biochemica, 핀란드)를 플레이트(Nunc, 덴마크)에 코팅하고, 1% 소혈청알부민이 용해된 인산염완충용액으로 처리하였다. 시료는 1% 소혈청알부민이 용해된 인산염완충용액으로 희석하여 사용하였고, sulfo-NHS-biotin(Pierce biotechnology, 미국)을 이용하여 접합시킨 알파-1 안티트립신 단일클론항체-biotin 접합체와 스트렙타비딘-HRP를 사용하여 알파-1 안티트립신을 검출하였다. 발색 반응은 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)와 과산화수소수 발색용액을 사용하였고, 황산을 각 웰에 첨가하여 반응을 종료시킨 후 microplate reader(Molecular Device, 미국)로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 두 번째 방법은 인간 알파-1 안티트립신에 대한 단일클론항체(Medix Biochemica, 핀란드)를 플레이트(Nunc, 덴마크)에 코팅하고, 1% 소혈청알부민이 용해된 인산염완충용액으로 처리하였다. 시료는 1% 소혈청알부민이 용해된 인산염완충용액으로 희석하여 사용하였고, 알파-1 안티트립신 폴리클론항체-biotin 접합체(Abcam, 영국)와 스트렙타비딘-HRP를 사용하여 알파-1 안티트립신을 검출하였다. 발색 반응은 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)와 과산화수소수 발색용액을 사용하였고, 황산을 각 웰에 첨가하여 반응을 종료시킨 후 microplate reader(Molecular Device, 미국)로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 단계별로 세척용액(0.05% 트윈 20, 인산염 완충용액)으로 플레이트를 세척하였다. 각 시료의 정량값은 표준물질에 대한 표준곡선을 작성한 후 회귀분석을 통해 구하였다.
혈장 유래 알파-1 안티트립신과 차이니즈 햄스터 난소 세포 유래의 알파-1 안티트립신 및 이의 변이체의 피하 투여 약물동태 그래프 및 정맥 투여 약물동태 그래프는 각각 도 4, 도 5, 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 혈장 유래 알파-1 안티트립신, 재조합 알파-1 안티트립신 및 이의 변이체들을 피하 투여 시 약물동태 양상은 다양하게 나타났다. 도 4에서 혈장 유래 알파-1 안티트립신은 체내 반감기(t1/2)가 약 15.2시간으로 나타났고, Tmax가 16.8시간, AUC(hr*μg/mL) 값은 113.1로 나타났고, 재조합 알파-1 안티트립신(T003)은 체내 반감기(t1/2)가 약 16.5시간, Tmax가 20.8시간, AUC(hr*μg/mL) 값은 156.6시간으로 나타났다. 따라서 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 제조한 알파-1 안티트립신은 혈장 유래 알파-1 안티트립신에 비해 큰 차이는 없었으며, 재조합 알파-1 안티트립신이 혈장 유래 알파-1 안티트립신에 비하여 반감기(t1/2)와 Tmax가 약간 길게 나타났고, AUC(hr*μg/mL)도 약 40% 정도 증가하였다. 또한, 알파-1 안티트립신의 isoform 인 M2 형(His101) 과 M3 형(Arg101)의 경우 동물을 이용한 약물 동태 시험에서 시험 오차 범위 내에서 차이가 나지 않음을 보여 주었다.
반면 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 제조한 알파-1 안티트립신의 변이체는 추가된 당화 부위에 따라 다양한 약물동태학적 양상을 나타내었다.
도 5에서 AT70N, AT178N, AT201N, AT212N은 AUCINF_obs(hr*μg/mL)가 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 제조한 알파-1 안티트립신(T003)의 약 50~70% 수준으로 낮게 나타났다. 그러나 체내 반감기의 경우 상기 변이체들은 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 제조한 야생형 알파-1 안티트립신 보다 약 15~90% 정도 길게 나타나 당화 부위 추가가 체내 반감기에 영향을 준 것으로 나타났다. 한편 AT148T의 경우 AUC(hr*μg/mL)가 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 제조한 알파-1 안티트립신과 유사하였으나 체내 반감기는 24.6시간으로 약 50% 정도 증가하였다. 이는 AT148T의 당화부위 추가에 의해 약물동태 양상이 향상되었다는 것을 나타낸다.
