DE2701890C2 - Peptielischer Glycosidhydrolase-Inhibitor aus einem Streptomyceten und seine Verwendung - Google Patents
Peptielischer Glycosidhydrolase-Inhibitor aus einem Streptomyceten und seine VerwendungInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen neuen Inhibitor der Glycosidhydrolasen des Verdauungstraktes, insbesondere- der «-Amylase aus
Pankreas. Die Erfindung betrifft ferner die Herstellung eines solchen^ inhibitors durch Fermentation des
spezifischen Nlikroorganismus Streptomyces tendae.
Stamm 4158.
Inhibitoren der Glycosidhydrolasen aus Mikroorganismen, besonders aus Actinomyceten sind bekannt
(vergL DE-OS 20 64 092 und DE-OS 22 09 833). Die in
der DE-OS 22 09 833 beschriebenen Substanzen gehören chemisch in die Klasse der Oligo- oder Polysaccharide, während die in der DE-OS 20 64 092 beschriebenen
Inhibitoren zwei Gruppen umfassen, die eine Gruppe gehört in die Klasse der Polysaccharide, während es sich
bei der anderen Gruppe um durch Trypsin abbaubare Polypeptide mit einer Hemmaktivität gegen Amylase
von 80 AIE/mg im günstigsten Fair handelt Die in den
beiden Anmeldungen beschriebenen Inhibitoren mit Polysaccharidstruktur bewirken keir«; reversible Hemmung der Glycosidhydrolasen. Darüber hinaus ist die
Glycosidhydrolase-hemmende Aktivität brett gefächert, ein spezifisches Wirkungsprofil fehlt Diese Inhibitoren
werden der Forderung an moderner Pharmaka, nur am Zielenzym zu wirken, nicht gerecht Aus Gründen der
Wirksicherheit ist ferner eine irreversible Hemmung am Enzym erwünscht
Es wurde nun in Fermentationsansätzen von Streptomyces tendae, Stamm 4158, ein hochaktiver Hemmstoff
der a-Amylase aus Pankreas gefunden, der sich
chemisch zu den Peptiden einordnen läßt.
Die Erfindung betrifft daher einen peptidischen Glycosidhydrolase-Inhibitor, erhältlich durch Kultivieren von Mikroorganismen aus der Gattung Streptomyces und Gewinnen des Inhibitors aus der Kultur,
dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus den Stamm Streptomyces tendae 4158 (ATCC-Nr. 31 210) verwendet.
Der Inhibitor hat ein Molekulargewicht von 5000 bis !0 000, ein Absorptionsmaximum in UV-Licht bei
276 nm, einen isoelektrischen Punkt von 4,4 und eine Aminosäurezusammensetzung wie weiter unten angegeben.
Der erfindungsgemäße Inhibitor hat ein relativ hohes
Molekulargewicht. Er diffundiert nicht oder allenfalls zu einem sehr geringen Teil durch handelsübliche Dialysiermembranen wie Visking^-Schläuche. Naturgemäß
ist die Bestimmung des genauen Molekulargewichts schwierig und man gelangt mit verschiedenen Bestimmungsmethoden zu unterschiedlichen Resulaten. Benützt man zur Molekulargewichtsbestimmung die
analytische Ultrazentrifuge (Biochemisches Taschenbuch. 2. Teil, Seite 746 bis 767), so erhält man Werte von
ungefähr 10 000. Werden hingegen Molekular-Siebe wie
Sephadex* G-50 superfein verwandt, so ermittelt man
ein Molekulargewicht" von 5000 oder sogar noch darunter. Es ist demgemäß aufgrund der derzeitig
vorliegenden Untersuchungsergebnisse ein Molekular
gewicht zwischen 5000 und 10 000 anzunehmen.
Die erfindungsgemäße Verbindung ist eine farblose Substanz! Sie absorbiert aber ultraviolettes Licht mit
einem bei 276 nnvliegenden Maximum, das bei TSl nm
eine. Schulter aufweist. E ü = 16. Fig. I gibt ein
ίο Absorptionsspektrum wieder.
