JPH10117786A - 改変された膵臓分泌トリプシン阻害剤およびそれをコードするｄｎａ、ならびにそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 改変されたヒト膵臓分泌トリプシン阻害剤の
提供。 【解決手段】 膵臓分泌トリプシン阻害剤のアミノ酸配
列を本質的に有するペプチドであって、該配列中に存在
するアミノ酸残基が少なくとも１個他の天然由来のアミ
ノ酸残基で置換されているアミノ酸配列を含むペプチ
ド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト膵臓分泌トリプシ
ン阻害剤（h−ＰＳＴＩ）のアミノ酸配列を有する、微
生物的に生産されたペプチドに関する。本発明は、さら
に、もとの配列中のアミノ酸の１または２以上が他のア
ミノ酸によって置換されている、このようなペプチドの
変異型に関する。これらのペプチドは、それらの阻害作
用において有利に改変された特異性を示す。これらのペ
プチド類の調製法およびそれらの製薬学的使用をも開示
する。

【０００２】

【従来の技術】多形核の顆粒球からのリソソームのエラ
スターゼ（白血球エラスターゼ）；Ｊ．Ｇ．ビース（Ｂ
ieth）（１９８６）２１７−３２０ページ［レギュレイ
ション・オブ・マトリックス・アキュムレイション（Ｒ
egulation of Ｍatrix Ａccumlation）、メカム（Ｍ
echam）編、アカデミック・プレス（Ａcademic Ｐres
s）、オーランド（Ｏrland）］は、効力のある細胞内プ
ロテアーゼであり、リソソーム中に貯蔵され、そしてフ
ァゴリソソーム中においてその生理学的機能の細胞内蛋
白質破壊を遂行する。リソソームプロテアーゼの主要な
機能的役割｛エラスターゼ、カテプシンＧなど；Ｈ．フ
リッツ（Ｆritz）ら（１９８４）［臨床酵素学において
選択されたトピックス（Ｓelected Ｔopics in Ｃli
nical Ｅnzymology）、ゴールドバーグ（Ｇoldberg）
およびウェルナー（Ｗerner）編、ワルター・デ・グル
イター(Ｇruyter)、ベルリン（Ｂerlin）vol．２、３０
５−３２８ページ｝は、有機体自体（例えば、代謝産
物、傷を受けた組織）からあるいは侵入性有機体（例え
ば、バクテリア、ウイルス、かびなど）の食作用を受け
た物質のデグラデーション（または分解）である。

【０００３】細胞外（血液または間質性流体）に放出さ
れると、エラスターゼは、血漿中において効力のある内
因性阻害剤、例えば、α₁−ＰＩ［α₁−プロテアーゼ阻
害剤；Ｊ．トラビス（Ｔravis）およびＧ．Ｓ．サルベ
ーセン（Ｓalvesen）、（１９８３）、Ａnn．Ｒev．Ｂi
ochem．p．６５５−７０９］、および／または粘膜の分
泌物中において抗白血球プロテアーゼ［いわゆるＨＵＳ
Ｉ−Ｉ、ヒト精液プロテアーゼ阻害剤；Ｈ．シースラー
（Ｓchiessler）ら（１９７８）p．１９５−２０７、ヒ
ト多形核白血球の中性プロテアーゼ（Ｎeutral Ｐrote
ases of Ｈuman Ｐolymorphonuclear Ｌeukocyte
s）、ヘイブマン（Ｈaveman）およびジャノフ（Ｊanof
f）編、アーバン・アンド・シュワルゼンバーグ（Ｕrba
n ＆ Ｓchwarzenberg）、バルチモア］によって急速
に結合される。

【０００４】遺伝的なα₁−ＰＩの欠損のため［Ｊ．
Ｂ．ビース（Ｂieth）、１９８６］あるいはエラスター
ゼの大量の細胞外放出の結果［急性および慢性の炎症、
多数の外傷またはショックにおいて；Ｈ．フリッツ（Ｆ
ritz）ら、１９８４］、天然プロテアーゼ阻害剤による
エラスターゼの分解性能力に対する有機体の保護は不十
分である。内因性プロテアーゼ阻害剤の過度の消費およ
び局所的には全体にさえ及ぶ消費は、（i）エラスター
ゼとの複合体の形成、（ii）種々のリソソームのプロテ
アーゼによる蛋白質分解的不活性化、および（iii）と
くに酸化的不活性化（α₁−ＰＩ）によって生ずる
［Ｊ．Ｂ．ビース（Ｂieth）、（１９８６）；Ｈ．フリ
ッツ（Ｆritz）ら、（１９８４）；Ｊ．トラビス（Ｔra
vis）およびＧ．Ｓ．サルベーセン（Ｓalvesen）、（１
９８３）；上を参照］。

【０００５】結果は結合組織の過度の蛋白質分解的デグ
ラデーション、ならびに凝固因子、フィブリン溶解因子
および補体因子を包含する体液性蛋白質のエラスターゼ
および他のリソソームのプロテアーゼ（例えば、カテプ
シンＧ）による過度の蛋白質分解的デグラデーションで
あり、重い臨床的症候、例えば、気腫、ショック肺、大
人の呼吸困難症候群、凝固傷害、腎臓および肝臓の不全
などに導く［上の文献に加えて、次の文献を参照：ノイ
エ・ウェッジ・イン・デル・エントズングスジアグノス
チク（Ｎeue Ｗege in der Ｅntzuendungsdiagnost
ik）、ＰＭＮエラスターゼ；Ｍ．ジョチャム（Ｊochu
m）ら（編）、（１９８５）、ＧＩＴフェルラーグ（Ｖe
rlag）、ダームシュタット；Ｃ．Ｔ．リー（Ｌee）ら、
（１９８１）、ニュー・イングランド・ジャーナル・オ
ブ・メディシン（Ｎ．Ｅngl．Ｊ．Ｍed.）、３０４、１
９２−１９６；Ｗ．Ｗ．マクグイヤー（ＭcＧuire）
ら、（１９８２）、ジャーナル・オブ・クリニカル・イ
ンベスティゲーション（Ｊ．Ｃlin．Ｉnvest.）、６
９、５４３］。

【０００６】エラスターゼは、また、リウマチ性関節
炎、例えば、結合組織の構成成分のデグラデーション、
に亢進する局所的炎症の事象の一因となる［Ｋ．クリー
シイク（Ｋleesiek）ら（１９８５）、ノイエ・ウェッ
ジ・イン・デル・エントズングスジアグノスチク（Ｎeu
e Ｗege in der Ｅntzuendungsdiagnostik）、ＰＭ
Ｎ エラスターゼ、p．７１−８２］。

【０００７】重い傷を受けた後の、あるいは敗血症ショ
ック、ショック肺などのような病気における、エラスタ
ーゼの細胞外放出は、酵素イムノアッセイによって日常
的に監視できる［Ｓ．ノイマン（Ｎeumann）およびＭ．
ジョチャム（Ｊochum）、（１９８４）、p．１８４−１
９５、Ｍethods of Ｅnzymatic Ａnalysis、ベルグ
メイヤー（Ｂergmeyer）（編）、フェルラーグ・ヘミー
（Ｖerlag Ｃhemie）、ワインハイム］。

【０００８】セプシスおよび気腫の実験的モデルにおい
て、合成エラスターゼ阻害剤［Ｊ．Ｃ．パワーズ（Ｐow
ers）、アメリカン・リビュー・オブ・レスピレイタリ
ー・ディジーズ（Ａm．Ｒev．Ｒespir．Ｄis.）、（１
９８３）、１２７、５５４−５５８］および動物からの
天然阻害剤、例えば、エグリンＣ［Ｈ．Ｐ．シュネブリ
（Ｓchnebli）ら、（１９８５）、ユーロピアン・ジャ
ーナル・オブ・レスピレイタリー・ディジーズ（Ｅur．
Ｊ．Ｒespir．Ｄis.）、６６、Ｓuppl．１３９p.６６−
７０］が、治療学的に有用であることが証明された。ヒ
ト起源のプロテアーゼ阻害剤の適用は、毒性の副作用、
例えば、α₁−ＰＩ欠損（気腫）の処置において、こと
に長期にわたる治療が必要とされるとき、アレルギー性
反応を回避するために、好ましいであろう。ヒトα₁−
ＰＩは高分子量の糖蛋白質であるので、遺伝子技術によ
る十分な量のその生産は近い将来においては実施できな
いであろう。

【０００９】抗白血球プロテアーゼすなわちＨＵＳＩ−
Ｉ［Ｈ．シースラー（Ｓchiessler）ら、１９７８；お
よびＵ．シーミュラー（Ｓeemueller）ら（１９８６）
ＦＥＢＳ Ｌetters、１９９、４３−４８］は、１４，
０００ダルトンの分子量を有し、そして２つの活性ドメ
インから成り、その一方はエラスターゼに対して向けら
れ、そして他方はトリプシンに対して向けられている。
それゆえ、このタイプの阻害剤は比較的低い選択性を有
し、そして特異的なエラスターゼ阻害剤ではない。トリ
プシンまたはトリプシン様酵素の阻害は、通常上に記載
した適用は意図されていない。

【００１０】

【発明の構成】ヒト膵臓はＰＳＴＩ、すなわち、低分子
量（６．２kd）のプロテアーゼ阻害剤を分泌し、それは
トリプシンを特異的に阻害する、すなわち、それはプテ
アーゼの１つの特定のタイプに対して高い選択性を有す
る。

【００１１】本発明において提供される１つの利点は、
ＰＳＴＩ中の１つ（または数個）のアミノ酸のみを組換
えＤＮＡ技術によって置換してＰＳＴＩ変異型を生成す
ることにあり、これらの変異型は白血球エラスターゼに
対して高い特異性を有する、高度に有効なプロテアーゼ
阻害剤であることが示された。その上、その比較的低い
分子量のため、エラスターゼＰＳＴＩ誘導複合体は腎臓
をさらによく通過するであろう。したがって、細胞外に
放出されたエラスターゼの排除は高度に効率的であろ
う。ＰＳＴＩがヒト起源であるという事実は、その低い
分子量と一緒になって、ＰＳＴＩ誘導体を異質蛋白質と
して免疫系が認識することによる合併症を、これらの誘
導体の適用は回避するであろうと期待される。

【００１２】α₁−ＰＩおよび抗白血球プロテアーゼ類
と比較したＰＳＴＩの他の本質的な利点は、強い酸化剤
が生成されかつ細胞外に放出される、炎症の過程の間に
おける、酸化的不活性化に対してＰＳＴＩが不感受性で
あるということである。結局、α₁−ＰＩおよび抗白血
球プロテアーゼ類に比較して、ＰＳＴＩ誘導体類の低い
投与量は、同様な保護的作用を達成するために十分であ
ろう。

【００１３】したがって、本発明の１つの目的は、プロ
テアーゼ阻害活性を有し、好ましくは改良された特異性
および／または改良された阻害効能を有する、製薬学的
に有用なペプチド類を提供することである。前記ペプチ
ド類は、組換えＤＮＡ技術によって生成された、膵臓分
泌トリプシン阻害剤（ＰＳＴＩ）の配列を有するペプチ
ド類およびそれらの変異型である。用語「変異型（vari
ants）」は、親配列中のアミノ酸の１または２以上が天
然に産出するアミノ酸の他のものによって置換された、
ペプチド類を呼ぶ。親配列として、ヒト膵臓トリプシン
阻害剤（h−ＰＳＴＩ＝ＰＳＴＩ ０）の配列を使用す
る。アミノ酸の置換にかけるべき好ましい位置は、ペプ
チド中の位置１７、１８、１９、２０、２１、２９、３
２および３６である。より詳しくは、本発明は、次のア
ミノ酸からなるＰＳＴＩ ０の配列［Ｌ．Ｊ．グリーン
（Ｇreene）、１９７６、酵素学における方法（Ｍethod
sＥnzymol．）、４５、８１３−８２５に報告されてい
るような］を本質的に有し、かつ各位置に次のアミノ酸
を含んでなるペプチド類に関する：位置１３におけるＧ
lu、ＡspまたはＬeu、位置１４におけるＧlu、Ａspまた
はＡsn、位置１７におけるＴhr、Ｐro、Ｓer、Ａrg、Ｌ
euまたはＭet、位置１８におけるＬeu、Ｍet、Ｖal、Ｇ
ln、Ｓer、Ａla、Ｔhr、Ｉle、Ｔyr、Ｐhe、Ａrg、Ｔrp
またはＬys、位置１９におけるＧlu、Ａsp、Ｌeuまたは
Ｉleおよび位置２０におけるＴyr、Ｐhe、Ａsp、Ａsn、
Ｌeu、Ｇlu、Ｇln、ＨisまたはＡrg、位置２１における
Ｇlu、Ａrg、Ｍet、Ｐhe、Ｌys、Ｖal、Ｔhr、Ｇln、Ｌ
eu、ＡspまたはＡsn、位置２９におけるＬys、Ｇlu、Ｉ
le、Ｇln、ＡspまたはＡsn、位置３２におけるＰro、Ｇ
ly、Ｓer、Ａsn、Ａla、Ａsp、Ｖal、ＡrgまたはＨisお
よび位置３６におけるＡsn、Ａsp、Ａla、Ｓer、Ｇly、
Ｔyr、ＶａlまたはＧluのアミノ酸、ただしＬeu¹³−Ａs
n¹⁴−Ｔhr¹⁷−Ｌys¹⁸−Ｉle¹⁹−Ｔyr²⁰−Ａsn²¹−Ａsp
²⁹−Ｐro³²−Ｖal³⁶およびＬeu¹³−Ａsn¹⁴−Ｔhr¹⁷−Ｌ
ys¹⁸−Ｉle¹⁹−Ｔyr²⁰−Ａsp²¹−Ａsn²⁹−Ｐro³²−Ｖal
³⁶の組み合わせを除外する。

