KR101629702B1 - 카잘-형 세린 프로테아제 억제제의 치료학적 적용 - Google Patents

카잘-형 세린 프로테아제 억제제의 치료학적 적용 Download PDF

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Abstract

본 발명의 목적은 가장 일반적인 측면에서, 소위 내인성 응고 경로의 활성화에 관련된 단백질을 방해함으로써 3차원적 동맥 또는 정맥 혈전의 형성 및/또는 안정화를 예방하는, 카잘-형 세린 프로테아제 억제제 인페스틴 또는 이의 도메인 또는 인페스틴 동족체를 기초로 한 변형된 카잘-형 세린 프로테아제 억제제의 치료학적 적용에 있다. 특히, 본 발명은 동맥 혈전 형성과 관련된 상태 또는 질환, 즉, 뇌졸중, 심근경색, 염증, 보체 활성화, 섬유소용해, 혈관형성 및/또는 저장성 쇼크, 유전성 맥관부종을 포함하는 부종, 세균 감염, 관절염, 췌장염 또는 관절 통풍, 파종성 혈관내 응고 증후군(DIC) 및 패혈증과 같은 병리학적 키닌 형성에 연관된 질병의 치료 또는 예방에 있어서 상기 카잘-형 세린 프로테아제 억제제 또는 이의 단편 또는 변형된 카잘-형 세린 프로테아제 억제제의 용도에 관한 것이다.
카잘-형 세린 프로테아제 억제제, 인페스틴, 내인성 응고 경로, 혈전 형성, 혈전증

Description

카잘-형 세린 프로테아제 억제제의 치료학적 적용{Therapeutic application of Kazal-type serine protease inhibitors}
본 발명의 목적은, 가장 일반적인 측면에서, 소위 내인성(intrinsic) 응고 경로의 활성화에 포함된 단백질을 방해함으로써 3차원적 동맥 또는 정맥 혈전의 형성 및/또는 안정화를 예방하는, 카잘-형(Kazal-type) 세린 프로테아제 억제제 인페스틴(Infestin) 또는 이의 도메인 또는 인페스틴 동족체를 기준으로 한 변형된 카잘-형 세린 프로테아제 억제제의 치료학적 적용이다. 특히, 본 발명은 동맥 혈전 형성, 예를 들면, 뇌졸중 또는 심근경색, 염증, 보체 활성화, 섬유소용해, 혈관형성 및/또는 저장성 쇼크, 유전성 맥관부종을 포함하는 부종, 세균 감염, 관절염, 췌장염 또는 관절 통풍, 파종성 혈관내 응고 증후군(DIC) 및 패혈증과 같은 병리학적 키닌 형성에 연관된 질병의 치료 또는 예방에 있어서 상기 카잘-형 세린 프로테아제 억제제 또는 이의 단편 또는 변형된 카잘-형 세린 프로테아제 억제제의 용도에 관한 것이다.
혈관벽 손상은 혈액 혈소판의 갑작스러운 부착 및 응집에 이어, 손상 부위를 폐색시키는 섬유소-함유 트롬빈의 형성 및 혈장 응고 시스템의 활성화를 유도한다. 이러한 현상은 외상 후 혈액 손실을 제한하는데 있어 중요하지만 또한 병든 혈관을 폐색시킴으로써 허혈 및 중요 기관의 경색증을 유도할 수 있다. 폭포 모델(waterfall model)에서, 혈액 응고는 트롬빈의 생성시 최고점에 이르는 제한된 단백질분해에 의한 자이모젠(zymogen) 활성화를 포함하는 일련의 반응에 의해 진행되며, 이는 혈장 피브리노겐을 피브린으로 전환시키고 혈소판을 활성화시킨다. 이어서, 콜라겐- 또는 피브린-부착 혈소판은 응고 프로테아제 복합체의 조립 및 활성화를 전파하는, 이들의 외부 표면에서 응고촉진성 인지질(주로, 포스파티딜 세린)의 노출을 통한 몇 배의 확대 및 혈소판 수용체 및 응고 인자 사이의 직접적인 상호작용에 의해 트롬빈 생성을 촉진한다.
혈관 시스템의 외인성(혈관 벽) 또는 내인성(혈액-기원) 성분에 의해 개시되는 응고를 위한 2개의 집중된 경로가 존재한다. "외인성" 경로는, 관강내 표면상에는 부재하지만 혈관의 내피하 층내에서 강력하게 발현되며 조직 손상을 통해 접근가능하거나 유리되는 필수 응고 인자인, 통합 막 단백질 조직 인자(TF)와 혈장 인자 VII(FVII)의 복합체에 의해 개시된다. 순환하는 미세혈관내에서 발현된 TF는 또한 활성화된 혈소판의 표면상에서 트롬빈 생성을 유지함으로써 혈전 증식에 기여할 수 있다.
"내인성" 또는 접촉 활성화 경로는, 인자 XII[FXII, 하게만 인자(Hageman factor)]가 고분자량 키니노겐과 혈장 칼리크레인을 포함하는 반응에서 음성으로 하전된 표면과 접촉하는 경우 개시된다. FXII는 글리코스아미노글리칸 및 콜라겐과 같은 내피하 매트릭스, 설파타이트, 뉴클레오타이드 및 유리 또는 중합체와 같은 비-생리학적 물질 또는 다른 가용성 다가양이온의 거대분자 성분에 의해 활성화될 수 있다. 가장 강력한 접촉 활성인자들 중 하나는 카올린이며 이의 반응은 주요 임상적 응고 시험에 대한 기전적 기초로서, "내인성" 경로를 통해 응고력을 측정하는 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)를 제공한다. 혈소판에 의해 전파된 반응에서, 활성화된 FXII는 이후에 FXI를 FXIa로 활성화시킨 후 FXIa는 인자 IX를 활성화시킨다. 미량의 FXa 및/또는 트롬빈에 의해 이미 활성화된 FVIIIa와 FIXa의 복합체(테나제 복합체)는 후속적으로 FX를 활성화시킨다(참조: 도 1, "좌측"). 시험관내에서 혈액 응고를 유도하는 이의 높은 효능에도 불구하고, FXII-개시된 내인성 응고 경로의 (병리)생리학적 중요성은, FXII와 고 분자량 키니노겐 및 혈장 칼리크레인의 유전적 결핍성이 출혈 합병증과 관련되어 있지 않다는 사실로 인해 의문시되고 있다. TF 및 FVII와 같은 내인성 경로 성분을 결여하고 있는 사람 및 마우스가 심각한 출혈을 겪고 있다는 관측과 함께 이는 생체내 출혈의 중지의 경우 전적으로 외인성 캐스케이드가 요구된다는 현재의 가설을 이끈다[참조: Mackman, N. 2004. Role of tissue factor in hemostasis, thrombosis, and vascular development. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 1015-1022).
병리학적 상태에서, 응고 캐스케이드는 부적절하게 활성화될 수 있으며 이후에 이는 혈관내에 지혈 플러그(haemostatic plug)의 형성을 초래한다. 이에 의해, 혈관은 폐색되고 먼 기관으로의 혈액 공급이 제한된다. 이러한 과정은 혈전색전증으로 알려져 있으며 높은 치사율과 관련되어 있다. 또한, 혈액과 접촉하는 인공 기구의 사용은 내인성 응고 캐스케이드의 활성화로 인하여 심각하게 제한된다. 인공 표면의 적합한 응고는 일부 경우에 상기 문제를 피할 수 있으나 다른 경우에서는 이의 기능을 약화시킬 수 있다. 이러한 인공 기구의 예는 혈액투석기(haemodialyser), 심폐 우회로(cardiopulmonary by-pass circuit), 심장 판막, 혈관 스텐트 및 유치 카테터(in-dwelling catheter)이다. 이러한 기구가 사용되는 경우에, 헤파린과 같은 항응고제가 투여되어 표면상에 피브린 형성을 예방한다. 그러나, 일부 환자들은 헤파린을 용납하지 않으며, 이는 헤파린-유도된 저혈소판증(HIT)을 유발하여 혈소판 응고 및 생명을 위협하는 혈전증을 초래할 수 있다. 또한, 임상에서 사용된 모든 항응고제의 고유의 단점은 심각한 출혈 현상의 증가된 위험이다. 따라서, 이러한 합병증과 관련되어 있지 않고 고통받는 환자 또는 출혈 위험의 증가없이 혈전증을 예방하는 우수한 치료요법 개념으로 사용될 수 있는 새로운 유형의 항응고제의 존재가 강력히 요구되고 있다(참조: Renne T et al. 2005. Defective thrombus formation in mice lacking factor XII. J. Exp. Med. 202:271-281).
제WO2006/066878호에는 FXII/FXIIa에 대한 항체의 용도 또는 FXII/FXIIa의 억제제의 용도가 제안되어 있다. 강력한 억제제로서, 항트롬빈 III (AT III), 안지오텐신 전환 효소 억제제, C1 억제제, 아프로티닌, 알파-1 프로테아제 억제제, 안티파인 ([(S)-1-카복시-2-페닐에틸]-카바모일-L-Arg-L-Val-아르기날), Z-Pro-Pro-알데하이드-디메틸 아세테이트, DX88(제조원: Dyax Inc., 300 Technology Square, Cambridge, MA 02139, USA)(참조: Williams A and Baird LG.2003. DX-88 and HAE: a developmental perspective. Transfus Apheresis Sci. 29:255-258), 류펩틴, Fmoc-Ala-Pyr-CN과 같은 프롤릴 올리고펩티다제의 억제제, 옥수수-트립신 억제제, 소 췌장 트립신 억제제의 돌연변이체, 에코틴, 각시가자미(yellowfin sole) 항응고 단백질, 단호박(Cucurbita maxima) 이소억제제를 포함하는 단호박 트립신 억제제-V 및 하마다린(문헌: Isawa H et al. 2002. A mosquito salivary protein inhibits activation of the plasma contact system by binding to factor XII and high molecular weight kininogen. J. Biol. Chem. 277:27651-27658에 기술된 바와 같음)이 제안되어 있다.
FXII/FXIIa에 대해 높은 억제 활성을 나타내면서 치료제로서의 FXII/FXIIa의 이상적인 억제제는 출혈의 위험을 증가시키지 않고, 비-면역원성이며 이상적으로 단지 1회로 드물게 투여되어야 할 것이다. Z-Pro-Pro-알데하이드-디메틸 아세테이트와 같은 소 분자 억제제는 요구되는 다수 주사제의 투여 후 단지 매우 짧은 반감기를 가지거나 경구적으로 이용가능한 서방형으로 개발된 후 또한 장기간 동안 일정하게 제공되어야 한다. C1 억제제와 같은 사람 혈장 단백질은 우선 모든 요건들을 충족해야 하며 FXII/FXIIa에 대해 비교적 높은 억제 활성을 가지는 반면 출혈 위험이 증가되지 않아야 하며 사람 단백질로서 비-면역원성이고 또한 상당히 긴 혈장 반감기를 가질 수 있다.
본 발명에 이르러 사람 FXII/FXIIa 억제제의 주요 후보물로서 혈전생성 C1 억제제의 생체내 모델은 폐색을 방지하는데 성공적으로 사용될 수 없음이 밝혀졌다. 사람 혈장, 즉 AT III 억제제로부터의 다른 제안된 FXII/FXIIa 억제제는, 제2 요건을 적어도 충족시키지 못하는데, 그 이유는 이것을 FXII/FXIIa의 억제제로 사용하면 출혈 위험이 증가될 수 있기 때문이다(참조: Warren BL et al. 2001. Caring for the critically ill patient. High-dose antithrombin III in severe sepsis: a randomized controlled trial. JAMA 286:1869-1878).