도 5에서 보면 AT26T의 경우 체내 반감기는 차이니즈 햄스터 난소세포에서 제조한 알파-1 안티트립신(T003) 보다 약간 긴 반면 AUC(hr*μg/mL)가 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 제조한 알파-1 안티트립신(T003)의 약 17% 수준밖에 되지 않고, 체내 배설(CL/F; mL/hr/kg) 속도도 약 6배 정도 높아서 26번 위치에 당화 부위 추가가 약물 동태학적 측면에서는 가장 좋지 않은 결과를 나타내었다.
도 6은 혈장 유래 알파-1 안티트립신, 재조합 알파-1 안티트립신의 변이체들을 피하 투여 시 약물동태 그래프를 나타낸 것이다. 혈장 유래 알파-1 안티트립신은 체내 반감기(t1/2)가 약 15.2시간, 알파-1 안티트립신 변이체 중 AT148T는 반감기가 24.6시간, AT9N은 37.7시간으로 길게 나타났고, AT212N은 19.1시간으로 나타나 추가된 당화 부위에 따라 다양한 양상을 나타내었다.
이와 같은 결과를 종합하여 보면, 알파-1 안티트립신의 loop 지역을 변이시켜 추가 당화를 시킨 알파-1 안티트립신 변이체들(AT26T, AT148T, AT178N, AT201N, AT212N)에서는 추가로 당화를 시키지 않은 재조합 알파-1 안티트립신 대비 반감기에서 약간 증가하는 변화는 있었으나, 다른 약물 동태학적 측면에서 야생형 재조합 알파-1 안티트립신(T003)보다도 더 열등한 결과를 나타내었으며, 이로 인하여 이들 당화 변이체들은 임상적으로 야생형 알파-1 안티트립신 보다 우월한 면이 없다고 할 수 있다.
그러나, 재조합 알파-1 안티트립신을 추가로 당화시킨 변이체들 중 N-말단의 9번 위치에 당화 부위를 추가하면 다른 당 추가 변이체들에 비하여 체내 지속성이 월등히 개선됨은 물론 체내 배출이 현저히 저하되는 것을 알 수 있다. 따라서, 알파-1 안티트립신의 N-말단 펩타이드 구조 중 25번 아미노산 이하의 위치에서 당을 추가 할 경우 약물 동태학적 파라미터들이 변화하는가를 살펴보았다.
도 7은 알파-1 안티트립신의 N-말단 4번 위치, 9번 위치 그리고 12번 위치에 당화를 시킨 변이체들의 약물동태학 실험을 한 결과이다. 그림에서 9번과 12번 위치에 당화가 추가되었을 경우 체내 반감기 혹은 체내 분포도(AUC; area under the curve)가 4번에 당화가 된 변이체보다 월등한 것을 알 수 있다. 알파-1 안티트립신의 N 말단 부위는 X-ray 결정 구조에서 나타나지 않는 부위로서 용액 내에서 무정형의 구조를 가지고 있고, 자유로이 움직이는 부위이다. 이 부위에 당화가 됨으로서 알파-1 안티트립신의 hydrodynamic volume이 증가되고, 체내 반감기가 증가하며 아울러 이 변이체들은 주사 후 체내 흡수율이 증가되는 것으로 유추할 수 있다.
실험예 2. 혈장 유래 알파-1 안티트립신과 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 제조한 알파-1 안티트립신 및 이의 이중체의 약물동태
본 발명에 따른 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 제조한 알파-1 안티트립신 이중체의 약물동태를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 알파-1 안티트립신의 9번 위치에 추가 당화를 시킨 단백질을 병렬로 연결하여 클로닝한 후 CHO 세포에서 발현한 AT9N(M2)-AT9N(M2)과 monomer인 T003을 각각 정제한 후 약물동태 시험을 수행하였다.
도 8에서 보면 AT9N(M2)-AT9N(M2) 이중체(dimer)의 체내 반감기는 32.8시간으로 T003의 체내 반감기 16.5시간에 비해 두 배 증가했으며 AUC 값도 두 배 이상 증가했음을 확인할 수 있었으며, clearance 값도 상당히 감소함을 보였다. 상기로부터, 체내 지속성이 증가된 알파-1 안티트립신의 변이체를 사용함에 있어서 변이체의 단일체로 사용할 수 있을 뿐만 아니라 이중체 또한 약물로 사용가능함을 확인하였다.
