JP6001074B2 - 新規なα−１アンチトリプシン変異体、その製造方法及び用途 - Google Patents

新規なα−１アンチトリプシン変異体、その製造方法及び用途 Download PDF

Info

Publication number
JP6001074B2
JP6001074B2 JP2014530581A JP2014530581A JP6001074B2 JP 6001074 B2 JP6001074 B2 JP 6001074B2 JP 2014530581 A JP2014530581 A JP 2014530581A JP 2014530581 A JP2014530581 A JP 2014530581A JP 6001074 B2 JP6001074 B2 JP 6001074B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antitrypsin
leu
mutant
lys
thr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2014530581A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2014534166A (ja
Inventor
チェ パク、ソン
チェ パク、ソン
チョン、ヘ−シン
ミ イ、サン
ミ イ、サン
ソン キム、チ
ソン キム、チ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Alteogen Inc
Original Assignee
Alteogen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alteogen Inc filed Critical Alteogen Inc
Publication of JP2014534166A publication Critical patent/JP2014534166A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6001074B2 publication Critical patent/JP6001074B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8121—Serpins
    • C07K14/8125—Alpha-1-antitrypsin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/16—Blood plasma; Blood serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/05—Dipeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/785—Alveolar surfactant peptides; Pulmonary surfactant peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06191—Dipeptides containing heteroatoms different from O, S, or N
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K9/001—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure
    • C07K9/005—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure containing within the molecule the substructure with m, n > 0 and m+n > 0, A, B, D, E being heteroatoms; X being a bond or a chain, e.g. muramylpeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)