그러므로, 혈전증 및 유사 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 개선된 의약에 대한 요구가 여전히 존재함은 명백하다. 따라서, 본 발명의 목적은 이러한 요구를 만족시키는 것이다.
50년 이상 동안 응고 인자 XII의 결핍은 증가되는 일시적이거나 손상 관련된 출혈 합병증과 관련되어 있지 않음이 알려져 있다(참조: Ratnoff OD & Colopy JE 1955. A familial hemorrhagic trait associated with a deficiency of a clot-promoting fraction of plasma. J Clin Invest 34:602-613). 실제로, aPTT에서 측정한 병리학적 값에 의해 용이하게 검출된다고 해도(응고의 내인성 경로에 초점을 맞춘 임상적 응고 시험), FXII를 결여하고 있는 사람은 주요 외과 수술 동안에도 비정상적으로 출혈을 일으키지 않는다[참조: Colman RW. Hemostasis and Thrombosis. Basic principles & clinical practice (eds. Colman RW, Hirsch J, Mader VJ, Clowes AW, & George J) 103-122 (Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2001)]. 대조적으로, FXII의 결핍은 정맥 혈전증의 증가된 위험과 관련되어 있다(참조: Kuhli C et al. 2004. Factor XII deficiency: a thrombophilic risk factor for retinal vein occlusion. Am. J. Ophthalmol. 137:459-464; Halbmayer WM et al. 1993. Factor XII (Hageman factor) deficiency: a risk factor for development of thromboembolism. Incidence of FXII deficiency in patients after recurrent venous or arterial thromboembolism and myocardial infarction. Wien. Med. Wochenschr. 143:43-50). 이러한 사상을 지지하는 연구 및 경우 보고서는 폐 색전증으로 사망한 존 하게만(John Hageman)의 FXII 결핍증의 지침증례를 참조한다. FXII 결핍증이 증가된 혈전촉진성 위험과 관련되어 있다는 가설은, FXII 결핍이 혈전증과 연관되어 있다는 원래의 보고를 보고하는 몇몇 경우에 대한 최근의 재평가에 의해 도전받고 있다(참조: Girolami A et al. 2004. The occasional venous thromboses seen in patients with severe (homozygous) FXII deficiency are probably due to associated risk factors: A study of prevalence in 21 patients and review of the literature. J. Thromb. Thrombolysis 17:139-143). 대부분의 경우에, 저자는 동시의 선천적 또는 후천적 혈전촉진성 위험 인자와 함께 FXII와는 독립적인 혈전증 현상에 관여할 수 있는 인자 FXII 결핍성을 확인하였다. 충분히 특성화된 환자(참조: Koster T et al. 1994. John Hageman's factor and deep-vein thrombosis: Leiden thrombophilia Study. Br. J. Haematol. 87:422-424) 및 FXII-결핍 가계(참조: Zeerleder S et al. 1999. Reevaluation of the incidence of thromboembolic complications in congenital factor XII deficiency - a study on 73 subjects from 14 Swiss families. Thromb. Haemost. 82:1240-1246)을 이용한 최대 역학적 연구는, FXII 결핍이 어떠한 혈전촉진성 또는 항-혈전성 위험과도 관련성이 존재하지 않음을 나타낸다.
놀랍게도 및 당해 분야의 숙련가의 일반적인 생각과는 대조적으로, 인자 XII-기원한 내인성 응고 경로가 생체내에서 동맥 혈전 형성에 관련되어 있으나 정상 조직-특이적인 지혈에 필수적이 아님을 발견하였다(참조: Kleinschnitz C et al. 2006. Targeting coagulation factor XII provides protection from pathological thrombosis in cerebral ischemia without interfering with hemostasis. J. Exp. Med. 203:513-518; WO 2006/066878). 예측치않게도, 이러한 결과들은, 인자 XII를 병리학적 혈전 형성의 과정에서 중심 위치에 둔다(도 1). 따라서, FXII 활성화 또는 FXIIa 활성화를 방해하고 차단할 수 있는 물질은 병리학적 동맥 혈전 형성 및 이의 임상 결과를 차단하는데 적합할 수 있다.
최근에 FXII/FXIIa의 신규 억제제가 곤충에서 발견되었다: 흡혈 곤충인, 트리아토마 기생충(Triatoma infestans) 중간창자로부터의 인페스틴 도메인 3-4(인페스틴 3-4) 및 인페스틴 도메인 4(인페스틴-4)(참조: Campos ITN et al. 2002. Infestin, a thrombin inhibitor present in Triatoma infestans midgut, a Chagas' disease vector: gene cloning, expression and characterization of the inhibitor. Insect Biochem. Mol. Biol. 32:991-997; Campos ITN et al. 2004. Identification and characterization of a novel factor XIIa inhibitor in the hematophagous insect, Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae). FEBS Lett. 577:512-516). 이들 단백질은 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간을 대략 3배 연장시키는 카잘-형 세린 프로테아제 억제제의 강력한 FXIIa 억제제로서 공지되어 있다.
이들 억제제는 병리학적 혈전 형성을 차단하는 치료학적 적용 측면에서 평가되지 않았다. 또한, 이는 사람에서 이러한 이종 억제제의 면역원성을 감소시키고 이들의 생체내 반감기를 연장시키기 위해 시도되지 않았다.
놀랍게도 카잘-형 세린 프로테아제 억제제 도메인 인페스틴-4는 병리학적 혈전 형성에 대해 마우스를 보호하는 반면 이들 동물에서 증가된 출혈 위험은 관측되지 않았음이 밝혀졌다. 혈장 반감기를 증가시키기 위해, 인페스틴-4를 포유동물 세포에서 사람 알부민에 대한 융합체로서 발현시키고 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 정제된 억제제를 마우스내로 주사하고 혈전 챌린지(thrombotic challenge)를 FeCl3의 보조로 유도하였다. rHA-인페스틴-4로 처리한 마우스의 100%가 보호된 반면, 처리되지 않은 대조군 마우스의 거의 대부분에서 혈관 폐색이 발생하였다. 관련된 출혈 위험의 결여는 꼬리 클립핑 시험(tail clipping experiment)으로 입증된다. 인페스틴-4 처리된 마우스 및 처리되지 않은 대조군 마우스는 비교가능한 지혈시간 및 혈액 손실을 보여준다. 즉, 무시할 정도의 출혈 위험과 함께 혈전증에 대한 생체내 보호는 재조합체 인페스틴-4에 대해 마우스내에서 입증된다. 이와 관련하여, 인페스틴 3-4는 인페스틴-4의 측면에서 포함되나 바람직한 화합물은 인페스틴-4 또는 인페스틴 3-4 둘다와 주로 인페스틴-4의 혼합물이다.
rHA-인페스틴-4를 또한 내인성 경로를 효과적으로 억제하는 물질과 일치하여 또한 연장된, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)를 측정함으로써 내인성 경로를 특이적으로 억제하는 이의 효능에 대해 시험관내에서 시험하였다. 대조적으로, 응고의 외인성 경로의 인자 VIIa/조직 인자-개시된 활성화에 대한 시험인, 프로트롬빈 시간(PT)은 거의 영향받지 않았다. FXII 활성의 감소는 또한 FXII 결핍성 사람 혈장을 기준으로 직접 입증하였다. 따라서, 본 발명의 목적은 의약으로서, 보다 특이적으로는 aPTT를 연장(PT는 필수적으로 영향받지 않는다)시킴으로써 동시 출혈 위험없이 3차원적인 동맥 또는 정맥 혈전의 형성 및/또는 안정화를 예방하는, 혈전증 질병용 의약의 제조를 위한, 카잘-형 세린 프로테아제 억제제 인페스틴 또는 이의 단편, 바람직하게는 도메인 3-4, 가장 바람직하게는 도메인 4, 또는 이의 단편의 용도이다. 각각의 억제제는 이에 의해 내인성 응고 경로, 특히 FXIIa의 활성을 억제하고 3차원적 동맥 또는 정맥 혈전의 형성 및/또는 안정화를 억제하기 위해 작용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 동맥 혈전 형성과 관련된 상태 또는 질환, 예를 들면, 뇌졸중 또는 심근 경색의 치료 또는 예방용의 각각의 약제 물질을 제공한다. FXIIa의 다수의 효과기 작용으로 인해, 각각의 약제 물질은 또한 보체 활성화, 섬유소용해, 염증, 혈관형성 및/또는 저장성 쇼크, 유전성 혈관부종을 포함하는 부종, 세균 감염, 관절염, 췌장염 또는 관절성 통풍, 파종성 혈관내 응고 증후군(DIC) 및 패혈증과 같은 병리학적 키닌 형성과 관련된 질병에서 추가의 치료 효과를 갖는다.
변형된 카잘 -형 세린 프로테아제 억제제
사람에서 인페스틴-4와 같은 이종 억제제의 치료학적 투여는 면역 반응을 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 목적은 면역원성이 없지만 여전히 강력한 카잘-형 세린 프로테아제 억제제를 확인하는 것이다. 놀랍게도 추정되는 효소 접촉 부위(들)을 인페스틴-4의 상응하는 영역으로 대체시키는 방식으로 사람 카잘-형 세린 프로테아제 억제제(세린 프로테아제 억제제 카잘-1형, SPINK-1)과 관련된 것을 변형시킴에 의해, 특히 혈전증 현상을 치료하거나 예방하기 위한 물질의 제조에 사용될 수 있는 고도로 활성인 FXIIa 억제제가 생성되었다. 이러한 결과를 바탕으로 하여, 임의의 천연 카잘-형 세린 프로테아제 억제제를 FXIIa 특이적이 되도록 하는 방식으로 변형시키는 것이 가능하다. 예는 다음 단락에 기술되어 있다.
사람에서 치료학적 용도를 위해 강력한 FXIIa 억제제를 생성하기 위하여, 본 발명자들은 곤충 기원 단백질보다 사람 환자에서 면역원성이 아닌, 인페스틴-4에 대해 유사성이 높은 사람 단백질을 조사하였다. 인페스틴-4와 유사성이 높은 사람 단백질은 SPINK-1, 췌장에서 발현된 카잘-형 세린 프로테아제 억제제(또한 췌장 분비 트립신 억제제, PSTI로도 공지됨)인 것으로 밝혀졌다. 인페스틴-4와 SPINK-1 사이의 유사성은 도 2에 요약되어 있다.