Der Inhibitor ist seiner chemischen Struktur nach ein Peptid- Er kann durch Hydrolyse in Aminosäuren
gespalten werden. Es ist bis jetzt nicht gelungen, neben
den Aminosäuren andere Bestandteile nachzuweisen.
Bestimmt man die Aminosäurezusammensetzung mit der von St Moore - und W. H. Stein (Methods in
Enzymology, Band VI, Seite 819 bis 831, herausgegeben von Colovick und Kaplan in Academic Press, New York,
London 1963) angegebenen Methode, so kann man
folgende Zusammensetzung ermitteln:
Der Wert von Tryptophan wurde aus der Absorption von ultraviolettem Licht geschaut. Es ist naturgemäß,
daß die Ergebnisse der Aminosäure-Untersuchung nicht immer auf ein einziges ganzzahliges Mengenverhältnis
deuten, und daß derartige Messungen allgemein mit
gewissen Fehlern behaftet sind. Demgemäß beruhen die
in der Aufzählung wiedergegebenen Variationsgrenzen nicht auf einer Uneinheitlichkeit des Inhibitors, sondern
auf der unvermeidlichen Meßungenauigkeit des Analysenverfahrens. Kennzeichnend für den erfindungsgemä-
ßen Inhibitor ist aber, daß die Aminosäuren Apsparaginsäure. Glutaminsäure, Threonin, Glycin, Alanin und
Valin einen überdurchschnittlich hohen molekularen Anteil des Peptids einnehmen und daß Methionin in der
reinen Substanz gänzlich zu fehlen scheint. Da
Methionin eine weit verbreitete Aminosäure ist, ist ihre
weitgehende Abwesenheit ein gutes Kennzeichnungsmerkmal für den erfindungsgemäßen Inhibitor und kann
insbesondere auch bei Anreicherungsverfahren zur Reinheitsermittlung des Produkts dienen.
Der erfindungsgemäße Inhibitor reagiert positiv auf Peptidreagenzien aber negativ auf Phenol-Schwefelsäure.
Der erfindungsgemäße «-Amylase-Inhibitor enthält
keinen Zuckeranteil. Dadurch, sowie durch seine Aminosäurezusammensetzung, sein Molekulargewicht
und seinem isoelektrischen Punkt unterscheidet er sich allen bekannten «-Amylase-Inhibitoren. Reine
Asparaginsäure | 5—6 |
Threonin | 5-6 |
Serin | 3-5 |
Glutaminsäure | 5-6 |
Prolin | 2—3 |
Alanin | 5-6 |
Glycin | 5-6 |
Cystein | 3-4 |
Valin | 5-6 |
Isoleucin | 1-2 |
Leucin | 3-4 |
Tyrosin | 4-5 |
Phenylalanin | 0-2 |
Histidin | 1-2 |
Lysin | 0-1 |
Arginin | 2-3 |
Tryptophan | 1-2 |
von
3 - 10«AlE/gauf.
Für eine Substanz von Peptidnatur weist der
beanspruchte Arnylaseinhibitor eine bemerkenswerte
thermische Stabilität auf. Selbst Kochen in einem neutralen oder sCb^Vachsauren Medium (pH etwa 4—8)
während einer formte ist auf seine glucosihydrolasehemmeiden Eigenschaften ohne nennenswerten Einfluß.
Der Inhibitor ^ird durch Pepsin, Trypsin oder
Chymotrypsin im Vergleich zu anderen Proteinen nur sehr langsam prPl^olytisch inaktiviert Während des
therapeutischen Wfckungszeitraams ist daher nicht mit
einer nennenswerten Aktivitätsverminderung jm Verdäuungstrakt zu rechnen. ; - ■. I
Der Inhibitor weist eine hohe Wirküngsspezilität auf.
Die a-Amylase aus Pankreas wird außerordentlich stark
gehemmt, während demgegenüber bakterielle «^Amylasen, z.B. solche aus Bacillus, subülis, nicht meßbar
inhibiert werden. Desgleichen ist keine Wirkung gegen
/?-AmyIasen beobachtet worden.