Description

本発明は、新規なα−１アンチトリプシン変異体、その製造方法及び用途に関する。
α−１アンチトリプシン(ａｌｐｈａ−１ ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ)は、３９４個のアミノ酸で構成された分子量約５０,０００ダルトンの哺乳類の血液内に存在するタンパク質の一つとして、血液内濃度は、約２ｍｇ/ｍＬに達する主血液タンパク質の一つであり(Ｒｏｂｉｎ Ｗ.Ｃ. ｅｔ. ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ, ２９８, ３２９−３３４, １９８２)、α−１プロテアーゼ抑制剤(ａｌｐｈａ−１ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ)とも呼ばれる。α−１アンチトリプシンは、自然界に１００余種以上の対立遺伝子(ａｌｌｅｌｅ)が存在し、表現型(ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ)は、ＩＥＦ(ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ)類型によってＡからＺに区分される。この中で一番多いＭ型対立遺伝子が大部分のヒトの血液内に存在し、少なくとも約７５個のイソフォーム(ｉｓｏｆｏｒｍ)が存在することで知られており(Ｂｒａｎｔｌｅｙ, Ｍ. ｅｔ. ａｌ., Ａｍ. Ｊ. Ｍｅｄ., ８４(ｓｕｐｐｌ. ６Ａ), １３−３１, １９８８)、タンパク質分解酵素抑制剤としての主機能も維持されている。
一般的に、約９０％のα−１アンチトリプシンは、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５の５個のＰｉＭ ｓｕｂｔｙｐｅが存在することで知られている。この中で、Ｍ１が約６７％、Ｍ２が約１６％、そしてＭ３が約１１％の分布を示している(Ｊａｎ−Ｏｌｏｆ Ｊｅｐｐｓｓｏｎ ａｎｄ Ｃａｒｌ−Ｂｅｒｔｉｌ Ｌａｕｒｅｌｌ, ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ., ２３１, ３２７−３３０, １９８８)。この中でＭ２タイプは、１０１番位置にＨｉｓが存在し、Ｍ３サブタイプは、１０１番位置にＡｒｇが存在し、α−１アンチトリプシン固有の活性には影響を与えないことで知られている。
α−１アンチトリプシンは、共通的にタンパク質の３ヶ所に糖化されている糖タンパク質の構造を有しており(Ｍｅｇａ, Ｔ. ｅｔ. ａｌ., Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ., ２５５, ４０５７−４０６１, １９８０)、Ｘ−ｒａｙ結晶構造によれば、α−１アンチトリプシンは、血液に存在する他のタンパク質分解酵素抑制剤(Ｓｅｒｐｉｎ類)と同様に３個のβシート(ｂｅｔａ−ｓｈｅｅｔ)と８個のアルファへリックス(ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ)構造を有している(Ｅｌｌｉｏｔ Ｐ.Ｒ., ｅｔ. ａｌ., ＪＭＢ, ２７５, ４１９−４２５, １９９８)。α−１アンチトリプシンは、体内で多くの種類のタンパク質分解酵素を抑制するが、現在知られた疾患と関連された生体内の主な機能は、好中球エラスターゼ(ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｌａｓｔａｓｅ)の活性を抑制して(Ｂｅａｔｔｙ ｅｔ. ａｌ., Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ., ２５５, ３９３１〜３９３４, １９８０)、α−１アンチトリプシンが欠乏されると、エラスチンの分解により肺機能が低下される肺気腫(ｅｍｐｈｙｓｅｍａ)のような深刻な疾病が誘発される。また、α−１アンチトリプシンの変形されたタンパク質は、肝(ｌｉｖｅｒ)でまともに分泌されなくて、変形されたα−１アンチトリプシンが肝に蓄積されて結局肝硬変(Ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ)が発生するという臨床的報告もある。
現在、α−１アンチトリプシン欠乏症治療剤として、ヒトの血液から抽出した何種類の製品がアメリカＦＤＡから医薬品で許可を受けて市販されている。代表的な製品では、Ｔａｌｅｃｒｉｓ社のＰｒｏｌａｓｔｉｎ、Ｂａｘｔｅｒ社のアラルラスト(Ａｒａｌａｓｔ)、そしてＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ社のＺｅｍａｉｒａがあり、通常的に、６０ｍｇ/ｋｇの用量で１週間隔で静脈注射して人体に投与される。したがって、大人１人当り１週に４〜５ｇの多量のタンパク質を患者に長期投与しなければならない。
データモニター(Ｄａｔａ Ｍｏｎｉｔｏｒ)(ＤＭＨＣ２３６４)分析によれば、アメリカとヨーロッパにおいて遺伝的にα−１アンチトリプシンに問題がある患者数が２０万人に至ることで推測されるが、適切な診断が行われないので、一部患者のみが治療を受けている。現在まで医薬品で開発された製品は、全てヒトの血液から抽出したα−１アンチトリプシンである。このようなヒトの血液から抽出したα−１アンチトリプシンは、製造過程で徹底に遮断してもヒト免疫欠乏ウイルス(ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｖｉｒｕｓ)、Ｂ型肝炎ウイルス(ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ)、Ｃ型肝炎ウイルス(ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ)などヒトに致命的な疾病を誘発させることができる人体に有害なウイルスなどが常在する可能性が存在し、いくつかの病原体に対する血液選別検査とウイルス不活性化過程を使用しても今まで知られていない稀少病原体の基本的な根絶が不可能であるため、未知の病原体による人体感染の恐れはいつも存在する。また、商業的に必要なα−１アンチトリプシンを製造するための汚染されなかった血液の円滑な供給もいつも問題になって来た。
このような問題点を解決するためには、遺伝子再組み換え技術を利用してα−１アンチトリプシンを治療剤で開発する必要がある。したがって、これと関連された多様な研究が進行されて来たが、さまざまな制限的な要因により今まで商業的に成功できなかった。
ヒトα−１アンチトリプシンは、総３個の部位(４６番アスパラギン、８３番アスパラギン、２４７番アスパラギン)で糖化が起きて３個のＮ−グリカンを有することで知られている。遺伝子再組み換え方法でＥ.ｃｏｌｉのような微生物を利用して生成されたα−１アンチトリプシンの場合、ヒト由来のα−１アンチトリプシンとは異なり糖化されないため、体内投与時に半減期が短いことで知られている(Ｋａｒｎａｕｋｈｏｖａ ｅｔ. ａｌ., Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ, ３０, ３１７−３３２, ２００６, Ｇａｒｖｅｒ Ｊｒ. ｅｔ. ａｌ., Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｉ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ., ８４, １０５０−１０５４, １９８７)。このような問題点を克服して多量のα−１アンチトリプシンを経済的に得るために、α−１アンチトリプシンを植物から発現させる研究が行われた。しかし、植物から発現された再組み換えα−１アンチトリプシンの場合、植物由来の糖化が起きたが、体内半減期がヒトα−１アンチトリプシンに比べて短いことで報告された(Ｈｕａｎｇ ｅｔ. ａｌ., Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. Ｐｒｏｇ., １７, １２６−１３３, ２００１)。
α−１アンチトリプシンの体内半減期を改善するために、Ｃａｎｔｉｎなどは、微生物から発現させたα−１アンチトリプシンのシステイン残基にポリエチレングリコールを接合させた融合体に対して報告した(Ｃａｎｔｉｎ ｅｔ. ａｌ., Ａｍ. Ｊ. Ｒｅｓｐｉｒ. Ｃｅｌｌ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ., ２７, ６５９−６６５, ２００２)。前記論文によれば、微生物から発現させたα−１アンチトリプシンのシステイン残基に２０ＫＤａと４０ＫＤａのポリエチレングリコールを接合させると、微生物から発現されたα−１アンチトリプシンに比べて体内半減期が改善されてヒトα−１アンチトリプシンと類似な水準に到逹した。しかし、タンパク質にポリエチレングリコールを接合させると、化学的な副反応によりさまざまな産物が作られて、これを除去するための追加工程が必要になる。また、ヒトα−１アンチトリプシンが有している糖構造上Ｎ−グリカンがないので、露出されたアミノ酸配列に対する免疫原性問題が発生する可能性がある。
動物細胞由来のα−１アンチトリプシンは、ヒトα−１アンチトリプシンと類似な体内半減期を有することで知られている(Ｇａｒｖｅｒ Ｊｒ. ｅｔ. ａｌ., Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｉ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ., ８４, １０５０−１０５４, １９８７)。したがって、ヒトα−１アンチトリプシンと糖構造が類似な動物細胞を利用して製造することが好ましい方法であると言える。しかし、動物細胞を利用した製造方法は、一般的に微生物を利用してα−１アンチトリプシンを生産することに比べて製造費用がたくさんかかるという短所がある。
一方、α−１アンチトリプシンの体内半減期を増加させるために、α−１アンチトリプシンのループ(ｌｏｏｐ)領域などに糖化部位を追加する技術が研究された。一般的に動物細胞から発現されたタンパク質に糖化を追加する場合、糖化が付かされたタンパク質の流体力学的容積(ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｖｏｌｕｍｅ)が増加して、糖化が追加されなかったタンパク質に比べて人体内に投与される場合、体内半減期が増加すると考えられる。しかし、一般的に生理活性タンパク質に糖化を変更または追加する方法は、赤血球生成促進因子(ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ)の例から分かるように、糖化が追加された位置にしたがって体内半減期に大きい影響を与えるようになる(Ｅｌｉｏｔｔ ｅｔ. ａｌ., Ｎａｔ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ., ２１, ４１４−４２１, ２００３)。したがって、体内半減期を増加させるためにα−１アンチトリプシンに糖化を追加する場合、α−１アンチトリプシンのどの位置に糖化部位を追加すると体内安全性のような生理活性の改善が行われるかに対する研究結果が具体的に証明されなければならない。
結論的に、α−１アンチトリプシンの体内安全性を増加させるために、α−１アンチトリプシンを遺伝子再組み換え技術を利用して製造しようとする多様な方法が試みされて来たが、このような方法は、前述したさまざまな問題により医薬用で開発することが適合ではなかった。したがって、体内安全性が優れた再組み換えα−１アンチトリプシンを開発するための新しい方法に対する研究の必要性が切実に要求されている。
本発明者は、臨床的に有用な再組み換えα−１アンチトリプシンを構成するために、α−１アンチトリプシンの多くの特定部位に糖化を追加してα−１アンチトリプシン変異体を製造したところ、血中半減期(ｔ１/２)と薬物濃度−時間曲線下面積(ＡＵＣ)が顕著に増加して体内安全性が優秀であり、エラスターゼ活性抑制効果が維持されるα−１アンチトリプシン変異体を確認して、本発明を完成した。
本発明は、α−１アンチトリプシンのＮ−末端の１番位置から２５番位置の間の特定部位にあるアミノ酸を置換して糖化部位を追加させたα−１アンチトリプシン変異体を提供する。
本発明の一具現例として、前記α−１アンチトリプシン変異体は、糖化部位を１個〜３個以下で追加させたことを特徴とする。
本発明の他の具現例として、前記特定部位は、Ｎ−末端の３番位置から１３番位置の間であることを特徴とする。
本発明のまた他の具現例として、前記特定部位は、Ｎ−末端の９番位置あるいは１２番位置であることを特徴とする。
本発明のまた他の具現例として、前記特定部位は、Ｎ−末端の４番と９番、あるいは４番と１２番、あるいは９番と１２番位置であることを特徴とする。
また、本発明は、α−１アンチトリプシンのＮ−末端の１番位置から２５番位置の間の特定部位にあるアミノ酸を置換して糖化部位を追加させる段階と、前記糖化部位が追加されたα−１アンチトリプシン変異体発現ベクターを転移させた細胞を培地上で培養する段階と、前記細胞からα−１アンチトリプシン変異体タンパク質を発現させる段階と、前記発現されたα−１アンチトリプシン変異体タンパク質を精製して回収する段階と、を含む、α−１アンチトリプシン変異体の製造方法を提供する。
また、本発明は、α−１アンチトリプシンのＮ−末端の１番位置から２５番位置の間の特定部位にあるアミノ酸を置換して糖化部位を追加させたα−１アンチトリプシン変異体を有効成分で含む、α−１アンチトリプシン欠乏症の予防または治療用組成物を提供する。