야생형 SPINK-1 서열을 기준으로 하여, 상이한 돌연변이체가 인페스틴-4에 대해 SPINK-1 서열의 유사성이 높게 생성되었다. 인페스틴에 대해 구조적인 데이터가 없으므로, 트롬빈과의 복합체(PDB: 1TBQ)에서 로드니우스 프롤릭수스(Rhodnius prolixus)로부터의 관련된 억제제에 대한 데이터를 분석하였다. 알.프롤릭수스(R. prolixus) 억제제는 2개의 카잘 도메인을 가지며, 이의 N-말단은 트롬빈의 촉매 잔기와 상호작용한다. 따라서, N-말단 도메인은 인페스틴-4와의 비교를 위한 기준으로서 사용되었다. 도 3은 알.플록릭수스 억제제와 트롬빈의 접촉 부위 및 SPINK-1과 키모트립신의 접촉 부위를 나타낸다. 카잘-형 세린 프로테아제 억제제의 일반적인 특징은 N-말단 영역내 접촉 부위의 축적이다. 당해 영역이 억제 특이성을 전달한다고 추정하여, SPINK-1의 몇가지 돌연변이체를 생성하였다. K1으로 명명된 제1 돌연변이체의 경우, SPINK-1의 아미노-말단 부위내 예측된 프로테아제 접촉 부위는 인페스틴-4의 것으로 대체되었다. 또한 돌연변이체 K2 및 K3내 아미노산 교환은 SPINK-1을 인페스틴-4 서열에 대해 보다 근접하게 변화시켰다. 도 4는 이들 돌연변이체의 아미노산 서열 및 SPINK-1 야생형 서열에 대한 변화도를 나타낸다. 성숙한 SPINK-1 야생형 단백질, 3개의 돌연변이체 및 인페스틴-4의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 5로 나타낸다. 용어 "각각의 증가된 유사성이 증가된 SPINK-1 돌연변이체"는 인페스틴-4와 20개 이상 동일한 아미노산, 또는 동일한 아미노산외에 보존적 치환을 의미하는 동일성 대신 보존적 치환을 갖는 돌연변이체를 의미한다. 이들 돌연변이체는 제EP-A2-0352089호, 제WO88/03171A호 및 제EP-A2-0278112호에 기술된 사람 췌장 분비 트립신 억제제의 돌연변이체와는 상이하다.
SPINK-1 돌연변이체가 발현되고 정제되었다. 돌연변이체는 내인성 경로를 억제할 수 있는 물질의 경우에 예측되는 바와 같이 연장된, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)을 측정함으로써 내인성 경로를 특이적으로 억제하는 이들의 잠재능에 대해 시험관내에서 시험하였다. 대조적으로, 응고의 외인성 경로의 인자 VIIa/조직 인자-개시된 활성화에 대한 시험인, 프로트롬빈 시간(PT)은 필수적으로 영향받지 않았다.
따라서, 본 발명의 다른 양태는 약제로서, 보다 상세하게는 혈전병에 대한 약제 제조를 위한 포유동물 카잘-형 세린 프로테아제 억제제 SPINK-1, 인페스틴 동족체 또는 이의 단편, 또는 바람직하게는 인페스틴 도메인 4 또는 이의 단편 및 동족체의 변형된 형태의 용도이다. 이러한 증상의 작용 모드는 연장된(PT는 필수적으로 영향받지 않음) aPTT에 의해 측정될 수 있는 FXII/FXIIa 활성의 억제이다. 이러한 방식으로, 3차원적 동맥 또는 정맥 혈전의 형성 및/또는 안정화가 예방된다. 각각의 억제제는 3차원적인 동맥 또는 정맥 혈전의 형성 및/또는 안정화를 억제하는 한, 여기서 내인성 응고 경로, 특히 FXIIa의 활성의 억제제로서 작용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 동맥 혈전 형성과 관련된 상태 또는 질환, 예를 들면, 뇌졸중 또는 심근경색, 보체 활성화, 섬유소용해, 염증, 혈관형성 및/또는 저장성 쇼크, 유전성 혈관부종을 포함하는 부종, 세균 감염, 암[트로우쎄우 증후군(Trousseau syndrome)], 관절염, 췌장염 또는 관절 통풍, 파종성 혈관내 응고 증후군(DIC) 또는 패혈증과 같은 병리학적 키닌 형성과 관련된 질병의 치료 또는 예방을 위해 사람에서 면역원성의 위험이 감소된 물질을 제공한다.
본 발명의 다른 특히 바람직한 단백질은 위에서 기술한 바와 같은 사람 췌장 프로테아제 억제제 SPINK-1 유도된 돌연변이체이며, 여기서, 이러한 돌연변이체는, 이들이 FXIIa 활성을 억제하는 능력과 관련하여 인페스틴-4 단백질과의 이들의 유사성을 증가하도록 변화되어 있음을 특징으로 한다. 이러한 돌연변이체는, 이들이 시험관내에서 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간을 연장시킴을 특징으로 한다.
반감기가 연장된 변형된 포유동물 카잘 -형 세린 프로테아제 억제제인 인페스틴 -4 및 변형된 카잘형 세린 프로테아제 억제제
본 발명의 다른 측면은 반감기가 연장된 인페스틴-4 및 인페스틴 동족체 또는 이의 단편을 기준으로 한 변형된 포유동물 카잘-형 세린 프로테아제 억제제이다. 본 발명의 카잘-형 세린 프로테아제는 다소 소 단백질이므로, 다른 소 단백질에 대해 발표된 바와 같은, 신속한 신장 제거율을 예측할 수 있다(참조: Werle M. and Bernkop-Schnurch A. 2006. Strategies to improve plasma half-life time of peptide and protein drugs. Amino Acids 30:351-367). 폴리펩타이드성 화합물의 짧은 혈장 반감기를 해결하는 하나의 방법은 물론 이를 반복적으로 또는 연속 주입을 통해 주사하는 것이다. 바람직하게는 폴리펩타이드 자체의 내인성 혈장 반감기는 증가된다. 따라서, 본 발명의 다른 측면은 반감기 연장 단백질(HLEP)에 융합된 카잘-형 세린 프로테아제 억제제를 제공하는 것이다.
본원에 사용된 "반감기 증진 폴리펩타이드"(HLEP)는 알부민, 알부민-계열의 구성원, 면역글로불린 G의 불변 영역 및 이의 단편 및 생리학적 조건하에서 알부민, 알부민 계열의 구성원 및 면역글로불린 불변 영역의 부위에 결합할 수 있는 폴리펩타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
반감기 증진 폴리펩타이드(HLEP)의 특정 예로서 알부민 및 면역글로불린 및 이들의 단편 또는 유도체가 기술되어 있다.
발란스(Ballance) 등은 제WO 01/79271호에서 사람 혈청 알부민에 융합되는 경우 생체내 증가된 작용성 반감기 및 연장된 저장-수명을 갖는 것으로 예측되는 다수의 상이한 치료학적 폴리펩타이드의 융합 폴리펩타이드를 기술하였다. 치료학적 단백질은 직접 또는 펩타이드성 링커를 통해 알부민 잔기에 융합될 수 있으며, C- 및 N-말단 융합체가 기술되어 있다.
용어 사람 혈청 알부민(HSA) 및 사람 알부민(HA)은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 용어 "알부민" 및 "혈청 알부민"은 보다 광범위하며 사람 혈청 알부민(및 이의 단편 및 변이체) 및 다른 종으로부터의 알부민(및 이의 단편 및 변이체)를 포함한다.
본원에 사용된 "알부민"은 총칭하여 알부민의 하나 이상의 작용적 활성(예를 들면, 생물학적 활성)을 갖는, 알부민 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열, 또는 알부민 단편 또는 변이체를 말한다. 특히, "알부민"은 사람 알부민 또는 이의 단편, 특히 본원의 서열번호 6에 나타낸 것으로서 사람 알부민의 성숙한 형태 또는 다른 척추동물로부터의 알부민 또는 이의 단편, 또는 이들 분자들의 유사체 또는 변이체 또는 이의 단편을 말한다.
알부민 융합 단백질의 알부민 부위는 위에서 기술한 바와 같은 완전한 길이의 HA 서열을 포함할 수 있거나, 치료학적 활성을 안정화하거나 연장시킬 수 있는 하나 이상의 이의 단편을 포함할 수 있다. 이러한 단편은, 길이가 10개 이상의 아미노산일 수 있거나 HA 서열로부터의 약 15, 20, 25, 30, 50개 이상의 연속된 아미노산을 포함할 수 있거나 HA의 특정 도메인의 일부 또는 모두를 포함할 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 부위는 정상 HA의 변이체일 수 있다. 본 발명의 융합 단백질의 치료학적 폴리펩타이드 부위는 또한 본원에 기술된 바와 같은 상응하는 치료학적 폴리펩타이드의 변이체일 수 있다. 용어 "변이체"는 보존적 또는 비-보전적인 삽입, 결실 및 치환을 포함하며, 여기서, 이러한 변화는 치료학적 폴리펩타이드의 치료학적 활성을 부여하는 활성 부위 또는 활성 도메인을 실질적으로 변경시키지 않는다.
특히, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 사람 알부민의 천연적으로 존재하는 다형체성 변이체 및 사람 알부민의 단편을 포함할 수 있다. 알부민은 임의의 척추동물, 특히, 임의의 포유동물, 예를 들면, 사람, 원숭이, 소, 양 또는 돼지로부터 기원할 수 있다. 비-포유동물 알부민은 암탉 및 연어로부터 기원한 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 알부민-연결된 폴리펩타이드의 알부민 부위는 치료학적 폴리펩타이드 부위외에 상이한 동물로부터 존재할 수 있다.
일반적으로, 알부민 단편 또는 변이체는 적어도 20, 바람직하게는 적어도 40, 가장 바람직하게는 70개 이상의 아미노산 길이일 것이다. 알부민 변이체는 바람직하게는 알부민의 적어도 하나의 전체 도메인 또는 이러한 도메인의 단편, 예를 들면, 도메인 1(서열번호 6의 아미노산 1-194), 2(서열번호 6의 아미노산 195-387), 3 (서열번호 6의 아미노산 388-585), 1 + 2 (서열번호 6의 아미노산 1-387), 2 + 3 (서열번호 6의 아미노산 195-585) 또는 1 + 3 (서열번호 6의 아미노산 1-194 + 서열번호 6의 아미노산 388-585)으로 이루어지거나 달리는 포함할 수 있다. 각각의 도메인 자체는 잔기 Lys106 내지 Glu119, Glu292 내지 Val315 및 Glu492 내지 Ala511를 포함하는 가요성 서브도메인간(inter-subdomain) 링커 영역을 갖는, 2개의 동종 서브도메인 즉, 1-105, 120-194, 195-291 , 316-387, 388-491 및 512-585로 이루어져 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 부위는 HA의 적어도 하나의 서브도메인 또는 도메인 또는 이의 보존적 변형을 포함할 수 있다. 알부민외에, 알부민 계열의 다른 구성원인 알파-페토단백질은 생체내에서 부착된 치료학적 폴리펩타이드의 반감기를 연장시키는 것으로 청구되어 있다(제WO 2005/024044). 혈청 전달 단백질과 진화론적으로 관련된 단백질의 알부민 계열은 알부민, 알파-페토단백질(AFP; 참조: Beattie & Dugaiczyk 1982. Structure and evolution of human alpha-fetoprotein deduced from partial sequence of cloned cDNA. Gene 20:415-422), 아파민(AFM; 참조: Lichenstein et al. 1994. Afamin is a new member of the albumin, alpha-fetoprotein, and vitamin D-binding protein gene family. J. Biol. Chem. 269:18149-18154) 및 비타민 D 결합 단백질(DBP; 참조: Cooke & David 1985. Serum vitamin D-binding protein is a third member of the albumin and alpha fetoprotein gene family. J. Clin. Invest. 76:2420-2424)로 이루어진다. 이들의 유전자는 사람, 마우스 및 래트에서 동일한 염색체 영역으로 맵핑되는 구조 및 작용적 유사성을 갖는 다수유전자 클러스터를 나타낸다. 알부민 계열 구성원의 구조적 유사성은 HLEP로서의 이들의 유용성을 제안한다. 따라서, 본 발명의 다른 목적은 이러한 알부민 계열 구성원, 이의 단편 및 변이체를 HLEP로서 사용하는 것이다. 용어 "변이체"는 보존적 또는 비-보존적인 삽입, 결실 및 치환을 포함하며, 여기서, 이러한 변화는 치료학적 폴리펩타이드의 치료학적 활성을 부여하는 활성 부위 또는 활성 도메인을 실질적으로 변경시키지 않는다.
