JP2010518039A - カザールタイプ・セリン・プロテアーゼ阻害剤の治療への応用 - Google Patents
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Abstract
Description
インフェスチン−4の様な異種の阻害剤をヒトに治療的投与すると、免疫応答を起こす可能性がある。従って、本発明の別の目的は、免疫原性がより少ないが、なお強力なカザールタイプ・セリン・プロテアーゼ阻害剤を同定することである。驚くべきことに、1つの関連するヒトカザールタイプ・セリン・プロテアーゼ阻害剤(セリン・プロテアーゼ阻害剤カザールタイプ1、SPINK−1)を、推定される酵素接触部位をインフェスチン−4の対応する領域で置換する方法で修飾することにより、高度に活性なFXIIa阻害剤が生成され、この阻害剤が、特に血栓性の事象を治療又は予防する物質を製造するために用いることが出来ることが発見された。これらの結果に基づいて、任意の天然のカザールタイプ・セリン・プロテアーゼ阻害剤を、FXIIa特異的になる方法で修飾することが可能である。その実施例を以下の章に記載する。
本発明の別の側面は、インフェスチン−4及び修飾した半減期を有するインフェスチン類似体又はそのフラグメントに基づく修飾哺乳類カザールタイプ・セリン・プロテアーゼ阻害剤である。本発明のカザールタイプ・セリン・プロテアーゼ阻害剤は比較的小さなタンパク質なので、他の小さなタンパク質に関して報告されているように迅速な腎クリアランスが期待され得る(Werle M. and Bernkop-Schnurch A., 2006, ペプチド及びタンパク質薬剤の血漿半減期を改善する戦略(Strategies to improve plasma half-life time of
peptide and protein drugs), Amino Acids 30:351-367)。ポリペプチド系化合物の短い血漿半減を対処する1つの方法は、勿論、繰り返しそれを注射するか又は連続注入によるかである。好ましくは、そのポリペプチド自体の固有の血漿半減期を増大させることである。従って、本発明の別の側面は、カザールタイプ・セリン・プロテアーゼ阻害剤を半減期延長タンパク質(HLEP)に融合させることである。
−カザールタイプ・セリン・プロテアーゼ阻害剤が発現する条件下で本発明の宿主細胞を培養すること;及び
−場合により、その培養液からカザールタイプ・セリン・プロテアーゼ阻害剤を回収すること;
を含む。
本発明のカザールタイプ・セリン・プロテアーゼ阻害剤及び修飾カザールタイプ・セリン・プロテアーゼ阻害剤は、細菌、酵母、植物、動物(昆虫を含む)又はヒト細胞株のような、原核又は真核の宿主細胞において、又はトランスジェニック動物において組み換え分子として産生することが出来る。場合により、ポリペプチドは宿主細胞から分泌させる。
好適な宿主細胞における高レベルでの遺伝子組み換えタンパク質の産生は、当業者に既知の方法に従って、上述の修飾cDNAを、種々の発現システムに増強することが出来る組み換え発現ベクター中の適した調節要素と共に効率的な転写ユニット内に組み立てることを必要とする。効率的な転写調節要素は、ウイルスの天然の宿主としての動物細胞を有するウイルスから又は動物細胞の染色体DNAから誘導することができる。好ましくは、シミアンウイルス40、アデノウイルス、BKポリオーマウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、若しくはラウス肉腫ウイルスの長端末反復から誘導されたプロモーター−エンハンサーの組み合わせ、又はベータアクチン若しくはGRP78のように動物細胞において強く構成的に転写された遺伝子を含むプロモーター−エンハンサーの組み合わせを用いることが出来る。cDNAから転写された安定した高レベルのmRNAを得るために、その転写ユニットは、3’−近位部に転写終結−ポリアデニル化配列をコード化するDNA領域を含む必要がある。好ましくは、この配列は、シミアンウイルス40の初期転写領域、ウサギベータグロビン遺伝子、又はヒト組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子由来のものである。
本発明の実施において、宿主として有用であると見込まれている酵母の典型的な属は、ピチア(Pichia)(以前はハンセヌラとして分類されていた)、サッカロミセス(Saccharomyces)、クリベロミセス(Kluyveronyces)、アスペルギルス(Aspergillus)、カンジダ(Candida)、トルロプシス(Torulopsis)、トルラスポラ(Torulaspora)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、シテロミセス(Citeromyces)、パキソレン(Pachysolen)、ザイゴサッカロミセス(Zygosaccharomyces)、デバロミセス(Debaromyces)、トリコデルマ(Trichoderma)、セファロスポリウム(Cephalosporium)、フミコラ(Humicola)、ムコール(Mucor)、ニューロスポラ(Neurospora)、ヤロウィア(Yarrowia)、メチニコウィア(Metschunikowia)、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)、ロイコスポリジウム(Leucosporidium)、ボツリアスクス(Botryoascus)、スポリジオボルス(Sporidiobolus)、エンドマイコプシス(Endomycopsis)などである。