本発明の一具現例として、前記α−１アンチトリプシン欠乏症は、慢性閉鎖性肺疾患あるいは肝硬変であることを特徴とする。
また、本発明は、α−１アンチトリプシンのＮ−末端の１番位置から２５番位置の間の特定部位にあるアミノ酸を置換して糖化部位を追加させたα−１アンチトリプシン変異体を治療的有効量で患者に投与することを特徴とするα−１アンチトリプシン欠乏症の予防または治療方法を提供する。
また、本発明は、α−１アンチトリプシンのＮ−末端の１番位置から２５番位置の間の特定部位にあるアミノ酸を置換して糖化部位を追加させたα−１アンチトリプシン変異体を二つ連結して体内半減期が増加されたα−１ アンチトリプシン変異体の融合体を提供する。
また、本発明は、α−１アンチトリプシンのＮ−末端の１番位置から２５番位置の間の特定部位にあるアミノ酸を置換して糖化部位を追加させたα−１アンチトリプシン変異体に他の異種タンパク質を連結して異種タンパク質の体内半減期が増加されたα−１アンチトリプシン変異体の融合体を提供する。
本発明の一具現例として、前記α−１アンチトリプシン変異体は、追加的にＰ２位置である３５７番目アミノ酸のプロリン(ｐｒｏｌｉｎｅ)がアスパラギン(ａｓｐａｒａｇｉｎｅ)に置換れたことを特徴とする。
本発明によるα−１アンチトリプシン変異体は、Ｎ−末端の１番位置から２５番位置の間のアミノ酸変異を通じてＮ−糖化部位を追加させることで、血中半減期(ｔ１/２)と薬物濃度−時間曲線下面積(ＡＵＣ)が顕著に増加して体内安全性が優秀であり、エラスターゼ活性抑制効果が維持される。したがって、本発明のα−１アンチトリプシン変異体は、α−１アンチトリプシン欠乏症の予防または治療に有用に使用することができる。また、本発明によるα−１アンチトリプシン変異体に異種タンパク質を結合させて異種タンパク質の体内半減期を増加させるために使用することができる。
本発明によるα−１アンチトリプシンベクター(ｐＴ００３)の模式図である。 本発明によるα−１アンチトリプシン変異体の配列と位置を示した図である。 本発明の精製されたα−１アンチトリプシン及びその変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示した図である。 血漿由来のα−１ アンチトリプシン及び本発明の動物細胞から発現させた再組み換えα−１アンチトリプシンの皮下投与薬物動態グラフを示した図である。 本発明によるα−１アンチトリプシン及びその変異体の皮下投与薬物動態グラフを示した図である。 血漿由来のα−１アンチトリプシン及び再組み換えα−１アンチトリプシン変異体の皮下投与薬物動態グラフを示した図である。 本発明によるα−１アンチトリプシン変異体の皮下及び静脈投与薬物動態グラフを示した図である。 本発明によるα−１アンチトリプシン及び二量体(ｄｉｍｅｒ)の静脈投与薬物動態グラフを示した図である。 本発明によるヒト成長ホルモン/α−１アンチトリプシン変異体の融合体の皮下投与薬物動態グラフを示した図である。 本発明による顆粒球刺激因子/α−１アンチトリプシン変異体融合体の皮下投与薬物動態グラフを示した図である。
本発明は、α−１アンチトリプシンのＮ−末端の１番位置から２５番位置の間の特定部位にあるアミノ酸を置換して糖化部位を追加させたα−１アンチトリプシン変異体を提供する。
本発明によるα−１アンチトリプシン変異体は、α−１アンチトリプシンの三つの糖化部位(４６番アスパラギン、８３番アスパラギン、２４７番アスパラギン)以外に、Ｎ−末端の１番位置から２５番位置の間の特定部位にあるアミノ酸を置換してＮ−糖化部位を追加することを特徴とする。追加できる糖化部位の数には、制限がない。好ましくは、１個〜３個以下である。
前記ヒトα−１アンチトリプシンのＮ−末端の特定部位にＮ−糖化部位を追加することは、Ｎ−末端の１番位置から２５番位置の間でＮ−グリカン付着部位配列であるＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ/Ｓｅｒを生成させることを特徴とする。好ましくは、ヒトα−１アンチトリプシンのＮ−末端の３番位置から１３番位置の間、一番好ましくは、、Ｎ−末端の９番位置、あるいは１２番位置のアミノ酸であるグルタミンをアスパラギンに置換して糖化部位を追加する。糖化追加による変異体は、４番と９番、あるいは４番と１２番、あるいは９番と１２番の位置に糖が同時に追加された構造を得ることができ、本実施例で記述した特定部位外に、Ｎ−末端の２５番以内の他の部位での追加糖化を含んでもよい。
また、本発明は、α−１アンチトリプシンのＮ−末端の１番位置から２５番位置の間の特定部位にあるアミノ酸を置換して糖化部位を追加させる段階と、前記糖化部位が追加されたα−１アンチトリプシン変異体発現ベクターが転移された細胞を培地上で培養する段階と、前記培養液からα−１アンチトリプシン変異体タンパク質を発現させる段階と、前記発現されたα−１アンチトリプシン変異体タンパク質を精製して回収する段階と、を含むα−１アンチトリプシン変異体の製造方法を提供する。
前記Ｎ−糖化部位を追加する技術は、遺伝子再組み換え技術を利用し、遺伝子組み換えを通じてアミノ酸を置換、挿入、除去してＮ−糖化部位を追加することができる。前記ヒトα−１アンチトリプシンのＮ−末端の２０個程度のアミノ酸は、α−１アンチトリプシンのＸ−ｒａｙ結晶構造でよく検出されない領域(ＰＤＢ ｃｏｄｅ：１ＱＬＰ、２ＱＵＧ、３ＣＷＬ、１ＰＳＩ、７ＡＰＩ、１ＫＣＴ(ｗｗｗ.ｐｄｂ.ｏｒｇ))として、３次構造が非常に柔軟な定形化されていない構造を有している。
本発明によるα−１アンチトリプシン変異体は、特定部位突然変異誘発(ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ)方法を利用して一つ以上のアミノ酸を変異させて製造することができる。例えば、ヒトα−１アンチトリプシンで９番位置のグルタミンをアスパラギンに置換するか１４８番位置のグリシンをアスパラギンに置換して動物細胞から発現させると、置換されたアスパラギンに糖化部位が生成される。または、１４８番のグリシンをスレオニンに置換すると、１４６番のアスパラギンに新しい糖化部位が生成される。このような方式で、α−１アンチトリプシンの非常に多様な位置で糖化部位を追加することができる。
本発明では、ヒトα−１アンチトリプシンの３個の糖化部位(４６番アスパラギン、８３番アスパラギン、２４７番アスパラギン)以外に、Ａ１ＡＴのＸ−ｒａｙ結晶構造で整形化された構造が検出されないＮ−末端の１番位置から２５番位置の間の特定部位にあるアミノ酸の置換を通じてＮ−糖化部位を追加してα−１アンチトリプシン変異体を製造し、これをチャイニーズハムスター卵巣(Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ)細胞から発現させた後、クロマトグラフィー方法を利用して高純度で精製して得る。
前記精製されたＮ−糖化部位が追加されたα−１アンチトリプシン変異体は、野生型α−１アンチトリプシンに比べて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試験で相対的に高い位置で染色帯が表示される。これは糖化により分子量が上昇したことで判断される。
また、前記精製されたα−１アンチトリプシン変異体は、血中薬物濃度−時間曲線下面積(ＡＵＣ：ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ)値と体内半減期(ｔ１/２)が顕著に増加して体内安全性が優れる。しかし、α−１アンチトリプシンの２６番位置のアミノ酸をスレオニンに置換した変異体(Ｉ２６Ｔ)の場合、Ｎ−糖化部位の追加により体内持続性が改善されなかった。また、ＷＯ２００８/１５１８４５に記載されたループ(ｌｏｏｐ)領域(ｌｏｏｐ Ａ、ｌｏｏｐ Ｂ、ｌｏｏｐ Ｃ、ｌｏｏｐ Ｄ、ｌｏｏｐ Ｅ)やその付近に糖化部位を追加したα−１アンチトリプシン変異体の場合にも体内持続性改善に大きい効果がなかった。さらに、ループ(ｌｏｏｐ)領域を糖化させると、タンパク質分解酵素としての固有の機能を有するα−１アンチトリプシンの活性に影響を与えることができるので、α−１アンチトリプシンの活性に影響を与えない糖化位置の選択が非常に重要である。
また、前記精製されたα−１アンチトリプシン変異体は、エラスターゼ活性抑制効果が維持されることを確認した。また、一般的にヒトα−１アンチトリプシンの結合速度定数は、１.０±０.２×１０５(Ｂｏｕｄｉｅｒ Ｃ., １９９４)〜１.６７×１０６Ｍ−１ｓ−１(Ｔｅｒａｓｈｉｍａ Ｍ, ｅｔ. ａｌ., Ａｐｐｌ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ., ５２(４), ５１６−５２３, １９９９)の範囲を有することで知られているが、本発明の野生型ヒトα−１アンチトリプシンとその変異体の結合速度定数及び平衡定数は類似である。したがって、α−１アンチトリプシンのＮ−末端部位の糖化がα−１アンチトリプシンのエラスターゼ活性抑制に影響を与えないことが分かる。
また、本発明は、前記α−１アンチトリプシン変異体を二つ連結して体内半減期が増加されたα−１アンチトリプシン変異体の融合体を提供する。
本発明者は、前記α−１アンチトリプシン変異体のＰ２位置である３５７番目のアミノ酸のプロリンをアスパラギンに追加的に置換させたα−１アンチトリプシン二重変異体を製造し、前記二重変異体に顆粒球刺激因子を結合させた融合体を製造して薬物動態実験を進行した結果、前記融合体の体内持続性が増加されたことを確認した(実験例５参照)。前記結果を通じて、前記二重変異体に生理活性タンパク質のような異種タンパク質を結合させると、前記生理活性タンパク質の半減期を増加させることができるということを確認した。
したがって、本発明は、前記α−１アンチトリプシン変異体に他の異種タンパク質を連結して異種タンパク質の体内半減期が増加されたα−１アンチトリプシン変異体の融合体を提供する。前記異種タンパク質の種類は、限定されるものではないが、好ましくは、生理活性ペプチドまたは生理活性タンパク質である。
前記精製されたα−１アンチトリプシン変異体を二つまたはその以上で連結して体内半減期が増加されたα−１アンチトリプシン変異体の融合体を製造することができる。以前研究で、Ｓｙｔｋｏｗｓｋｉ, Ａ.Ｊ.などは、赤血球成長因子(ＥＰＯ)を適切なリンカーを利用してＥＰＯ−ＥＰＯの融合タンパク質で作った場合、活性が顕著に増加することはもちろん、体内半減期がＥＰＯ単量体(ｍｏｎｏｍｅｒ)よりも一層増加することを証明した(Ｓｙｔｋｏｗｓｋｉ, Ａ.Ｊ., ｅｔ. ａｌ., Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ., ２７４, ２４７７３−２４７７８, １９９９)。したがって、本発明のα−１アンチトリプシン変異体を二つまたはその以上で連結する場合、α−１アンチトリプシン変異体の単量体に比べて体内半減期が増加されることで期待される。さらに、体内半減期が短い生理活性ペプチド、免疫調節因子、サイトカインなどに本発明のα−１アンチトリプシン変異体を連結する場合、体内半減期が顕著に増加して持続性効果を充分に示すことで期待される。
また、本発明は、前記α−１アンチトリプシン変異体を有効成分で含むα−１アンチトリプシン欠乏症の予防または治療用組成物を提供する。
また、本発明は、α−１アンチトリプシン変異体を治療的有効量で患者に投与してα−１アンチトリプシン欠乏症を予防または治療する方法を提供する。
上述のように、本発明によるα−１アンチトリプシン変異体は、Ｎ−末端の１番位置から２５番位置の間のアミノ酸変異を通じてＮ−糖化部位を追加させることで、血中半減期(ｔ１/２)と薬物濃度−時間曲線下面積(ＡＵＣ)が顕著に増加して体内安全性が優秀であり、エラスターゼ活性抑制効果が維持される。したがって、本発明のα−１アンチトリプシン変異体は、α−１アンチトリプシン欠乏症の予防または治療に有用に使用することができる。前記α−１アンチトリプシン欠乏症では、慢性閉鎖性肺疾患(ＣＯＰＤ：ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ)や肝硬変を含まれ、好ましくは、肺気腫が含まれるが、これに限定されるものではない。
本発明の組成物は、α−１アンチトリプシン変異体とともにα−１アンチトリプシン欠乏症の予防または治療効果を有する公知の有効成分を１種以上含むことができる。
本発明の組成物は、投与のために上述した有効成分の以外に追加で薬学的に許容可能な担体を１種以上を含んで製造することができる。薬学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれら成分の中で１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤で製剤化することができる。さらに、当分野の適正な方法にまたはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ(最近版)、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ, Ｅａｓｔｏｎ ＰＡに開示されている方法を利用して各疾患によってまたは成分によって適切に製剤化することができる。