알부민 계열 구성원은 완전한 길이의 각각의 단백질 AFP, AFM 및 DBP를 포함할 수 있거나, 치료학적 활성을 안정화시키거나 연장시킬 수 있는 하나 이상의 이의 단편을 포함할 수 있다. 이러한 단편은, 길이가 10개 이상인 아미노산일 수 있거나 각각의 단백질 서열의 약 15, 20, 25, 30, 50 이상의 연속된 아미노산을 포함할 수 있거나 각각의 단백질의 특정 도메인 중 일부 또는 모두를 포함할 수 있다.
본 발명의 알부민 계열 구성원 융합 단백질은 AFP, AFM 및 DBP의 천연적으로 존재하는 다형체성 변이체를 포함할 수 있다. 당해 단백질은 임의의 척추동물, 특히, 임의의 포유동물, 예를 들면, 사람, 원숭이, 소, 양 또는 돼지로부터 기원할 수 있다. 비-포유동물 알부민 계열 구성원은 암탉 및 연어로부터 기원된 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
항원-결합 도메인이 없는 IgG 및 IgG-단편을 또한 HLEP로서 사용할 수 있다. 치료학적 폴리펩타이드 부위는 바람직하게는 절단될 수도 있는 펩타이드성 링커 또는 항체의 힌지 영역을 통해 IgG 또는 IgG 단편에 연결된다. 몇개의 특허 및 특허원은 치료학적 단백질의 생체내 반감기를 연장시키기 위해 면역글로불린 불변 영역에 대한 치료학적 단백질의 융합을 기술하고 있다. 제US 2004/0087778호 및 제WO 2005/001025호는 펩타이드의 반감기를 증가시키며 또한 생체내에서 신속하게 분해되는 생물학적으로 활성인 펩타이드와 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부 또는 Fc 도메인의 융합 단백질을 기술하고 있다. Fc-IFN-β 융합 단백질은, 생물학적 활성이 증가되었고, 순환하는 반감기기 연장되고 가용성이 보다 커졌음을 기술하였다(참조: 제WO 2006/000448호). 연장된 혈청 반감기 및 증가된 생체내 효능을 갖는 Fc-EPO 단백질(참조: 제WO 2005/063808호) 및 G-CSF와의 Fc 융합체(참조: 제WO 2003/076567호), 글루카곤-유사 펩타이드-1(참조: 제WO 2005/000892호), 응고 인자(제WO 2004/101740호) 및 인터루킨-10(참조: 제US 6,403,077호)이 기술되어 있으며, 이들 모두는 반감기-연장 특성을 갖는다.
따라서, 본 발명의 다른 양태는 이러한 면역글로불린 서열, 바람직하게는 Fc 단편 및 이의 변이체의 HLEP로서의 용도에 관한 것이다. 인페스틴-4와 같은 카잘-형 세린 프로테아제 억제제 및 SPINK-1 돌연변이체와 같이 FXIIa에 대해 향상된 억제 특이성을 지닌 변형된 카잘형 세린 프로테아제 억제제는 Fc 도메인 또는 HLEP와 같은 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부에 융합되어 이.콜라이(E. coli), 효모, 곤충, 식물 또는 척추동물 세포 또는 유전자도입 동물내에서 발현될 수 있다. SPINK-K2-Fc 융합 단백질은 서열번호 25에 예시적으로 나타나 있다.
본 발명은 상세하게는 인페스틴-4와 같은 카잘-형 세린 프로테아제 억제제 및 SPINK-1 돌연변이체 또는 이의 단편 또는 변이체와 같은 변형된 카잘-형 세린 프로테아제 억제제를 HLEP 또는 이의 단편 또는 변이체의 N- 또는 C-말단에 연결함으로써 형성된 융합 단백질이 HLEP에 연결되지 않은 상응하는 카잘-형 세린 프로테아제 억제제와 비교하여 증가된 생체내 반감기를 갖도록 함을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 개재된(intervening) 펩타이드성 링커는 치료학적 폴리펩타이드 및 HLEP 사이에 도입될 수 있다. HLEP가 예를 들면, 입체적 장애에 의해 치료학적 폴리펩타이드의 특이적인 활성을 방해하는 경우, 절단가능한 링커가 도입될 수 있다. 링커 절단에 바람직한 효소는 내인성 응고 경로의 응고 프로테아제, FXIIa, FXIa, FIXa, FVIIIa 또는 FXa이며, 여기서, 가장 바람직한 절단 효소는 FXIIa이다.
카잘-형 세린 프로테아제 억제제 계열은 세린 프로테아제 억제제의 다수의 계열 중 하나이다. 상이한 종으로부터의 많은 단백질이 기술되어 있다(참조: Laskowski M and Kato I. 1980. Protein inhibitors of proteinases. Ann. Rev. Biochem. 49: 593-626).
상기 정의내 "인페스틴-4 및 변형된 카잘-형 세린 프로테아제 억제제"는 천연 아미노산 서열 또는 서열번호 2 내지 5 또는 21 내지 24를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 그러나, 이러한 정의는, 또한 이러한 폴리펩타이드가 각각의 카잘-형 세린 프로테아제 억제제의 활성을 실질적으로 보유하는 한, 약간 변형된 아미노산 서열, 예를 들면 말단 아미노산 결실 또는 부가를 포함하는 변형된 N-말단 또는 C-말단 끝을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 정의내 "카잘-형 세린 프로테아제 억제제"는 각각 개별적으로 존재할 수 있고 발생할 수 있는 천연의 대립유전자 변이를 포함한다. 상기 정의내 "카잘-형 세린 프로테아제 억제제"는 또한 카잘-형 세린 프로테아제 억제제의 변이체를 포함한다. 이러한 변이체는 야생형 서열과는 하나 이상의 아미노산 잔기에 있어 상이하다. 이러한 차이의 예는 하나 이상의 아미노산 잔기(예를 들면, 1 내지 10개의 아미노산 잔기)에 의한 N- 및/또는 C-말단의 절두(truncation), 또는 N- 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 추가적 잔기의 부가, 및 보존적 아미노산 치환, 예를 들면, 유사한 특성을 갖는 아미노산, 예를 들면, (1) 소 아미노산, (2) 산성 아미노산, (3) 극성 아미노산, (4) 염기성 아미노산, (5) 소수성 아미노산, 및 (6) 방향족 아미노산의 그룹내에서 수행된 치환을 포함할 수 있다. 이러한 보존적 치환의 예는 표 1에 나타낸다.
(1) 알라닌 글리신
(2) 아스파르트산 글루탐산
(3a) 아스파라긴 글루타민
(3b) 세린 트레오닌
(4) 아르기닌 히스티딘 라이신
(5) 이소루이신 루이신 메티오닌 발린
(6) 페닐알라닌 타이로신 트립토판
본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 카잘-형 세린 프로테아제 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 용어 "폴리뉴클레오타이드(들)"은 일반적으로 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 말한다. 폴리뉴클레오타이드는 일본쇄- 또는 이본쇄 DNA, 일본쇄 또는 이본쇄 RNA일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오타이드(들)"은 또한 이노신과 같은 일반적이지 않은 염기 및/또는 하나 이상의 변형된 염기들을 포함하는 DNA 또는 RNA를 포함한다. 각종의 변형이 당해 분야의 숙련가에게 공지된 많은 유용한 목적을 제공하는 DNA 및 RNA에 대해 이루어질 수 있음은 인지될 것이다. 본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오타이드(들)"은 이러한 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태의 폴리뉴클레오타이드, 및 예를 들면, 단성 및 복합 세포를 포함하는 바이러스 및 세포의 특징적인 DNA 및 RNA의 화학 형태를 포함한다.
숙련가들은, 유전 암호의 축퇴성으로 인하여, 제공된 폴리펩타이드가 상이한 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화될 수 있음을 이해할 것이다. 이들 "변이체"는 본 발명에 의해 포함된다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 분리된 폴리뉴클레오타이드이다. 용어 "분리된" 폴리뉴클레오타이드는 다른 염색체성 및 염색체외 DNA 및 RNA와 같은 및 이에 한정되지 않는 다른 핵산 서열로부터 실질적으로 유리된 폴리뉴클레오타이드를 말한다. 분리된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 숙련가에게 공지된 통상의 핵산 정제 방법을 사용하여 분리된 폴리뉴클레오타이드를 수득할 수 있다. 당해 용어는 또한 재조합체 폴리뉴클레오타이드 및 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드 또는 벡터이다. 바람직하게는, 플라스미드 또는 벡터는 발현 벡터이다. 특정 양태에서, 벡터는 사람 유전자 치료요법에 사용하기 위한 전달 벡터이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.
본 발명의 숙주 세포는 본 발명의 일부인 카잘-형 세린 프로테아제 억제제를 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 당해 방법은
- 본 발명의 숙주 세포를 카잘-형 세린 프로테아제 억제제가 발현되는 조건하에 배양하는 단계; 및
- 카잘-형 세린 프로테아제 억제제를 배양 배지로부터 임의로 회수하는 단계를 포함한다.
제안된 폴리펩타이드의 발현:
본 발명의 카잘-형 세린 프로테아제 및 변형된 카잘-형 세린 프로테아제 억제제는 세균, 효모, 식물, 동물(곤충 포함) 또는 사람 세포주 또는 유전자도입 동물과 같은 원핵 또는 진핵 숙주 세포내에서 재조합체 분자로서 생산될 수 있다.
동물 또는 사람 세포주내에서의 발현
적합한 숙주 세포내에서 재조합체 단백질의 고 수준 생산은 상기-언급한 변형된 cDNA를 효율적인 전사 단위내에 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 따라 각종 발현 시스템내에서 증식될 수 있는 재조합체 발현 벡터내 적합한 조절 성분과 함께 조립함을 필요로 한다. 효율적인 전사 조절 성분은 이들의 천연 숙주로서 동물 세포를 갖는 바이러스로부터 또는 동물 세포의 염색체 DNA로부터 기원할 수 있다. 바람직하게는, 시미안 바이러스 40, 아데노바이러스, BK 폴리오마 바이러스, 사람 사이토메갈로바이러스로부터 기원한 프로모터-인핸서 조합 또는 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복단위, 또는 베타 액틴 또는 GRP78와 같은 동물 세포내에서 강력하게 구성적으로 전사된 유전자를 포함하는 프로모터-인핸서 조합을 사용할 수 있다. cDNA로부터 전사된 안정하게 높은 수준의 mRNA를 달성하기 위해, 전사 단위는 이의 3'-인접한 부위에 전사 말단-폴리아데닐화 서열을 암호화하는 DNA 영역을 함유하여야 한다. 바람직하게는, 당해 서열은 시미안 바이러스 40 초기 전사 영역, 토끼 베타-글로빈 유전자, 또는 사람 조직 플라스미노겐 활성인자 유전자로부터 기원한다.