属としては、サッカロミセス(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、クリベロミセス(Kluyveronyces)、ピチア(Pichia)、及びトルラスポラ(Torulaspora)から成る群から選択されたものが含まれる。サッカロミセス種(Saccharomyces spp)の例としては、S.セレビシエ(S. cerevisiae)、S.イタリクス(S. italicus)及びS.ルーキシイ(S. rouxii)がある。
1990, シゾサッカロミセス ポンベのfbp1遺伝子の発現を構成する突然変異株の単離と特性解析(Isolation and characterization of mutants constitutive for expression of the fbp1 gene of Schizosaccharomyces pombe), Genetics 124:807-816)によって記載されたグルコース−抑制jbpl遺伝子プロモーターである。
細菌における本発明の修飾カザールタイプ・セリン・プロテアーゼ阻害剤の産生のための典型的な発現システムは、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、カウロバクター・クレセンツス(Caulobacter crescentus)、及び最も重要なものとして、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli )BL21、及びE.コリ(E. coli )K12、並びにそれらの派生菌を含む。便利なプロモーターとしては、trcプロモーター、tacプロモーター、lacプロモーター、ラムダファージ、プロモーターPL、L−アラビノース誘導のaraBADプロモーター、L−ラムノース誘導のrhaPプロモーター、及び無水テトラサイクリン誘導のtetAプロモーター/オペレーターが挙げられるが、それらに限定されない。
本発明の修飾カザールタイプ・セリン・プロテアーゼ阻害剤の発現の典型的な植物系には、タバコ、バレイショ、コメ、メイズ、ダイズ、アルファルファ、トマト、レタス及びマメ科植物が含まれる(MaJKC et al., 2003, 植物における遺伝子組み換え薬用タンパク質の生産(The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants), Nat. Rev. Genet. 4:794-805に要約されている)。植物系における組み換えタンパク質の発現を、好適な調節因子によって、果実、種子、葉又は塊茎のような特定の器官又は組織に対して指令することができる。代わりに、タンパク質を根から分泌させることができる。細胞の中で、タンパク質を、特定のコンパートメント、例えば小胞体、タンパク粒、又は色素体などに標的化することができる。その場所で、生産物はより高いレベルに蓄積するか、又は特別な形態の翻訳後修飾を受けることができる。
大規模なトランスジェニック発現システム(概説のためにはPollock DP., 1999, トランスジェニック抗体の産生の方法としてのトランスジェニックミルク(Transgenic milk as a method for the production of recombinant antibodies), J. Immunol Methods 231:147-157を参照)の典型的な例としては、ウサギ(Chrenek P et al., 2007, 数世代の遺伝子組み換えウサギのミルクにおける組み換えヒト第VIII因子の発現(Expression of recombinant humen factor VIII in milk of several generations of transgenic rabbits), Transgenic Res. 2007 Jan 31)、ヤギ(Lazaris A et al., 2006, ヤギにおける核移植を用いた遺伝子導入(Transgenesis using nuclear transfer in goats), Methods Mol Biol. 348:213-26.)、ブタ及びウシが挙げられる。
本発明のカザールタイプ・セリン・プロテアーゼ阻害剤は、好ましくは80%を越える純度、より好ましくは95%を越える純度、特に好ましくは薬学的純度の状態、即ち含有する高分子、特に他のタンパク質及び核酸に関して99.9%を越える純度であり、そして感染性及び発熱性物質が存在しない状態に精製される。好ましくは、単離された又は精製された本発明のカザールタイプ・セリン・プロテアーゼ阻害剤は、他のポリペプチドを実質的に含まない。