本発明の組成物は、目的する方法によって経口投与するか非経口投与(例えば、静脈内、皮下、腹腔内、吸入または局所などに適用)でき、あるいは本発明によるα−１アンチトリプシン変異体の遺伝子治療法(Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ)に利用することができる。投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度などによってその範囲が多様である。前記α−１アンチトリプシン変異体の週１回投与量は、α−１アンチトリプシンの投与容量である６０ｍｇ/ｋｇより少ない量で同等な臨床効能を示すか、あるいは野生型α−１アンチトリプシン投与容量と同一な用量を使用する場合、投与期間をさらに延長しても同一な臨床的効能を示すことで予想される。
本発明の組成物は、α−１アンチトリプシン欠乏症の予防または治療のために、単独で、または手術、ホルモン治療、薬物治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法などと併用して使用することができる。
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例及び実験例を提示する。しかし、下記実施例及び実験例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
実施例１. α−１アンチトリプシン及びその変異体と二重体の製造
１−１. 発現ベクターｐＡＶ１の製造
本発明に必要な発現ベクタークローニングは、母ベクターであるｐＳＧＨＶ０(ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＡＦ２８５１８３)を利用して産業で使用可能に目的に合わせて改良して開発したｐＡＶ１ベクターを利用した。母ベクターは、大腸菌のようなバクテリアを利用してヒト由来のタンパク質を発現させる場合には、タンパク質が細胞内で過剰発現されるが、大部分活性を有しないので、動物細胞を利用した場合には、細胞外に生理活性を有した目的タンパク質を高濃度で発現させる特性を有しているので、生理活性を有したタンパク質を手軽く精製する目的で製作された研究用ベクターである。しかし、産業で生産用で使用するためには、いろいろに制限があるので、ｐＳＧＨＶ０ベクターの最大の長所である発現量が高い点を生産に利用するために、産業で使用可能に改良した。
１−２. α−１アンチトリプシン(ｓｕｂｔｙｐｅ Ｍ３)ベクター(ｐＴ００３)の製造
α−１アンチトリプシンベクターを製造するために、ｈＭＵ００１４４８(ＫＲＩＢＢ)を鋳型としたα−１アンチトリプシン(Ｍ３)遺伝子をｐＡＶ１ベクターにクローニングしてα−１アンチトリプシンベクター(ｐＴ００３)を製造した。具体的には、ｈＭＵ００１４４８(ＫＲＩＢＢ)を鋳型として、２個のプライマーであるＸｈｏＡＴ正方向プライマー(５'−ＣＣＣ ＴＣＣ ＴＣＧ ＡＧＡ ＡＴＧ ＣＣＧ ＴＣＴ ＴＣＴ ＧＴＣ ＴＣＧ−３'、配列番号１)とＡＴＮｏｔ逆方向プライマー(５'−ＧＧＧ ＣＣＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＡ ＧＴＴ ＡＴＴ ＴＴＴ ＧＧＧ ＴＧＧ Ｇ−３'、配列番号２)を利用してＰＣＲで増幅した。前記増幅されたヌクレオチドを、末端に存在する二つの制限酵素であるＸｈｏＩと ＮｏｔＩで切断し、ＸｈｏＩ/ＮｏｔＩ切断部を有している発現ベクターｐＡＶ１と接合してα−１アンチトリプシンベクター(ｐＴ００３、配列番号３９)を製造した。前記α−１アンチトリプシンベクター(ｐＴ００３)の模式図は、図１に示した。
１−３. α−１アンチトリプシン(Ｍ３)変異体の製造
糖化部位が追加された多くのα−１アンチトリプシン変異体を製造するために、前記実施例１−２で製造したα−１アンチトリプシンベクター(ｐＴ００３)を鋳型として、下記表１に記載された各々の２個の正方向プライマーと逆方向プライマーと変異体生成キット(Ｅｎｚｙｎｏｍｉｘ、ＥＺｃｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ)を利用してα−１アンチトリプシン変異体を製造した。α−１アンチトリプシン変異体の配列と位置は、図２に示した。
全てのα−１アンチトリプシン変異体の変異目的は、Ｎ−糖化部位を増加させることであるので、動物細胞でＮ−糖化されたと知られているＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒを作るために、主に元々のアミノ酸をアスパラギンに置換したが、いくつの場合は、元々存在するアスパラギンを利用するために隣接したアミノ酸をスレオニンに変異させた。
１−４. α−１アンチトリプシン(ｓｕｂｔｙｐｅ Ｍ２)ベクター(ｐＴ００６)の製造
α−１アンチトリプシンベクターを製造するために、ｐＥＡＴ８(ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ１−ＡＴ(Ｍ２) ｃＤＮＡ)を鋳型としたα−１アンチトリプシン遺伝子をｐＡＶ１ベクターにクローニングして、α−１アンチトリプシンベクター(ｐＴ００６)を製造した。具体的には、ｐＥＡＴ８(ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ１−ＡＴ(Ｍ２) ｃＤＮＡ)を鋳型として、２個のプライマーであるＸｈｏＡＴ正方向プライマー(５'−ＣＣＣ ＴＣＣ ＴＣＧ ＡＧＡ ＡＴＧ ＣＣＧ ＴＣＴ ＴＣＴ ＧＴＣ ＴＣＧ−３'、配列番号１)とＡＴＮｏｔ逆方向プライマー(５'−ＧＧＧ ＣＣＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＡ ＧＴＴ ＡＴＴ ＴＴＴ ＧＧＧ ＴＧＧ Ｇ−３'、配列番号２)を利用してＰＣＲで増幅した。前記増幅されたヌクレオチドを末端に存在する二つの制限酵素であるＸｈｏＩと ＮｏｔＩで切断し、ＸｈｏＩ/ＮｏｔＩ切断部を有している発現ベクターｐＡＶ１と接合してα−１アンチトリプシンベクター(ｐＴ００６、配列番号４０)を製造した。
１−５. α−１アンチトリプシン(Ｍ２)変異体の製造
糖化部位が追加されたα−１アンチトリプシン(Ｍ２)変異体を製造するために、前記実施例１−４で製造したα−１アンチトリプシンベクター(ｐＴ００６)を鋳型として、２個のプライマーである正方向プライマー(配列番号５)と逆方向プライマー(配列番号６)を利用して、変異体生成キット(Ｅｎｚｙｎｏｍｉｘ、ＥＺｃｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ)を利用してα−１アンチトリプシン(Ｍ２)変異体ベクター(ＡＴ９Ｎ(Ｍ２))を製造した。製造されたα−１アンチトリプシン変異体のアミノ酸配列は、配列番号４２に示した。
１−６. α−１アンチトリプシン及び変異体の二重体の製造
α−１アンチトリプシン変異体の二重体を製造するために、α−１アンチトリプシン変異体は、ｐＡＴ９Ｎ(ｓｕｂｔｙｐｅ Ｍ２)を使用した。二重体ベクターを製造するために、ｐＡＴ９Ｎ(Ｍ２)を鋳型として、２個のプライマーであるＸｈｏＡＴ正方向プライマー２(５'−ＧＧＧ ＣＣＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＣＣＧ ＴＣＴ ＴＣＴ ＧＴＣ ＴＣＧ ＴＧＧ ＧＧＣ ＡＴＣ ＣＴＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＣＡ ＧＧＣ ＣＴＧ ＴＧＣ ＴＧＣ ＣＴＧ ＧＴＣ ＣＣＴ ＧＴＣ ＴＣＣ ＣＴＧ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＡＴ ＣＣＣ ＣＡＧ ＧＧＡ −３'、配列番号３１)とＡＴＢａｍ逆方向プライマー２(５'−ＧＧＧ ＧＧＧ ＡＴＣ ＣＴＣ ＴＴＴ ＴＴＧ ＧＧＴ ＧＧＧ ＡＴＴ ＣＡＣ −３'、配列番号３２)を利用してＰＣＲで増幅した。前記増幅されたヌクレオチドを末端に存在する二つの制限酵素であるＸｈｏＩと ＢａｍＨＩで切断し、ＸｈｏＩ/ＢａｍＨＩ切断部を有している発現ベクターｐＡＴ９Ｎ(Ｍ２)と接合してα−１アンチトリプシン二重体ベクター(ｐＡＴ９Ｎ(Ｍ２)−ＡＴ９Ｎ(Ｍ２))を製造した。
１−７. α−１アンチトリプシン及びその変異体と二重体の発現
チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ−Ｋ１)を利用して、前記実施例１−２、３、４、５及び６で製造したα−１アンチトリプシン(Ｔ００３、Ｔ００６)とその変異体及び二重体のタンパク質発現を確認した。ＣＨＯ−Ｋ１は、１０％ ＦＢＳ(Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ)と抗生剤を含んだＤＭＥＭ(Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉａ)に５％ＣＯ２と３７℃条件で培養して維持した。α−１アンチトリプシン及びその変異体発現ベクターを導入する一日前、１００mm培養皿に細胞を５×１０６ ｃｅｌｌｓで接種して培養し、ＦＢＳと抗生剤がない８００μＬのＤＭＥＭと１０μgのα−１アンチトリプシンとその変異体及び二重体の発現ベクター各々を混合して常温で１分間維持した後、２０μgのＰＥＩ(Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ｌｉｎｅａｒ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ.(Ｃａｔ. ｎｏ：２３９６６, ＭＷ〜２５,０００)と混合して１０〜１５分程度の常温で放置した。この時、一日の前に培養した細胞をＰＢＳで洗浄して新しい培養液の６ｍＬのＤＭＥＭを添加した。１０〜１５分後、常温に放置したα−１アンチトリプシンとその変異体及び二重体の発現ベクターを各々前記培養皿に添加した。翌日、ＰＢＳで洗浄してＦＢＳのないＩＭＤＭ(Ｃａｔ. Ｎｏ １２２００−０２８, Ｇｉｂｃｏ, Ｉｓｃｏｖｅ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ)培地を添加してタンパク質発現を確認した。
１−８. α−１アンチトリプシンとその変異体及び二重体の精製
前記実施例１−７により発現されたα−１アンチトリプシンとその変異体及び二重体は、下記のように精製した。具体的には、細胞培養液に分泌されたα−１アンチトリプシンとその変異体及び二重体を精製するために、培養液を遠心分離して細胞を除去した後、上清液のみを取り、細胞上清液を平衡緩衝溶液(２０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ８.０)で希釈した。その後、前記平衡緩衝溶液で希釈された細胞上清液を平衡緩衝溶液で平衡化されたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ(ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、アメリカ)コラムに注入して平衡緩衝溶液で充分に洗浄した後、塩化ナトリウムの濃度を増加(０〜４００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ８.０)させてタンパク質を溶出させた。溶出されたタンパク質を平衡緩衝溶液(トリス５０ｍＭ、塩化ナトリウム０.１５Ｍ、ｐＨ７.５)で平衡化されたＡｌｐｈａ−１ Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ Ｓｅｌｅｃｔ(ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、アメリカ)コラムに注入した後、平衡緩衝溶液で充分に洗浄してＭｇＣｌ２の濃度を増加させてタンパク質を溶出させた。前記溶液をリン酸塩緩衝溶液で透析した後、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０(ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、アメリカ)を使用して濃縮して、最終的に、高純度で精製されたタンパク質を得た。前記精製されたα−１アンチトリプシンとその変異体及び二重体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果は、図３に示した。
図３に示したように、野生型α−１アンチトリプシン(Ｔ００３またはＴ００６)に比べてＮ−糖化部位が追加されたα−１アンチトリプシン変異体が相対的に高い位置で染色帯が表示されることを確認した。これは、糖化により分子量が上昇したことで判断される。また、二重体の場合は、二重体の分子量位置で現れ、糖化程度によって少しずつ分子量の位置の差を確認することができた。
実施例２. ヒト成長ホルモン/α−１ アンチトリプシン変異体の融合体の製造
ヒト成長ホルモン/α−１アンチトリプシン変異体(ＡＴ９Ｎ)の融合体を製造するために、α−１アンチトリプシン変異体ではｐＡＴ９Ｎ(ｓｕｂｔｙｐｅ Ｍ２)を使用した。融合体ベクターを製造するために、ヒト成長ホルモン遺伝子(ＩＯＨ４５７３４(ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ))を鋳型として、２個のプライマーあるＸｈｏＧＨ正方向プライマー(５'−ＧＧＧ ＣＣＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＣＴ ＡＣＡ ＧＧＣ ＴＣＣ ＣＧＧ−３'、配列番号３３)とＧＨＢａｍ逆方向プライマー(５'−ＧＧＧ ＧＧＧ ＡＴＣ ＣＴＣ ＧＡＡ ＧＣＣ ＡＣＡ ＧＣＴ ＧＣＣ ＣＴＣ −３'、配列番号３４)を利用してＰＣＲで増幅した。前記増幅されたヌクレオチドを末端に存在する二つの制限酵素であるＸｈｏＩとＢａｍＨＩで切断し、ＸｈｏＩ/ＢａｍＨＩ切断部を有している発現ベクターｐＡＴ９Ｎ(Ｍ２)と接合してヒト成長ホルモン/α−１アンチトリプシン変異体融合体ベクター(ｐｈＧＨ−ＡＴ９Ｎ(Ｍ２)、配列番号４３)を製造した。