이후에, cDNA는 치료학적 폴리펩타이드의 발현을 위해 적합한 숙주 세포주내로 형질감염된다. 사용될 수 있는 세포주의 예는 원숭이 COS-세포, 마우스 L-세포, 마우스 C127-세포, 햄스터 BHK-21 세포, 사람 배아 신장 293 세포 및 햄스터 CHO-세포이다.
상응하는 cDNA를 암호화하는 재조합체 발현 벡터를 수개의 상이한 방식으로 도입시킬 수 있다. 예를 들면, 재조합체 발현 벡터는 상이한 동물 바이러스를 기초로 하여 벡터로부터 생성될 수 있다. 이들의 예는 바큘로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 및 바람직하게는 소 파필로바 바이러스를 기초로 하는 벡터이다.
상응하는 DNA를 암호화하는 전사 단위를 또한 재조합체 DNA를 이들의 게놈내로 통합시키는 특이적인 세포 클론의 분리를 촉진시키기 위해 이들 세포내에서 우세한 선택가능한 마커로서 작용할 수 있는 다른 재조합체 유전자와 함께 동물 세포내로 도입시킬 수 있다. 이러한 유형의 우세한 선택가능한 마커 유전자의 예는 제네티신(G418)에 대해 내성을 부여하는 Tn5 아미노 글리코사이드 포스포트랜스퍼라제, 하이그로마이신에 대해 내성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 및 퓨로마이신에 대해 내성을 부여하는 퓨로마이신 아세틸 트랜스퍼라제이다. 이러한 선택가능한 마커를 암호화하는 재조합체 발현 벡터는 목적한 단백질의 cDNA를 암호화하는 것과 동일한 벡터 상에 존재할 수 있거나, 또는 이는 숙주 세포의 게놈내에 동시 도입되어 통합되는 별개의 벡터 상에 암호화되어, 흔히 상이한 전사 단위 사이에 강력한 물리적 연결을 생성할 수 있다.
바람직한 단백질의 cDNA와 함께 사용할 수 있는 다른 유형의 선택가능한 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(dhfr)를 암호화하는 각종 전사 단위를 기본으로 한다. 이러한 유형의 유전자를 내인성 dhfr-활성을 결여한 세포, 바람직하게는 CHO-세포(DUKX-B11, DG-44)내로 도입시킨 후, 이들을 뉴클레오사이드가 결핍된 배지 속에서 성장하도록 할 것이다. 이러한 배지의 예는 하이포크산틴, 티미딘 및 글라이신이 없는 햄스(Ham's) F12이다. 이러한 dhfr-유전자를 카잘-형 세린 프로테아제 억제제의 cDNA 전사 단위와 함께 동일한 벡터상에 또는 상이한 벡터상에 연결된 상기 유형의 CHO-세포내로 도입시킴으로써, 재조합체 단백질을 생산하는 dhfr-양성 세포주를 생성할 수 있다.
상기 세포주가 세포독성 dhfr-억제제 메토트렉세이트의 존재하에서 성장하는 경우, 메토트렉세이트에 대해 내성인 신규 세포주가 출현할 것이다. 이들 세포주는 증폭된 수의 연결된 dhfr 및 바람직한 단백질의 전사 단위로 인하여 증가된 비율로 재조합체 단백질을 생산할 수 있다. 증가되는 농도의 메토트렉세이트(1-10000nM) 속에서 이들 세포주를 증식시키는 경우, 바람직한 단백질을 매우 높은 비율로 생산하는 신규 세포주가 수득될 수 있다.
바람직한 단백질을 생산하는 상기 세포주는 현탁액 배양물 또는 각종 고체 지지물 속에서 대규모로 성장할 수 있다. 이러한 지지물의 예는 중공 섬유 또는 각종 세라믹 물질의 형태인 덱스트란 또는 콜라겐 매트릭스 또는 고체 지지물을 기초로 한 미세 담체이다. 세포 현탁액 배양물 속에서 또는 미세 담체 상에서 성장시키는 경우 상기 세포주의 배양은 배치 배양 또는 연장된 기간에 걸쳐 조건화된 배지가 연속 생산되는 관류 배양으로서 수행될 수 있다. 즉, 본 발명에 따라서, 상기 세포주는 바람직한 재조합체 단백질의 생산을 위한 산업 공정의 개발에 매우 적합하다.
상기 유형의 세포를 분비하는 배지 속에 축적되는 재조합체 단백질은 세포 배양 배지 속에서 바람직한 단백질 및 다른 물질 사이의 크기, 전하, 소수성, 가용성, 특이적인 친화성 등에 있어서의 차이점을 이용하는 방법을 포함하는, 각종의 생화학적 및 크로마토그래피 방법으로 농축시키거나 정제할 수 있다.
이러한 정제의 예는 재조합체 단백질을 고체 지지체상에 고정된 모노클로날 항체 또는 결합 펩타이드에 흡착시키는 것이다. 흡착 후, 단백질은 또한 상기 특성을 기준으로 한 각종의 크로마토그래피 기술로 정제할 수 있다.
효모 발현 시스템내에서의 발현
숙주로서 본 발명의 실시예 유용한 것으로 고려되는 예시적인 효모의 속은 피키아[Pichia, 앞서 한세눌라(Hansenula)로 분류], 사카로마이세스(Saccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 아스퍼질러스(Aspergillus), 칸디다(Candida), 토룰롭시스(Torulopsis), 토룰라스포라(Torulaspora), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 키테로마이세스(Citeromyces), 파키솔렌(Pachysolen), 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 데바로마이세스(Debaromyces), 트리초데르마(Tricho derma), 세팔로스포리움(Cephalosporium), 후미콜라(Humicola), 무코르(Mucor), 뉴로스포라(Neurospora), 야로위아(Yarrowia), 메츠쿠니코비아(Metschunikowia), 로도스포리디움(Rhodosporidium), 류코스포리디움(Leucosporidium), 보트리오아스쿠스(Botryoascus), 스포리디오볼루스(Sporidiobolus), 엔도마이콥시스(Endomycopsis) 등이다. 속에는 사카로마이세스, 스키조사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 피키아 및 토룰라스포라로 이루어진 그룹 중에서 선택된 것들을 포함한다. 사카로마이세스 아종의 예는 에스.세레비지아에, 에스.이탈리쿠스(S. italicus) 및 에스.로욱시(S. rouxii)이다.
에스.세레비지아에에 적합한 프로모터는 PGKI 유전자, GAL1 또는 GAL10 유전자, CYCI, PHO5, TRPI, ADHI, ADH2, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프럭토키나제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 포스포글루코즈 이소머라제, 글루코키나제, 알파-교배 인자 페로몬, PRBI, GUT2, GPDI 프로모터 및 다른 프로모터의 5' 조절 영역의 일부 또는 상부 활성화 부위(예를 들면, 제EP-A-258 067호의 프로모터)와 5' 조절 영역의 일부의 하이브리드를 포함하는 하이브리드 프로모터에 대한 유전자와 관련된 것들을 포함한다.
스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)에서 사용하기에 편리한 조절가능한 프로모터는 마운드렐(Maundrell)의 문헌[참조: Maundrell K. 1990. Nmt1 of fission yeast. A highly transcribed gene completely repressed by thiamine. J. Biol. Chem. 265:10857-10864]에 기술된 바와 같은 nmt 유전자로부터의 티아민-억제가능한 프로모터 및 호프만(Hoffman) 및 윈스톤(Winston)의 문헌[참조: Hoffman CS and Winston F. 1990. Isolation and characterization of mutants constitutive for expression of the fbp1 gene of Schizosaccharomyces pombe. Genetics 124:807-816]에 기술된 바와 같은 글루코즈 억제가능한 jbpI 유전자 프로모터이다.
전사 종결 시그날은 전사 종결 및 폴리아데닐화에 대한 적절한 시그날을 함유하는 진핵세포 유전자의 3' 플랭킹 서열일 수 있다. 적합한 3' 플랭킹 서열은 예를 들면, 사용된 발현 조절 서열에 천연적으로 연결된 유전자의 것일 수 있으며, 예를 들면, 프로모터에 상응할 수 있다. 달리는, 이들은, 에스.세레비지아에 ADHI 유전자의 종결 시그날이 임의로 사용되는 경우에 상이할 수 있다.
세균 발현 시스템에서의 발현
세균내에서 본 발명의 변형된 카잘-형 세린 프로테아제 억제제의 생산을 위한 예시적인 발현 시스템은 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 브레비스(Bacillus brevis), 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium), 카울로박터 크레센투스(Caulobacter crescentus) 및 가장 중요하게는 에스케리키아 콜라이 BL21 및 이.콜라이 K12 및 이들의 유도체를 포함한다. 편리한 프로모터는 trc 프로모터, tac 프로모터, lac 프로모터, 람다 파지 프로모터 pL, L-아르기노스 유도성 araBAD 프로모터, L-람노즈 유도성 rhaP 프로모터 및 안하이드로테트라사이클린-유도성 tetA 프로모터/오퍼레이터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
하나의 양태에서, 본 발명의 인페스틴 및 변형된 카잘-형 세린 프로테아제 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 원핵 세포의 특정 구획에 대한 본 발명의 단백질의 국재화를 지시하고/하거나 원핵 세포로부터 본 발명의 단백질의 분비를 지시할 시그날 서열에 융합될 수 있다. 예를 들면, 이.콜라이에서, 단백질을 주변세포질 영역으로 발현하도록 지시하는 것이 요구될 수 있다. 폴리펩타이드가 세균의 주변세포질 공간으로 발현되도록 지시하기 위하여 본 발명의 단백질의 단백질이 융합될 수 있는 시그날 서열 또는 단백질(또는 이의 단편)의 예는 pelB 시그날 서열, 말토즈 결합 단백질 시그날 서열, ompA 시그날 서열, 주변세포질성 이.콜라이 열-불안정성 장독소 B-서브유닛의 시그날 서열, 및 알칼리성 포스파타제의 시그날 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. pMAL 계열의 벡터[제조원: 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)]와 같은 단백질의 국재화를 지시할 융합 단백질의 작제를 위한 몇몇 벡터는 상업적으로 이용가능하다.
식물 세포내에서의 발현
본 발명의 변형된 카잘-형 세린 프로테아제 억제제의 발현을 위한 예시적인 식물 시스템은 담배, 감자, 벼, 옥수수, 대두, 알파파, 토마토, 상추 및 콩류를 포함한다(참조: Ma JKC et al. 2003. The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Nat. Rev. Genet. 4:794-805). 식물 시스템에서 재조합체 단백질의 발현은 과일, 종자, 잎 또는 덩이줄기(tuber)와 같은 특정 기관 또는 조직에 대해 적합한 조절 성분에 의해 지시될 수 있다. 달리는, 단백질은 뿌리로부터 분비될 수 있다. 세포내에서, 단백질은 특정 구획, 예를 들면, 세포질세망, 단백질체 또는 플라스티드(plastid)에 대해 표적화될 수 있다. 여기서, 생성물은 보다 높은 수준으로 축적되거나 해독후 변형의 특정 형태를 겪을 수 있다.