【００１４】下表１は変異型のいくつかを示し、位置３
２および３６におけるアミノ酸が、それぞれ、プロリン
およびバリンである場合、ＰＳＴＩ ０は親配列であ
る。

【００１５】表１に開示する変異型は、位置３２および
３６において上に列挙するアミノ酸によって、さらに変
化させることができる。

【００１６】本発明は、また、位置−１にメチオニンま
たはリーダーペプチドをさらに含有する、上に概説した
配列を有するペプチドに関する。本発明に関連して用語
「リーダーペプチド」は、発現生成物の分泌を促進する
シグナル配列［Ｓ．Ｄ．エムル（Ｅmr）ら、Ｊ．of Ｃ
ell Ｂiol．、１９８０、８６、p.７０１−７１１］を
意味するばかりでなく、かつまたＰＳＴＩ配列の前にシ
グナル配列およびリンカー配列を含有するペプチドを意
味する。

【００１７】表１：PSTI−異変型 位置 17 18 19 20 21 29 PSTI 0 Thr Lys Ile Tyr Asn Asp PSTI 1 Thr Leu Ile Tyr Asn Asp PSTI 2 Thr Leu Ile Tyr Asp Asn PSTI 3 Thr Tyr Glu Tyr Arg Asp PSTI 4 Thr Leu Glu Tyr Arg Asp PSTI 5 Thr Val Glu Tyr Arg Asp PSTI 6 Thr Leu Glu Tyr Asn Asp PSTI 7 Thr Leu Ile Tyr Arg Asp PSTI 8 Thr Val Glu Leu Asn Asp PSTI 9 Thr Val Glu Leu Arg Asp PSTI 10 Pro Lys Ile Tyr Asp Asn PSTI 11 Pro Leu Glu Tyr Arg Asp PSTI 12 Pro Val Glu Tyr Arg Asp PSTI 13 Thr Ile Glu Tyr Asn Asp PSTI 14 Thr Arg Glu Tyr Asn Asp PSTI 15 Thr Phe Glu Tyr Asn Asp PSTI 16 Thr Ala Glu Tyr Asn Asp PSTI 17 Thr Val Ile Tyr Asn Asp PSTI 18 Thr Ile Ile Tyr Asn Asp PSTI 19 Thr Val Ile Tyr Asp Asn PSTI 20 Thr Ile Ile Tyr Asp Asn PSTI 21 Thr Ile Glu Tyr Arg Asp PSTI 22 Thr Tyr Ile Tyr Asn Asp PSTI 23 Thr Phe Ile Tyr Asn Asp PSTI 24 Thr Lys Glu Tyr Arg Asp 本発明は、また、前記ペプチドをコードするＤＮＡに関
する。とくに、本発明は、次の配列を有する、以後「マ
スター遺伝子」と呼ぶＤＮＡおよびその機能的同等体に
関する：

【００１８】

【化２】

【００１９】「機能的同等体」は、上のＤＮＡ配列の誘
導体が、また、同一蛋白質の発現に有用でありうること
を意味する。当業者に知られているように、あるコドン
において、所定の蛋白質中に組込むべきアミノ酸に作用
を有さない他の塩基によって、塩基の１、または２、ま
たは３を置換することができる。ペプチドを生成するた
めに、マスター遺伝子を、ＤＮＡ技術によって、特定の
位置におけるアミノ酸のためのコドンが他のアミノ酸の
ためのコドンで置換されるような方法で、修飾する。本
発明による変異型ペプチドの１つをコードするＤＮＡを
得るために、位置１７、１８、１９、２０、２１、２
９、３２および３６におけるアミノ酸のためのコドンを
他のコドンで置換することができる。

【００２０】このような置換において好ましいコドン
は、上に列挙したアミノ酸をコードするコドンである。
用いる発現系に依存して、本発明のＤＮＡは、また、リ
ーダーペプチドをコードする配列を上流にさらに有す
る、上のペプチドの１つをコードするＤＮＡであること
ができる。

【００２１】本発明の他の目的は、本発明のペプチドの
１つをコードするＤＮＡを含んでなる、また、プラスミ
ドと呼ぶ発現ベクターである。このプラスミドは宿主有
機体の形質転換のために使用する。本発明は、また、こ
のような形質転換された微生物に関する。形質転換に適
当な、多数の種々の微生物がこの分野において知られて
いる。このプラスミドの性質は、主として、使用すべき
宿主有機体に依存する。

【００２２】本発明のＤＮＡからなるプラスミドで形質
転換された宿主有機体は、上のペプチドおよびその変異
型の生成に使用される。生成は、 a）適当な条件下に宿主有機体を培養し、 b）前記培養物からペプチドを回収し、そして c）前記ペプチドを精製する、工程を含んでなる。

【００２３】ペプチドの精製は、蛋白質化学の既知の方
法により、例えば、沈殿、クロマトグラフィーおよび電
気泳動によって達成することができる。前述のリンカー
ペプチドはこのような精製のためにすぐれた道具である
ことができる。なぜなら、それは精製ハンドルとして有
利に使用できるからである。例えば、リンカーペプチド
が主として塩基性または酸性のアミノ酸からなる場合、
イオン交換クロマトグラフィーは発現された生成物の精
製において非常に有用であることがある。

【００２４】本発明は、また、上に概説したペプチドを
含んでなる製薬学的組成物および調製物ならびに製薬学
的組成物の調製における前記ペプチドの使用に関する。
このような組成物は、前述の適用に非常に有用である。

【００２５】このような製薬学的調製物は、無毒の不活
性な製薬学的に適当な賦形剤に加えて、本発明による化
合物の１種または２種以上を含有するか、あるいは本発
明による活性化合物の１種または２種以上から成る。

【００２６】本発明は、また、投与単位の形態の製薬学
的調製物を包含する。これは、製薬学的調製物が個々の
部分の形態、例えば、錠剤、被覆された錠剤、カプセル
剤、ピル、坐薬およびアンプル剤の形態であることを意
味し、その活性化合物の含量は個々の投与量の数分の１
あるいは多数倍に相当する。投与単位は、例えば、１、
２、３または４倍の個々の投与量、あるいは個々の投与
量の１／２、１／３または１／４を含有することができ
る。個々の投与量は、好ましくは、１回の投与で与えら
れかつ通常１日量の全部、半分または３分の１または４
分の１に相当する量の活性化合物を含有する。

【００２７】無毒の不活性の製薬学的に適当な賦形剤と
は、すべての種類の固体、半固体または液体の希釈剤、
充填剤および配合助剤であると解釈すべきである。

【００２８】錠剤、被覆された錠剤、カプセル剤、ピ
ル、丸剤、坐薬、溶液、懸濁液および乳濁液、泥膏、軟
膏、ゲル、クリーム、ローション、粉末およびスプレー
を好ましい製薬学的調製物として挙げることができる。

【００２９】錠剤、被覆された錠剤、カプセル剤および
顆粒剤は、活性化合物の１種または２種以上を、次の普
通の賦形剤と一緒に含有できる：（a）充填剤および増
量剤、例えば、澱粉、ラクトース、グルコース、マンニ
トールおよびシリカ、（b）結合剤、例えば、カルボキ
シメチルセルロース、アルギン酸塩類、ゼラチンおよび
ポリビニルピロリドン、（c）保湿剤、例えば、グリセ
ロール、（d）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム
および重炭酸ナトリウム、（e）溶解遅延剤、例えば、
パラフィン、および（f）吸収促進剤、例えば、第四ア
ンモニウム化合物、（g）湿潤剤、例えば、セチルアル
コールまたはグリセロールモノステアレート、（h）吸
着剤、例えば、カオリンおよびベントナイト、および
（i）潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウ
ム、ステアリン酸マグネシウムおよび固体のポリエチレ
ングリコール、または上の（a）〜（i）に記載した物質
の混合物。

【００３０】錠剤、被覆された錠剤、カプセル剤、ピル
および顆粒剤は、普通の被膜および外殻を含有すること
ができ、これらは不透明化剤を含むことができ、そし
て、また、活性化合物の１種または２種以上のみを、あ
るいは優先的に、腸管の特定の部分において、必要に応
じて遅延した方法で、放出するような組成物であること
ができ、ここで使用できる埋め込み組成物の例はポリマ
ー物質およびワックスである。

【００３１】活性化合物の１種または２種以上は、必要
に応じて前述の賦形剤の１種または２種以上と一緒に、
マイクロカプセル化した形態にすることもできる。

【００３２】坐薬は、活性化合物の１種または２種以上
に加えて、普通の水溶性または水不溶性の賦形剤、例え
ば、ポリエチレングリコール、脂肪、例えば、カカオ脂
肪、高級エステル、（例えば、Ｃ₁₄ーアルコールとＣ₁₆
ー脂肪酸とのエステル）またはこれらの物質の混合物を
含有することができる。

【００３３】軟膏、泥膏、クリームおよびゲルは、活性
化合物の１種または２種以上に加えて、普通の賦形剤、
例えば、動物性および植物性の脂肪、ワックス、パラフ
ィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエ
チレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリ
カ、タルクおよび酸化亜鉛またはこれらの混合物を含有
することができる。

【００３４】散剤およびスプレーは、活性化合物の１種
または２種以上に加えて、普通の賦形剤、例えば、ラク
トース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸
カルシウムおよびポリアミド粉末またはこれらの物質の
混合物を含有することができる。スプレーは、慣用の噴
射剤、例えば、クロロフルオロ炭化水素をさらに含有す
ることができる。

【００３５】溶液および乳濁液は、活性化合物の１種ま
たは２種以上に加えて、慣用の賦形剤、例えば、溶媒、
可溶化剤および乳化剤、例えば、水、エチルアルコー
ル、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチ
ル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレ
ングリコール、１，３ーブチレングリコール、ジメチル
ホルムアミド、油、ことに綿実油、落花生油、トウモロ
コシ胚油、オリーブ油、ヒマシ油およびごま油、グリセ
ロール、グリセロールホルマール、テトラヒドロフルフ
リルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビ
タンの脂肪酸エステル、またはこれらの混合物を含有す
ることができる。

【００３６】非経口的投与のために、溶液および乳濁液
は、また、血液と等張性の無菌の形態にすることができ
る。

【００３７】懸濁液は、活性化合物の１種または２種以
上に加えて、慣用の賦形剤、例えば、液状希釈剤、例え
ば、水、エチルアルコールまたはプロピレングリコー
ル、懸濁剤、例えば、エトキシル化イソステアリルアル
コール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビ
タンのエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アル
ミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ま
たはこれらに混合物を含有することができる。

【００３８】前述の配合形態は、また、染料、防腐剤お
よび、芳香および風味を改良する添加剤、例えば、ペパ
ーミント油およびユーカリ油、および甘味剤、例えば、
サッカリンを含有することができる。

【００３９】治療学的に活性な化合物は、好ましくは、
前述の製薬学的調製物中に、全混合物の約０．１〜９
９．５重量％、好ましくは約０．５〜９５重量％の量で
存在する。

【００４０】前述の製薬学的調製物は、また、本発明に
よる化合物に加えて、他の製薬学的に活性な化合物を含
有することができる。

【００４１】前述の製薬学的調製物は、既知の方法に従
い通常の方法で、活性化合物の１種または２種以上を賦
形剤の１種または２種以上と混合することによってつく
られる。

【００４２】活性化合物または製薬学的調製物は、局所
的、経口的、非経口的、腹腔内および／または経直腸的
に、好ましくは経口的または非経口的に、例えば、静脈
内または筋肉内に投与することができる。

【００４３】一般に、人間の医学および獣医学におい
て、所望の結果を得るためには、本発明による活性化合
物の１種または２種以上を２４時間毎に約０．５〜約５
００mg／kg体重、好ましくは５〜１００mg／kg体重の合
計量で、適当ならば数回に分けて投与することが有利で
あることがわかった。個々の投薬物は、好ましくは、本
発明による活性化合物の１種または２種以上を約１〜約
２５０mg／kg体重、とくに３〜６０mg／kg体重の量で含
有する。しかしながら、前述の投薬量からはずれなけれ
ばならないことがあり、特にそのことは処置すべき患者
の性質および体重、病気の性質および重さ、調製物の性
質および薬剤の投与方法、投与を行う時間または間隔に
依存する。

【００４４】かくして、ある場合には、活性化合物は前
述の量よりも少量で十分であり、一方他の場合には前記
量を超えなければならない場合も起こるであろう。必要
な特定の最適な投与量および活性化合物の投与方法は、
この分野に精通するものにとっては、その専門知識に基
づき容易に決定することができる。

【００４５】ＰＳＴＩは膵臓から単離することができる
が、ことにヒト起源のこのようなＰＳＴＩは大量に入手
することができない。

【００４６】したがって、組換えＤＮＡおよび関連する
技術は、必要な大量の高品質のh−ＰＳＴＩおよびこの
ようなペプチドの変異型を得る有効な方法であろうこと
が考えられた。組換えバクテリア中の異質蛋白質の生成
は、多くの場合に見出される既知の不安定性に照して簡
単なことではない［Ｂ．Ｅ．バターワース（Ｂutterwor
th）およびＢ．Ｄ．コバント（Ｋovant）：Ｊ．Ｖiro
l.、１４、（１９８４）、２８２−２９１、Ｄ．Ｖ．ゲ
ッデル（Ｇoeddel）ら：プロシーディングス・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐroc．
Ｎatn．Ａcad．Ｓci.）ＵＳＡ、７６、（１９７９）、
１０６−１１０、Ｍ．イノウエ（Ｉnoye）ら、「核酸の
研究における将来（Ｔhe future in nucreic acid
research）」、Ｉ．ワタナベ（Ｗatanabe）編、（東
京、アカデミック・プレス）、（１９８３）］。不安定
性は、とくに、比較的短い鎖長を有するペプチドの発現
において問題である。

【００４７】ヒト膵臓はＰＳＴＩ、すなわち、低分子量
（６．２kb）のプロテアーゼ阻害剤を分泌し、このＰＳ
ＴＩはトリプシンを特異的に阻害する、すなわち、それ
はプロテアーゼの１つのタイプに対して高い選択性を有
する。