実施例３. 顆粒球刺激因子/α−１アンチトリプシン二重変異体の融合体の製造
３−１. α−１アンチトリプシン二重変異体の製造
実施例１−５と同一な方法で製造されたα−１アンチトリプシン変異体(ＡＴ９Ｎ)ベクターを鋳型として、下記２個のプライマーの正方向プライマー(５'−ＣＣＡ ＴＧＴ ＴＴＴ ＴＡＧ ＡＧＧ ＣＣＡ ＴＡＡ ＡＣＡ ＴＧＴ ＣＴＡ ＴＣＣ ＣＣＣ ＣＣ−３'、配列番号３５)と逆方向プライマー(５'−ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＡＴ ＡＧＡ ＣＡＴ ＧＴＴ ＴＡＴ ＧＧＣ ＣＴＣ ＴＡＡ ＡＡＡ ＣＡＴ ＧＧ−３'、配列番号３６)と変異体生成キット(Ｅｎｚｙｎｏｍｉｘ、ＥＺｃｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ)を利用して、α−１アンチトリプシンＮ−末端の９番位置のグルタミン(ｇｌｕｔａｍｉｎｅ)がアスパラギン(ａｓｐａｒａｇｉｎｅ)に置換されて、また３５７番位置のプロリン(ｐｒｏｌｉｎｅ)がアスパラギン(ａｓｐａｒａｇｉｎｅ)に置換されたα−１アンチトリプシン二重変異体を含むベクターｐＴ００４Ｎ(Ｑ９Ｎ、Ｐ３５７Ｎ)を製造した。製造されたα−１アンチトリプシン二重変異体のアミノ酸配列は、配列番号４４に示した。
３−２. 顆粒球刺激因子/α−１アンチトリプシン二重変異体の融合体の製造
顆粒球刺激因子/α−１アンチトリプシン二重変異体の融合体を製造するために、実施例３−１の方法で製造されたα−１アンチトリプシン二重変異体を含むｐＴ００４Ｎ(Ｑ９Ｎ、Ｐ３５７Ｎ)を使用した。融合体ベクターを製造するために、顆粒球刺激因子(Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ, ＩＨＳ１３８０-９７６５２３４３(Ｏｐｅｎ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ))を鋳型として、２個のプライマーであるＸｈｏＣＳＦ正方向プライマー(５'−ＧＧＧ ＣＣＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＡＴＧ ＧＣＴ ＧＧＡ ＣＣＴ ＧＣＣ ＡＣＣ−３'、配列番号３７)とＣＳＦＢａｍ逆方向プライマー(５'−ＧＧＧ ＧＧＧ ＡＴＣ ＣＴＣ ＧＧＧ ＣＴＧ ＧＧＣ ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＣＧ−３'、配列番号３８)を利用してＰＣＲで増幅した。前記増幅されたヌクレオチドを末端に存在する二つの制限酵素であるＸｈｏＩとＢａｍＨＩで切断し、ＸｈｏＩ/ＢａｍＨＩ切断部を有している発現ベクターｐＴ００４Ｎと接合して顆粒球刺激因子/α−１アンチトリプシン二重変異体融合体ベクター(ｐＴ６０３Ｎ、配列番号４５)を製造した。以後、製造された前記ベクター(ｐＴ６０３Ｎ)を利用して実施例１−７及び１−８と同一な方法で顆粒球刺激因子/α−１アンチトリプシン二重変異体を発現及び精製した。
実験例１. 血漿由来のα−１アンチトリプシンとチャイニーズハムスター卵巣細胞で製造したα−１アンチトリプシン及びその変異体の薬物動態
血漿由来のα−１アンチトリプシンと本発明のチャイニーズハムスター卵巣細胞で製造したα−１アンチトリプシンの薬物動態を確認するために、下記のような実験を実行した。
実験動物としてＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラット(ｒａｔ)を使用し、各実験群当たり３〜５匹ずつ割り当てた。各群のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、血漿由来のヒトα−１アンチトリプシン(Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、アメリカ)、再組み換えα−１アンチトリプシン及びその変異体を各々ラットｋｇ当たり４４５μgの投与量で皮下注射または静脈注射した。希釈は、リン酸塩緩衝溶液を使用した。投与後、時間別に採血して遠心分離して血清を得た。各採血時間別に得た血清は、分析時まで冷凍保管し、酵素免疫分析法を利用してα−１アンチトリプシン及びその変異体の血中濃度を測定した。酵素免疫分析法は、二つの方法で実行した。一番目の方法は、次のようである。ヒトα−１アンチトリプシンに対するモノクローナル抗体(Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、フィンランド)をプレート(Ｎｕｎｃ、デンマーク)にコーティングし、１％ウシ血清アルブミンが溶解されたリン酸塩緩衝溶液で処理した。試料は、１％ウシ血清アルブミンが溶解されたリン酸塩緩衝溶液で希釈して使用し、ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ｂｉｏｔｉｎ(Ｐｉｅｒｃｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、アメリカ)を利用して接合させたα−１アンチトリプシンモノクローナル抗体−ビオチンとストレプトアビジン−ＨＲＰを使用してα−１アンチトリプシンを検出した。発色反応は 、ＴＭＢ(３,３',５,６'−テトラメチルベンジジン)と過酸化水素水発色溶液を使用し、硫酸を各ウェルに添加して反応を終了させた後、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、アメリカ)で４５０nmで吸光度を測定した。二番目の方法は、ヒトα−１アンチトリプシンに対するモノクローナル抗体(Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、フィンランド)をプレート(Ｎｕｎｃ、デンマーク)にコーティングし、１％ウシ血清アルブミンが溶解されたリン酸塩緩衝溶液で処理した。試料は、１％ウシ血清アルブミンが溶解されたリン酸塩緩衝溶液 で希釈して使用し、α−１アンチトリプシンポリクローナル抗体−ビオチン接合体(Ａｂｃａｍ、イギリス)とストレプトアビジン−ＨＲＰを使用してα−１アンチトリプシンを検出した。発色反応は、ＴＭＢ(３,３',５,５'−テトラメチルベンジジン)と過酸化水素水発色溶液を使用し、硫酸を各ウェルに添加して反応を終了させた後、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、アメリカ)で４５０nmで吸光度を測定した。各段階別に、洗浄溶液(０.０５％ツイン２０、リン酸塩緩衝溶液)でプレートを洗浄した。各試料の定量値は、標準物質に対する標準曲線を作成した後に回帰分析を通じて求めた。
血漿由来のα−１アンチトリプシンとチャイニーズハムスター卵巣細胞由来のα−１アンチトリプシン及びその変異体の皮下投与薬物動態グラフ及び静脈投与薬物動態グラフは、各々図４、図５、図６及び図７に示した。
図４及び図５に示したように、血漿由来のα−１ アンチトリプシン、再組み換えα−１アンチトリプシン及びその変異体を皮下投与する時の薬物動態様相は多様に現われた。図４を参照すれば、血漿由来のα−１アンチトリプシンは、体内半減期(ｔ１/２)が約 １５.２時間であり、Ｔｍａｘが１６.８時間、ＡＵＣ(ｈｒ*μg/ｍＬ)値は１１３.１であった。再組み換えα−１アンチトリプシン(Ｔ００３)は、体内半減期(ｔ１/２)が約１６.５時間、Ｔｍａｘが２０.８時間、ＡＵＣ(ｈｒ*μg/ｍＬ)値は１５６.６時間であった。したがって、チャイニーズハムスター卵巣細胞で製造したα−１アンチトリプシンは、血漿由来のα−１アンチトリプシンに比べて大きい差はなかったが、再組み換えα−１アンチトリプシンが血漿由来のα−１ アンチトリプシンに比べて半減期(ｔ１/２)とＴｍａｘが多少長くて、ＡＵＣ(ｈｒ*μg/ｍＬ)も約４０％ほど増加した。また、α−１アンチトリプシンのイソフォーム(ｉｓｏｆｏｒｍ)であるＭ２型(Ｈｉｓ１０１)とＭ３型(Ａｒｇ１０１)の場合、動物を利用した薬物動態試験においてその差が試験誤差範囲内であることを確認した。
一方、チャイニーズハムスター卵巣細胞で製造したα−１アンチトリプシンの変異体は、追加された糖化部位によって多様な薬物動態学的様相を示した。
図５を参照すれば、ＡＴ７０Ｎ、ＡＴ１７８Ｎ、ＡＴ２０１Ｎ、ＡＴ２１２Ｎは、ＡＵＣＩＮＦ＿ｏｂｓ(ｈｒ*μg/ｍＬ)が、チャイニーズハムスター卵巣細胞で製造したα−１アンチトリプシン(Ｔ００３)の薬５０〜７０％水準で低く示された。しかし、体内半減期の場合、前記変異体は、チャイニーズハムスター卵巣細胞で製造した野生型α−１アンチトリプシンより約１５〜９０％程度長くて、糖化部位の追加が体内半減期に影響を与えたことを確認した。一方、ＡＴ１４８Ｔの場合、ＡＵＣ(ｈｒ*μg/ｍＬ)がチャイニーズハムスター卵巣細胞で製造したα−１アンチトリプシンと類似であったが、体内半減期は、２４.６時間で、約 ５０％程度増加した。これは、ＡＴ１４８Ｔの糖化部位の追加により薬物動態様相が向上したことを示す。
図５を参照すれば、ＡＴ２６Ｔの場合、体内半減期は、チャイニーズハムスター卵巣細胞で製造したα−１アンチトリプシン(Ｔ００３)より多少長いが、ＡＵＣ(ｈｒ*μg/ｍＬ)がチャイニーズハムスター卵巣細胞で製造したα−１アンチトリプシン(Ｔ００３)の約１７％水準しかならないで、体内排泄(ＣＬ/Ｆ; ｍＬ/ｈｒ/ｋｇ)速度も約６倍程度高くて、２６番位置に糖化部位の追加が薬物動態学的側面では一番良くない結果を示した。
図６は、血漿由来のα−１アンチトリプシン、再組み換えα−１アンチトリプシンの変異体を皮下投与する時の薬物動態グラフを示す。血漿由来のα−１アンチトリプシンは、体内半減期(ｔ１/２)が約１５.２時間、α−１アンチトリプシン変異体のうち、ＡＴ１４８Ｔは、半減期が２４.６時間、ＡＴ９Ｎは、３７.７時間で長くて、ＡＴ２１２Ｎは、１９.１時間として、追加された糖化部位によって多様な様相を示した。
このような結果を総合して見れば、α−１アンチトリプシンのループ(ｌｏｏｐ)領域を変異させて追加糖化させたα−１アンチトリプシン変異体(ＡＴ２６Ｔ、ＡＴ１４８Ｔ、ＡＴ１７８Ｎ、ＡＴ２０１Ｎ、ＡＴ２１２Ｎ)では、追加で糖化させなかった再組み換えα−１アンチトリプシン対比半減期において多少増加する変化はあったが、他の薬物動態学的側面で、野生型再組み換えα−１アンチトリプシン(Ｔ００３)よりも一層劣等な結果を示した。したがって、これら糖化変異体は、臨床的に野生型α−１アンチトリプシンより優れた面がないと言える。
しかし、再組み換えα−１アンチトリプシンを追加で糖化させた変異体の中で、Ｎ−末端の９番位置に糖化部位を追加すれば、他の糖追加変異体に比べて体内持続性が一層改善されるだけではなく体内排出が顕著に低下されることが分かる。したがって、α−１アンチトリプシンのＮ−末端ペプチド構造の中で２５番アミノ酸以下の位置で糖を追加する場合、薬物動態学的パラメータが変化するかを確認するために実験した。
図７は、α−１アンチトリプシンのＮ−末端の４番位置、９番位置、そして１２番位置を糖化させた変異体の薬物動態学な実験結果である。図７を参照すれば、９番と１２番位置に糖化が追加された場合、体内半減期あるいは体内分布度(ＡＵＣ; ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ)が、４番位置が糖化された変異体より優れることが分かる。α−１アンチトリプシンのＮ末端部位は、Ｘ−ｒａｙ結晶構造で現われない部位として、溶液内で無定形の構造を有しており、自由に動く部位である。この部位が糖化されることで、α−１アンチトリプシンの流体力学的容積(ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｖｏｌｕｍｅ)が増加され、体内半減期が増加し、且つこの変異体は注射後に体内吸収率が増加することで類推することができる。
実験例２. 血漿由来のα−１ アンチトリプシンとチャイニーズハムスター卵巣細胞で製造したα−１アンチトリプシン及びその二重体の薬物動態
本発明によるチャイニーズハムスター卵巣細胞で製造したα−１アンチトリプシン二重体の薬物動態を確認するために、下記のような実験を実行した。α−１アンチトリプシンの９番位置を追加で糖化させたタンパク質を並列で連結してクローニングした後、ＣＨＯ細胞から発現したＡＴ９Ｎ(Ｍ２)−ＡＴ９Ｎ(Ｍ２)と単量体(ｍｏｎｏｍｅｒ)であるＴ００３を各々精製した後、薬物動態試験を実行した。
図８を参照すれば、ＡＴ９Ｎ(Ｍ２)−ＡＴ９Ｎ(Ｍ２)二重体(ｄｉｍｅｒ)の体内半減期は、３２.８時間として、Ｔ３００の体内半減期である１６.５時間に比べて二倍増加した。また、ＡＵＣ値も２倍以上増加したことが確認でき、クリアランス(ｃｌｅａｒａｎｃｅ)値もよほど減少した。前記結果から、体内持続性が増加されたα−１アンチトリプシンの変異体を使用するにおいて、変異体の単一体で使用できることだけではなく、二重体も薬物に使用可能であることを確認した。
実験例３. α−１アンチトリプシン及びその変異体のエラスターゼ活性抑制効果、
本発明によるα−１アンチトリプシン及びその変異体のエラスターゼ活性抑制効果を確認するために、下記のような実験を実行した。