실험예 3. 알파-1 안티트립신 및 이의 변이체의 엘라스타제 활성 억제 효과
본 발명에 따른 알파-1 안티트립신 및 이의 변이체의 엘라스타제 활성 억제 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
돼지 췌장 엘라스타제(Calbiochem, Cat. 324682)와 AAA-pNA(N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide, Sigma, S4760)를 각각 효소와 기질로 사용하여 알파-1 안티트립신 및 이의 변이체에 대한 속도상수(rate constant)를 측정하였다. 구체적으로는, 돼지 췌장 엘라스타제와 알파-1 안티트립신 및 이의 변이체를 동일 몰비로 혼합하여 25℃에서 120, 300, 600초 동안 반응시키고, AAA-pNA을 넣은 후 1분 간격으로 5분 동안 반응속도론(kinetics)을 측정하였다. 최종 반응의 농도는 돼지 췌장 엘라스타제와 알파-1 안티트립신 및 이의 변이체가 20nM이고, AAA-pNA는 1mM 이었다.
돼지 췌장 엘라스타제와 알파-1 안티트립신 및 이의 변이체의 반응은 비가역적인 2차 반응(Levenspiel O. Chemical reaction engineering, 2nd edition. 1972, Wiley, New York)이기 때문에 속도상수는 1/R = kaCE0 t + 1 [R=Remaining PPE activity, ka=Rate constant(M-1s-1), CE0=Initial concentration of AAT(M), t=Reaction time(second)]이다. 결합 속도상수(association rate constant; ka)는 각각의 반응시간에 남아 있는 돼지 췌장 엘라스타제의 활성을 이용하여 계산하였으며, 결과는 표 2에 나타내었다.
또한, 알파-1 안티트립신 및 이의 변이체의 평형상수(equilibration constant)는 하기 식으로 계산하였으며, 결과는 표 3에 나타내었다.
Ka (M-1) =[EI]/[E]f/[I]f × 109
[E]T = 효소의 초기 농도(Initial concentration of enzyme)
[I]T = 저해제의 초기 농도(Initial concentration of inhibitor)
[E]f = [E]T × (Atest/Acontrol)
[EI] = [E]T - [E]f = [E]T × (1 - Atest/Acontrol)
[I]f = [I]T - [EI]
A = slope of t(measurement time) vs absorbance
표 2
엘라스타제 억제제 결합 속도상수(ka (M-1s-1))
혈장 알파-1 안티트립신 5.4×105
T003 6.5×105
AT9N 6.0×105
표 3
엘라스타 억제제 평형상수(Ka(M-1))
혈장 알파-1 안티트립신 2.60×109
T003 3.56×109
AT9N 3.04×109
표 2 및 표 3에 나타난 바와 같이, 야생형 인간 알파-1 안티트립신(T003)과 알파-1 안티트립신의 변이체인 AT9N의 결합 속도상수 및 평형상수는 혈장 유래 인간 알파-1 안티트립신의 결합 속도상수 및 평형상수와 유사한 값을 갖는 것으로 관찰되었다. 따라서, 알파-1 안티트립신의 N-말단의 당화는 알파-1 안티트립신의 엘라스타제 활성 억제에 영향을 주지 않는다는 것을 알 수 있었다. 그러나, AT148T 와 혈장유래 알파-1 안티트립신의 엘라스타제에 대한 억제(inhibition) 정도를 비교 하였을때, AT148T는 야생형 알파-1 안티트립신에 비하여 2배 이상 낮은 결합력을 보여주었다. 따라서, AT148T가 당화가 추가되어서 체내 반감기에 영향을 미치기는 하였으나, 알파-1 안티트립신의 148번 위치에 추가된 당은 알파-1 안티트립신과 단백질 분해 효소(Proteolytic enzyme)의 결합에 영향을 끼친다는 것을 알 수 있다.
AT70N 및 AT178N과 같은 변이체들도 엘라스타제와의 결합력에 있어서 야생형 혈장 유래 알파-1 안티트립신에 비하여 현저히 저하된 결합력을 보여 주었다. 이로서 알파-1 안티트립신의 특정 위치에 당화를 추가하면 체내 약물 동태에 영향을 끼칠 수는 있지만, 알파-1 안티트립신의 활성에 영향을 미치지 않는 당화 위치의 선택이 매우 중요하다는 것을 알 수 있다.