유전자도입 발현
대규모 유전자도입 발현 시스템에 대한 예시적 예(참조: Pollock DP. 1999. Transgenic milk as a method for the production of recombinant antibodies. J Immunol Methods 231: 147-157)는 토끼(참조: Chrenek P et al. 2007. Expression of recombinant human factor VIII in milk of several generations of transgenic rabbits. Transgenic Res. 2007 Jan 31), 염소(참조: Lazaris A et al. 2006. Transgenesis using nuclear transfer in goats. Methods Mol Biol. 348:213-26), 돼지 및 소를 포함한다.
정제 및 치료학적 제형
본 발명의 카잘-형 세린 프로테아제 억제제를 80% 이상의 순도, 보다 바람직하게는 95% 이상의 순도로 정제하는 것이 바람직하며, 오염 거대분자, 특히 다른 단백질 및 핵산과 관련하여 순도가 99.9% 이상이고 감염성 및 발열성 인자가 없는 약제학적으로 순수한 상태가 특히 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명의 분리되거나 정제된 카잘-형 세린 프로테아제 억제제는 다른 폴리펩타이드를 실질적으로 포함하지 않는다.
본 발명은 의약에서 본원에 기술된 이러한 억제제의 용도; 및 또한 의약의 제조시 이러한 억제제의 용도를 제공한다. 따라서, 본 발명의 다른 측면에 따라서, 약제학적 제형은 인자 XII의 활성화 또는 인자 XIIa의 활성을 억제하는데 적합하고 3차원적 동맥 또는 정맥 혈전의 형성 및/또는 안정화를 예방하는, 당해 억제제를 포함하는 약제학적 제형이 제공된다.
본 발명에 기술된 치료학적 폴리펩타이드는 치료학적 용도를 위한 약제학적 제제로 제형화될 수 있다. 정제된 단백질은 임의로 약제학적 부형제가 가해져서 약제학적 제제를 제공하는 통상의 생리학적으로 혼용성인 수성 완충액 용액 속에 용해될 수 있다.
이러한 약제학적 담체 및 부형제, 및 적합한 약제학적 제형은 당해 분야에 익히 공지되어 있다[참조: 예를 들면, "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer et al., Taylor & Francis (2000) 또는 "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3rd edition, Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000)]. 특히, 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 동결건조되거나 안정한 가용성 형태로 제형화될 수 있다. 폴리펩타이드는 당해 분야에 공지된 각종 공정으로 동결건조될 수 있다. 동결건조된 제형은 주사용 멸균수 또는 멸균된 생리학적 염 용액과 같은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제를 첨가시킴에 의해 사용전에 재구성된다.
조성물의 제형은 특정의 약제학적으로 적합한 투여 수단에 의해 개체에게 전달된다. 각종 전달 시스템이 공지되어 있으며 임의의 통상적인 경로에 의해 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 전신계적으로 투여된다. 전신계적 사용을 위해, 본 발명의 치료학적 단백질은 비경구(예를 들면, 정맥내, 피하, 근육내, 복강내, 뇌내, 폐내, 비강내 또는 경피)용으로 또는 장내(예를 들면, 경구, 질내 또는 직장) 전달을 위해 통상의 방법에 따라 제형화된다. 가장 바람직한 투여 경로는 정맥내 투여이다. 제형은 주입 또는 일시 주사에 의해 연속 투여될 수 있다. 일부 제형은 서방출 시스템을 포함한다.
경구 투여용 정제 및 캅셀제는 결합제, 충전재, 윤활제 및 습윤제 등과 같은 통상의 부형제를 함유할 수 있다. 경구 액체 제제는 수성 또는 유성 현탁제, 액제, 유제, 시럽제, 엘릭서르제 등의 형태일 수 있거나, 사용시 물 또는 다른 적합한 비히클과의 재구성을 위한 무수 생성물로 존재할 수 있다. 이러한 액제 제제는 현탁화제, 유화제, 비-수성 비히클 및 방부제와 같은 통상의 첨가제를 함유할 수 있다.
국소 적용에 적합한 제형은 수성 또는 유성 현탁제, 용제, 유제, 겔제 또는 바람직하게는 유액 연고제의 형태일 수 있다. 분무 적용에 유용한 제형은 분무가능한 액제 또는 무수 분말제의 형태일 수 있다.
본 발명의 카잘-형 세린 프로테아제 억제제 폴리펩타이드는 환자에게, 용인되지 않는 부작용을 생성하는 투여량에 이르지 않으면서 치료하는 상태 또는 징후의 중증도 또는 확산을 방지하거나 저하시키면서 바람직한 효과를 생성하기에 충분한 투여량을 의미하는 치료학적 유효량으로 투여된다. 정확한 투여량은 예를 들면, 처방, 제형 및 투여 유형과 같은 많은 인자들에 따르며 각각의 개별 징후에 대해 전임상 및 임상 시험시 측정되어야 한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 이들 제제는 동일한 약제의 일부로서 혼입될 수 있다.
본 발명의 각종 생성물은 의약으로서 유용하다. 따라서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 카잘-형 세린 프로테아제 억제제 폴리펩타이드, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명의 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 변형된 DNA는 또한 사람 유전자 치료요법에 사용하기 위한 전달 벡터내로 통합될 수 있다.
본 발명의 특성, 이점 및 추가의 특징은 수행된 실험 및 이들의 결과의 하기 상세한 기술과 함께 하기 기술되는 첨부된 도면을 고려할 때 명백해진다.
도 1: 콜만(Colman)에 의해 논의된 병리학적 혈전증의 모델(참조: Colman RW. 2006. Are hemostasis and thrombosis two sides of the same coin? J. Exp. Med. 203:493-495).
도 2: 인페스틴-4(I4) 및 SPINK-1(SP) 사이의 아미노산 서열 유사성. *, 동일한 아미노산; |, 유사한 아미노산.
도 3: 알.프롤릭수스 억제제와 트롬빈의 접촉 부위는 #으로 나타내며 SPINK-1과 키모트립신의 접촉 부위는 +로 나타낸다.
도 4: 인페스틴-4, SPINK1 및 3개의 SPINK1 돌연변이체(K1 - K3)의 아미노산 서열; 인페스틴-4 서열과 관련하여 *은 동일한 아미노산을; |은 유사한 아미노산을 나타낸다. I4의 밑줄친 서열은 SPINK-1의 15개 아미노산을 교체하여 돌연변이체 K1을 생성하는데 사용되었다. 돌연변이체 K2 및 K3은 K1 서열상의 추가의 점 돌연변이(밑줄친 아미노산)에 의해 생성되었다.
도 5: rHA-인페스틴-4가 시험관내에서 마우스 혈장내 aPTT 및 FXII 활성에 미치는 효과
도 6: 마우스내에서 (투여 전 및) 4.5시간까지 100 및 200 mg/kg의 rHA-인페스틴-4(정맥내)의 투여 후 aPTT의 연장
도 7: 마우스에서 (투여 전 및) 4.5시간까지 100 및 200 mg/kg의 rHA-인페스틴-4(정맥내) 투여 후 FXII의 억제
도 8: 100 mg/kg의 정맥내 주사 후 시간 경과에 따른 마우스 혈장내 rHA-인페스틴-4(평균; n=1-2/시점)
도 9: 마우스에서 (His)6-인페스틴 및 rHA-인페스틴-4의 약동학의 비교
도 10: rHA-인페스틴-4가 지혈 시간에 미치는 효과(n=10-15/그룹, 평균±SD)
도 11: rHA-인페스틴-4가 총 혈액 손실에 미치는 효과(n=10-15/그룹, 평균±SD)
도 12: rHA-인페스틴-4가 지혈 시간에 미치는 효과(n=10-15/그룹, 개별 데이터)
도 13: rHA-인페스틴-4가 총 혈액 손실에 미치는 효과(n=10-15/그룹, 개별 데이터)
실시예 1 : 인페스틴 -4, SPINK -1 및 변형된 카잘 -형 세린 프로테아제 억제제의 클로닝
SPINK-1 아미노산 서열을 포유동물 세포 발현에 대해 최적화되고 적합한 제한 부위를 포함하는 cDNA 서열내로 역 해독하였다. 천연의 SPINK-1 시그날 펩타이드를 포함하는 생성될 SPINK 분자의 뉴클레오타이드 서열(참조: 도 4)을 3개의 단편으로 나누고, 이들 각각을 올리고뉴클레오타이드[제조원: 메디게노믹스(Medigenomix), 독일 마르틴스리드 소재]를 오버랩핑하여 주문 합성하였다. 단편 2 및 3의 2개의 변이체 각각을 생성시키고 다음 방식으로 조립하였다:
S1 + S2wt + S3wt으로 SPINK-1 야생형을 생성함
S1 + S2K1 + S3wt으로 SPINK-K1을 생성함
S1 + S2K1 + S3K3으로 SPINK-K3을 생성함
단편의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7 내지 11(S1, 서열번호 7; S2wt, 서열번호 8; S2K1, 서열번호 9; S3wt, 서열번호 10; S3K3, 서열번호 11)로 제공된다.
단편의 조립은 다음과 같이 수행하였다. 클로닝 벡터 pCR2.1(제조원: 인비트로젠)내 메디게노믹스로부터 수득한 단편을 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI/NarI (S1), NarI/KpnI(S2wt 및 S2K1) 및 KpnI/BamH1(S3wt 및 S3K3) 각각으로 절단하고, 아가로즈 겔로부터 분리하고 EcoRI/BamH1 분해된 발현 벡터 pIRESpuro3[제조원: 비 디 바이오사이언스(BD Biosciences)]내로
a) S1 EcoRI/NarI + S2wt NarI/KpnI + S3wt KpnI/BamH1
b) S1 EcoRI/NarI + S2K1 NarI/KpnI + S3wt KpnI/BamH1
c) S1 EcoRI/NarI + S2K1 NarI/KpnI + S3K3 KpnI/BamH1
의 조합으로 연결하여 플라스미드 p1171 (a), p1172 (b) 및 p1174 (c)를 각각 수득하였다.
SPINK-K2 서열을 생성시키기 위하여, 플라스미드 p1174를 시판되는 돌연변이유발 키트[QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit, 제조원: 스트라타젠(Stratagene)]로 올리고뉴클레오타이드 We2450 및 We2451(서열번호 12 및 13)을 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 부위 지시된 돌연변이유발 반응을 수행하였다. 수득되는 플라스미드는 p1173로 명명하였다.
인페스틴-4 서열을 p1174(SPINK-K3의 N-말단 부분) 및 올리고뉴클레오타이드(제조원: 메디게노믹스, 독일 마르틴스리드 소재)를 오버랩핑함으로써 주문 합성된, C-말단 부분(단편 14C, 서열번호 14)에 대한 암호화 서열로부터 조립하였다. 우선, SPINK-K3 N-말단에 대한 암호화 서열을 함유하는 EcoRI/BamH1 단편을 p1174로부터 분리하고 EcoRI/BamH1 선형화시킨 plRESpuro3내로 클로닝하였다. 수득되는 플라스미드를 후속적으로 BamH1 및 NotI으로 분해하고 14C 단편에 대한 암호화 서열을 함유하는 pCR2.1 벡터(메디게노믹스로부터 제공)로부터 분리한 BglII/NotI 단편을 삽입하였다. 수득되는 플라스미드는 p1288로 칭하며 이는 인페스틴-4에 대한 암호화 서열을 함유하였다.