Schon geringe Dosierungen des erfindungsgemäßen
Amylaseinhibitors führen zu einer vollständigen Hemmung der enzymatischen Aktivität der Pankreasamylase. Dieser Befund ist mit den klassischen Hemmechanismen nicht zu erklären, bei denen die Hemmung der
enzymatischen Katalyse vom relativen Mengenverhältnis von Inhibitor und Substrat (Stärke) abhängt Es muß
vielmehr eine irreversible Inaktivierung der Pankreasamylase durch den erfindungsgemäßen Inhibitor angenommen werden.
Zur Herstellung des Amylaseinhibitors bedient man sich erfindungsgemäß des Stammes Streptomyces
tendae 4158. Dieser Stamm unterscheidet sich vom Originalstamm S. tendae (Ettlinger et al. Arch. Mikrobiol. 31,351 (1959)) hinsichtlich seiner Sporen-Morphologie. Die Sporen sind kugelförmig und haben einen
Durchmesser von 1 μ. Die Eigenschaften des Stammes sind wie folgt:
gelb-braun;
keine Farbveränderung durch pH-Verschiebung
Farbe des versporten Luftmycels:
grau-braun (light grayish redish brown nach: ISCC
methods of designating colors)
Morphologie der Sporenketten:
Retinaculum apertum (RA)
Sporenmorphologie:
kugelförmige Sporen mit einem durchschnittlichen
Oberfläche.
Melaninbildung auf Peptonmedium:
positiv
Nitratreduktion:
positiv
Substratverwertungsspektrum:
Glucose + +
Arabinose +
Xylose +
Inositol + +
Mannitol + +
Fructose +
Rhamnose + +
Der Stamm Strepiomyces tendae 4158 ist bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der
Die Fermentation kann bei 25 bis 350C, insbesondere
bei 28 bis 300C, entweder submers in Schüttelkultur
oder in verschieden großen Fermentationsgefäßen unter Rührung und Belüftung durchgeführt werden.
Als Kulturmedium hat sich eine Kombination von Kohlenstoff- und Stickstoffquellen besonders bewährt
Ein solches Kulturmedium "enthält z. B. neben den bei
der Kultur von Mikroorganismen üblicherweise ange-
to wandten anorganischen Salzen mindestens eine Kohlenstoffquelle wie Stärke, Glucose, Rohrzucker, Fruktose, Lactose, Glycerin odefc Melasse^ sowie; mindestens
eine Stickstoffquelle wie Sojamehl, Cbrnsteep liquor,
Hefeextrakt, BaumwöIlsämenmehl,;Erdnußmehl, Pepto-
ts ne, Milchpulver, Nitrate oder Ammoniumsalze.
Als optimale Zusammensetzung hat sich erwiesen (Gewichts-% in Lösung) 3γτγ5% ,lösliche Stärke,
0,2—0,6% Cornsteep, 0,5—14% Glucose, 0,5—1%
(NH4J2HPO4, 03—0,6% Sojamehl, 0,5—1,5% Casein
pepton. Auch auf anderen stärkehaltigen Nährmedien,
z.B. einem solchen aas 2—6% Erdnußmehl, 1—3%
Kartoffelstärke, 3—5% Hafermehl, 3—5% Molkepulver, 1 —2% Molkensirup, 1 —2% Milchzucker wird der
Amylaseinhibitor in guten Ausbeuten erhalten, wobei
die Wahl der Stickstoffquelle und des Pufferanteils,
sofern man in physiologischen Bereichen ist, nicht so entscheidend ist Wird jedoch der Gehalt an Stärke
vermindert oder ganz gestrichen, so geht die Inhjfoitorenausbeute drastisch zurück. Erhöht man andererseits
Ji) die Stärkekonzentration wesentlich über 7%, so wird
aufgrund der hohen Viskosität die Sauerstoff-Versorgung der Mikroorganismen suboptimal. Damit verbunden sinkt die Inhibitorausbeute.