インフェスチン−4、SPINK−1及び修飾カザールタイプ・セリン・プロテアーゼ阻害剤のクローニング
SPINK−1アミノ酸配列を、哺乳動物細胞発現に最適化し、好適な制限部位を含めて、cDNA配列に逆翻訳した。天然のSPINK−1シグナルペプチドを含んで、産生しようとするSPINK分子のヌクレオチド配列(図4を参照)を、3つのセグメントに分け、そのそれぞれをオーバーラップオリゴヌクレオチド(Medigenomix、Martinsried、Germany)によりカスタム合成した。セグメント2及び3の2つの変異体を産生させそれぞれ以下のように組み立てた。
S1+S2K1+S3wtで、野生型SPINK−K1を生じた;
S1+S2K1+S3K3で、野生型SPINK−K3を生じた。
これらのセグメントのヌクレオチド配列は、配列番号7〜11として示してある(S1:配列番号7;S2wt:配列番号8; S2K1:配列番号9;S3wt:配列番号10;S3K3:配列番号11)。
b)S1:EcoRI/NarI+S2K1:NarI/Kpnl+S3wt:Kpnl/BamH1;
c)S1:EcoRI/NarI+S2K1:NarI/Kpnl+S3K3:Kpnl/BamH1;
において、EcoRI/BamH1消化発現ベクターpIRESpuro3(BD Bioscience)中にライゲート、それぞれプラスミドp1171(a)、p1172(b)及びp1174(c)を得た。
アルブミン融合構築物のクローニング
先ず、pIRE−Spuro3(BD BioSciences)のEcoRI部位にクローニングしたヒトアルブミンcDNA配列を、オリゴヌクレオチドWe2467及びWe2468(配列番号15及び16)を用いて市販の突然変異誘発キット(QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit、Stragene)を用いた位置指定突然変異誘発により突然変異誘発を行い、終止コドンを除き、SPINKとインフェスチン−4配列を挿入するためにグリシン/セリン・リンカーの最初の部分とBamH1制限部位を導入した。得られたプラスミドをp1192と名付けた。このSPINKコード配列(シグナルペプチド無し)をPCRにより、p1171、p1172、p1173、及びp1174をテンプレートとして用い、グリシン/セリン・リンカーの残りの部分及びBamH1部位を5’末端にNoTI部位を3’末端に導入したWe2470及びWe2473(配列番号17及び18)をプライマーに用いて増幅した。PCRフラグメントを、BamH1/Notlで消化し、精製し、そしてp1192に挿入し、そしてBamH1/Notlで切断した。得られたアルブミン融合プラスミドp1187は、アルブミンに融合した野生型SPINK−1を、p1188はアルブミンに融合したSPINK−K1を、p1189はアルブミンに融合したSPINK−K2を、そしてp1190はアルブミンに融合したSPINK−K3を含んでいた。同様に、インフェスチン−4アルブミン発現プラスミドも構築したが、p1288には、代わりにWe2473及びWe2623(配列番号18及び19)を用いた。得られた発現プラスミドをp1290と名付けた。コード化されたタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号20、21、22、23及び24に示す。
哺乳動物細胞培養におけるHisタグのついたインフェスチン−4及びインフェスチン−4とSPINKアルブミンの融合タンパク質のトランスフェクション及び発現
発現プラスミドをE.コリTOP10(Invitrogen)で増殖させ、標準プロトコル(Quiagen)を用いて精製した。HEK−293細胞にリポフェクタミン2000試薬(Invitrogen)を用いてトランスフェクトし、無血清培地(Invitrogen 293 Express)中、4μg/mlのピューロマイシンの存在下で増殖させた。トランスフェクションした細胞集団を、T型フラスコを通してローラーボトル又は小規模の培養槽内に広げ、そこから培養上清を精製のために取得した。HEK−293細胞における発現収率は、アルブミン融合タンパク質について6〜15μg/mLであり、His−タグ付きインフェスチン−4について約0.5〜1μg/mLであった。
酵母におけるHisタグ付きのインフェスチン−4及びインフェスチン−4アルブミン融合タンパク質の発現
Hisタグ付きのインフェスチン−4及びインフェスチン−4アルブミン融合タンパク質のコード配列を、Introgen, MoBiTec又はNovozyme Biopharmaに記載されているようにして、S.セレビシエ(S. cerevisiae)の発現に適した発現ベクター中に移した。振とう培養フラスコ内で標準増殖培地を用いた発現の結果、発現収率は、クマジー染色後のSDS−PAGE分析から推定して、アルブミン融合タンパク質について、30〜50μg/mLの間であり、Hisタグ付きのインフェスチン−4について、約1〜5μg/mLであった。
カザール阻害剤−アルブミン融合タンパク質の精製