정제 목적을 위해 인페스틴-4에 헥사히스티딘 태그가 부착된 발현 벡터를 작제하였다. 이러한 목적을 위해 삽입 돌연변이유발을 시판되는 돌연변이유발 키트(QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit, 제조원: 스트라타젠)를 사용하여 키트 제조업자가 기술한 조건하에서 주형으로서 p1288 및 돌연변이유발 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 We2973 및 We2974(서열번호 26 및 27)를 사용하여 수행하였다. 수득되는 플라스미드는 8개 아미노산 글리신/세린 링커 및 6개 길이의 히스티딘 잔기가 C-말단 연장된 인페스틴-4 서열을 암호화하는 p1481로 명명하였다(서열번호 28).
실시예 2: 알부민 융합 작제물의 클로닝
우선, pIRE-Spuro3[제조원: 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences)]의 EcoRI 부위내로 클로닝된 사람 알부민 cDNA 서열을 시판되는 돌연변이유발 키트(QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit, 제조원: 스트라타젠)으로 올리고뉴클레오타이드 We2467 및 We2468 (서열번호 15 및 16)을 사용하여 부위 지시된 돌연변이유발로 돌연변이유발시킴으로써 종결 코돈을 제거하고 글리신/세린 링커의 제1 부분 및 SPINK 및 인페스틴-4 서열의 삽입을 위한 BamH1 제한 부위를 도입하였다. 수득되는 플라스미드는 p1192로 명명하였다. SPINK 암호화 서열(시그날 펩타이드 부재)를 주형으로서 p1171, p1172, p1173 및 p1174와 글리신/세린 링커의 나머지 부분 및 프라이머로서 5'-말단에 BamH1 부위와 3'-말단에 NotI 부위를 도입하는 올리고뉴클레오타이드 We2470 및 We2473(서열번호 17 및 18)을 사용한 PCR로 증 폭시켰다. PCR 단편을 BamH1/NotI으로 분해하고, 정제하며 p1192내로 삽입하고, 또한 BamH1/NotI으로 절단하였다. 수득되는 알부민 융합 플라스미드 p1187은 알부민에 융합된 SPINK-1 야생형, 알부민에 융합된 p1188 SPINK-K1, 알부민에 융합된 p1189 SPINK-K2, 및 알부민에 융합된 p1190 SPINK-K3을 함유하였다. 유사하게, 인페스틴-4 알부민 발현 플라스미드를 작제하였으나 대신 프라이머 We2473 및 We2623(서열번호 18 및 19)을 p1288 상에서 사용하였다. 수득되는 발현 플라스미드는 p1290으로 명명하였다. 암호화된 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 20, 21, 22, 23 및 24로 각각 제공하였다.
실시예 3: 포유동물 세포 배양물 속에서 인페스틴-4 및 인페스틴-4와 SPINK 알부민 융합 단백질의 형질감염 및 발현
발현 플라스미드를 이.콜라이 TOP10(제조원: 인비트로겐) 속에서 성장시키고 표준 프로토콜[공급원: 퀴아젠(Qiagen)]을 사용하여 정제하였다. HEK-293 세포를 리포펙타민 2000 시약(제조원: 인비트로겐)을 사용하여 형질감염시키고 4㎍/ml의 퓨로마이신의 존재하에 무혈청 배지[제조원: 인비트로겐 293 익스프레스(Invitrogen 293 Express)] 속에서 성장시켰다. 형질감염된 세포 집단을 T-플라스크를 통해 상청액이 정제를 위해 수거된 롤러 병 또는 소-규모 발효기를 통해 확산시켰다. HEK-293 세포내에서 발현 수율은 알부민 융합 단백질의 경우 6 내지 15 μg/mL이었고 His-태그된 인페스틴-4의 경우 약 0.5 내지 1 μg/mL이었다.
실시예 4: 효모에서 His-태그된 인페스틴-4 및 인페스틴-4 알부민 융합 단백질의 발현
His-태그된 인페스틴-4 및 인페스틴-4 알부민 융합 단백질의 암호화 서열을 인비트로젠, 모비테크(MoBiTec) 또는 노보자임스 바이오파마(Novozymes Biopharma)가 기술한 바와 같이 에스.세레비지아에(S. cerevisiae) 발현에 적합한 발현 벡터내로 이전하였다. 표준 성장 배지를 사용하는 진탕 플라스크 배양물 속에서 발현으로 쿠마시 염색 후 SDS PAGE 분석으로부터 평가한 것에 따르면 알부민 융합 단백질의 경우 30 및 50 μg/mL 및 His-태그된 인페스틴-4의 경우 약 1 내지 5 μg/mL의 발현 수율이 수득되었다.
실시예 5: 카잘 억제제-알부민 융합 단백질의 정제
25 L의 0.2 μm 여과된 세포 배양물 상청액을 한외 여과(10 kDa 배제 크기)에 의해 1L로 농축시킨 후 40 mM 트리스/HCl pH 7.5에 대해 투석시키고 다시 0.2 μm 여과하였다. 조 농축물을 추가로 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 POROS 50 PI(26 x 750)으로 정제하였다. 컬럼을 40 mM 트리스/HCl pH 7.5로 평형화하였다. 15개 컬럼 용적(CV)을 로딩한 후 세척 단계를 수행하였다. 생성물을 35CV에 걸쳐서 선형 구배로 40 mM 트리스/HCl 1200 mM 염화나트륨 pH 7.5으로 용출시켰다. 단편을 함유하는 융합 단백질을 혼주시키고 한외여과로 농축시켰다. 생리학적 염화나트륨 용액에 대한 한외여과로 약 15mg/mL 농도의 약 90% 순도의 생성물이 수득되었다.
His-태그된 인페스틴-4의 정제 및 검출은 정제를 위한 Ni-NTA 수지와 His-태그된 단백질의 검출을 위한 PentaHis 항체를 함유하는 시판되는 키트(예를 들면, His-태그 정제 및 검출 키트; 제조원: 퀴아젠, 독일 힐덴 소재)를 사용하여 달성할 수 있다.
실시예 6: 카잘 억제제-알부민 융합 단백질의 생화학적 특성
동일성/순도의 측정
단백질의 동일성/순도를 SDS-PAGE(8-16%)에 의해 표준 과정(NOVEX)을 사용하여 측정하였다. 염색을 쿠마시 블루로 수행하였다.
단백질 농도:
알부민 융합 단백질의 단백질 농도는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기본 수행인 알부민 특이적인 ELISA를 사용하여 측정하였다. 요약하면, 마이크로플레이트를 완충액 A(Sigma C-3041) 속에서 1:14000으로 희석시킨 포획 항체(토끼 항 사람 알부민 IgG, DAKO A0001)의 웰당 120μL와 함께 밤새 주위 온도에서 항온처리하였다. 완충액 B(Sigma T-9039)로 다른 3회 세척 후, 각각의 웰을 200μL의 완충액 C(Sigma T-8793)으로 1시간 동안 주위 온도에서 항온처리하였다. 완충액 B로 추가로 3회 세척 단계 후, 완충액 B 속의 시험 샘플의 일련 희석물 및 완충액 B(웰당 용적: 100μL) 중 N 단백질 표준물 SL[제조원: 다데 베링(Dade Behring), 0.5 - 100 ng/mL]을 1시간 동안 주위 온도에서 항온처리하였다. 완충액 B로 3회 세척 단계 후, 완충액 B 중 검출 항체(토끼 항 사람 알부민, DAKO P0356, 표지된 퍼옥시다제)의 1:12500 희석물 100 μL를 각각의 웰에 가하고 다른 1시간 동안 주위 온도에서 항온처리하였다. 완충액 B로 3회 세척 단계 후, 100 μL의 기질 용액(TMB, 제조원: 다데 베링, OUVF)을 웰 당 가하고 30분 동안 주위 온도에서 암실 속에서 항온처리하였다. 100 μL의 종결 용액(제조원: 다데 베링, OSFA)을 첨가하여 450nm 파장에서 적합한 마이크로플레이트 판독기에서 판독하기 위한 샘플을 제조하였다. 이후에 시험 샘플의 농도를 참조물로서 N 단백질 표준물을 사용한 표준 곡선을 사용하여 계산하였다.
활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간의 측정
활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간을 표준 사람 혈장(SHP, 제조원: 다데 베링) 속에서 측정하였으며, 여기서, 상이한 양의 각각의 억제제가 총 200μL의 용적으로 이미다졸 완충액에 가해졌다. 50 μL의 당해 용액을 50 μL의 파트롬틴 SL(제조원: 다데 베링)에 가하고 120초 동안 37℃에서 항온처리하였다. 후속적으로, 50 μL의 염화칼슘 용액(25 mM)을 가하여 반응을 개시하였다.
당해 과정을 제조업자가 제시한 조건에 따라 BCT(베링 응고 타이머)에서 수행하였다.
프로트롬빈 시간의 측정:
프로트롬빈 시간은 표준 사람 혈장(제조원: 다데 베링) 속에서 측정하며, 활성화 시약은 트롬보렐 S(제조원: 다데 베링)이었다. 100 μl의 트롬보렐 S를 50 μL의 샘플(상기 참조)에 15초의 항온처리 시간 후 가하였다. 당해 과정은 제조업자가 제안한 조건에 따라 BCT(베링 응고 타이머)에서 수행하였다.
결과:
Figure 112009055516072-pct00001
이들 시험들은, 카잘-형 억제제가 거의 일정한 PT에 의해 발현된 외인성 경로에 거의 영향을 미치지 않으면서 내인성 경로를 억제할 수 있음을 입증한다.
실시예 7: 동맥 혈전증에 대한 마우스 모델에서 혈관 폐색을 예방하는데 고도로 효과적인 인페스틴 -4 알부민 융합체
동맥 혈전증으로부터 마우스를 강력하게 보호하는데 요구되는 투여량을 평가하기 위하여, 시험적 시험관내 스파이킹 실험을 수행하였다. rHA-인페스틴-4를 마우스 혈장내로 스파이킹하는 것은 감소된 FXII 활성 및 aPTT의 연장을 초래하였으나, PT는 사실상 변하지 않은 채로 남았다.
Figure 112009055516072-pct00002
Figure 112009055516072-pct00003
시험관내에서 마우스 혈장의 스파이크 후 매우 명확한 억제가 관측되었으므로, 마우스를 rHA-인페스틴-4로 정맥내 처리하고 시간 경과에 따른 aPTT 및 FXII 활성을 평가하였다(도 6 및 7). 또한, rHA-인페스틴-4의 혈장 수준을 표 5에 명시한 시점에서 측정하였다.
Figure 112009055516072-pct00004
당해 시험은, rHA-인페스틴-4의 400 mg/kg의 1회 정맥내 주사로 aPTT가 연장되고 FXII 활성이 적어도 1시간 동안 감소하였음을 나타내었다. 따라서, 1회 주사는 혈전증의 FeCl3 모델에서 혈전성 혈관 폐색으로부터 마우스를 보호할 수 있었다. 따라서, 동물을 400 mg/kg의 rHA-인페스틴-4로 정맥내 투여하고 혈관 폐색률 및 폐색이 발생될 때까지의 시간을 측정하였다.