실험예 4. 인 성장 호르몬/알파-1 안티트립신 변이체 융합체의 약물동태 실험
본 발명에 따른 인 성장 호르몬/알파-1 안티트립신 변이체의 융합체의 약물동태를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 실험동물로 Sprague-Dawley 쥐(rat)를 사용하였으며, 인 성장 호르몬 투여군에는 3마리, 융합체 투여군에는 5마리를 할당하였다. Sprague-Dawley 쥐에 상기 실시예 2에서 제조한 인 성장 호르몬/알파-1 안티트립신 융합체를 각각 쥐 kg 당 720μg의 투여량으로 피하 주사하였고, 희석액은 인산염완충용액을 사용하였으며, 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 24, 30, 48시간 후 채혈하여 원심분리 후 혈청을 얻었다. 대조군으로는 인 성장 호르몬인 Scitropin(SciGen, 싱가포르)을 쥐 kg 당 200μg의 투여량으로 피하 주사하였고, 희석액은 인산염완충용액을 사용하였으며, 0, 0.33, 1, 2, 5, 8, 12, 18, 24, 30, 48시간 후 채혈하여 원심분리 후 혈청을 얻었다. 각 시료에 대해서는 다음과 같은 효소면역분석 방법을 이용하여 분석하였다. 인 성장 호르몬에 대한 단일클론 항체(Medix Biochemica, 핀란드)를 인산염 완충용액에 1~5μg/mL의 농도로 희석하여 100μL를 96웰 플레이트(Nunc, 덴마크)에 분주한 후 상온에서 15~18시간 동안 방치하였다. 웰 플레이트에 부착되지 않고 남아있는 항체를 제거한 후 1% 소혈청알부민이 용해된 인산염완충용액 250μL를 분주하여 상온에서 2시간 방치시키고 세척용액(0.05% 트윈 20, 인산염완충용액)으로 3회 세척한 후 용액을 제거하였다. 시료는 1% 소혈청알부민이 용해된 인산염완충용액으로 희석하였으며, 96웰 플레이트에 첨가하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 96웰 플레이트를 세척용액으로 5회 세척한 후 sulfo-NHS-biotin(Pierce biotechnology, 미국)을 이용하여 접합시킨 인 성장 호르몬 단클론 항체-biotin 접합체를 희석용액에 희석하여 96웰 플레이트에 100μL씩 분주하였다. 이어서 플레이트를 상온에서 2시간 반응시킨 다음 세척용액으로 5회 세척한 후 스트렙타비딘-HRP 용액을 가하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 세척용액으로 5회 세척하고 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)와 과산화수소수 발색용액 100μL를 각 웰에 첨가한 후 암소에서 30분간 반응시켰다. 1M 황산 100μL를 각 웰에 첨가하여 반응을 종료시키고, VersaMax microplate reader(Molecular Device, 미국)로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 정량값은 표준물질에 대한 표준곡선을 작성한 후 회귀분석을 통해 구하였다.
본 발명에 따른 인 성장 호르몬/알파-1 안티트립신 변이체의 융합체의 약물동태 그래프는 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 본 발명의 인 성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이체의 융합체의 혈중반감기(t1/2)는 약 6시간으로 인 성장호르몬에 비해 4배 이상 현저히 증가된 체내 안정성을 갖는다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 5. 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이체 융합체의 약물동태 실험
본 발명에 따른 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이체 융합체의 약물동태를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 실험동물로 Sprague-Dawley 쥐(rat)를 사용하였으며, 과립구 자극인자 투여군에는 5마리, 융합체 투여군에는 3마리를 각각 할당하였다. Sprague-Dawley 쥐에 실시예 3의 방법으로 제조한 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이체 융합체(pT603N)를 각각 쥐 kg당 340μg의 투여량으로 피하 주사하였고, 희석액으로는 인산염완충용액(phosphate buffered saline, PBS)을 사용하였다. 피하 주사 후, 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 24, 36, 48, 60, 및 72시간 후 채혈하여 원심분리하여 혈청을 수득하였다. 대조군으로는 과립구 자극인자인 그라신(Grasin, Filgrastim)을 인산염완충용액으로 희석하여 쥐 kg당 100μg의 투여량으로 피하 주사하고, 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 24, 36, 및 48시간 후 채혈하여 원심분리하여 혈청을 수득하였다. 각 시료에 대해서는 하기와 같은 효소면역분석방법(ELISA)을 이용하여 분석하였다. 과립구 자극인자에 대한 단클론 항체(R&D systems)를 인산염 완충용액에 1~10μg/mL의 농도로 희석하여 100μL씩 96웰 플레이트(Nunc, 덴마크)에 분주한 후 상온에서 15~18시간 동안 방치하였다. 이후 웰 플레이트에 부착되지 않고 남아있는 항체를 제거한 후 1% 소혈청알부민이 용해된 인산염완충용액 250μL를 분주하여 상온에서 2시간 방치시키고 세척용액(0.05% 트윈 20, 인산염완충용액)으로 3회 세척한 후 용액을 제거하였다. 시료는 1% 소혈청알부민이 용해된 인산염완충용액으로 희석하였으며, 96웰 플레이트에 첨가하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 96웰 플레이트를 세척용액으로 5회 세척한 후 과립구 자극인자 다클론 항체-biotin 접합체(R&D systems)를 희석용액에 희석하여 96웰 플레이트에 100μL씩 분주하였다. 이어서 플레이트를 상온에서 2시간 반응시킨 다음 세척용액으로 5회 세척하고 스트렙타비딘-HRP 용액을 가하여 상온에서 30분간 반응시킨 후, 세척용액으로 5회 세척하고 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)와 과산화수소수 발색용액 100μL를 각 웰에 첨가한 후 암소에서 30분간 반응시켰다. 이후 1M 황산 용액 100μL를 각 웰에 첨가하여 반응을 종료시키고, VersaMax microplate reader(Molecular Device, 미국)로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 정량값은 표준물질에 대한 표준곡선을 작성한 후 회귀분석을 통해 구하였다. 본 발명에 따른 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 변이체의 융합체의 약물동태 그래프는 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, 본 발명의 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이체 융합체의 혈중반감기(t1/2)는 약 7.3시간으로 과립구 자극인자의 2.7시간에 비해 약 3배, AUC는 3배 이상 현저히 증가된 체내 안정성을 갖는다는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통하여, 상기 알파-1 안티트립신 이중변이체에 생리활성 단백질과 같은 이종 단백질을 결합시키면 이종 단백질의 반감기를 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