ü Inhibitors in der Regel zwischen der 10. und 30. Stunde
der Fementation ein. Innerhalb der nächsten 20 Stunden wird sie weitgehend abgeschlossen. Längere Fermentationszeiten haben keinen nachteiligen Einfloß auf die
Inhibitorausbeute, jedoch erhöht sich diese auch nicht
4» mehr nennenswert Daraus ergibt sich, daß die
Fermentationsansätze etwa 30—70 Stunden in Betrieb zu halten sind.
Zur Isolierung des Inhibitors wird aus der Fermentationslösung die Zellmasse durch Zentrifugieren, Filtrie-
> ren oder Nutschen entfernt, da sich der größte Teil des Wirkstoffes in der Regel in der klaren Kulturflüssigkeit
befindet
Falls aufgrund spezieller Fermentationsbedingungen ein Teil des Inhibitors im Zellmaterial verbleibt, so
"·" bereitet es keine Schwierigkeiten, den Wirkstoff durch
geeignete Methoden daraus zu extrahieren, z. B. durch Ausrühren mit einem wassermischbaren organischen
Lösungsmittel wie Methanol, wobei ein zusätzliches Mazerieren des Zellmaterials von Vorteil ist. Der im
">"> Extraktionsmiitil gelöste Wirkstoff kann-mittels Zentrifugieren oder Filtrieren von den ungelösten Zellbestandteilen befreit und wie die klare Kulturflüssigkeit
weiterbearbestet werden.
Aus der Kulturflüssigkeit läßt sich der Inhibitor durch an sich bekannte Verfahren der Protein- und Peptidchemie isolieren. So eignen sich Fällungen rait wassermischbaren organischen Lösungsmitteln wie Aceton,
Isopropanol oder anderen niederen Alkohlen, oder auch mit Salzen, wie Ammoniumsulfat.
f>5 Es ist weiter möglich, den Inhibitor auf entsprechende
Träger, z. B. auf Aktivkohle zu adsorbieren und diese durch Filtration oder Zentrifugation aus der wäßrigen
Lösung abzuscheiden. Das kann in einem w.eilen
27 Ol 890
pH-Bereich zwischen 2 bis 10 geschehen, insbesondere benützt man aber den Bereich zwischen pH 4 bis 6.
Ionenaustauscher können zur Abtrennung des erfindungsgemäßen Λ-Amylase-Inhibitors ebenfalls angewandt
werden. Da die beanspruchte Substanz sowohl saure als auch basische Eigenschaften hat, also
amphoter ist, kann sie sowohl mit Kationen- als auch mit Anionenaustauschern reagieren und mit Hilfe dieser aus
der Fermentationslösung entfernt werden. Hierbei
können die Techniken angewandt werden, die im Prinzip im Kapital über Ionenaustauscher im Biochemischen
Taschenbuch, herausgegeben von H. M. Rauen im Springer-Verlag 1964, 2.Teil, Seite 808-824. beschrieben
sind.
Bei der Aufarbeitung von Fermentationsansätzen, die die erfindungsgemäße Substanz in der Kulturflüssigkeit
enthalten, ist es häufig zweckmäßig, diese zu konzentrieren. Hierzu können die bekannten Verfahren für
Destillation, Ultrafiltration, Sprüh- und Gefriertrocknung oder andere bekannte Methoden herangezogen
werden. Aus dem so erhaltenen Konzentrat läßt sich der Inhibitor wieder mit den oben beschriebenen Verfahren
abtrennen. Aus Konzentraten, wie sie die eingeengten Kuiturfiltrate darstellen, kann der Inhibitor auch
dadurch angereichert werden, daß die wesentlichen Verunreinigungen entfernt werden. So haben sich zur
Abtrennung von fettartigen Stoffen Extraktionen mit organischen Lösungsmitteln bewährt. Durch Dialyse
oder gegebenenfalls Ultrafiltration (C. J. O. R und P. Morris »Separation methods in Biochemistry« Ditman
Publishing. London 1976, Seiten 944—950) kann die Lösung von niedermolekularen Substanzen befreit
werden. Hochmolekulare Stoffe, wie Nucleinsäuren, Polysaccharide oder manche Eiweißstoffe können
mittels fraktionierter Fällung durch Aussalzen oder durch Zugäbe eines fnü Wasser mischbaren Lösungsmittels,
wie Aceton oder eines niederen Alkohols abgesondert werden. Die Zugabe des Fällungsmittels
wird in diesen Fällen so dosiert, daß die leicht präzipitierbaren Stoffe mit Molekulargewichten über
100 000 ausgefällt werden, während der a-Amylase-Inhibitor
in Lösung bleibt. Die geschilderten Anreicherungsschritte können in beliebiger Reihenfolge kombiniert
und variiert werden. Auf diese Weise gelangt man zu Lösungen, die an Inhibitor stark angereichert sind.