【００４８】本発明において提供される１つの利点は、
ＰＳＴＩ中の１つ（または数個）のアミノ酸のみを組換
えＤＮＡ技術によって置換してＰＳＴＩ変異型を生成す
ることにあり、これらの変異型は白血球エラスターゼに
対して高い特異性を有する、高度に有効なプロテアーゼ
阻害剤であることが示された。その上、その低い分子量
のため、エラスターゼＰＳＴＩ誘導複合体は腎臓をさら
によく通過するであろう。したがって、細胞外に放出さ
れたエラスターゼの排除は高度に効率的であろう。ＰＳ
ＴＩがヒト起源であるという事実は、その低い分子量と
一緒になって、ＰＳＴＩ誘導体を異質蛋白質として免疫
系が認識することによる合併症を、これらの誘導体の適
用は回避するであろうと期待される。

【００４９】α₁−ＰＩおよび抗白血球プロテアーゼ類
と比較したＰＳＴＩの他の本質的な利点は、強い酸化剤
が生成さかつ細胞外に放出される、炎症の過程の間にお
ける、酸化的不活性化に対してＰＳＴＩが不感受性であ
るということである。結局、α₁−ＰＩおよび抗白血球
プロテアーゼ類に比較して、ＰＳＴＩ誘導体類の低い投
与量は、同様な保護的作用を達成するために十分であろ
う。

【００５０】遺伝子の配列 h−ＰＳＴＩのアミノ酸配列は、高度に発現された大腸
菌（以後、Ｅ．coli）遺伝子中に最も頻繁に見出される
コドンを使用して、ＤＮＡマスター遺伝子の配列に逆翻
訳された［グウウイ（Ｇouy）、Ｍ．およびガウチアー
（Ｇautier）、Ｃ．、（１９８２）、Ｎucl．Ａcids
Ｒes．図１参照。ＰＳＴＩ変異型のアミノ酸置換（表
１）のため、対応するコドンをマスター遺伝子において
交換した（下表２参照）。

【００５１】表２において星印を付したコドンを、次の
例外を除いて、全体を通じて使用した： Ｔhr ２６ すべての遺伝子において、位置７２〜７７においてＫpnＩ部位を （ＡＣＣ） つくるため。

【００５２】 Ｌys １８ ＰＳＴＩ−０および−１０において、位置５３〜５８においてＢ （ＡＡＧ） ｇlＩＩ部位をつくるため。

【００５３】 Ｇly ２８ ＰＳＴＩ−２、−１０、−１９および−２０において、対応する （ＧＧＣ） オリゴヌクレオチドの断片の適切なハイブリダイゼーションを達 成するため（下を参照）。

【００５４】 Ｐro １７ ＰＳＴＩ １１において、位置５１〜５６においてＸbaＩ部位 (ＣＣＴ)＋ をつくるため。

【００５５】 Ｌeu １８ （ＣＴＡ） 遺伝子の５’末端 第１コドン、ＨincＩＩ部位の第２半分ＧＴＰyＰuＡＣを を含む。

【００５６】 遺伝子の３’末端 停止コドンＴＧＡ、ＥcoＲＩ部位（位置１７０〜１７５） および引続くＨindＩＩＩ位Ｉ部位（位置１７６〜１８１) およびＮcoＩ接着末端(位置１８２〜１８６)と重複する。

【００５７】

【表１】

【００５８】簡単に、ＰＳＴＩ遺伝子の構成は次の通り
である： １、２５の短いオリゴヌクレオチド（各相補的鎖について、それぞれ１２およ び１３）の合成 ２ ・・・・・・ ２２ ２４ ・・・・ １ ３ ２３ ２５ ここである変 異型について特定の断片を合成した（下表３を参照）。イオン交換高性能液体ク ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による正しい大きさの断片の精製。

【００５９】２、断片の結合は、成熟ＰＳＴＩ（アミノ
酸１〜５６）のための解読領域のために二本鎖の分子を
与え、ここで成熟ＰＳＴＩはアミノ末端の解読末端に
「平滑」末端およびカルボキシ末端の解読末端にＧＡＴ
Ｃの一本鎖５’延長テイルを有する。この工程のため、
誤った生成物を最小にするために、合成すべきオリゴヌ
クレオチドの配列を最適化することが重要であった。

【００６０】３、種々のベクター、例えば、pＵＣ８、p
ＧＶ４５１、Ｍ１３mp１８中における配列決定のための
クローニング（方法のテキストを参照）。

【００６１】４、特定の合成オリゴヌクレオチドを使用
するＭ１３ファージのベクター中の一本鎖突然変異誘発
による、それ以上の変異型の生成。

【００６２】表３ 番号の意味 第１カラム 断片の番号（図１参照）。

【００６３】第２および３カラム マスター遺伝子内
の断片の最初および最後のヌクレオチドの位置（５’→
３’）。

【００６４】第４カラム 断片のヌクレオチ
ド配列（５’→３’）。

【００６５】点は、マスター遺伝子の配列と異なりかつ
遺伝子の変異型の構成に要求される断片を示す。

【００６６】PSTI 0 （セグメントＩ）−マスター遺伝
子 断片１〜１１のリスト： 1 7 1 GAGAGTC 2 1 13 GACTCTCTGGGTC 3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA 4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC 5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT 6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG 7 54 40 CTTAGTGCAACCGTT 8 48 60 CACTAAGATCTAC 9 66 55 CGGGTTGTAGAT 10 61 74 AACCCGGTTTGCGG 11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC PSTI−0(セグメントII)−マスター遺伝子 断片１２〜２５のリスト： 12 75 89 TACCGACGGTGACAC 13 97 82 TCGGGTAAGTGTCACC 14 90 105 TTACCCGAACGAATGC 15 113 98 CACAGAACGCATTCGT 16 106 121 GTTCTGTGCTTCGAAA 17 129 114 TTTACGGTTTTCGAAG 18 122 137 ACCGTAAACGTCAGAC 19 145 130 GGATAGAAGTCTGACG 20 138 152 TTCTATCCTGATCCA 21 160 146 CAGATTTCTGGATCA 22 153 167 GAAATCTGGTCCGTG 23 174 161 AATTCAGCACGGAC 24 168 182 CTGAATTCAAGCTTC 25 186 175 CATGGAAGCTTG PSTI 1（セグメントI) 断片１〜１１のリスト： 1 7 1 GAGAGTC 2 1 13 GACTCTCTGGGTC 3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA 4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC 5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT 6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG ・7 54 40 CAGAGTGCAACCGTT ・8 48 60 CACTCTGATCTAC 9 66 55 CGGGTTGTAGAT 10 61 74 AACCCGGTTTGCGG 11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC PSTI 2(セグメントI) 断片１〜１１のリスト： 1 7 1 GAGAGTC 2 1 13 GACTCTCTGGGTC 3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA 4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC 5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT 6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG ・7 54 40 CAGAGTGCAACCGTT ・8 48 60 CACTCTGATCTAC ・9 66 55 CGGGTCGTAGAT ・10 61 74 GACCCGGTTTGCGG 11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC PSTI 3(セグメントI) 断片１〜１１のリスト： 1 7 1 GAGAGTC 2 1 13 GACTCTCTGGGTC 3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA 4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC 5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT 6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG ・7 54 40 GTAAGTGCAACCGTT ・8 48 60 CACTTACGAATAC ・9 66 55 CGGACGGTATTC ・10 61 74 CGTCCGGTTTGCGG 11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC PSTI 4(セグメントI) 断片１〜１１のリスト： 1 7 1 GAGAGTC 2 1 13 GACTCTCTGGGTC 3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA 4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC 5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT 6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG ・7 54 40 CAGAGTGCAACCGTT ・8 48 60 CACTCTGGAATAC ・9 66 55 CGGACGGTATTC ・10 61 74 CGTCCGGTTTGCGG 11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC PSTI 5(セグメントI) 断片１〜１１のリスト： 1 7 1 GAGAGTC 2 1 13 GACTCTCTGGGTC 3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA 4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC 5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT 6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG ・7 54 40 AACAGTGCAACCGTT ・8 48 60 CACTGTTGAATAC ・9 66 55 CGGACGGTATTC ・10 61 74 CGTCCGGTTTGCGG 11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC PSTI 6(セグメントI) 断片１〜１１のリスト： 1 7 1 GAGAGTC 2 1 13 GACTCTCTGGGTC 3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA 4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC 5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT 6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG ・7 54 40 CAGAGTGCAACCGTT ・8 48 60 CACTCTGGAATAC ・9 66 55 CGGGTTGTATTC 10 61 74 AACCCGGTTTGCGG 11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC PSTI 7(セグメントI) 断片１〜１１のリスト： 1 7 1 GAGAGTC 2 1 13 GACTCTCTGGGTC 3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA 4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC 5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT 6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG ・7 54 40 CAGAGTGCAACCGTT ・8 48 60 CACTCTGATCTAC ・9 66 55 CGGACGGTAGAT ・10 61 74 CGTCCGGTTTGCGG 11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC PSTI 13(セグメントI) 断片１〜１１のリスト： 1 7 1 GAGAGTC 2 1 13 GACTCTCTGGGTC 3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA 4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC 5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT 6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG ・7 54 40 GATAGTGCAACCGTT ・8 48 60 CACTATCGAATAC ・9 66 55 CGGGTTGTATTC 10 61 74 AACCCGGTTTGCGG 11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC PSTI 14(セグメントI) 断片１〜１１のリスト： 1 7 1 GAGAGTC 2 1 13 GACTCTCTGGGTC 3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA 4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC 5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT 6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG ・7 54 40 ACGAGTGCAACCGTT ・8 48 60 CACTCGTGAATAC ・9 66 55 CGGGTTGTATTC 10 61 74 AACCCGGTTTGCGG 11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC PSTI 15(セグメントI) 断片１〜１１のリスト： 1 7 1 GAGAGTC 2 1 13 GACTCTCTGGGTC 3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA 4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC 5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT 6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG ・7 54 40 GAAAGTGCAACCGTT ・8 48 60 CACTTTCGAATAC ・9 66 55 CGGGTTGTATTC 10 61 74 AACCCGGTTTGCGG 11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC PSTI 16(セグメントI) 断片１〜１１のリスト： 1 7 1 GAGAGTC 2 1 13 GACTCTCTGGGTC 3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA 4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC 5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT 6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG ・7 54 40 AGCAGTGCAACCGTT ・8 48 60 CACTGCTGAATAC ・9 66 55 CGGGTTGTATTC 10 61 74 AACCCGGTTTGCGG 11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC PSTI 17(セグメントI) 断片１〜１１のリスト： 1 7 1 GAGAGTC 2 1 13 GACTCTCTGGGTC 3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA 4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC 5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT 6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG ・7 54 40 AACAGTGCAACCGTT ・8 48 60 CACTGTTATCTAC 9 66 55 CGGGTTGTAGAT 10 61 74 AACCCGGTTTGCGG 11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC PSTI 18(セグメントI) 断片１〜１１のリスト： 1 7 1 GAGAGTC 2 1 13 GACTCTCTGGGTC 3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA 4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC 5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT 6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG ・7 54 40 GATAGTGCAACCGTT ・8 48 60 CACTATCATCTAC 9 66 55 CGGGTTGTAGAT 10 61 74 AACCCGGTTTGCGG 11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC PSTI 19(セグメントI) 断片１〜１１のリスト： 1 7 1 GAGAGTC 2 1 13 GACTCTCTGGGTC 3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA 4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC 5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT 6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG ・7 54 40 AACAGTGCAACCGTT ・8 48 60 CACTGTTATCTAC ・9 66 55 CGGGTCGTAGAT ・10 61 74 GACCCGGTTTGCGG 11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC PSTI 20(セグメントI) 断片１〜１１のリスト： 1 7 1 GAGAGTC 2 1 13 GACTCTCTGGGTC 3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA 4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC 5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT 6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG ・7 54 40 GATAGTGCAACCGTT ・8 48 60 CACTATCATCTAC ・9 66 55 CGGGTCGTAGAT ・10 61 74 GACCCGGTTTGCGG 11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC PSTI‐A(セグメントII) 断片１２〜２５のリスト： 12 75 89 TACCGACGGTGACAC ・13 97 82 TAGCGTAAGTGTCACC ・14 90 105 TTACGCTAACGAATGC 15 113 98 CACAGAACGCATTCGT 16 106 121 GTTCTGTGCTTCGAAA 17 129 114 TTTACGGTTTTCGAAG 18 122 137 ACCGTAAACGTCAGAC 19 145 130 GGATAGAAGTCTGACG 20 138 152 TTCTATCCTGATCCA 21 160 146 CAGATTTCTGGATCA 22 153 167 GAAATCTGGTCCGTG 23 174 161 AATTCAGCACGGAC 24 168 182 CTGAATTCAAGCTTC 25 186 175 CATGGAAGCTTG PSTI‐S(セグメントII) 断片１２〜２５のリスト： 12 75 89 TACCGACGGTGACAC ・13 97 82 TAGAGTAAGTGTCACC ・14 90 105 TTACTCTAACGAATGC 15 113 98 CACAGAACGCATTCGT 16 106 121 GTTCTGTGCTTCGAAA 17 129 114 TTTACGGTTTTCGAAG 18 122 137 ACCGTAAACGTCAGAC 19 145 130 GGATAGAAGTCTGACG 20 138 152 TTCTATCCTGATCCA 21 160 146 CAGATTTCTGGATCA 22 153 167 GAAATCTGGTCCGTG 23 174 161 AATTCAGCACGGAC 24 168 182 CTGAATTCAAGCTTC 25 186 175 CATGGAAGCTTG PSTI 2,10,19および20（セグメントII） 断片１２〜２５のリスト： ・12 75 89 TACCGACGGCAACAC ・13 97 82 TCGGGTAAGTGTTGCC 14 90 105 TTACCCGAACGAATGC 15 113 98 CACAGAACGCATTCGT 16 106 121 GTTCTGTGCTTCGAAA 17 129 114 TTTACGGTTTTCGAAG 18 122 137 ACCGTAAACGTCAGAC 19 145 130 GGATAGAAGTCTGACG 20 138 152 TTCTATCCTGATCCA 21 160 146 CAGATTTCTGGATCA 22 153 167 GAAATCTGGTCCGTG 23 174 161 AATTCAAGCACGGAC 24 168 182 CTGAATTCAAGCTTC 25 186 175 CATGGAAGCTTG PSTI 21(セグメントI) 断片１から１１のリスト： 1 7 1 GAGAGTC 2 1 13 GACTCTCTGGGTC 3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA 4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC 5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT 6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG ・7 54 40 GATAGTGCAACCGTT ・8 48 60 CACTATCGAATGC ・9 66 55 CGGACGGTATTC ・10 61 74 CGTCCGGTTTGCGG 11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC PSTI 22(セグメントI) 断片１から１１のリスト： 1 7 1 GAGAGTC 2 1 13 GACTCTCTGGGTC 3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA 4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC 5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT 6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG ・7 54 40 GTAAGTGCAACCGTT ・8 48 60 CACTTACATCTAC 9 66 55 CGGGTTGTAGAT 10 61 74 AACCCGGTTTGCGG 11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC PSTI 23(セグメントI) 断片１から１１のリスト： 1 7 1 GAGAGTC 2 1 13 GACTCTCTGGGTC 3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA 4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC 5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT 6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG ・7 54 40 GAAAGTGCAACCGTT ・8 48 60 CACTTTCATCTAC 9 66 55 CGGGTTGTAGAT 10 61 74 AACCCGGTTTGCGG 11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC PSTI 24(セグメントI） 断片１から１１のリスト： 1 7 1 GAGAGTC 2 1 13 GACTCTCTGGGTC 3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA 4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC 5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT 6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG ・7 54 40 TTTAGTGCAACCGTT ・8 48 60 CACTAAAGAATAC ・9 66 55 CGGACGGTATTC ・10 61 74 CGTCCGGTTTGCGG 11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC

【００６７】

【実施例】遺伝子の構築 設計した遺伝子の配列はオリゴヌクレオチド断片に分割
された（図１）。これらの断片は、多成分反応において
ＤＮＡ二本鎖の正しい酵素的アセブリーを可能とする特
有の重複を有する。

【００６８】ＰＳＴＩ遺伝子変異型の構築のために基本
的計画は、遺伝子の２つのセグメントの別々のアセンブ
リーを包含する：断片１〜１１からのセグメントＩ、可
変アミノ酸位置１７〜２１を包含する。

【００６９】断片１２〜２５からのセグメントＩＩ、可
変アミノ酸位置２９および３２を包含する。

【００７０】表３は、異なるセグメントＩおよびＩＩを
アセンブリングするために使用するオリゴヌクレオチド
の断片の組み合わせを示す。点はマスター遺伝子の断片
と異なる断片を示す。

【００７１】セグメントＩおよびＩＩの対応する対の酵
素的結合は、所望の完全な遺伝子変異型を生成するであ
ろう。遺伝子のマルチマー（multimer）は、また、セグ
メントＩの５'−末端における平滑末端の結合およびセ
グメントＩＩの３'−末端における粘着末端の結合を許
すことによって、最初に生成した。モノマーの遺伝子
は、マルチマーから、ＨincＩＩおよびＨindＩＩＩ、Ｅ
coＲＩまたはＮcoＩで切断することによって切除した。

【００７２】方法 オリゴヌクレオチド断片の化学的合成 すべての必要なオリゴデオキシヌクレオチドは、確立さ
れたホスホトリエステル化学によりセグメントの支持体
としてセルロースのディスク上で合成した［フランク
（Ｆrank）ら（１９８３）Ｎucl．Ａcids Ｒes.、１
１、（４３６５−４３７７）］。オリゴデオキシヌクレ
オチドは、ワットマン・パーチシル（Ｗhatman Ｐarti
sil）ＳＡＸ−１０カラムのイオン交換ＨＰＬＣによ
り、６０％の水性ホルムアルデヒド中のリン酸トリエチ
ルアンモニウム（pＨ６.３）の勾配を用いて精製した。

【００７３】オリゴヌクレオチドのセグメントＩおよび
ＩＩのＤＮＡ二本鎖へのオリゴヌクレオチドの結合 等モル量（５０ピコモル）の各オリゴヌクレオチド断片
（表３参照）をシリコーン化プラスチック管中で一緒に
した(管Ａ:上の鎖からなる断片；管Ｂ：下の鎖からなる
断片）。断片１および１１、ならびにホスホリル化しな
いであろう断片１２および２５を別の管（管Ｃ）中で一
緒にした。この物質を乾燥した。管ＡおよびＢのオリゴ
ヌクレオチドを、３倍過剰量の［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ（約
２Ｃi／ミリモル）で５'−ヒドロキシ末端において、６
０ミリモル濃度のトリス・ＨＣl（pＨ８）、６ミリモル
濃度のＭgＣl₂、１０ミリモル濃度のＤＴＥおよび２単
位のＴ４ ＰＮＫを含有する１０μlの反応混合物中
で、３７℃において３０分間ホスホリル化した。定量的
ホスホリル化後、Ｔ４ ＰＮＫを管ＡおよびＢを９５℃
に２分間加熱することによって不活性化し、そして内容
物を管Ｃに移した。１０ミリモル濃度のＤＴＥ、０.２
ミリモル濃度のＡＴＰおよび２単位のＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼを添加し、そしてこの混合物を４０℃で１時間イン
キュベーションした。３７℃に冷却後、さらに２単位の
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを添加し、そしてインキュベーシ
ョンを３７℃で１時間、３０℃で３時間そして１５℃で
一夜続けた。次いで、この混合物のアリコートを、０.
０４×２０×４０cmの１０％の非変性ポリアクリルアミ
ドゲル［アクリルアミド：メチレン−ビスアクリルアミ
ド−２９：１、５０ミリモル濃度のトリス・ボレート
（pＨ８.３）、１ミリモル濃度ＥＤＴＡ］の電気泳動に
より精製し、ここで２５℃にサーモスタット制御し、１
０００Ｖにおいて、ＢＰＢが２５cm動くまで展開した。
ゲル電気泳動のための試料は、０.０５％のＸＣ、０.０
５％のＢＰＢ、１０ミリモル濃度のＥＤＴＡおよび４モ
ル濃度の尿素を含有する混合物中の配合し、そして装入
前に加熱しなかった。ゲル電気泳動からの結果が期待す
る長さの生成物を生成するまで、もとの反応混合物を−
２０℃で貯蔵した。

【００７４】次いで、ＤＮＡリガーゼを６５℃に１５分
間加熱することによって不活性化した。結合生成物は、
反応混合物から、厚さ１mmのゲルの調製用ゲル電気泳動
によって上の条件下で単離した。

【００７５】完全ＰＳＴＩ遺伝子変異型のアセンブリー １０ピコモルの対応するセグメントＩおよびＩＩのＤＮ
Ａを一緒にし、そして６０ピコモルの［γ−³²Ｐ］ＡＴ
Ｐ（２００Ｃi／ミリモル）、６０ミリモル濃度のトリ
ス・ＨＣl（pＨ８）、６ミリモル濃度のＭgＣl₂、１０
ミリモル濃度のＤＴＥおよび２単位のＴ４ ＰＮＫを含
有する２０μlの反応混合物中で３７℃で３０分間ホス
ホリル化した。次いで、２μlの１ミリモル濃度のＡＴ
Ｐおよび２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、次いで
１５℃で一夜インキュベーションした。次いで、この混
合物を、制限酵素による硝化に適切な緩衝条件に調節す
ることによって、５０μlに希釈した。

【００７６】例えば、ＰＳＴＩの遺伝子変異型ＰＳＴＩ
−１−Ａla−３２（−１Ａ）、ＰＳＴＩ ３−Ｐro−３
２−（−３Ｐ）、ＰＳＴＩ ６−Ｓer−３２（−４Ａ）
およびＰＳＴＩ ５−Ｐro−３２（５Ｐ）を上のプロト
コールに従って構成した。

【００７７】ＰＳＴＩ変異型遺伝子のクローニング計画 遺伝子は、前述のように、アミノ酸１７、１８、１９、
２０、２１、２９および３２をコードする各位置におい
て種々の配列を有する合成遺伝子断片から合成を開始し
た。名称ＰＳＴＩ−０〜ＰＳＴＩ−２４（表１参照）
は、アミノ酸１７〜２１、および引続く位置３２におけ
るＡ（アラニンについて）、Ｓ（セリンについて）、Ｇ
（グリシンについて）、またはＰ（プロリンについて）
の領域のための特定の解読配列を意味する。

【００７８】遺伝子の構築は、セグメントＩにおける変
異型がセグメントＩＩにおける変異型（例えば、位置３
２における変異型）と、位置７２〜７６におけるＫpnＩ
部位の開裂後、再結合できるように計画を立てる（図
１）。

【００７９】それ以上の変異型は、合成オリゴヌクレオ
チドを使用する、Ｍ１３ mp−一本鎖バクテリオファー
ジ中でクローニングした遺伝子断片上の部位特異的突然
変異誘発によってつくるか、あるいは前述のように全体
の遺伝子の合成によってつくる。

【００８０】クローニング ５'−末端にフラッシュエンド（flush end）（アミノ
末端解読末端）および３'−末端にＨindＩＩＩ部位を有
するＰＳＴＩ−変異型（例えば、ＰＳＴＩ−１Ａおよび
ＰＳＴＩ−３Ｐ）のための遺伝子を、ＨincＩＩ、Ｈind
ＩＩＩ制限プラスミドpＵＣ８（pＵＣ−ＰＳＴＩ−１Ａ
およびpＵＣ−ＰＳＴＩ−３Ｐ）中にクローニングし
た。

【００８１】追加のメチオニンをＮＨ₂−末端に含有す
るＰＳＴＩ変異型（例えば、Ｍet^-1−ＰＳＴＩ−４Ａ）
を、同様にpＵＣ８−ＮcoＩ（ＨincＩＩ部位中に導入さ
れたＮcoＩ−リンカーＣＣＣＡＴＧＧＧを含有する）中
にクローニングした。pＵＣ８−ＮcoＩをＮcoＩで制限
し、ＤＮＡ Ｐo１Ｉ（大きい断片）の存在下にdＮＴＰ
で充填し、そしてさらにＨindＩＩＩで制限した。ＰＳ
ＴＩ−４Ａ変異型の遺伝子をこのベクター中にクローニ
ングすることによって、ＮcoＩ制限部位を再構成する
（pＵＣ−Ｍet−ＰＳＴＩ−４Ａ）。制限酵素の開裂（c
leavage）、結合、形質転換およびβ−ガラクトシダー
ゼ活性の「挿入不活性化」についてのスクリーニング
は、マニアチス（Ｍaniatis）、Ｔ.、フリトシ（Ｆritsc
h）、Ｅ．Ｇ．およびサムブルック（Ｓambrook）、Ｊ.、
分子クローニング（Ｍolecular Ｃloning）、コールド
・スプリング・ハーバー・パブリケイションズ（Ｃold
Ｓpring Ｈarbor Ｐublications）、コールド・ス
プリング・ハーバー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor）、１９
８２に記載されている。

【００８２】組換えによる追加の変異型の調製 制限エンドヌクレアーゼＫpnＩは、すべての構築物のＰ
ＳＴＩ遺伝子を上の鎖上の塩基７６後および下の鎖上の
塩基７２後において開裂して、４bpの一本鎖の３'−突
起（protruding）末端（ＧＴＡＣ）を生成する。

【００８３】pＵＣ８−ＰＳＴＩ雑種のＫpnＩ、ＳcaＩ
の二重の開裂後、２つのＰ断片が得られ、一方の断片は
アミノ酸残基１７〜２１の変異型配列をもつ遺伝子の
５'−末端を含有し、そして他方の断片はアミノ酸２９
および３２中に変異型を有する遺伝子の３'−末端を含
有する。異なるプラスミドからの断片の再結合は、再分
類された（reassorted）５'および３'の両者を有する新
規な組換えpＵＣ８−ＰＳＴＩ変異型を生成する（例え
ば、ＰＳＴＩ ０ＰおよびＰＳＴＩ−１Ａから出発し
て、ＰＳＴＩ ０ＡおよびＰＳＴＩ-１Ｐを誘導でき
る)。大腸菌（Ｅscherichia coli）Ｋ−１２菌株△Ｍ
１５およびＤＨ １を、再配置されたpＵＣ８−ＰＳＴ
Ｉ変異型のための受容宿主として使用した（参照ＡＴＣ
Ｃ ３１３４３および３３６２５)。

【００８４】部位特異的突然変異誘発による追加の変異
型の調製 この突然変異誘発手順のための出発物質はＭ１３ mp９
−ＰＳＴＩクローンであり、このクローンはpＵＣ８−
ＰＳＴＩ変異型からのＨincＩＩ−ＨindＩＩＩＰＳＴＩ
−断片を、メッシング（Ｍessing）、Ｊおよびビエラ
（Ｖiera）、Ｊ（１９８２）、Ｇene、１９、２６９−
２７６の方法に従い、二本鎖Ｍ１３ mp９バクテリオフ
ァージ中にクローニングすることによってつくる。一本
鎖の雑種バクテリオファージを分離し、そしてバクテリ
オファージＭ１３ mp９ revの線状のネガティブ鎖に
対して交雑した。次いで、突然変異誘発部位に新しい変
異型の配列を含有する合成オリゴヌクレオチドを、この
いわゆる「グラップド・デュープレックス（grapped d
uplex）」に対して交雑し、そしてポリメラーゼＩ［ク
レノー断片、ベーリンガー・マンハイム（Ｂoehringer
Ｍannheim）］およびＤＮＡリガーゼを連続的に作用
させることによって、充填および結合して、突然変異誘
発部位に塩基の不一致を含有する閉じた円形二重らせん
を形成する。不適性塩基対の修復の欠損Ｅ．coli Ｍut
Ｓ菌株ＢＭＨ７１−１８中へのこのＤＮＡの形質転換
は、合成「突然変異誘発プライマー」によって決定され
る新しい配列を含有するＭ１３ mp９ rev−ＰＳＴＩ
変異型を高い頻度で生成し、それらは引続いてＥ．coli
sa^-［アンバーサプレッサー（amber suppressor）^-
マイナス］菌株ＭＫ３０−３中で選択する。実験のプロ
トコールはクラマー（Ｋramer）、Ｗ．ら、Ｎucl．Ａci
ds Ｒes.、１２（１９８４）に記載されるものに従
う。このようにして、ＰＳＴＩ−８Ｐ、−９Ｐ、−１０
Ｐ、−１１Ｐ、−１２Ｐ、−１５Ｐ、−１７Ｐ、−１８
Ｐおよび−１９Ｐが構築された。