본 발명에 따른 N-말단의 1번 위치에서 25번 위치 사이의 아미노산 변이를 통해 N-당화 부위를 추가시킨 알파-1 안티트립신 변이체를 알파-1 안티트립신 결핍증의 예방 또는 치료에 사용할 경우, 혈중 반감기(t1/2)와 약물농도-시간 곡선하 면적(AUC)이 현저히 증가하여 체내 안정성이 우수하고, 엘라스타제 활성 억제 효과가 유지되게 된다. 따라서 본 발명에 따른 알파-1안티트립신 변이체를 사용하면 알파-1 안티트립신 결핍증에 사용할 수 있고, 알파-1 안티트립신 변이체에 이종 단백질을 결합시켜 이종 단백질의 체내 반감기를 증가시키는데 사용할 수 있으므로 예방법 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hGH reverse primer
<400> 34
ggggggatcc tcgaagccac agctgccctc 30
<210> 35
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P357N forward primer
<400> 35
ccatgttttt agaggccata aacatgtcta tccccccc 38
<210> 36
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P357N reverse primer
<400> 36
gggggggata gacatgttta tggcctctaa aaacatgg 38
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> XhoCSF forward primer
<400> 37
gggcccctcg agatggctgg acctgccacc 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CSFBam reverse primer
<400> 38
ggggggatcc tcgggctggg caaggtggcg 30
<210> 39
<211> 1182
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pT003
<400> 39
gaggatcccc agggagatgc tgcccagaag acagatacat cccaccatga tcaggatcac 60
ccaaccttca acaagatcac ccccaacctg gctgagttcg ccttcagcct ataccgccag 120
ctggcacacc agtccaacag caccaatatc ttcttctccc cagtgagcat cgctacagcc 180
tttgcaatgc tctccctggg gaccaaggct gacactcacg atgaaatcct ggagggcctg 240
aatttcaacc tcacggagat tccggaggct cagatccatg aaggcttcca ggaactcctc 300
cgtaccctca accagccaga cagccagctc cagctgacca ccggcaatgg cttgttcctc 360
agcgagggcc tgaagctagt ggataagttt ttggaggatg ttaaaaagtt gtaccactca 420
gaagccttca ctgtcaactt cggggacacc gaagaggcca agaaacagat caacgattac 480
gtggagaagg gtactcaagg gaaaattgtg gatttggtca aggagcttga cagagacaca 540
gtttttgctc tggtgaatta catcttcttt aaaggcaaat gggagagacc ctttgaagtc 600
aaggacaccg aggaagagga cttccacgtg gaccaggtga ccaccgtgaa ggtgcctatg 660
atgaagcgtt taggcatgtt taacatccag cactgtaaga agctgtccag ctgggtgctg 720
ctgatgaaat acctgggcaa tgccaccgcc atcttcttcc tgcctgatga ggggaaacta 780
cagcacctgg aaaatgaact cacccacgat atcatcacca agttcctgga aaatgaagac 840
agaaggtctg ccagcttaca tttacccaaa ctgtccatta ctggaaccta tgatctgaag 900
agcgtcctgg gtcaactggg catcactaag gtcttcagca atggggctga cctctccggg 960
gtcacagagg aggcacccct gaagctctcc aaggccgtgc ataaggctgt gctgaccatc 1020
gacgagaaag ggactgaagc tgctggggcc atgtttttag aggccatacc catgtctatc 1080
ccccccgagg tcaagttcaa caaacccttt gtcttcttaa tgattgacca aaataccaag 1140
tctcccctct tcatgggaaa agtggtgaat cccacccaaa aa 1182
<210> 40
<211> 1182
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pT006
<400> 40
gaggatcccc agggagatgc tgcccagaag acagatacat cccaccatga tcaggatcac 60
ccaaccttca acaagatcac ccccaacctg gctgagttcg ccttcagcct ataccgccag 120
ctggcacacc agtccaacag caccaatatc ttcttctccc cagtgagcat cgctacagcc 180
tttgcaatgc tctccctggg gaccaaggct gacactcacg atgaaatcct ggagggcctg 240
aatttcaacc tcacggagat tccggaggct cagatccatg aaggcttcca ggaactcctc 300
cataccctca accagccaga cagccagctc cagctgacca ccggcaatgg cctgttcctc 360
agcgagggcc tgaagctagt ggataagttt ttggaggatg ttaaaaagtt gtaccactca 420
gaagccttca ctgtcaactt cggggacacc gaagaggcca agaaacagat caacgattac 480