豚膵腸エラスターゼ(Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ, Ｃａｔ. ３２４６８２)とＡＡＡ−ｐＮＡ(Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ, Ｓｉｇｍａ, Ｓ４７６０)を各々酵素と基質で使用して、α−１アンチトリプシン及びその変異体に対する速度定数(ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ)を測定した。具体的には、豚膵腸エラスターゼとα−１アンチトリプシン及びその変異体を同一モール比で混合して２５℃で１２０秒、３００秒、６００秒間反応させて、ＡＡＡ−ｐＮＡを入れた後、１分おきで５分間反応速度論(ｋｉｎｅｔｉｃｓ)を測定した。最終反応の濃度は、豚膵腸エラスターゼとα−１アンチトリプシン及びその変異体が２０ｎＭであり、ＡＡＡ−ｐＮＡは、１ｍＭであった。
豚膵腸エラスターゼとα−１アンチトリプシン及びその変異体の反応は、非可逆的な２次反応(Ｌｅｖｅｎｓｐｉｅｌ Ｏ. Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ, ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ. １９７２, Ｗｉｌｅｙ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ)であるため、速度定数は、１/Ｒ＝ｋａＣＥ０ｔ + １[Ｒ＝Ｒｅｍａｉｎｉｎｇ ＰＰＥ ａｃｔｉｖｉｔｙ, ｋａ＝Ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ(Ｍ−１ｓ−１)、ＣＥ０＝Ｉｎｉｔｉａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＴ(Ｍ)、ｔ＝Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ(ｓｅｃｏｎｄ)]である。結合速度定数(ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ; ｋａ)は、各々の反応時間に残っている豚膵腸エラスターゼの活性を利用して計算した。その結果は、表２に示した。
また、α−１アンチトリプシン及びその変異体の平衡定数(ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ)は、下記式で計算した。その結果は、表３に示した。
Ｋａ(Ｍ−１)＝[ＥＩ]/[Ｅ]ｆ/[Ｉ]ｆ×１０９
[Ｅ]Ｔ＝酵素の初期濃度(Ｉｎｉｔｉａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ)
[Ｉ]Ｔ＝阻害剤の初期濃度(Ｉｎｉｔｉａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ)
[Ｅ]ｆ＝[Ｅ]Ｔ×(Ａｔｅｓｔ/Ａｃｏｎｔｒｏｌ)
[ＥＩ]＝[Ｅ]Ｔ−[Ｅ]ｆ＝[Ｅ]Ｔ×(１−Ａｔｅｓｔ/Ａｃｏｎｔｒｏｌ)
[Ｉ]ｆ＝[Ｉ]Ｔ−[ＥＩ]
Ａ＝ｓｌｏｐｅ ｏｆ ｔ(ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｔｉｍｅ)ｖｓ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ
表２及び表３に示したように、野生型ヒトα−１アンチトリプシン(Ｔ３００)とα−１アンチトリプシンの変異体であるＡＴ９Ｎの結合速度定数及び平衡定数は、血漿由来のヒトα−１アンチトリプシンの結合速度定数及び平衡定数と類似な値を有することで観察された。したがって、α−１アンチトリプシンのＮ−末端の糖化は、α−１アンチトリプシンのエラスターゼ活性抑制に影響を与えないことが分かった。しかし、ＡＴ１４８Ｔと血漿由来のα−１アンチトリプシンのエラスターゼに対する抑制(ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ)程度を比較した時、ＡＴ１４８Ｔは、野生型α−１アンチトリプシンに比べて２倍以上の低い結合力を示した。したがって、ＡＴ１４８Ｔは、糖化が追加されて体内半減期に影響を与えることはしたが、α−１アンチトリプシンの１４８番位置に追加された糖は、α−１アンチトリプシンとタンパク質分解酵素(Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ)の結合に影響を与えることが分かる。
ＡＴ７０Ｎ及びＡＴ１７８Ｎのような変異体もエラスターゼとの結合力において野生型血漿由来のα−１アンチトリプシンに比べて顕著に低下された結合力を示した。これにより、α−１アンチトリプシンの特定位置に糖化を追加すれば、体内薬物動態に影響を与えることはできるが、α−１アンチトリプシンの活性に影響を与えない糖化位置の選択が非常に重要であることが分かる。
実験例４. ヒト成長ホルモン/α−１アンチトリプシン変異体融合体の薬物動態実験
本発明によるヒト成長ホルモン/α−１アンチトリプシン変異体の融合体の薬物動態を確認するために、下記のような実験を実行した。実験動物としてＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット(ｒａｔ)を使用した。ヒト成長ホルモン投与群には、３匹を割り当て、融合体投与群には、５匹を割り当てた。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに前記実施例２で製造したヒト成長ホルモン/α−１アンチトリプシン融合体を各々ラットｋｇ当たり７２０μgの投与量で皮下注射した。希釈液は、リン酸塩緩衝溶液を使用し、０、１、２、４、８、１２、１６、２４、３０、４８時間後に採血して遠心分離して血清を得た。対照群では、ヒト成長ホルモンであるＳｃｉｔｒｏｐｉｎ(ＳｃｉＧｅｎ, シンガポール)をラットｋｇ当たり２００μgの投与量で皮下注射した。希釈液は、リン酸塩緩衝溶液を使用し、０、０.３３、１、２、５、８、１２、１８、２４、３０、４８時間後に採血して遠心離して血清を得た。各試料に対しては、次のような酵素免疫分析方法を利用して分析した。ヒト成長ホルモンに対するモノクローナル抗体(Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ, フィンランド)をリン酸塩緩衝溶液に１〜５μg/ｍＬの濃度で希釈して１００μＬを９６ウェルプレート(Ｎｕｎｃ, デンマーク)に分注した後、常温で１５〜１８時間の間放置した。ウェルプレートに付着しなく残っている抗体を除去した後、１％ウシ血清アルブミンが溶解されたリン酸塩緩衝溶液２５０μＬを分注して常温で２時間放置させて、洗浄溶液(０.０５％ツイン２０、リン酸塩緩衝溶液)で３回洗浄して溶液を除去した。試料は、１％ウシ血清アルブミンが溶解されたリン酸塩緩衝溶液で希釈し、９６ウェルプレートに添加して常温で２時間の間反応させた。９６ウェルプレートを洗浄溶液で５回洗浄した後、ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ｂｉｏｔｉｎ(Ｐｉｅｒｃｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、アメリカ)を利用して接合させたヒト成長ホルモンモノクローナル抗体−ビオチン接合体を希釈溶液で希釈して９６ウェルプレートに１００μＬずつ分注した。引き継いで、プレートを常温で２時間反応させた後、洗浄溶液で５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ溶液を加えて常温で３０分間反応させた。洗浄溶液で５回洗浄してＴＭＢ(３,３',５,５'−テトラメチルベンジジン)と過酸化水素水発色溶液１００μＬを各ウェルに添加した後、暗所で３０分間反応させた。１Ｍ硫酸１００μＬを各ウェルに添加して反応を終了させて、ＶｅｒｓａＭａｘ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、アメリカ)で４５０nmで吸光度を測定した。各試料の定量値は、標準物質に対する標準曲線を作成して回帰分析を通じて求めた。
本発明によるヒト成長ホルモン/α−１アンチトリプシン変異体の融合体の薬物動態グラフは、図９に示した。
図９に示したように、本発明のヒト成長ホルモン/α−１アンチトリプシン変異体の融合体の血中半減期(ｔ１/２)は、約６時間として、ヒト成長ホルモンに比べて４倍以上顕著に増加された体内安全性を有することを確認することができた。
実験例５. 顆粒球刺激因子/α−１アンチトリプシン二重変異体融合体の薬物動態実験
本発明による顆粒球刺激因子/α−１アンチトリプシン二重変異体融合体の薬物動態を確認するために、下記のような実験を実行した。実験動物として、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット(ｒａｔ)を使用した。顆粒球刺激因子投与群には、５匹を割り当て、融合体投与群には、３匹を各々割り当てた。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに実施例３の方法で製造した顆粒球刺激因子/α−１アンチトリプシン二重変異体融合体(ｐＴ６０３Ｎ)を各々ラットｋｇ当たり３４０μgの投与量で皮下注射した。希釈液では、リン酸塩緩衝溶液(ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ)を使用した。皮下注射した後、０、１、２、４、８、１２、１６、２４、３６、４８、６０及び７２時間後に採血して遠心分離して血清を収得した。対照群では、顆粒球刺激因子であるグラシン(Ｇｒａｓｉｎ, Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ)をリン酸塩緩衝溶液で希釈してラットｋｇ当たり１００μgの投与量で皮下注射し、０、０.５、１、２、４、８、１２、１６、２４、３６及び４８時間後に採血して遠心分離して血清を収得した。各試料に対しては、下記のような酵素免疫分析方法(ＥＬＩＳＡ)を利用して分析した。顆粒球刺激因子に対するモノクローナル抗体(Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ)をリン酸塩緩衝溶液に１〜１０μg/ｍＬの濃度で希釈して１００μＬずつ９６ウェルプレート(Ｎｕｎｃ、デンマーク)に分注した後、常温で１５〜１８時間の間放置した。以後、ウェルプレートに付着しなくて残っている抗体を除去した後、１％ウシ血清アルブミンが溶解されたリン酸塩緩衝溶液２５０μＬを分注して常温で２時間放置させて、洗浄溶液(０.０５％ツイン２０、リン酸塩緩衝溶液)で３回洗浄して溶液を除去した。試料は、１％ウシ血清アルブミンが溶解されたリン酸塩緩衝溶液で希釈し、９６ウェルプレートに添加して常温で２時間の間反応させた。９６ウェルプレートを洗浄溶液で５回洗浄した後、顆粒球刺激因子であるポリクローナル抗体−ビオチン接合体(Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ)を希釈溶液で希薄して９６ウェルプレートに１００μＬずつ分注した。引き継いで、プレートを常温で２時間反応させた後、洗浄溶液で５回洗浄してストレプトアビジン−ＨＲＰ溶液を加えて常温で３０分間反応させた後、洗浄溶液で５回洗浄してＴＭＢ(３,３',５,５'−テトラメチルベンジジン)と過酸化水素水発色溶液１００μＬを各ウェルに添加して暗所で３０分間反応させた。以後、１Ｍ硫酸溶液１００μＬを各ウェルに添加して反応を終了させて、ＶｅｒｓａＭａｘ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、アメリカ)で４５０nmで吸光度を測定した。各試料の定量値は、標準物質に対する標準曲線を作成して回帰分析を通じて求めた。本発明による顆粒球刺激因子/α−１アンチトリプシン変異体の融合体の薬物動態グラフは、図１０に示した。
図１０に示したように、本発明の顆粒球刺激因子/α−１アンチトリプシン二重変異体融合体の血中半減期(ｔ１/２)は、約７.３時間として、顆粒球刺激因子の２.７時間に比べて約３倍、ＡＵＣは、３倍以上顕著に増加された体内安全性を有することが確認できた。前記結果を通じて、前記α−１アンチトリプシン二重変異体融合体に生理活性タンパク質のような異種タンパク質を結合させると、異種タンパク質の半減期を増加させることができることを確認した。
以上、添付した図面を参照して本発明の実施形態について説明したが、本発明が属する技術の分野における通常の知識を有する者であれば、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で、様々な置換、変形及び変更が可能であるので、上述した実施例及び実験例に限定されるものではない。
本発明によるＮ−末端の１番位置から２５番位置の間のアミノ酸変異を通じてＮ−糖化部位を追加させたα−１アンチトリプシン変異体をα−１アンチトリプシン欠乏症の予防または治療に使用する場合、血中半減期(ｔ１/２)と薬物濃度−時間曲線下面積(ＡＵＣ)が顕著に増加して体内安全性が優秀であり、エラスターゼ活性抑制効果が維持される。したがって、本発明によるα−１アンチトリプシン変異体を使用すれば、α−１アンチトリプシン欠乏症に使用することができ、α−１アンチトリプシン変異体に異種タンパク質を結合させて異種タンパク質の体内半減期を増加させるために使用することができるので、予防法または治療剤で有用に使用できる。
<110> ALTEOGEN, INC.