【００８５】ＤＮＡ−配列決定 ＤＮＡの配列決定は、一本鎖のＭ１３ mp８、Ｍ１３
mp９、Ｍ１３ mp１８、Ｍ１３ mp９（rev）−ＰＳＴ
Ｉ分子について、サンガー（Ｓanger）、Ｆ.ら（１９７
７）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシズ（Ｐroc．Ｎatn．Ａcad．Ｓc
i.）ＵＳＡ、７６、５４６３−５４６７に記載されてい
るデオキシ法に従い実施し、あるいはpＧＶ４５１の構
築について、ボカート（Ｖockaert）Ｇ.ら、（１９８
４）、Ｇene Ａnalysis Ｔechniques、１、５２−５
９の特異的末端−標識および化学的劣化法に従い実施し
た。発現ベクター中のクローニング ＰＳＴＩ変異型ペプチドの生成は、α−アミラーゼ
（Ｂ．subtilis）またはペニシリンアシラーゼ（Ｅ．co
li）のシグナル配列を含有するＥ．coli分泌ベクター中
にクローニングすることによって達成した。ＰＳＴＩに
類似するヒト分泌ペプチドの発現のためにＥ．coli分泌
ベクターを使用すると、融合したシグナルペプチドは遺
伝子生成物を細胞質膜を横切って細胞形質空間中に導
き、同時にシグナルペプチドを処理し［Ｇ．クレイル
(Ｋreil)、（１９８１)、Ａnn．Ｒev．Ｂiochem.、５
０、３１７−３４８］かつ活性ＰＳＴＩを、その成熟形
態で、あるいはそのアミノ末端に数個のアミノ酸のリン
カーペプチドを含有する融合生成物として、放出すると
いう、利点が得られる。

【００８６】制限酵素開裂の方法：ＤＮＡ pol １
（大きい断片）の存在下のdＮＴＰによる５'突起末端の
充填、Ｓ₁ヌクレアーゼによる消化、ＤＮＡのゲル電気
泳動、ＤＮＡ断片の分離、結合および形質転換は、Ｔ．
マニアチス（Ｍaniatis）ら、分子クローニング（Ｍole
cular Ｃloning）、コールド・スプリング・ハーバー
（Ｃold Ｓpring Ｈarbor）、（１９８２）に記載さ
れている。

【００８７】α−アミラーゼ分泌ベクターpＣＨ ２３
３およびpＣＨ ２３３１の構築 Ｂ．subtilisからのα−アミラーゼシグナル配列を、Ｂ
acillus subtilis ＤＳＭ ７０４［ドイチェ スタ
ンムスアンムルング・ヒュール・ミクロオルガニスメン
（Ｄeutsche Ｓtammsammlung fuer Ｍikroorganisme
n）、ゲッチンゲン］から、染色体ＤＮＡの部分的Ｓau
３Ａ消化物をpＭＫ ３のＢamＨＩ部位中にクローニン
グすることによって誘導した［Ｍ．Ａ．サリバン（Ｓul
livan）ら、Ｇene（１９８４）２９、２１−２６］。α
−アミラーゼ遺伝子をもつ３kbのＤＮＡ断片を含有する
クローンの１つを、α−アミラーゼの構造遺伝子の一部
を欠失してpＡＬＫ１を生成することによって改変し
た。pＡＬＫ１のＤＮＡ配列は、２３０bpのＥcoＲＩ−
ＢstＥＩＩ断片上に可能なリボソーム結合部位（ＲＢ
Ｓ）およびシグナル配列を明らかにし、Ｂ．subtilis
１Ａ２８９からのα−アミラーゼと広い範囲にわたって
相同性を示した［図２中のＤＮＡ配列とＭ．ヤング（Ｙ
ang）ら、Ｎucl．Ａcids Ｒes.（１９８３）、２３７
−２４９とを比較せよ］。Ｂ．subtilis中のα−アミラ
ーゼのシグナル配列の処理はアミノ酸位置４１において
起こることが期待された（図２参照）ので、シグナル配
列のＰＳＴＩリーディングフレームへの融合はＢstＥＩ
Ｉ部位において実施した。この目的で、われわれは、p
ＡＬＫ１から、可能なシャイン−ダルガノ（Ｓhine−Ｄ
algano）部位およびα−アミラーゼのシグナル配列を含
有する２３０bpの断片を単離した（図３のＡ中の断片
Ａ）。Ｍet−ＰＳＴＩ−１ＡまたはＭet−ＰＳＴＩ−４
Ａのいずれかのリーディングフレームを含有する断片Ｂ
を、pＵＣ−Ｍet−ＰＳＴＩ−１ＡまたはpＵＣ−Ｍet−
ＰＳＴＩ−４Ａから分離した（「ＰＳＴＩ変異型遺伝子
のクローニング」を参照）。断片Ａの平滑末端をＢの平
滑末端へ結合すると、α−アミラーゼのシグナル配列の
リーディングフレームはＭet−ＰＳＴＩ−１Ａまたは
（Ｍet−ＰＳＴＩ−４Ａ）のそれへ融合し、こによって
ＢstＥＩＩ−およびＮcoＩ−制限部位が再構築される
（図３のＢ参照）。lac zプロモーターに関してＡ−Ｂ
−断片の向きを補正する（図３のＡ）と、ＰＳＴＩ前駆
体の遺伝子はlac Ｚ^poの制御下にlac z'のリーディン
グフレームの背後に配置され、lacz'のリーディングフ
レームはＴＡＡ−停止コドンにおいて停止するであろう
（図２、断片ＡのＤＮＡ中の位置−５８／−５６）。同
一mＲＮＡ上の蛋白質合成の再開始は、リボソームが停
止コドンから約５０塩基下流のα−アミラーゼの可能な
シャイン−ダルガノ（Ｓhine−Ｄalgano）部位に位置−
１０において結合した後起こるであろう（図２参照）。

【００８８】pＣＨ ２３３（ＰＳＴＩ−１Ａ）またはp
ＣＨ ２３３１（ＰＳＴＩ−４Ａ）で形質転換したＥ．
coli △Ｍ１５からのＰＳＴＩ生成物は、蛋白質の精製
およびアミノ酸の配列決定後、１３アミノ酸がＰＳＴＩ
分子へ融合したことを明らかにした（実施例１および３
参照）。asn−−ala−glu−thr・・・・を使用して出発
したこれらの追加のアミノ酸は、図３のＢにおいてアミ
ノ酸３２から出発したα−アミラーゼのシグナル配列中
のものと同一であることが発見され、Ｅ．coliのシグナ
ルペプチドによるＰＳＴＩ前駆体のプロセッシングは、
バシルス（bacillus）α−アミラーゼのシグナル配列中
のアミノ酸配列・・・・pro−ala₂₉−ala−ala₃₁↓後に
起こることが示された。

【００８９】ペニシリンアシラーゼ分泌ベクターpＣＨ
２３６１、pＣＨ ２３６２、およびpＣＨ ２３６３の
構成 ＰＳＴＩ変異型の生成のためのそしてのシグナル配列
を、Ｅ．coliペニシリンアシラーゼ（ＰＥＮＡＣ）、
Ｅ．coli ＡＴＣＣ １１１０５由来のペリプラズム酵
素から誘導した。

【００９０】ペニシリンアシラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列
［Ｗ．ブルンス（Ｂruns）ら、（１９８５）、ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・アンド・アプライド・ジェネ
チックス（Ｊ．Ｍol．Ａppl．Ｇenet.）、３、３６−４
４］に従い、シャイン−ダルガノ（Ｓhine−Ｄalgano）
部位およびＰＥＮＡＣのシグナル配列を含有するＤＮＡ
断片を合成し、これを図４において配列の位置４０にお
けるシャイン−ダルガノ（Ｓhine−Ｄalgano）部位、Ｂ
cl Ｉ部位より上流にＥcoＲ Ｉ部位および下流にＥco
Ｒ Ｖ部位を導入することによって改変し、これによっ
てもとのＰＥＮＡＣシグナル配列のアミノ酸９をバリン
からメチオニンに変えた。Ｎhe Ｉ部位をアミノ酸２６
におけるＰＥＮＡＣシグナル配列のプロセッシング部位
に導入した。ＰＥＮＡＣ−ＤＮＡ断片を、ＰＳＴＩ遺伝
子について説明したように４つのＤＮＡ断片からアセン
ブリングし、そしてＥcoＲ ＩおよびＮhe Ｉで制限消化
したpＢＲ ３２２中にクローニングした（pＰＥＮＡＣ
１、図５）。ＤＮＡ断片パス（pass）１〜４のオリゴ
ヌクレオチドの合成は、アプライド・バイオシステムス
（Ａpplied Ｂiosystems）３８０型合成装置により製
造業者の指示に従い実施した。次いで、ＰＥＮＡＣシグ
ナル配列を、lac^poの制御下に、pＰＥＮＡＣ１からのＥ
coＲＩ−ＢamＨＩ断片をpＵＣ８中にクローニングする
ことによって動かした（pＵＣ２３６、図５）。

【００９１】ＰＳＴＩ−５Ｐ（pＣＨ ２３６１）の遺
伝子およびＰＳＴＩ−３Ｐ（pＣＨ２３６２）の遺伝子
をもつＰＥＮＡＣ発現ベクターを構築するため、pＣＨ
２３６をＮhe Ｉ部位制限処理し、そして修飾し（図
５参照）そしてさらにＨincＩＩＩで制限した。調製し
たpＣＨ ２３６中にＰＳＴＩ−５Ｐ（またはＰＳＴＩ
−３Ｐ）の遺伝子を結合すると、ＰＥＮＡＣシグナル配
列はＰＳＴＩリーディングフレームに融合し、発現ベク
ターpＣＨ ２３６１（またはpＣＨ ２３６２）が生成
する。再びここでpＣＨ ２３３について前述したよう
に、lac z'リーディングフレームはＰＥＮＡＣのシャ
イン−ダルガノ（Ｓhine−Ｄalgano）部位の前のＴＡＧ
コドンにおいて停止するであろう（位置７〜９、図
４）。

【００９２】Ｍet−ＰＳＴＩ−４Ａ（実施例４）を生成
するため、pＣＨ ２３６３を前述のようにpＣＨ ２３
６を調製することによって構成した。Ｍet−ＰＳＴＩ−
４Ａの遺伝子はpＵＣ−Ｍet−ＰＳＴＩ−４Ａから分離
した（図５）。

【００９３】pＣＨ ２３３、２３３１、２３６１、２
３６２および２３６３のＥ．coliＲＲ１ △Ｍ１５また
はＤＨ₁中への形質転換 標準の手順［Ｔ．マニアチス（Ｍaniatis）ら、１９８
２、分子クローニング（Ｍolecular Ｃloning）ning）
−ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌaboratory Ｍ
annual)；コールド・スプリング・ハーバー（Ｃold Ｓ
pring Ｈarbor）、ニューヨーク］を使用して、コンピ
テントＥ．coli ＤＨ １またはＲＲ１△Ｍ１５をpＣ
Ｈ ２３３、２３３１、２３６１−２３６３で形質転換
し、選択培地（５０μg／mlのアンピシリンを含む寒天
平板）上で平板培養し、微小調製（minipreparation）
し、そして単一コロニーからプラスミドＤＮＡを制限分
析した。遺伝子のセグメント中にあるいは発現ベクター
中に存在する制限部位についてスクリーニングした後、
挿入したＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を合成遺伝子について
前述したようにして決定した。

【００９４】pＣＨ ２３３、２３３１、２３６１、２
３６２および２３６３で形質転換したＥ．coli ＲＲ１
△Ｍ１５の発酵および誘発 △Ｍ１５形質転換pＣＨ ２３３、２３３１、２３６
１、２３６２および２３６３を一夜の培養として増殖し
た。この培地は蒸留水（pＨ７.０）中に３％に牛肉エキ
ス［ギブコ（Ｇibco）]、１.５％の酵母エキス（ギブ
コ）および０.５％のＫ₂ＨＰＯ₄および５０μg／mlのア
ンピシリンを含有した。１００mlの培地を充填した１０
００ml容のエルレンマイヤーフラスコ内で培養物をイン
キュベーションすることによって、良好な通気を達成す
るように注意した。

【００９５】フラスコをキューナー（Ｋuehner）ＲＣ−
６−Ｕ上で２８℃または３７℃および１９０rpmにおい
て振盪した。

【００９６】ＰＳＴＩ変異型を生成するため、一夜の培
養物を新鮮な媒質中に３７℃で１：１００に希釈し、そ
して１.５Ａ５５０nmの光学濃度に約３時間増殖した。
１ミリモル濃度のイソプロピルチオガラクトシド［シグ
マ（Ｓigma）］を培養物に添加することによって、lac
プロモーターの誘導を実施した。発酵を２０時間約４〜
６Ａ５５０に続け、そして８０００rpmにおける遠心
［１０分、４℃、コントロン・セントリコン（Ｋontron
Ｃentrikon）Ｈ−４０１、ローターＡ６．１４］によ
って軽鎖を収穫した。