gtggagaagg gtactcaagg gaaaattgtg gatttggtca aggagcttga cagagacaca 540
gtttttgctc tggtgaatta catcttcttt aaaggcaaat gggagagacc ctttgaagtc 600
aaggacaccg aggaagagga cttccacgtg gaccaggtga ccaccgtgaa ggtgcctatg 660
atgaagcgtt taggcatgtt taacatccag cactgtaaga agctgtccag ctgggtgctg 720
ctgatgaaat acctgggcaa tgccaccgcc atcttcttcc tgcctgatga ggggaaacta 780
cagcacctgg aaaatgaact cacccacgat atcatcacca agttcctgga aaatgaagac 840
agaaggtctg ccagcttaca tttacccaaa ctgtccatta ctggaaccta tgatctgaag 900
agcgtcctgg gtcaactggg catcactaag gtcttcagca atggggctga cctctccggg 960
gtcacagagg aggcacccct gaagctctcc aaggccgtgc ataaggctgt gctgaccatc 1020
gacgagaaag ggactgaagc tgctggggcc atgtttttag aggccatacc catgtctatc 1080
ccccccgagg tcaagttcaa caaacccttt gtcttcttaa tgattgacca aaataccaag 1140
tctcccctct tcatgggaaa agtggtgaat cccacccaaa aa 1182
<210> 41
<211> 394
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Alpha-1 antitrypsine
<400> 41
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
1 5 10 15
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30
Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45
Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95
Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110
Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125
Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140
Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160
Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175
Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205
His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220
Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255
Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270
Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335
Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365
Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Asp Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380
Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys
385 390
<210> 42
<211> 394
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Alpha-1 antitrypsine variant
<400> 42
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Asn Lys Thr Asp Thr Ser His His
1 5 10 15
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30
Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45
Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95
Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110
Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125
Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140
Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160
Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175
Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205
His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220
Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255
Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270
Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335
Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365
Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Asp Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380
Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys
385 390
<210> 43
<211> 1755
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> phGH-AT9N DNA
<400> 43
ttcccaacca ttcccttatc caggcttttt gacaacgcta tgctccgcgc ccatcgtctg 60
caccagctgg cctttgacac ctaccaggag tttgaagaag cctatatccc aaaggaacag 120
aagtattcat tcctgcagaa cccccagacc tccctctgtt tctcagagtc tattccgaca 180