<120> New alpha-1 antitrypsin variant, method for producing the same and use thereof

<130> J-P14027

<150> KR 10-2011-0092819
<151> 2011-09-15

<150> KR 10-2012-0058998
<151> 2012-06-01

<160> 45

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> A1AT forward primer 1


<400> 1
ccctcctcga gaatgccgtc ttctgtctcg 30


<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> A1AT reverse primer 1


<400> 2
gggcccgcgg ccgcagttat ttttgggtgg g 31


<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Q4N forward primer


<400> 3
aacggaactg ctgcccagaa gacagataca 30


<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Q4N reverse primer


<400> 4
gggatcctca gccagggaga c 21


<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Q9N forward primer


<400> 5
aacaagacag atacatccca c 21


<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Q9N reverse primer


<400> 6
ggcagcatct ccctggggat c 21


<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> D12N forward primer


<400> 7
aatacaaccc accatgatca ggatcac 27


<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> D12N reverse primer


<400> 8
tgtcttctgg gcagcatctc c 21


<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> I26T forward primer


<400> 9
actaccccca acctggctg 19


<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> I26T reverse primer


<400> 10
cttgttgaag gttgggtgat cc 22


<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> A31T forward primer


<400> 11
actgagttcg ccttcagcct atac 24


<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> A31T reverse primer


<400> 12
caggttgggg gtgatcttgt tg 22


<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> L66N forward primer


<400> 13
aacgggacca aggctgacac 20


<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> L66N reverse primer


<400> 14
ggagagcatt gcaaaggctg ta 22


<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> A70N forward primer


<400> 15
aacgacactc acgatgaaat cctg 24


<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> A70N reverse primer


<400> 16
cttggtcccc agggagag 18


<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> G148N forward primer


<400> 17
aacgacaccg aagaggccaa g 21


<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> G148N reverse primer


<400> 18
gaagttgaca gtgaaggctt ctg 23


<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> G148T forward primer


<400> 19
actgacaccg aagaggccaa g 21


<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> G148T reverse primer


<400> 20
gaagttgaca gtgaaggctt ctg 23


<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> R178N forward primer


<400> 21
aacgacacag tttttgctct ggtg 24


<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> R178N reverse primer


<400> 22
gtcaagctcc ttgaccaaat cca 23


<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> K201N forward primer


<400> 23
aacgacaccg aggaagagga c 21


<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> K201N reverse primer


<400> 24
gacttcaaag ggtctctccc att 23


<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Q212N forward primer


<400> 25
aacgtgacca ccgtgaaggt g 21


<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Q212N reverse primer


<400> 26
gtccacgtgg aagtcctctt c 21


<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> E266N forward primer


<400> 27
aacctcaccc acgatatcat cac 23


<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> E266N reverse primer


<400> 28
attttccagg tgctgtagtt tccc 24


<210> 29
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> K343N forward primer


<400> 29
aacgggactg aagctg 16


<210> 30
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> K343N reverse primer


<400> 30
ctcgtcgatg gtcagc 16


<210> 31
<211> 105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> A1AT forward primer 2


<400> 31
gggcccctcg aggccaccat gccgtcttct gtctcgtggg gcatcctcct gctggcaggc 60

ctgtgctgcc tggtccctgt ctccctggct gaagatcccc aggga 105


<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> A1AT reverse primer 2


<400> 32
ggggggatcc tctttttggg tgggattcac 30


<210> 33
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> hGH forward primer


<400> 33
gggcccctcg aggccaccat ggctacaggc tcccgg 36


<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> hGH reverse primer


<400> 34
ggggggatcc tcgaagccac agctgccctc 30


<210> 35
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> P357N forward primer


<400> 35
ccatgttttt agaggccata aacatgtcta tccccccc 38


<210> 36
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> P357N reverse primer


<400> 36
gggggggata gacatgttta tggcctctaa aaacatgg 38


<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> XhoCSF forward primer


<400> 37
gggcccctcg agatggctgg acctgccacc 30


<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> CSFBam reverse primer


<400> 38
ggggggatcc tcgggctggg caaggtggcg 30


<210> 39
<211> 1182
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> pT003


<400> 39
gaggatcccc agggagatgc tgcccagaag acagatacat cccaccatga tcaggatcac 60

ccaaccttca acaagatcac ccccaacctg gctgagttcg ccttcagcct ataccgccag 120

ctggcacacc agtccaacag caccaatatc ttcttctccc cagtgagcat cgctacagcc 180

tttgcaatgc tctccctggg gaccaaggct gacactcacg atgaaatcct ggagggcctg 240

aatttcaacc tcacggagat tccggaggct cagatccatg aaggcttcca ggaactcctc 300

cgtaccctca accagccaga cagccagctc cagctgacca ccggcaatgg cttgttcctc 360

agcgagggcc tgaagctagt ggataagttt ttggaggatg ttaaaaagtt gtaccactca 420

gaagccttca ctgtcaactt cggggacacc gaagaggcca agaaacagat caacgattac 480

gtggagaagg gtactcaagg gaaaattgtg gatttggtca aggagcttga cagagacaca 540

gtttttgctc tggtgaatta catcttcttt aaaggcaaat gggagagacc ctttgaagtc 600

aaggacaccg aggaagagga cttccacgtg gaccaggtga ccaccgtgaa ggtgcctatg 660

atgaagcgtt taggcatgtt taacatccag cactgtaaga agctgtccag ctgggtgctg 720

ctgatgaaat acctgggcaa tgccaccgcc atcttcttcc tgcctgatga ggggaaacta 780

cagcacctgg aaaatgaact cacccacgat atcatcacca agttcctgga aaatgaagac 840

agaaggtctg ccagcttaca tttacccaaa ctgtccatta ctggaaccta tgatctgaag 900

agcgtcctgg gtcaactggg catcactaag gtcttcagca atggggctga cctctccggg 960

gtcacagagg aggcacccct gaagctctcc aaggccgtgc ataaggctgt gctgaccatc 1020

gacgagaaag ggactgaagc tgctggggcc atgtttttag aggccatacc catgtctatc 1080

ccccccgagg tcaagttcaa caaacccttt gtcttcttaa tgattgacca aaataccaag 1140

tctcccctct tcatgggaaa agtggtgaat cccacccaaa aa 1182


<210> 40
<211> 1182
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> pT006


<400> 40
gaggatcccc agggagatgc tgcccagaag acagatacat cccaccatga tcaggatcac 60

ccaaccttca acaagatcac ccccaacctg gctgagttcg ccttcagcct ataccgccag 120

ctggcacacc agtccaacag caccaatatc ttcttctccc cagtgagcat cgctacagcc 180

tttgcaatgc tctccctggg gaccaaggct gacactcacg atgaaatcct ggagggcctg 240

aatttcaacc tcacggagat tccggaggct cagatccatg aaggcttcca ggaactcctc 300

cataccctca accagccaga cagccagctc cagctgacca ccggcaatgg cctgttcctc 360

agcgagggcc tgaagctagt ggataagttt ttggaggatg ttaaaaagtt gtaccactca 420

gaagccttca ctgtcaactt cggggacacc gaagaggcca agaaacagat caacgattac 480

gtggagaagg gtactcaagg gaaaattgtg gatttggtca aggagcttga cagagacaca 540

gtttttgctc tggtgaatta catcttcttt aaaggcaaat gggagagacc ctttgaagtc 600

aaggacaccg aggaagagga cttccacgtg gaccaggtga ccaccgtgaa ggtgcctatg 660

atgaagcgtt taggcatgtt taacatccag cactgtaaga agctgtccag ctgggtgctg 720

ctgatgaaat acctgggcaa tgccaccgcc atcttcttcc tgcctgatga ggggaaacta 780

cagcacctgg aaaatgaact cacccacgat atcatcacca agttcctgga aaatgaagac 840

agaaggtctg ccagcttaca tttacccaaa ctgtccatta ctggaaccta tgatctgaag 900

agcgtcctgg gtcaactggg catcactaag gtcttcagca atggggctga cctctccggg 960

gtcacagagg aggcacccct gaagctctcc aaggccgtgc ataaggctgt gctgaccatc 1020

gacgagaaag ggactgaagc tgctggggcc atgtttttag aggccatacc catgtctatc 1080

ccccccgagg tcaagttcaa caaacccttt gtcttcttaa tgattgacca aaataccaag 1140

tctcccctct tcatgggaaa agtggtgaat cccacccaaa aa 1182


<210> 41
<211> 394
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Alpha-1 antitrypsine


<400> 41
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
1 5 10 15

Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30

Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45

Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60

Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80

Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95

Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110

Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125

Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140

Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160

Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175

Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190

Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205

His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220

Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240

Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255

Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270

Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285

Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300

Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320

Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335

Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe
340 345 350

Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365

Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Asp Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380

Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys
385 390


<210> 42
<211> 394
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Alpha-1 antitrypsine variant


<400> 42
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Asn Lys Thr Asp Thr Ser His His
1 5 10 15

Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30

Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45

Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60

Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80

Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95

Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110

Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125

Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140

Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160

Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175

Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190

Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205

His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220

Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240

Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255

Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270

Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285

Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300

Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320

Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335

Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe
340 345 350

Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365

Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Asp Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380

Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys
385 390


<210> 43
<211> 1755
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> phGH-AT9N DNA


<400> 43
ttcccaacca ttcccttatc caggcttttt gacaacgcta tgctccgcgc ccatcgtctg 60

caccagctgg cctttgacac ctaccaggag tttgaagaag cctatatccc aaaggaacag 120

aagtattcat tcctgcagaa cccccagacc tccctctgtt tctcagagtc tattccgaca 180

ccctccaaca gggaggaaac acaacagaaa tccaacctag agctgctccg catctccctg 240

ctgctcatcc agtcgtggct ggagcccgtg cagttcctca ggagtgtctt cgccaacagc 300

ctggtgtacg gcgcctctga cagcaacgtc tatgacctcc taaaggacct agaggaaggc 360

atccaaacgc tgatggggag gctggaagat ggcagccccc ggactgggca gatcttcaag 420

cagacctaca gcaagttcga cacaaactca cacaacgatg acgcactact caagaactac 480

gggctgctct actgcttcag gaaggacatg gacaaggtcg agacattcct gcgcatcgtg 540

cagtgccgct ctgtggaggg cagctgtggc ttcgaggatc cccagggaga tgctgccaac 600

aagacagata catcccacca tgatcaggat cacccaacct tcaacaagat cacccccaac 660

ctggctgagt tcgccttcag cctataccgc cagctggcac accagtccaa cagcaccaat 720

atcttcttct ccccagtgag catcgctaca gcctttgcaa tgctctccct ggggaccaag 780

gctgacactc acgatgaaat cctggagggc ctgaatttca acctcacgga gattccggag 840

gctcagatcc atgaaggctt ccaggaactc ctccataccc tcaaccagcc agacagccag 900

ctccagctga ccaccggcaa tggcctgttc ctcagcgagg gcctgaagct agtggataag 960

tttttggagg atgttaaaaa gttgtaccac tcagaagcct tcactgtcaa cttcggggac 1020

accgaagagg ccaagaaaca gatcaacgat tacgtggaga agggtactca agggaaaatt 1080

gtggatttgg tcaaggagct tgacagagac acagtttttg ctctggtgaa ttacatcttc 1140

tttaaaggca aatgggagag accctttgaa gtcaaggaca ccgaggaaga ggacttccac 1200

gtggaccagg tgaccaccgt gaaggtgcct atgatgaagc gtttaggcat gtttaacatc 1260

cagcactgta agaagctgtc cagctgggtg ctgctgatga aatacctggg caatgccacc 1320

gccatcttct tcctgcctga tgaggggaaa ctacagcacc tggaaaatga actcacccac 1380

gatatcatca ccaagttcct ggaaaatgaa gacagaaggt ctgccagctt acatttaccc 1440

aaactgtcca ttactggaac ctatgatctg aagagcgtcc tgggtcaact gggcatcact 1500

aaggtcttca gcaatggggc tgacctctcc ggggtcacag aggaggcacc cctgaagctc 1560

tccaaggccg tgcataaggc tgtgctgacc atcgacgaga aagggactga agctgctggg 1620

gccatgtttt tagaggccat acccatgtct atcccccccg aggtcaagtt caacaaaccc 1680

tttgtcttct taatgattga ccaaaatacc aagtctcccc tcttcatggg aaaagtggtg 1740

aatcccaccc aaaaa 1755


<210> 44
<211> 394
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Alpha-1 antitrypsine divariant