【００９７】阻害剤の分離および特性づけ 酵素 ヒト白血球エラスターゼ（ＨＬＥ）およびブタ膵臓エラ
スターゼ（ＰＰＥ）を、エラスチン・プロダクツ・カン
パニー・インコーポレーテッド（Ｅlastin Ｐroducts
Ｃompany，Ｉnc．Ｐ.Ｏ.Ｂox １４７、Ｐaciffic，
Ｍiss．６３０６９／ＵＳＡ］から入手した。

【００９８】ウシα−キモトリプシン（ＣＨＴ）をＥ．
メルク（Ｅ．Ｍerck，Ｄarmastadt）から入手した。

【００９９】基質 基質：ＭeＯＳuc−Ａla−Ａla−Ｐro−Ｖal−pＮＡ（Ｈ
ＬＥ）、Ａc−Ａla−Ａla−Ｐro−Ａla−pＮＡおよびＳ
uc−Ａla−Ａla−Ａla−pＮＡ（ＰＰＥ）およびＳuc−
Ａla−Ａla−Ｐro−Ｐhe−pＮＡ（ＣＨＴ）を、ベイチ
ェム（Ｂachem、Ｂubendorf／Ｓwitzerland）から入手
した。

【０１００】クロマトグラフィーのための材料 セファデックス（Ｓepadex^R）Ｇ−２５；セファデック
ス（Ｓepadex^R）Ｇ−５０；セファロース（Ｓepharos
e^R）４Ｂ−Ｃl、ＳＰ−セファデックス（Ｓepadex^R）Ｇ
−２５は、ドイチェ・ファーマシア（Ｄeutche Ｐharm
acia、Ｆreiburg）から入手した。疎水性樹脂ＬＧＰ
４４２９は、バイエル社（Ｂayer ＡＧ、Ｌeverkuse
n）の製品である。

【０１０１】方法 Ｇ．Ｂ．ローゲル（Ｒoger）ら、（１９７５）、バイオ
ケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミ
ュニケーションズ（Ｂiochem．Ｂiophys．Ｒes．Ｃommu
n.）、１６４、４７８−４８４の方法に従って、セファ
ロース（Ｓepharose^R)４Ｂ−Ｃlを過ヨウ素酸ナトリウ
ムで酸化した後、キモトリプシンと形成したシッフ塩基
をＮa［ＣＨＢＨ₃］で還元することによって、キモトリ
プシンをセファロース（Ｓepharose^R）４Ｂ−Ｃl上に固
定化した。

【０１０２】ＨＰＬＣは適当なカラムを使用して実施し
た。これらはテキストおよび／または対応する図面の凡
例に記載されている。

【０１０３】アミノ酸配列の決定 約０.５〜２ナノモルの蛋白質を３０μlのＴＦＡ中に溶
解した。３mgのポリブレンで予備処理したガラス繊維の
フィルターに試料を適用した。配列の分析は、アプライ
ド・バイオシステムス・インコーポレーテッドから入手
した気相蛋白質配列決定装置（sequencer）により、ヘ
イウィック［Ｒ．Ｍ．ヘイウィック（Ｈewick）、Ｍ．
Ｗ．フンカピラー（Ｈunkapillar）、Ｌ．Ｅ．フード
（Ｈood）、Ｗ．ドレガー（Ｄreger）、１９８１、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂ
iol．Ｃhem.）、２５６、７９９０−７９９７］に従い
実施した。各段階で遊離したアミノ酸フェニルチオヒダ
ントイン誘導体を、シアノ−ＨＰＬＣカラム（デュポ
ン）およびベイレウサー［Ｋ．ベイレウサー（Ｂeyreut
her）、Ｂ．ビースラー（Ｂiesler）、Ｊ．ボウェンス
（Ｂowens）、Ｒ．ジルドロップ（Ｄildrop）、Ｋ．ネ
ウファー（Ｎerfer）、Ｋ．スチューバー（Ｓtuebe
r）、Ｓ．ザイス（Ｚais）、Ｒ．エーリング（Ｅhrin
g）、Ｐ．ザベル（Ｚabel）、１９８３、Ｍodern Ｍet
hods in Ｐrotein Ｃhemistry、３０３-３２５ペー
ジ、ワルター・デ・グルイター（Ｗalter de Ｇruyte
r）＋カンパニー（Ｃo.）、ベルリン］が記載する分離
システムを使用して分析した。Ｍ ５１０ポンプ、ＷＩ
ＳＰ ７１０オートインゼクター、ＬＣ分光光度計Ｍ
４８１およびＳＨＩＭＡＤＵ積分計Ｃ−Ｐ３Ａを含むＷ
ＡＴＥＲＳ ＨＰＬＣシステムを使用した。

【０１０４】酸加水分解およびアミノ酸分析 約１ナノモルの蛋白質をパイレックス管に加え、これに
０.０５％の２−メルカプトエタノールを含有する６モ
ル濃度のＨＣl［Ｉ．Ｔ．ポッツ（Ｐotts）Ｊr．１９６
９、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａnal．Ｂi
ochem.）、１３１、１−１５］の２００μlを添加し
た。管を真空下に密閉し、そして１１０℃で２２時間イ
ンキュベーションした。加水分解物を急速に乾燥し、１
５０μlの０.２モル濃度のクエン酸ナトリウム緩衝液、
pＨ２.２、中に再溶解し、そしてろ過した。蛍光検出器
およびＳＨＩＭＡＤＵ積分計Ｃ−Ｐ３Ａを装備するＢＩ
ＯＴＲＯＮＩＣ ＬＣ ５０００アミノ酸分析装置で、
アミノ酸分析を実施した。アミノ酸は、ベンソン［Ｊ．
Ｒ．ベンソン（Ｂenson）、Ｐ．Ｅ．ヘアー（Ｈare）、
１９７５、プロシーディングス・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシズ(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．
Ｓci.）ＵＳＡ、７２、６１９−６２２］が本質的に記
載するようにして、o−フタルジアルデヒドとの反応
後、定量した。

【０１０５】酵素試験および培養物ろ液中の阻害活性の
アッセイ 培養物ろ液は次のように試験した：１０μlのツイーン
（ＴＷＥＥＮ）８０溶液(０.５％）および５０μlの過
塩素酸（７０％）を、１mlの培養物ろ液に添加した。２
０分後、これらの試料を遠心し、そして透明上澄みを２
２５μlのトリス塩基の飽和溶液の添加によって中和し
た。これらの溶液のアリコートを採取して阻害活性を決
定した。

【０１０６】酵素のアッセイの条件は表４に記載されて
いる。一般に、試料を適当な容量の緩衝液で希釈し、そ
して酵素を添加した。予備インキュベーション時間後、
基質を添加した（基質をＤＭＳＯ中に０.１モル濃度で
溶解し、そして緩衝液で希釈して原溶液の濃度にし
た）。基質からのp−ニトロアニリンの解放は、４０５n
mにおいて、連続的に測定するか、あるは酢酸の添加に
より反応を停止した後に測定した。１００％の値は、阻
害剤を含有しない、展開試料によって決定した。阻害百
分率は、次の式によって計算した：

【０１０７】

【数１】

【０１０８】阻害剤の絶対量は検量線によって、少量の
精製された物質が入手可能になるようになった後はじめ
て、計算することができた。

【０１０９】この出願の実施例３および６の微生物は、
ザ・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリア
ル・バクテリア（ＮＣＩＢ)(Ｔhe Ｎational Ｃollec
tionＯf Ｉndustrial Ｂacteria，Ｔorry Ｒesearch
Ｓtation，Ｐ．Ｏ．Ｂox３１、１３５ Ａbbey Ｒoa
d，Ａberdeen ＡＢ９ ８ＤＧ、Ｓcotland，Ｕnited
Ｋingdom）に、それぞれ、表示ＮＣＩＢ １２３６５お
よびＮＣＩＢ １２３６４で受託されている。

【０１１０】実施例１ Ａsn^-13−Ａla^-12−Ｇlu^-11−Ｔhr^-10−Ａla^-9−Ｈis^-8
−Ｌys^-7−Ｓer^-6−Ａsn^-5−Ｇlu^-4−Ｖal^-3−Ｔhr^-2−
Ｍet^-1−Ｌeu¹⁸−Ｇlu¹⁹−Ａrg²¹−Ａla³²−ＰＳＴＩ
（ＰＳＴＩ−４Ａ［微小融合（mi nifusion）］）の分
離 １０リットルの△Ｍ１５／pＣＨ ２３３１の発酵ブロ
スを、３５０mlの過塩素酸（７０％）で処理した。沈殿
を遠心によって除去した。上澄みを８ＮのＫＯＨ溶液で
中和した。４℃で放置後、ブフナー漏斗を使用してＫＣ
lＯ₄の沈殿を吸引ろ過した。

【０１１１】ろ液をキモトリプシン−セファロース（Ｓ
epharose^R）４Ｂ−Ｃl接合体のゲルのベッド（７×９c
m）に４℃において通した。流出液の２８０nmにおける
光学濃度がゼロに到達するまで、ゲルを水で洗浄した。
ゲルを、さらに、５００mlの０.２モル濃度の酢酸塩緩
衝液（pＨ５）および５００mlの水で洗浄した。最後
に、ゲルを０.２モル濃度の酢酸で溶離し、ＨＣlでpＨ
２.０に調節した。溶離のプロフィルを図７に記載す
る。活性の分画（白血球エラスターゼの阻害アッセイに
おいて測定したように）をプールし、固体の酢酸ナトリ
ウムの添加によってpＨ４に調節し、そして回転蒸発に
よって濃縮する。塩類および少量の不純物を、最後に、
ＲＰ−３１８カラムの調製用ＨＰＬＣによって除去し
た。溶離のプロフィルを図８に示す。各分画の純度は分
析用ＨＰＬＣによって検査した。これらの結果に従い、
３つのプール、管４２−４４、４５−４６および４７−
４９をつくり、これらは凍結乾燥後６mg、１２mgおよび
６mgを与えた。最高の純度は中央の分画において達成さ
れ、その分析用ＨＰＬＣの線図を図９に示す。

【０１１２】アミノ酸組成、配列分析および阻害スペク
トルについてのデータを表５〜７に記載する。

【０１１３】実施例２ ＢrＣＮ開裂による微小融合蛋白質からのＬe u¹⁸−Ｇl
u¹⁹−Ａrg²¹−Ａla³²−ＰＳＴＩ（ＰＳＴＩ−４Ａ）の
調製 ２.９３mg（０.４６マイクロモル）のＰＳＴＩ−４Ａ微
小融合生成物（実施例１）を、１mlの７０％のギ酸中に
溶解した。それを、３mgの臭化シアンの添加および暗所
中の窒素雰囲気下の室温における１８時間のインキュベ
ーションによって、開裂した。この反応を１０mlの水の
希釈によって停止した。水および揮発性副生物を凍結乾
燥によって除去した。Ｌeu¹⁸−Ｇlu¹⁹−Ａrg²¹−Ａla³²
−ＰＳＴＩ（ＰＳＴＩ−４Ａ）を、副生物および開裂し
ない融合蛋白質から、１％のギ酸中のセファデックス
（Ｓepadex^R）Ｇ−５０（超微細）カラム（２.５×９０
cm）のゲルクロマトグラフィーによって分離した。分画
は、それらの保持時間に従い、バイロラド（Ｂiorad）
ＲＰ−３１８（４.６×２５０mm）大型カラム上にプー
ルした、溶液Ａ：０.１％のＴＦＡ；溶液Ｂ；０.１％の
ＴＦＡ／６０％のアセトニトリル、流れ１ml／分、室
温、２１０nmにおける検出；勾配：０−６０％。

【０１１４】分画を凍結乾燥し、そして同一条件下の同
一カラムの再クロマトグラフィーによって精製した。活
性の分画を集め、そして凍結乾燥した。純度は、実施例
１に記載したように、Ｌeu¹⁸−Ｇlu¹⁹−Ａrg²¹−Ａla³²
−ＰＳＴＩ（ＰＳＴＩ−４Ａ）の分析用ＨＰＬＣの展開
によって検査した。阻害剤は、表５〜７に記載するよう
に、アミノ酸分析、Ｎ−末端配列決定、ＨＰＬＣおよび
エラスターゼ阻害アッセイによって特徴づけた。

【０１１５】実施例３ Ａsn^-13−Ａls^-12−Ｇlu^-11−Ｔhr^-10−Ａla^-9−Ｈis^-8
−Ｌys^-7−Ｓer^-6−Ａsn^-5−Ｇlu^-4−Ｖal^-3−Ｔhr^-2−
Ｍet^-1、Ｌeu¹⁸−Ａla³²−ＰＳＴＩ（ＰＳＴＩ−１Ａ
［微小融合］）の分離 ４リットルの△Ｍ１５／pＣＨ ２３３の発酵ブロスを
１２０mlの過塩素酸（７０％）で処理し、そして形成し
た沈殿を遠心［３０分、４℃、４０００rpm、ベックマ
ン（Ｂeckman）Ｊ−６］によって除去した。上澄みを８
ＮのＮaＯＨ溶液でpＨ８.６に調節し、そしてキモトリ
プシン−セファロース（Ｓepharose^R)４Ｂ−Ｃl接合体
（８×１０cm）に通過させた。流出液の２８０nmにおけ
る光学濃度が基線のレベルに到達するまで、ゲルを０.
２モルのトリス−ＨＣl緩衝液（pＨ８.６）で洗浄し
た。次に、ゲルを順次に水および０.１モルの酢酸で溶
離し、ＨＣlでpＨ２に調節した。

【０１１６】阻害活性を含有する分画（白血球エラスタ
ーゼに対して測定した）をプールし、８ＮのＮaＯＨ溶
液でpＨ２.７に調節し、そして、前もって０.１５％の
トリフルオロ酢酸（ＮaＯＨ溶液でpＨ２.７に調節し
た）と平衡化したＳＰ−セファデックス（Ｓepadex^R）
Ｇ−２５（２.５×３５cm）に適用した。