0.2μmの目でろ過した細胞培養上清(25L)を、限外ろ過(10kDaの除去サイズ)により1Lの容量に濃縮し、引き続いて40mMのTris/HCl、pH7.5緩衝液に対して透析ろ過を行い、再度0.2μmでろ過を行った。この粗製の濃縮液を、更にPOROS 50 PI(26×750)を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーで精製した。カラムを、40mMのTris/HCl、pH7.5緩衝液で平衡化した。サンプルをローディングした後、15カラムボリューム(CV)の洗浄工程を行った。生産物を、35CVにわたって、40mMのTris/HCl、1200mMの塩化ナトリウム、pH7.5緩衝液までの線形グラジエントで溶離した。融合タンパク質含有画分をプールし、限外ろ過により濃縮した。生理食塩液に対する透析ろ過の結果、約15mg/mLの濃度を有する約90%の純度の生産物が得られた。
カザール阻害剤−アルブミン融合タンパク質の生化学的特性解析
同一性/純度の測定:
タンパク質の同一性/純度は、標準の手順(NOVEX)を用いるSDS−PAGE(8〜16%)により測定した。染色はクマジー青で行った。
アルブミン融合タンパク質のタンパク質濃度は、アルブミンに特異的なELISAを用いて測定したが、この主要な性能は当業者には公知である。簡潔にいえば、緩衝液A(Sigma C-3041)で1:14000に希釈したウェル当たり120μLの捕捉抗体(ウサギ抗ヒトアルブミンIgG、DAKO A0001)を有するマイクロプレートを、周囲温度で一夜インキュベートした。プレートを緩衝液B(Sigma T-9039)で3回洗浄した後、各ウェルを緩衝液C(Sigma T-8793)(200μL)と室温で更に1時間インキュベートした。更なる緩衝液Bによる3回の洗浄工程の後、緩衝液Bでの試験サンプルの連続希釈液、並びに緩衝液BでのN Protein Standard SL(Dade Behring, 0.5〜100ng/mL)の連続希釈液(ウェル当たり容量:100μL)を、周囲温度で1時間インキュベートした。3回の緩衝液Bによる洗浄工程の後、検出抗体(ウサギ抗ヒトアルブミン、DAKO P0356、ぺルオキシダーゼ標識)の緩衝液Bでの1:12500希釈液(100μL)を各ウェルに加え、周囲温度で更に1時間インキュベートした。緩衝液Bによる3回の洗浄工程の後、基質溶液(TMB, Dade Behring, OUVF)(各ウェル当たり100μL)を加え、周囲温度で30分間遮光下でインキュベートした。停止液(Dade Behring, OSFA)(100μL)を添加して、サンプルを適したマイクロプレートリーダーで波長450nmで測定するために調製した。次いで、試験サンプルの濃度を、基準としてN Protein Standardの標準曲線を使用して算出した。
活性化部分トロンボプラスチン時間を、標準ヒト血漿(SHP, Dade Behring)中で測定した。この場合、異なる量のそれぞれの阻害剤をイミダゾール緩衝液に加えて、全容量を200μLにした。この溶液(50μL)をPathromtin SL(Dade Behring)(50μL)に加え、37℃で120秒間インキュベートした。引き続いて、塩化カルシウム液(25mM、50μL)を加えて反応を開始した。
プロトロンビン時間を標準ヒト血漿(Dade Behring)で測定し、活性化試薬はThromborel S(Dade Behring)を用いた。15秒のインキュベーション時間の後に、Thromborel S(100μL)をサンプル(上記、50μL)に加えた。手順は、製造業者に示唆された条件に従って、BCT(Behring Coagulation Timer)で行なった。
インフェスチン−4アルブミン融合体は、マウスの動脈血栓症モデルにおいて血管閉塞を予防するのに高度に有効である
動脈血栓からマウスを強力に防護するために必要とされる用量を推定するために、予備的なインビトロでのスパイキング(spiking)実験を行なった。rHA−インフェスチン−4のマウスの血漿へのスパイキングは、FXII活性の低下及びaPTTの延長をもたらしたが、PTは実質的に無変化のままであった。
ラットFeCl3動脈モデルの血栓症における、市販のFXII(a)阻害剤Berinert(登録商標)PのaPTT、PT及び血管閉塞に対する効果
市販のFXII(a)阻害剤Berinert(登録商標)P(C1エステラーゼ阻害剤)のFXII(a)に対する潜在阻害能力の適切性を評価するために、幾つかのインビトロ及びインビボ実験を行った。
高濃度のBerinert(登録商標)Pは、著明なFXIIの阻害をインビトロでもたらした。しかし、FeCl3動脈血栓症モデルにおいては、高用量のBerinert(登録商標)Pでも効果がなかった。このBerinert(登録商標)Pの用量は、高用量の適用が高いタンパク質負荷と非生理的な注射容量になりかねないため、技術的な限界に近いものであった。
マウスにおける(His)6−インフェスチン及びrHA−インフェスチン−4の薬物動態の比較