ccctccaaca gggaggaaac acaacagaaa tccaacctag agctgctccg catctccctg 240
ctgctcatcc agtcgtggct ggagcccgtg cagttcctca ggagtgtctt cgccaacagc 300
ctggtgtacg gcgcctctga cagcaacgtc tatgacctcc taaaggacct agaggaaggc 360
atccaaacgc tgatggggag gctggaagat ggcagccccc ggactgggca gatcttcaag 420
cagacctaca gcaagttcga cacaaactca cacaacgatg acgcactact caagaactac 480
gggctgctct actgcttcag gaaggacatg gacaaggtcg agacattcct gcgcatcgtg 540
cagtgccgct ctgtggaggg cagctgtggc ttcgaggatc cccagggaga tgctgccaac 600
aagacagata catcccacca tgatcaggat cacccaacct tcaacaagat cacccccaac 660
ctggctgagt tcgccttcag cctataccgc cagctggcac accagtccaa cagcaccaat 720
atcttcttct ccccagtgag catcgctaca gcctttgcaa tgctctccct ggggaccaag 780
gctgacactc acgatgaaat cctggagggc ctgaatttca acctcacgga gattccggag 840
gctcagatcc atgaaggctt ccaggaactc ctccataccc tcaaccagcc agacagccag 900
ctccagctga ccaccggcaa tggcctgttc ctcagcgagg gcctgaagct agtggataag 960
tttttggagg atgttaaaaa gttgtaccac tcagaagcct tcactgtcaa cttcggggac 1020
accgaagagg ccaagaaaca gatcaacgat tacgtggaga agggtactca agggaaaatt 1080
gtggatttgg tcaaggagct tgacagagac acagtttttg ctctggtgaa ttacatcttc 1140
tttaaaggca aatgggagag accctttgaa gtcaaggaca ccgaggaaga ggacttccac 1200
gtggaccagg tgaccaccgt gaaggtgcct atgatgaagc gtttaggcat gtttaacatc 1260
cagcactgta agaagctgtc cagctgggtg ctgctgatga aatacctggg caatgccacc 1320
gccatcttct tcctgcctga tgaggggaaa ctacagcacc tggaaaatga actcacccac 1380
gatatcatca ccaagttcct ggaaaatgaa gacagaaggt ctgccagctt acatttaccc 1440
aaactgtcca ttactggaac ctatgatctg aagagcgtcc tgggtcaact gggcatcact 1500
aaggtcttca gcaatggggc tgacctctcc ggggtcacag aggaggcacc cctgaagctc 1560
tccaaggccg tgcataaggc tgtgctgacc atcgacgaga aagggactga agctgctggg 1620
gccatgtttt tagaggccat acccatgtct atcccccccg aggtcaagtt caacaaaccc 1680
tttgtcttct taatgattga ccaaaatacc aagtctcccc tcttcatggg aaaagtggtg 1740
aatcccaccc aaaaa 1755
<210> 44
<211> 394
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Alpha-1 antitrypsine divariant
<400> 44
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Asn Lys Thr Asp Thr Ser His His
1 5 10 15
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30
Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45
Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95
Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110
Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125
Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140
Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160
Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175
Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205
His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220
Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255
Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270
Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335
Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Ile Asn Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365
Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Asp Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380
Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys
385 390
<210> 45
<211> 1706
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pT603N
<400> 45
ccacccccct gggccctgcc agctccctgc cccagagctt cctgctcaag tgcttagagc 60
aagtgaggaa gatccagggc gatggcgcag cgctccagga gaagctgtgt gccacctaca 120
agctgtgcca ccccgaggag ctggtgctgc tcggacactc tctgggcatc ccctgggctc 180
ccctgagcag ctgccccagc caggccctgc agctggcagg ctgcttgagc caactccata 240
gcggcctttt cctctaccag gggctcctgc aggccctgga agggatctcc cccgagttgg 300