【０１１７】出発緩衝液で洗浄した後、このカラムを出
発緩衝液中の０−１モルのＮaＣlの直線の勾配で展開し
た。分画を、それらの阻害活性および分析用ＨＰＬＣ展
開（ＲＰ−３１８、ＢＩＯ−ＲＡＤ）の結果に従い、プ
ールした。プールをＵＭ２膜［アミコン（Ａmicon）］
を使用する限外ろ過によって濃縮し、そして最終の精製
をＲＰ ３１８の調製用クロマトグラフィー（勾配、
０.１５％のトリフルオロ酢酸中の０−６０％のアセト
ニトリル、６０分）によって達成した。２つのプールを
形成し、凍結乾燥し、８.７mgの均質な物質および１.９
mgの少量の不純物を含む物質が得られた。分析のデータ
（アミノ酸分析、配列の分析および阻害活性）を表５〜
７に記載する。

【０１１８】ＰＳＴＩ−１Ａ微小融合蛋白質の臭化シア
ンの開裂を、実施例２に記載するようにして実施し、そ
してＬeu¹⁸−Ａla³²−ＰＳＴＩ（ＰＳＴＩ−１Ａ）を得
た。

【０１１９】実施例４ Ｍet^-1−Ｌeu¹⁸−Ｇlu¹⁹−Ａrg²¹−Ａla³²−ＰＳＴＩ
（Ｍet−ＰＳＴ Ｉ−４Ａ）の分離 １リットルの△Ｍ１５／pＣＨ ２３６３の発酵ブロス
を、実施例１に記載するように、過塩素酸で処理し、遠
心し、そして中和し、そして最後に、キモトリプシン−
セファロース（Ｓepharose^R）４Ｂ−Ｃl接合（２.５×
１０cm）に通過させた。ゲルを、実施例１に記載するよ
うに、水、酢酸塩緩衝液、および水で洗浄した。０.２
モル濃度の酢酸、pＨ２（ＨＣlで調節）で溶離すること
によって、阻害剤を脱着した。阻害剤を含有する分画を
プールし、ＮaＯＨ溶液の添加によってpＨ４に調節し、
そしてロータリーエバポレーターによって５mlに濃縮し
た。最終の精製をＲＰ ３１８の調製用クロマトグラフ
ィー(勾配、０.１５％のトリフルオロ酢酸中の０−６０
％のアセトニトリル）によって達成した。プールした活
性分画の凍結乾燥により１.８mgの物質が得られた。そ
れ以上のデータ（アミノ酸組成、配列の分析および阻害
活性）を表５〜７に記載する。

【０１２０】実施例５ Ｔyr¹⁸−Ｇlu¹⁹−Ａrg²¹−ＰＳＴ Ｉ（ＰＳＴ Ｉ−３
Ｐ）の分離 ７５０mlの△Ｍ１５／pＣＨ ２３６２の発酵ブロス
を、２５mlの過塩素酸で処理し、そして３０分後遠心し
た。上澄みを４ＮのＫＯＨの添加によって中和し、そし
て６時間後、ＫＣlＯ₄をろ過によって除去した。ろ液を
キモトリプシン−セファロース（Ｓepharose^R)−４Ｂ−
Ｃlカラム(２.５×７cm）に装入し、これを順次に水お
よび０.２モル濃度の酢酸で洗浄した。０.２モル濃度の
酢酸（ＨＣlでpＨ１.８に調節した）によって阻害剤を
脱着した。活性分画をプールし、ＮaＯＨ溶液の添加に
よってpＨ３.５に調節し、そして回転蒸発によって濃縮
した。わずかの沈殿を遠心によって除去し、そして上澄
みをＲＰ−８の調製用ＨＰＬＣに通過させた。活性分画
を凍結乾燥すると、約０.８mgの阻害剤が得られ、これ
は分析用ＨＰＬＣにおいて均質であった。分析データ
（アミノ酸組成、配列の分析および阻害活性）を表５〜
７に記載する。

【０１２１】実施例６ Ｖal¹⁸−Ｇlu¹⁹−Ａrg²¹−ＰＳＴ Ｉ（ＰＳＴＩ−５
Ｐ）の分離 ３リットルの△Ｍ１５／pＣＨ ２３６１の発酵ブロス
に、１００mlの過塩素酸（７０％）を添加した。３０分
後、沈殿をろ過し、そして上澄みを８ＮのＮaＯＨ溶液
でpＨ７にした。次いで、それを、前もって０.１ＮのＨ
Ｃl、メタノールおよび水で洗浄した疎水性樹脂（Ｌewa
pol ＬＧＰ ４４２９、バイエル社）（直径：３cm、
ベッドの高さ：４０cm）に通過させた。この樹脂を水で
洗浄し、引続いて０〜７０％のメタノールの直線の勾配
で溶離した。阻害活性を各分画において決定した（蒸発
によりメタノールの除去後、白血球エラスターゼの阻害
アッセイ）。活性分画をプールし、そして真空蒸発によ
り濃縮した。濃縮物をトリフルオロ酢酸の添加によって
pＨ２.７に酸性化し、そして、０.１５％のトリフルオ
ロ酢酸（ＮaＯＨでpＨ２.７に調節した）と平衡化した
ＳＰ−セファデックス（Ｓepadex^R）Ｇ−２５（２.５×
１０cm）に適用した。

【０１２２】このカラムを出発緩衝液中の０〜１モル濃
度のＮaＣlの直線の勾配で展開した。阻害活性の分画を
プールし、中和し、濃縮し、そしてセファデックス（Ｓ
epadex^R）Ｇ-２５のろ過により、０.０１モル濃度のリ
ン酸塩緩衝液、pＨ７.０、を溶離剤として使用して脱塩
した。活性分画をpＨ２.７に調節し、再びＳＰ−セファ
デックス（Ｓepadex^R）Ｇ−２５のクロマトグラフィー
にかけ、０.１〜０.５モル濃度のＮaＣl、pＨ２.７、の
直線の勾配を使用した。

【０１２３】活性溶離液をpＨ４.０に調節し、濃縮し、
そして、ＲＰ−３１８の調製用ＨＰＬＣに通過させるこ
とによってさらに精製した。この工程を１回反復した。
最後の精製は、ファーマシア（Ｐharmacia）からのモノ
（Ｍono）−８−カラムの調製用ＨＰＬＣおよび引続く
ＲＰ−３１８の再クロマトグラフィーによって達成した
（図１０）。精製した生成物の分析用ＨＰＬＣ線図を図
１１に示す。それ以上のデータ（アミノ酸組成、配列、
阻害活性）を表５〜７に記載する。

【０１２４】

【表２】

【０１２５】

【表３】

【０１２６】

【表４】

【０１２７】

【表５】

【０１２８】図面についての注釈 図１： ＰＳＴＩマスター遺伝子のヌクレオチドおよび
対応するアミノ酸配列。カッコおよび番号は遺伝子をア
センブリングするために使用した合成オリゴヌクレオチ
ドを示す。ダッシュを付した線は、遺伝子のセグメント
Ｉ（第１部分）およびセグメントＩＩ（第２部分）の分
割を示す。

【０１２９】図２： 位置−１０付近に可能なシャイン
−ダルガノ（Ｓhine−Ｄalgano）部位部位（ＳＤ）およ
びα−アミラーゼからのシグナル配列［アンダークライ
ンド（underclined）アミノ酸配列、位置１において出
発する］を含有するpＡＬＫ１からの２３０bpのＥcoＲ
Ｉ−ＢstＥＩＩのＤＮＡ配列。細胞外酵素について可能
なプロセッシング部位はシグナル配列のアミノ酸４１に
示されている。

【０１３０】図３： Ａは、プラスミドをＢstＥＩＩで
切断し、そしてＤＮＡpolＩ（大きい断片）の存在下にd
ＮＴＰを充填することによって、断片ＡをpＡＣＫ１か
ら単離する工程を略図的に示す。ＤＮＡをフェノール化
し、エタノール沈殿し、そしてＥcoＲＩでさらに制限し
た。２％のアガロースゲル上で分離後、２３０bpのＤＮ
Ａ断片を単離した。同様に、pＵＣ−Ｍet−ＰＳＴＩ−
１Ａから（またはpＣＨ ２３３１の構成のためpＵＣ−
Ｍet−ＰＳＴＩ−４Ａ）、ＮcoＩによる制限、dＮＴＰ
の充填、エタノール沈殿、およびそれ以上のＥcoＲＩに
よる制限によって、１８０bpの断片Ｂを分離した。断片
ＡおよびＢの両者を結合してＥcoＲＩ制限pＵＣ８にし
た。

【０１３１】Ｂは、Ｍet−ＰＳＴＩ−１Ａまたは−４Ａ
のための、α−アミラーゼシグナル配列（断片Ａ）とＭ
et−ＰＳＴＩ遺伝子（断片Ｂ）との間の接合における配
列を示す。

【０１３２】図４： 可能なシャイン−ダルガノ（Ｓhi
ne−Ｄalgano）部位（位置１０付近）およびアミノ酸Ａ
la₂₆におけるプロセッシング部位をもつＥ．coliのペニ
シリンアシラーゼの改変シグナル配列を含有する、合成
ＥcoＲＩ−ＮheＩ ＤＮＡ断片を示す。

【０１３３】図５： ＥcoＲＩおよびＮheＩで制限した
pＢＲ ３２２中に、合成ＰＥＮＡＣ配列（９６bpのＥc
oＲＩ−ＮheＩ断片、図４参照）をクローニングして、p
ＰＥＮＡＣ１を生成した。pＰＥＮＡＣ１をＥcoＲＩお
よびＢamＨＩで制限し、そしてシャイン−ダルガノ（Ｓ
hine−Ｄalgano）部位およびＰＥＮＡＣシグナル配列を
含有する２５０bpのＤＮＡ断片を、ＥcoＲＩおよびＢam
ＨＩで制限したpＵＣ８中に結合してpＣＨ ２３６を生
成した。

【０１３４】pＣＨ ２３６１（またはpＣＨ ３６２）
を構成するため、pＣＨ２３６をＮhe Ｉで制限し、そ
してＤＮＡpolＩ（大きい断片）の存在下にdＣＴＰおよ
びdＴＴＰを充填した。ＤＮＡをフェノール化し、エタ
ノール沈殿し、そしてＳ１ヌクレアーゼ反応を実施し
て、ＰＥＮＡＣシグナル配列中のシグナルペプチダーゼ
の開裂部位にＡla₂₆のための平滑末端のコドンをつくっ
た（図４参照）。ＤＮＡ沈殿後、pＣＨ ２３６をＨind
ＩＩＩでさらに制限し、そしてベクターを０.８％のア
ガロースゲル上の電気泳動後分離した。

【０１３５】ＨincＩＩおよびＨindＩＩＩでpＵＣ−Ｐ
ＳＴＩ−５Ｐを制限することによってＰＳＴＩ−５Ｐの
遺伝子を分離し、そして１８０bpの断片を２％のアガロ
ースゲルの電気泳動後分離した。ＰＳＴＩ−３０の遺伝
子を同様にpＵＣ−ＰＳＴＩ−３Ｐから分離した。pＵＣ
−ＰＳＴＩ−５Ｐ（またはpＵＣ−ＰＳＴＩ−３）から
の１８０bpのＨincＩＩ−ＨindＩＩＩ断片をpＣＨ２３
６中に結合して、pＣＨ ２３６１（またはpＣＨ２３６
２）を生成した。

【０１３６】図６： pＣＨ ２３６をＮheＩで制限
し、そしてＤＮＡpolＩ（大きい断片）の存在下にdＣＴ
Ｐで充填した。ＤＮＡ沈殿後、Ｓ１ヌクレアーゼ処理を
実施して平滑末端を生成した。ベクターをさらにＨind
ＩＩＩで制限し、そして０.８％のアガロースゲル上の
電気泳動後分離した。Ｍet−ＰＳＴＩ−４Ａの遺伝子を
pＵＣ−Ｍet−ＰＳＴＩ−４ＡからＮcoＩの制限によっ
て分離し、そしてdＮＴＰで充填した。エタノール沈殿
後、ＤＮＡをＨindＩＩＩでさらに制限し、そして１８
０bpの断片を２％のアガロースゲル上の電気泳動後分離
した。

【０１３７】図７： 固定化したキモトリプシンを有す
るカラム（７×９cm）を使用する４℃における親和性ク
ロマトグラフィーによる、ＰＳＴＩ−４Ａ［微小融合］
の単離。１１mlの分画を集めた。横座標は管の番号を示
し、そして縦座標は２８０nmにおける吸収を示す。カラ
ムは水で（分画４０まで）、次いで０.２モル濃度の酢
酸塩緩衝液pＨ５.０で（分画７０まで）次いで蒸留水で
（分画８５まで）展開した。最後の脱着は０.２モル濃
度の酢酸−塩酸、pＨ２.０、で達成した。阻害剤は管９
２−１０８中に溶離された。

【０１３８】図８： ＲＰ−３１８−カラム（２５０−
４.６mm）（ＢＩＯ−ＲＡＤ）のキモトリプシン−親和
性カラム（管９２−１０８）の溶離液を含有するＰＳＴ
Ｉ−４Ａ［微小融合］の調製用ＨＰＬＣ。溶離は、０.
１５％のトリフルオロ酢酸および０.１５％のトリフル
オロ酢酸を含有する６０％のアセトニトリルの直線の勾
配を使用して実施した（２時間）。流速：１ml／分、１
５０バール；２２０nmにおける検出。縦座標は２２０nm
における吸収を示し、そして横座標は分画の番号を示
す。阻害剤は分画４４−５０中に溶離された。

【０１３９】図９： 予備カラム（７５×７.５mm)(Ｌ
ＫＢ）を使用するウルトラ−パック（ultra−pak）ＴＳ
Ｋ ＳＰ−５ ＰＷ−カラムによるＰＳＴＩ−４Ａ［微
小融合］の分析用ＨＰＬＣ。