동물에게 rHA-인페스틴-4를 t=0에서 400 mg/kg 이하의 투여량을 1회 정맥내 주사하였다. 동맥 혈전증을 평가하기 위해, 복부 동맥을 깊은 마취중에 노출시켰다. 기본 혈류를 혈관 주변에 초음파 유동 프로브를 두어 측정하였다. 혈전증을 개시하기 위하여 10%의 염화제이철 용액으로 포화시킨 0.5 mm2 패취의 여과지를 유동 프로브의 복부 동맥 하부에 두었다. 3분 노출 기간 후, 여과지를 제거하고 혈류를 60분 동안 모니터하여 혈전성 폐색의 발생을 측정하였다.
표 6은, 비히클 처리된 동물 중 82%가 혈전증을 나타내었음을 보여준다. 대조적으로 rHA-인페스틴-4로 처리된 10마리의 마우스 중 어느 것에서도 혈전증이 발생하지 않았다. 이러한 효과는 투여량-의존적이며 감소되는 폐색 발생률, 폐색의 발생이 증가될 때까지의 시간과는 반대이다.
Figure 112009055516072-pct00005
FXII k.o. 동물은 혈전증으로부터 유사하게 보호되나, 동시에 지혈 결핍증이 관측되지 않으므로, 지혈을 400 mg/kg 이하의 rHA-인페스틴-4를 정맥내 처리한 마우스에서 유사한 방식으로 분석하였다. 당해 목적을 위해, 동물을 나르코렌을 사용하여 약 60 mg/kg을 정맥내 1회 주사함으로써 마취하였다. rHA-인페스틴-4를 동물의 병변 15분 전, 즉 항혈전성 효과를 평가하기 위한 실험에서와 동일한 투여량을 사용하고 동일한 시점에서 주사하였다.
지혈은 지혈에 대한 시간 및 지혈이 일어나기까지 센서로 30분의 관측 기간의 말기에 혈액 손실을 측정함으로써 정량화하였다. 총 혈액 손실의 용적은 꼬리의 담금에 사용된 염수에 존재하는 HGB를 측정함으로써 계산하였다. 따라서 동물의 HGB를 고려하였다. 꼬리 절단을 깊은 마취하에 작은 칼을 사용하여 수행함으로써 꼬리를 약 3mm 제거하였다. 병변과 동시에, 꼬리를 예비-가온되고 또한 관측 기간 동안 수조를 사용하여 마우스의 생리학적 체온으로 유지시킨 염수에 담갔다. 출혈을 모니터하는 관측 시간은 30분이었다. 모든 시험 제품을 관측 기간의 시작(꼬리 절단) 15분 전에 정맥내 투여하였다.
관측 기간내 지혈에 대한 모든 주요 매개변수, 지혈에 이르는 시간 및 혈액 손실은 2개의 처리 그룹 및 비히클 대조군 그룹 사이에서 명백한 차이를 나타내지 않았다(표 7, 8, 도 10 내지 13).
Figure 112009055516072-pct00006
Figure 112009055516072-pct00007
오직 인페스틴-4, 즉 알부민과 융합되지 않은 인페스틴-4(예를 들면, 실시예 1 참조, His-태그된 인페스틴-4)를 혈전증으로부터 잠재적인 보호에 대해 시험한다. 400 mg/kg과 대략 등몰량인 투여량의 rHA-인페스틴-4를 혈전증 유도 15분 전에 1회 마우스내로 정맥내 주사한다. 혈전증의 유도 및 평가는 rHA-인페스틴-4에 대해 기술된 바와 동일한 방식으로 수행한다. 급속한 제거를 극복하기 위하여 인페스틴-4를 연속 주입 또는 반복된 주사로 적용하며, 이는 순환으로부터 급속히 제거되고 약동학적 이유외에 다른 매카니즘으로 인하여 활성을 상실하는 화합물의 높은 혈장 수준을 유지시키는 표준 과정이다.
결과는, rHA-인페스틴-4 처리된 마우스 그룹이 FXII k.o. 마우스 그룹의 결과(또한 나타냄)와 일치하는 혈전증 또는 출혈 위험을 나타내지 않음을 나타낸다.
실시예 8: 동맥 혈전증의 래트 FeCl 3 모델에서 시판되는 FXII (a) 억제제 Berinert ® P가 aPTT , PT 및 혈관 폐색에 미치는 효과
FXII(a)를 억제하는 효능에 있어서 시판되는 FXII(a) 억제제 Berinert® P(C1 에스테라제 억제제)의 적합성을 평가하기 위하여 수개의 시험관내 및 생체내 시험을 수행하였다.
시험 목표는 래트 혈장내에서 FXII 활성뿐만 아니라 aPTT 및 PT에 미치는 효과를 측정하고 동맥 혈전증의 래트 FeCl3 모델에서 잠재적인 항-혈전성 효과를 평가하기 위한 것이었다.
래트를 마취시키고 혈액 샘플을 후안와로부터 수거하고 표준 과정에 따라 인자 XII 활성의 측정을 위해 혈장으로 가공하였다. 이러한 혈장 샘플을 Berinertⓒ P로 스파이크하고 FXII 활성에 대해 직접 시험하였다.
Berinertⓒ P 스파이크를 시험관내에서 FXII 활성에 미치는 이의 효과에 대해 시험하였다. 고 농도에서 실질적인 FXII 억제가 관측되었다(표 9)
Figure 112009055516072-pct00008
FXII의 현저한 억제가 달성되었으므로, 생체내 시험을 수행하였다. 래트를Berinertⓒ P를 사용하여 1200 U/kg의 투여량으로 정맥내 투여함으로써 혈전증의 잠재적인 예방을 측정하였다. 투여량을 선택하여 혈장 농도가 10-15 U/mL이 되도록 하였다. 동맥 혈전증의 평가를 위해, 경동맥 및 경정맥을 깊은 마취하에 노출시켰다. 캐뉼라를 약물 투여를 위해 경정맥내로 삽관하였다. 혈류를 모니터하기 위해, 초음파 유동 프로브를 경동맥 주변에 위치시켰다. 혈전증을 개시하기 위해, 35% 염화제이철 용액으로 포화시킨 2.5 mm2 패치의 여과지를 유동 프로브의 경동맥 하부에 위치시켰다. 3분 노출시킨 후, 여과지를 제거하고 혈류를 60분 동안 모니터하여 혈전성 폐색의 발생을 측정하였다. APTT, PT 및 FXII 활성을 관측 기간 말기에 측정하였다.
경동맥을 35% 염화제이철로 3분 처리하면 혈전성 폐색이 100% 비율로 발생하였다(표 10). 비록 높은 투여량의 Berinert® P가 증가된 aPTT 및 중간의 FXII 억제를 가져온다고 해도, 폐색률에 미치는 긍정적인 효과는 관측되지 않았다.
Figure 112009055516072-pct00009
요약:
고 농도의 Berinert® P는 시험관내에서 FXII를 현저히 억제하였다. 그러나, 동맥 혈전증의 FeCl3 모델에서는 고 투여량의 Berinert® P도 불충분하였다. 당해 투여량의 Berinert? P는, 보다 높은 투여량의 적용이 높은 단백질 부하 및 비-생리학적 주사 용적을 초래하기 때문에 기술적 한계에 근접하였다.
실시예 9: 마우스에서 ( His )6- 인페스틴 및 rHA - 인페스틴 -4의 약동학의 비교
His-태그된 인페스틴-4 ((His)6-인페스틴-4) 또는 인페스틴-4 알부빈 융합체(rHA-인페스틴-4) 제제를 총 28마리의 NMRI 마우스에 정맥내 투여하였다. (His)6-인페스틴-4의 경우 투여량은 20mg/kg의 체중이었고 rHA-인페스틴-4의 경우 200 mg/kg의 체중이었다. 당해 투여량은 2개의 단백질, 즉, 인페스틴-4의 활성 성분과 동등한 양에 상응한다.
혈액 샘플을 시험 물질이 적용 후 5분째부터 적절한 간격으로 수거하였다. 인페스틴-4 항원 함량을 인페스틴-4에 특이적인 ELISA 검정으로 연속하여 정량하였다. 처리 그룹의 평균 값을 계산에 사용하였다. 각각의 단백질에 대한 반감기를 식 t1 /2 = ln2 / k(여기서, k는 회귀선의 기울기이다)에 따라 제거의 베타 상의 시점을 사용하여 계산하였다. 결과는 표 9에 나타낸다(n=1-4/시점; 평균).
rHA-인페스틴-4에 대해 계산된 최종 반감기는 3시간인 반면, (His)6-인페스틴-4에 대해 계산된 최종 반감기는 0.3시간이다. 따라서, 최종 반감기의 명백한 증가는 (His)6-인페스틴-4와 비교하여 rHA-인페스틴-4의 경우 10배로 나타난다.
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Val Arg Asn Pro Cys Ala Cys Phe 595 600 605 Arg Asn Tyr Val Pro Val Cys Gly Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Gly Asn 610 615 620 Pro Cys Met Leu Asn Cys Ala Ala Gln Thr Lys Val Pro Gly Leu Lys 625 630 635 640 Leu Val His Glu Gly Arg Cys 645 <210> 25 <211> 294 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Asp Ser Leu Gly Arg Glu Val Arg Asn Pro Cys Ala Cys Phe Arg Asn 1 5 10 15 Tyr Val Pro Val Cys Gly Thr Asp Gly Asn Thr Tyr Gly Asn Glu Cys 20 25 30 Met Leu Cys Ala Glu Asn Arg Lys Arg Gln Thr Ser Ile Leu Ile Gln 35 40 45 Lys Glu Gly Pro Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Pro 50 55 60 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 65 70 75 80 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 85 90 95 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 100 105 110 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 115 120 125 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 130 135 140 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 145 150 155 160 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 165 170 175 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 180 185 190 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 195 200 205 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 210 215 220 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 225 230 235 240 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 245 250 255 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 260 265 270 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 275 280 285 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 290

Claims (18)

  1. 인페스틴-4가 반감기 증진 폴리펩타이드에 연결된 융합 단백질로서, 상기 반감기 증진 폴리펩타이드가 사람 알부민 단백질 계열의 일원에 속함을 특징으로 하는 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 인페스틴 3-4가 상기 반감기 증진 폴리펩타이드에 연결됨을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 반감기 증진 폴리펩타이드가 사람 알부민, 사람 아파민 및 사람 알파-페토단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 사람 알부민 단백질 계열의 일원임을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 반감기 증진 폴리펩타이드가 사람 알부민 또는 이의 도메인 또는 일부임을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 반감기 증진 폴리펩타이드가 링커를 통해 인페스틴-4 잔기에 연결되는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 상기 링커가 내인성 응고 경로의 응고 프로테아제에 의해 절단가능한 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, FXIIa에 의해 절단가능한 링커를 특징으로 하는, 융합 단백질.
  8. 제1항에 따른 융합 단백질을 포함하는, 동맥 혈전증, 뇌졸중, 심근경색, 염증, 혈관형성, 저장성 쇼크, 부종, 유전성 맥관부종, 세균 감염, 관절염, 췌장염, 관절 통풍, 파종성 혈관내 응고 증후군(DIC) 및 패혈증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물.
  9. 제1항에 따른 융합 단백질을 포함하는, 뇌졸중 또는 심근경색을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  10. 사람 세포를 제외한 진핵 세포, 세균, 효모, 식물 세포, 곤충 세포, 또는 사람을 제외한 유전자도입 동물에서 재조합 수단을 통해 제1항에 따른 융합 단백질을 생산하는 방법.
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