<400> 44
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Asn Lys Thr Asp Thr Ser His His
1 5 10 15

Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30

Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45

Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60

Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80

Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95

Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110

Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125

Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140

Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160

Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175

Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190

Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205

His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220

Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240

Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255

Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270

Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285

Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300

Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320

Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335

Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe
340 345 350

Leu Glu Ala Ile Asn Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365

Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Asp Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380

Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys
385 390


<210> 45
<211> 1706
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> pT603N


<400> 45
ccacccccct gggccctgcc agctccctgc cccagagctt cctgctcaag tgcttagagc 60

aagtgaggaa gatccagggc gatggcgcag cgctccagga gaagctgtgt gccacctaca 120

agctgtgcca ccccgaggag ctggtgctgc tcggacactc tctgggcatc ccctgggctc 180

ccctgagcag ctgccccagc caggccctgc agctggcagg ctgcttgagc caactccata 240

gcggcctttt cctctaccag gggctcctgc aggccctgga agggatctcc cccgagttgg 300

gtcccacctt ggacacactg cagctggacg tcgccgactt tgccaccacc atctggcagc 360

agatggaaga actgggaatg gcccctgccc tgcagcccac ccagggtgcc atgccggcct 420

tcgcctctgc tttccagcgc cgggcaggag gggtcctggt tgcctcccat ctgcagagct 480

tcctggaggt gtcgtaccgc gttctacgcc accttgccca gcccgaggat ccccagggag 540

atgctgccaa caagacagat acatcccacc atgatcagga tcacccaacc ttcaacaaga 600

tcacccccaa cctggctgag ttcgccttca gcctataccg ccagctggca caccagtcca 660

acagcaccaa tatcttcttc tccccagtga gcatcgctac agcctttgca atgctctccc 720

tggggaccaa ggctgacact cacgatgaaa tcctggaggg cctgaatttc aacctcacgg 780

agattccgga ggctcagatc catgaaggct tccaggaact cctccatacc ctcaaccagc 840

cagacagcca gctccagctg accaccggca atggcctgtt cctcagcgag ggcctgaagc 900

tagtggataa gtttttggag gatgttaaaa agttgtacca ctcagaagcc ttcactgtca 960

acttcgggga caccgaagag gccaagaaac agatcaacga ttacgtggag aagggtactc 1020

aagggaaaat tgtggatttg gtcaaggagc ttgacagaga cacagttttt gctctggtga 1080

attacatctt ctttaaaggc aaatgggaga gaccctttga agtcaaggac accgaggaag 1140

aggacttcca cgtggaccag gtgaccaccg tgaaggtgcc tatgatgaag cgtttaggca 1200

tgtttaacat ccagcactgt aagaagctgt ccagctgggt gctgctgatg aaatacctgg 1260

gcaatgccac cgccatcttc ttcctgcctg atgaggggaa actacagcac ctggaaaatg 1320

aactcaccca cgatatcatc accaagttcc tggaaaatga agacagaagg tctgccagct 1380

tacatttacc caaactgtcc attactggaa cctatgatct gaagagcgtc ctgggtcaac 1440

tgggcatcac taaggtcttc agcaatgggg ctgacctctc cggggtcaca gaggaggcac 1500

ccctgaagct ctccaaggcc gtgcataagg ctgtgctgac catcgacgag aaagggactg 1560

aagctgctgg ggccatgttt ttagaggcca taaacatgtc tatccccccc gaggtcaagt 1620

tcaacaaacc ctttgtcttc ttaatgattg accaaaatac caagtctccc ctcttcatgg 1680

gaaaagtggt gaatcccacc caaaaa 1706

Claims (7)

  1. α−１アンチトリプシンのＮ−末端の１番位置から２５番位置の間の特定部位にあるアミノ酸をアスパラギンに置換して糖化部位を追加させたことを特徴とするα−１アンチトリプシン変異体であって、
    該特定部位は、９番位置あるいは１２番位置である、α−１アンチトリプシン変異体。
  2. ａ) α−１アンチトリプシンのＮ−末端の９番位置あるいは１２番位置にあるアミノ酸をアスパラギンに置換して糖化部位を追加させる段階と、
    ｂ) 前記糖化部位が追加されたα−１アンチトリプシン発現ベクターを転移させた細胞を培地上で培養する段階と、
    ｃ) 前記細胞からα−１アンチトリプシン変異体タンパク質を発現させる段階と、
    ｄ) 前記発現されたα−１アンチトリプシン変異体タンパク質を精製して回収する段階と、
    を含むことを特徴とする、請求項１に記載のα−１アンチトリプシン変異体の製造方法。
  3. 請求項１に記載のα−１アンチトリプシン変異体を有効成分で含むことを特徴とするα−１アンチトリプシン欠乏症の予防または治療用組成物。
  4. 前記α−１アンチトリプシン欠乏症は、慢性閉鎖性肺疾患あるいは肝硬変であることを特徴とする請求項３に記載のα−１アンチトリプシン欠乏症の予防または治療用組成物。
  5. 請求項１に記載のα−１アンチトリプシン変異体を二つ連結して体内半減期が増加されたことを特徴とするα−１アンチトリプシン変異体の融合体。
  6. 請求項１に記載のα−１アンチトリプシン変異体に他の異種タンパク質を連結して異種タンパク質の体内半減期が増加されたことを特徴とするα−１アンチトリプシン変異体の融合体。
  7. 前記α−１アンチトリプシン変異体は、追加的にＰ２位置である、α−１アンチトリプシンのＮ−末端の３５７番目アミノ酸のプロリン (ｐｒｏｌｉｎｅ)がアスパラギン(ａｓｐａｒａｇｉｎｅ)に置換されたことを特徴とする請求項６に記載のα−１アンチトリプシン変異体の融合体。
JP2014530581A 2011-09-15 2012-08-13 新規なα−１アンチトリプシン変異体、その製造方法及び用途 Active JP6001074B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20110092819 2011-09-15
KR10-2011-0092819 2011-09-15
KR10-2012-0058998 2012-06-01
KR1020120058998A KR101402702B1 (ko) 2011-09-15 2012-06-01 신규한 알파-1 안티트립신 변이체, 이의 제조방법 및 용도
PCT/KR2012/006441 WO2013039295A1 (ko) 2011-09-15 2012-08-13 신규한 알파-1 안티트립신 변이체, 이의 제조방법 및 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2014534166A JP2014534166A (ja) 2014-12-18
JP6001074B2 true JP6001074B2 (ja) 2016-10-05

Family

ID=48179554

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014530581A Active JP6001074B2 (ja) 2011-09-15 2012-08-13 新規なα−１アンチトリプシン変異体、その製造方法及び用途

Country Status (11)

Country Link
US (1) US9051395B2 (ja)
EP (1) EP2757110B1 (ja)
JP (1) JP6001074B2 (ja)
KR (1) KR101402702B1 (ja)
CN (1) CN103827141B (ja)
AU (1) AU2012309292B2 (ja)
BR (1) BR112014005788B1 (ja)
CA (1) CA2848919C (ja)
MX (1) MX349364B (ja)
RU (1) RU2567007C1 (ja)
WO (1) WO2013039295A1 (ja)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013183948A1 (ko) 2012-06-05 2013-12-12 씨제이제일제당 (주) 고당화된 지속형 인간 성장호르몬 단백질 및 이의 제조방법
WO2019125002A1 (ko) 2017-12-20 2019-06-27 (주)알테오젠 신규한 성장 호르몬 수용체 길항제 및 이의 융합 단백질
KR102167827B1 (ko) * 2017-12-20 2020-10-20 주식회사 알테오젠 신규한 성장 호르몬 수용체 길항제 및 이의 융합 단백질
WO2019237079A2 (en) * 2018-06-07 2019-12-12 Xiaolong Zhang Pharmaceutical composition containing fusion protein and use thereof
KR102134571B1 (ko) * 2018-06-15 2020-07-16 주식회사 알테오젠 혈액응고인자 VII/VIIa 융합단백질의 제조 방법
SG11202012765PA (en) 2018-06-22 2021-01-28 Ucl Business Ltd Novel compounds

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR0133252B1 (ko) * 1993-05-18 1998-04-14 김은영 내열성의 알파-1-안티트립신 뮤테인
US5817484A (en) * 1993-05-18 1998-10-06 Korea Institute Of Science And Technology Thermoresistant α-1-antitrypsin mutein
RU2392963C2 (ru) * 2004-08-09 2010-06-27 Элиоз Байофарма, Инк. Синтетические варианты гипергликозилированного протеазо-резистентного полипептида, пероральные композиции и способы применения таких вариантов
EP2167539A2 (en) 2007-06-15 2010-03-31 Charite-Universitätsmedizin Berlin Methods for producing glycosylated human alpha-1 antitrypsin (a1at) in mammalian host cells
BRPI1006443B1 (pt) * 2009-04-22 2021-05-25 Alteogen, Inc Proteína ou peptídeo de fusão e método para aumentar a meia-vida in vivo de uma proteína ou peptídeo
WO2013183948A1 (ko) * 2012-06-05 2013-12-12 씨제이제일제당 (주) 고당화된 지속형 인간 성장호르몬 단백질 및 이의 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
US9051395B2 (en) 2015-06-09
MX2014003183A (es) 2015-01-12
KR101402702B1 (ko) 2014-06-05
RU2014114790A (ru) 2015-10-20
BR112014005788B1 (pt) 2021-01-12
CA2848919C (en) 2016-09-13
US20140371160A1 (en) 2014-12-18
AU2012309292B2 (en) 2015-05-07
AU2012309292A1 (en) 2014-04-24
JP2014534166A (ja) 2014-12-18
RU2567007C1 (ru) 2015-10-27
WO2013039295A1 (ko) 2013-03-21
KR20130029713A (ko) 2013-03-25
CN103827141A (zh) 2014-05-28
MX349364B (es) 2017-07-26
EP2757110A4 (en) 2015-04-22
CN103827141B (zh) 2016-01-13
CA2848919A1 (en) 2013-03-21
EP2757110A1 (en) 2014-07-23
EP2757110B1 (en) 2017-09-27
BR112014005788A2 (pt) 2017-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6001074B2 (ja) 新規なα−１アンチトリプシン変異体、その製造方法及び用途
AU650730B2 (en) Recombinant human factor VIII derivatives
AU2010244592B2 (en) Recombinant human alpha1-antitrypsin
JP2019531087A (ja) 高グリコシル化ヒト血液凝固第ｖｉｉｉ因子の融合タンパク質、その調製方法、および使用
JP2010518039A (ja) カザールタイプ・セリン・プロテアーゼ阻害剤の治療への応用
AU2021225156B2 (en) UTI fusion proteins
TWI835773B (zh) 組合物及使用方法
US20240132573A1 (en) Modified serpins for the treatment of bradykinin-mediated disease
HUT75358A (en) Methods of prouducing effective recombinant serine protease inhibitors and uses of these inhibitors
EP3858865A9 (en) Fusion protein of mutated single-chain human coagulation factor viii, preparation method therefor, and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20150619

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150915

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20160128

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20160428

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20160818

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20160831

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6001074

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250