【０１４０】条件： 溶媒Ａ＝ ０.１５％のトリフルオロ酢酸および０.１モ
ル濃度のＮa₂ＳＯ₄、１０％のメタノール pＨ２.７。

【０１４１】溶媒Ｂ＝ ０.１５％のトリフルオロ酢
酸；０.６モル濃度のＮa₂ＳＯ₄、１０％のメタノール pＨ２.７。

【０１４２】

【０１４３】流速： １.５ml／分、２０バール。

【０１４４】検出： ２１５nm。

【０１４５】図１０：ＲＰ−３１８（２５０×４.６m
m）（ＢＩＯ−ＲＡＤ）の調製用ＨＰＬＣによるＰＳＴ
Ｉ−５Ｐの最後の精製。溶離は０.１５％のトリフルオ
ロ酢酸および０.１５％のトリフルオロ酢酸を含有する
６０％のアセトニトリルの直線の勾配を使用して実施し
た（２時間）。流速：１ml／分、１５０バール；２８０
nmに おける検出。阻害剤は管２０−２７中に溶離され
た。

【０１４６】図１１：バイオ−シル（Ｂio−Ｓil^R）Ｔ
ＳＫ ＣＭ−３−ＳＷカラム（７５×７.５mm）（ＢＩ
Ｏ−ＲＡＤ）を使用するＰＳＴＩ−５Ｐの分析用ＨＰＬ
Ｃ。

【０１４７】条件： 溶媒Ａ＝ ０.１５％のトリフルオロ酢酸、１０％のメ
タノール、０.１モルのＮa₂ＳＯ₄。

【０１４８】溶媒Ｂ＝ ０.１５％のトリフルオロ酢
酸、１０％のメタノール、０.６モルのＮa₂ＳＯ₄。

【０１４９】

【０１５０】流速： １.５ml／分、２２バール。

【０１５１】検出： ２１５nm。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＳＴＩマスター遺伝子のヌクレオチドおよび
対応するアミノ酸配列を示す。

【図２】pＡＬＫ１由来のα−アミラーゼシグナル配列
を示す。

【図３】Ａは、pＣＨ ２３３の構築手順を示す。Ｂ
は、Ｍet−ＰＳＴＩ−１Ａまたは−４Ａのための、α−
アミラーゼシグナル配列（断片Ａ）とＭet−ＰＳＴＩ遺
伝子（断片Ｂ）との間の接合における配列を示す。

【図４】ＰＥＮＡＣの配列を示す。

【図５】pＣＨ ２３６およびpＣＨ ２３６１（pＣＨ
２３６２）の構築手順を示す。

【図６】pＣＨ ２３６３の構築手順を示す。

【図７】固定化したキモトリプシンを有するカラム（７
×９cm）を使用する４℃における親和性クロマトグラフ
ィーによる、ＰＳＴＩ−４Ａ［微小融合］の分離挙動を
示す。

【図８】ＲＰ−３１８−カラム（２５０−４.６mm）
（ＢＩＯ−ＲＡＤ）のキモトリプシン−親和性カラム
（管９２−１０８）の溶離液を含有するＰＳＴＩ−４Ａ
［微小融合］の調製用ＨＰＬＣの分離挙動を示す。

【図９】予備カラム（７５×７.５mm)(ＬＫＢ）を使用
するウルトラ−パック（ultra−pak）ＴＳＫ ＳＰ−５
ＰＷ−カラムによるＰＳＴＩ−４Ａ［微小融合］の分
析用ＨＰＬＣの結果を示す。

【図１０】ＲＰ−３１８（２５０×４.６mm）（ＢＩＯ
−ＲＡＤ）の調製用ＨＰＬＣによるＰＳＴＩ−５Ｐの分
離挙動を示す。

【図１１】バイオ−シル（Ｂio−Ｓil^R）ＴＳＫ ＣＭ
−３−ＳＷカラム（７５×７.５mm）（ＢＩＯ−ＲＡ
Ｄ）を使用するＰＳＴＩ−５Ｐの分析用ＨＰＬＣの結果
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＢＦ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ロナルト・フランク ドイツ連邦共和国デー3340ボルフエンビユ ツテル・ライプニツツシユトラーセ８ (72)発明者 フリートヘルム・マイバルト ドイツ連邦共和国デー3300ブラウンシユバ イヒ・エルツベーク32 (72)発明者 ハンス・フリツツ ドイツ連邦共和国デー8011ホーエンブル ン・ノイリンガーシユトラーセ15 (72)発明者 ボルフガング・ブルンス ドイツ連邦共和国デー5600ブツペルタール １・カイザー−ビルヘルム−アレー37

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 膵臓分泌トリプシン阻害剤の配列を本質
   的に有するペプチドであって、前記配列中に存在するア
   ミノ酸残基の１または２以上が他の天然に産出するアミ
   ノ酸残基によって置換されていることを特徴とする前記
   ペプチド。
2. 【請求項２】 前記配列がヒト膵臓トリプシン阻害剤の
   配列から誘導される請求項１記載のペプチド。
3. 【請求項３】 位置１７、１８、１９、２０、２１、２
   ９、３２および３６におけるアミノ酸残基の１または２
   以上が天然に産出するアミノ酸残基によって置換されて
   いる請求項１または２記載のペプチド。
4. 【請求項４】 位置１３においてＧlu、ＡspまたはＬeu
   の、位置１４においてＧlu、ＡspまたはＡsn、位置１７
   においてＴhr、Ｐro、Ｓer、Ａrg、ＬeuまたはＭetの、
   位置１８においてＬeu、Ｍet、Ｖal、Ｇln、Ｓer、Ａl
   a、Ｔhr、Ｉle、Ｔyr、Ｐhe、Ａrg、ＴrpまたはＬys
   の、位置１９においてＧlu、Ａsp、ＬeuまたはＩleの、
   および位置２０においてＴyr、Ｐhe、Ａsp、Ａsn、Ｌe
   u、Ｇlu、Ｇln、ＨisまたはＡrgの、位置２１において
   Ｇlu、Ａrg、Ｍet、Ｐhe、Ｌys、Ｖal、Ｔhr、Ｇln、Ｌ
   eu、ＡspまたはＡsnの、位置２９においてＬys、Ｇlu、
   Ｉle、Ｇln、ＡspまたはＡsnの、位置３２においてＰr
   o、Ｇly、Ｓer、Ａsn、Ａla、Ａsp、Ｖal、Ａrgまたは
   Ｈisの、そして位置３６においてＡsn、Ａsp、Ａla、Ｓ
   er、Ｇly、Ｔyr、ＶalまたはＧluのアミノ酸残基を含有
   するが、Ｌeu¹³−Ａsn¹⁴−Ｔhr¹⁷−Ｌys¹⁸−Ｉle¹⁹−Ｔ
   yr²⁰−Ａsn²¹−Ａsp²⁹−Ｐro³²−Ｖal³⁶およびＬeu¹³−
   Ａsn¹⁴−Ｔhr¹⁷−Ｌys¹⁸−Ｉle¹⁹−Ｔyr²⁰−Ａsp²¹−Ａ
   sn²⁹−Ｐro³²−Ｖal³⁶の組み合わせを有するものを除く
   請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド。
5. 【請求項５】 群 PSTI 1 （Thr‐17 Leu‐18 Ile‐19 Tyr‐20 Asn‐21 Asp‐29）、 PSTI 2 （Thr-17 Leu-18 Ile-19 Tyr-20 Asn-21 Asn-29）、 PSTI 3 （Thr-17 Tyr-18 Glu-19 Tyr-20 Arg-21 Asp-29）、 PSTI 4 （Thr-17 Leu-18 Glu-19 Tyr-20 Arg-21 Asp-29）、 PSTI 5 （Thr-17 Val-18 Glu-19 Tyr-20 Arg-21 Asp-29）、 PSTI 6 （Thr-17 Leu-18 Glu-19 Tyr-20 Asn-21 Asp-29）、 PSTI 7 （Thr-17 Leu-18 Ile-19 Tyr-20 Arg-21 Asp-29）、 PSTI 8 （Thr-17 Val-18 Glu-19 Leu-20 Asn-21 Asp-29）、 PSTI 9 （Thr-17 Val-18 Glu-19 Leu-20 Arg-21 Asp-29）、 PSTI 10 （Pro-17 Lys-18 Ile-19 Tyr-20 Asp-21 Asn-29）、 PSTI 11 （Pro-17 Leu-18 Glu-19 Tyr-20 Arg-21 Asp-29）、 PSTI 12 （Pro-17 Val-18 Glu-19 Tyr-20 Arg-21 Asp-29）、 PSTI 13 （Thr-17 Ile-18 Glu-19 Tyr-20 Asn-21 Asp-29）、 PSTI 14 （Thr-17 Arg-18 Glu-19 Tyr-20 Asn-21 Asp-29）、 PSTI 15 （Thr-17 Phe-18 Glu-19 Tyr-20 Asn-21 Asp-29）、 PSTI 16 （Thr-17 Ala-18 Glu-19 Tyr-20 Asn-21 Asp-29）、 PSTI 17 （Thr-17 Val-18 Ile-19 Tyr-20 Asn-21 Asp-29）、 PSTI 18 （Thr-17 Ile-18 Ile-19 Tyr-20 Asn-21 Asp-29）、 PSTI 19 （Thr-17 Val-18 Ile-19 Tyr-20 Asp-21 Asn-29）、 PSTI 20 （Thr-17 Ile-18 Ile-19 Tyr-20 Asp-21 Asn-29）、 PSTI 21 （Thr-17 Ile-18 Glu-19 Tyr-20 Arg-21 Asp-29）、 PSTI 22 （Thr-17 Tyr-18 Ile-19 Tyr-20 Asn-21 Asp-29）、 PSTI 23 （Thr-17 Phe-18 Ile-19 Tyr-20 Asn-21 Asp-29）および PSTI 24 （Thr-17 Lys-18 Glu-19 Tyr-20 Arg-21 Asp-29） から選択され、さらに位置１３においてＧlu、Ａspまた
   はＬeuの、位置１４においてＧlu、ＡspまたはＡsnの、
   位置３２においてＰro、Ｇly、Ｓer、Ａsn、Ａla、Ａs
   p、Ｖal、ＡrgまたはＨisの、そして位置３６において
   Ａsn、Ａsp、Ａla、Ｓer、Ｇly、Ｔyr、ＶalまたはＧlu
   のアミノ酸残基を含む請求項１〜３のいずれかに記載の
   ペプチド。
6. 【請求項６】 位置１におけるＡspより前に存在するア
   ミノ酸残基またはペプチド配列を有する請求項１〜４の
   いずれかに記載のペプチド。
7. 【請求項７】 組換えＤＮＡ技術によって生成された請
   求項１〜６のいずれかに記載のペプチド。
8. 【請求項８】 請求項１〜６のいずれかに記載のペプチ
   ドをコードするＤＮＡ。
9. 【請求項９】 配列 【化１】 ならびにその変異型および機能的同等体からなる群より
   選ばれるＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 位置１３、１４、１７、１８、１９、
    ２０、２１、２９、３２および３６におけるアミノ酸を
    コードする１または２以上のコドンが天然に産出するい
    ずれかのアミノ酸をコードするコドンによって置換され
    ている請求項８記載のＤＮＡ。
11. 【請求項１１】 位置１３においてＧlu、ＡspまたはＬ
    euの、位置１４においてＧlu、ＡspまたはＡsnの、位置
    １７においてＴhr、Ｐro、Ｓer、Ａrg、ＬeuまたはＭet
    の、位置１８においてＬeu、Ｍet、Ｖal、Ｇln、Ｓer、
    Ａla、Ｔhr、Ｉle、Ｔyr、Ｐhe、Ａrg、ＴrpまたはＬys
    の、位置１９においてＧlu、Ａsp、ＬeuまたはＩleの、
    位置２０においてＴyr、Ｐhe、Ａsp、Ａsn、Ｌeu、Ｇl
    u、Ｇln、ＨisまたはＡrgの、位置２１においてＧlu、
    Ａrg、Ｍet、Ｐhe、Ｌys、Ｖal、Ｔhr、Ｇln、Ｌeu、Ａ
    spまたはＡsnの、位置２９においてＬys、Ｇlu、Ｉle、
    Ｇln、ＡspまたはＡsnの、位置３２においてＰro、Ｇl
    y、Ｓer、Ａsn、Ａla、Ａsp、Ｖal、ＡrgまたはＨis
    の、そして位置３６においてＡsn、Ａsp、Ａla、Ｓer、
    Ｇly、Ｔyr、ＶalまたはＧluのアミノ酸をコードするコ
    ドンを含むが、Ｌeu¹³−Ａsn¹⁴−Ｔhr¹⁷−Ｌys¹⁸−Ｉle
    ¹⁹−Ｔyr²⁰−Ａsn²¹−Ａsp²⁹−Ｐro³²−Ｖal³⁶およびＬ
    eu¹³−Ａsn¹⁴−Ｔhr¹⁷−Ｌys¹⁸−Ｉle¹⁹−Ｔyr²⁰−Ａsp
    ²¹−Ａsn²⁹−Ｐro³²−Ｖal³⁶の組み合わせをコードする
    ものは除く、請求項８または９記載のＤＮＡ。
12. 【請求項１２】 下流に、メチオニンをコードするコド
    ンまたはリーダーペプチドをコードするＤＮＡをさらに
    含む請求項８または９に記載のＤＮＡ。
13. 【請求項１３】 請求項８〜１０のいずれかに記載の１
    または２以上のＤＮＡを含んでなる発現ベクター。
14. 【請求項１４】 請求項１１記載の発現ベクターで形質
    転換された宿主有機体。
15. 【請求項１５】 a）適当な条件下に宿主有機体を培養
    する工程、 b）前記培養物からペプチドを回収する工程、および c）前記ペプチドを精製する工程、を含んでなり、前記
    宿主有機体が請求項１３記載の発現ベクターで形質転換
    されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに
    記載のペプチドを調製する方法。
16. 【請求項１６】 請求項１〜６のいずれかに記載のペプ
    チドを有効成分として含有するエラスターゼの活性に起
    因する疾患を処置するための製薬学的組成物。