gtcccacctt ggacacactg cagctggacg tcgccgactt tgccaccacc atctggcagc 360
agatggaaga actgggaatg gcccctgccc tgcagcccac ccagggtgcc atgccggcct 420
tcgcctctgc tttccagcgc cgggcaggag gggtcctggt tgcctcccat ctgcagagct 480
tcctggaggt gtcgtaccgc gttctacgcc accttgccca gcccgaggat ccccagggag 540
atgctgccaa caagacagat acatcccacc atgatcagga tcacccaacc ttcaacaaga 600
tcacccccaa cctggctgag ttcgccttca gcctataccg ccagctggca caccagtcca 660
acagcaccaa tatcttcttc tccccagtga gcatcgctac agcctttgca atgctctccc 720
tggggaccaa ggctgacact cacgatgaaa tcctggaggg cctgaatttc aacctcacgg 780
agattccgga ggctcagatc catgaaggct tccaggaact cctccatacc ctcaaccagc 840
cagacagcca gctccagctg accaccggca atggcctgtt cctcagcgag ggcctgaagc 900
tagtggataa gtttttggag gatgttaaaa agttgtacca ctcagaagcc ttcactgtca 960
acttcgggga caccgaagag gccaagaaac agatcaacga ttacgtggag aagggtactc 1020
aagggaaaat tgtggatttg gtcaaggagc ttgacagaga cacagttttt gctctggtga 1080
attacatctt ctttaaaggc aaatgggaga gaccctttga agtcaaggac accgaggaag 1140
aggacttcca cgtggaccag gtgaccaccg tgaaggtgcc tatgatgaag cgtttaggca 1200
tgtttaacat ccagcactgt aagaagctgt ccagctgggt gctgctgatg aaatacctgg 1260
gcaatgccac cgccatcttc ttcctgcctg atgaggggaa actacagcac ctggaaaatg 1320
aactcaccca cgatatcatc accaagttcc tggaaaatga agacagaagg tctgccagct 1380
tacatttacc caaactgtcc attactggaa cctatgatct gaagagcgtc ctgggtcaac 1440
tgggcatcac taaggtcttc agcaatgggg ctgacctctc cggggtcaca gaggaggcac 1500
ccctgaagct ctccaaggcc gtgcataagg ctgtgctgac catcgacgag aaagggactg 1560
aagctgctgg ggccatgttt ttagaggcca taaacatgtc tatccccccc gaggtcaagt 1620
tcaacaaacc ctttgtcttc ttaatgattg accaaaatac caagtctccc ctcttcatgg 1680
gaaaagtggt gaatcccacc caaaaa 1706

Claims (12)

  1. 알파-1 안티트립신의 N-말단의 1번 위치에서 25번 위치 사이의 특정 부위에 있는 아미노산을 치환하여 당화 부위를 추가시킨, 알파-1 안티트립신 변이체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 알파-1 안티트립신 변이체는 당화 부위를 하나 내지 세 개 이하로 추가시킨 것을 특징으로 하는, 알파-1 안티트립신 변이체.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 특정 부위는 N-말단의 3번 위치에서 13번 위치 사이인 것을 특징으로 하는, 알파-1 안티트립신 변이체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 특정 부위는 N-말단의 9번 혹은 12번 위치인 것을 특징으로 하는, 알파-1 안티트립신 변이체.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 특정 부위는 N-말단의 4번과 9번, 혹은 4번과 12번, 혹은 9번과 12번 위치인 것을 특징으로 하는, 알파-1 안티트립신 변이체.
  6. a) 알파-1 안티트립신의 N-말단의 1번 위치에서 25번 위치 사이의 특정 부위에 있는 아미노산을 치환하여 당화 부위를 추가시키는 단계;
    b) 상기 당화 부위가 추가된 알파-1 안티트립신 발현벡터를 전이시킨 세포를 배양 배지 상에서 배양하는 단계;
    c) 상기 세포로부터 알파-1 안티트립신 변이체 단백질을 발현시키는 단계; 및
    d) 상기 발현된 알파-1 안티트립신 변이체 단백질을 정제하고 회수하는 단계를 포함하는, 알파-1 안티트립신 변이체의 제조방법.
  7. 알파-1 안티트립신의 N-말단의 1번 위치에서 25번 위치 사이의 특정 부위에 있는 아미노산을 치환하여 당화 부위를 추가시킨 알파-1 안티트립신 변이체를 유효성분으로 함유하는, 알파-1 안티트립신 결핍증의 예방 또는 치료용 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 알파-1 안티트립신 결핍증은 만성 폐쇄성 폐질환 혹은 간경변인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  9. 알파-1 안티트립신의 N-말단의 1번 위치에서 25번 위치 사이의 특정 부위에 있는 아미노산을 치환하여 당화 부위를 추가시킨 알파-1 안티트립신 변이체를 치료적 유효량으로 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 알파-1 안티트립신 결핍증의 예방 또는 치료방법.
  10. 알파-1 안티트립신의 N-말단의 1번 위치에서 25번 위치 사이의 특정 부위에 있는 아미노산을 치환하여 당화 부위를 추가시킨 알파-1 안티트립신 변이체 두 개를 연결하여 체내 반감기가 증가된 알파-1 안티트립신 변이체의 융합체.
  11. 알파-1 안티트립신의 N-말단의 1번 위치에서 25번 위치 사이의 특정 부위에 있는 아미노산을 치환하여 당화 부위를 추가시킨 알파-1 안티트립신 변이체에 다른 이종 단백질을 연결하여 이종 단백질의 체내 반감기가 증가된 알파-1 안티트립신 변이체의 융합체.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 알파-1 안티트립신 변이체는 추가적으로 P2 위치인 357번째 아미노산인 프롤린(proline)이 아스파라진(asparagine)으로 치환된 것을 특징으로 하는, 알파-1 안티트립신 변이체의 융합체.
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