Hisタグ付きインフェスチン−4((His)6−インフェスチン−4)又はインフェスチン−4アルブミン融合体(rHA−インフェスチン−4)製剤を、合計28匹のNMRIマウスに静脈内投与した。用量は、それぞれ(His)6−インフェスチン−4に関しては20mg/kg体重、rHA−インフェスチン−4に関しては200mg/kg体重であった。これらの投与量は、2つのタンパク質、即ちインフェスチン−4の活性成分と等量に対応している。
Claims (18)
- インフェスチン−4に対する相同性を増大させるために突然変異をさせた阻害剤であり、且つ、三次元的な動脈又は静脈血栓の形成及び/又は安定化を予防するのに適した、SPINK−1由来の突然変異カザール阻害剤。
- 阻害されるプロテアーゼとの接触部位が、カザールタイプ阻害剤であるインフェスチンのドメイン4由来のものである、請求項1に記載の突然変異カザール阻害剤。
- 修飾カザール阻害剤配列内の追加のアミノ酸の位置がインフェスチンのドメイン4由来のものである、請求項2に記載の突然変異カザール阻害剤。
- SPINK K1、K2及びK3(配列番号2、3及び4)である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の突然変異カザール阻害剤。
- 阻害剤を半減期を増強させるポリペプチドに連結する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の突然変異カザール阻害剤、及び/又はインフェスチン若しくはそのフラグメント、好ましくはインフェスチン3〜4、又はより好ましくはインフェスチン4。
- 半減期を増強させるポリペプチドがヒトアルブミンタンパク質ファミリーのメンバー、即ちアルブミン、アファミン、アルファ−フェトプロテイン又はビタミンD結合タンパク質由来のものであることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の阻害剤。
- 半減期を増強させるポリペプチドが、ヒトアルブミン、又はその突然変異体、ドメイン若しくは一部であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の阻害剤。
- 半減期を増強させるポリペプチドが免疫グロブリン又はその一部であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の阻害剤。
- 免疫グロブリン部分がIgG Fc部分であることを特徴とする、請求項8に記載の阻害剤。
- 半減期を増強させるポリペプチドがリンカー、好ましくは切断可能なリンカーを介してカザール阻害剤部分に連結していることを特徴とする、請求項5〜9のいずれか1項に記載の阻害剤。
- リンカーが内因性凝固経路の凝固プロテアーゼにより切断可能であることを特徴とする、請求項10に記載の阻害剤。
- リンカーがFXIIaにより切断可能であることを特徴とする、請求項11に記載の阻害剤。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の阻害剤を含む、又はインフェスチン若しくはそのフラグメントを含む薬剤。
- 薬剤として使用するための、請求項1〜12のいずれか1項に記載の阻害剤及び/又はインフェスチン若しくはそのフラグメント。
- 動脈血栓形成に関連する状態又は疾患の治療若しくは予防する薬剤を製造するための、請求項1〜12のいずれか1項に記載の阻害剤及び/又はインフェスチン若しくはそのフラグメントの使用。
- 動脈血栓症、脳卒中、心筋梗塞、炎症、補体活性化、線維素溶解、血管新生、及び/又は低浸透圧ショック、遺伝性血管性浮腫を含む浮腫、細菌感染、関節炎、膵炎、又は関節痛風、播種性血管内凝固症候群(DIC)及び敗血症などの病的なキニン形成に関係する疾患を治療又は予防する薬剤を製造するための、請求項1〜12のいずれか1項に記載の阻害剤及び/又はインフェスチン若しくはそのフラグメントの使用。
- 動脈血栓形成に関連する状態又は疾患の治療における請求項1〜12のいずれか1項に記載の阻害剤及び/又はインフェスチン若しくはそのフラグメント、好ましくはインフェスチン3〜4、又はインフェスチン4の効能を増大させる方法であって、ここで、該阻害剤を半減期を増強するポリペプチドに連結する、方法。
- 真核細胞、細菌、酵母、植物若しくは昆虫細胞において組み換え体手段を介して、又はトランスジェニック動物において、請求項1〜12のいずれか1項に記載の阻害剤及び/又はインフェスチン若しくはそのフラグメントを生産する方法。
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A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
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A601 | Written request for extension of time |
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A761 | Written withdrawal of application |
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