Die Endreinigung kann mit verschiedenen gezielten Verfahren, wie Gel- und Ionenaustauscherchromatographie
erfolgen oder mit verwandten Verfahren, deren Trennprinzip nicht ausschließlich auf Ionenaustausch
beruht, wie z. B. die Trennung an Hydroxylapatit Weiterhin können Lösungsmittel- oder Salzfällungen
präparative Elektrophorese oder andere bekannte Verfahren angewandt werden. Besonders bewährt
haben sich Trennungen an Diäthylaminoäthyl-(DEAE-)-Gruppen
tragenden Ionenaustauschern sowie fraktionierte Fällungen mit Ammoniumsulfat oder Äthanol,
wobei sogar kristallines Material erhalten werden kann.
Die Eigenschaften des erfindungsgemäßen Inhibitors sind im Hinblick auf seine Anwendung als Therapeutikum
gegen Diabetes und Prädiabetes sowie Adipositas und Unterstützung von Diät interessant.
Stärkehaltige Nahrungs- und Genußmittel führen bei Tier und Mensch zu einem Anstieg des Blutzuckers und
dadurch auch zu einer vermehrten insuiinsekrektion des
Pankreas. Die Hyperglykämie kommt durch die Aufspaltung der Stärke im Verdauungstrakt unter
Einwirkung von Amyiase und Maltase zu Glukose zustande.
Bei Diabetikern ist diese Hyperglykämie besonders ausgeprägt und langanhaltend.
Bei Adipösen wirkt die vermehrte Insulinsektretion auf die Lipogenese und vermindert die Lipolyse.
Die alimentäre Hyperglykämie sowie die Hyperinsulinämie nach Stärkeaufnahme läßt sich durch den beanspruchten Amylase-Inhibitor vermindern. Diese Wirkung ist dosisabhängig. Der erfindungsgemäße Amylase-Inhibitor läßt sich daher als Therapeuticum
Die alimentäre Hyperglykämie sowie die Hyperinsulinämie nach Stärkeaufnahme läßt sich durch den beanspruchten Amylase-Inhibitor vermindern. Diese Wirkung ist dosisabhängig. Der erfindungsgemäße Amylase-Inhibitor läßt sich daher als Therapeuticum
ίο einsetzen bei Diabetes, Prädiabetes und Adipositas
sowie zur Unterstützung von Diät. Zu diesem Zweck empfiehlt sich eine Verabreichung, insbesondere zu den
Mahlzeiten. Die Dosierung, die sich nach dem Gewicht des Patienten sowie dem individuellen Bedarf ausrichten
soll, beträgt etv/a 10 000 bis 300 000 AIE, sie kann jedoch in begründeten Einzelfällen auch darüber oder
darunterliegen.
Der eriindungsgernäue Aniyiä&c-iriniuiiüi' cigiici sich
insbesondere zur oralen Verabreichung. Er kann als reine Substanz aber auch in Form einer pharmazeutischen
Zubereitung unter Verwendung der üblichen Hilfs- und Trägerstoffe angewandt werden.
Auch eine kombinierte Anwendung mit anderen Arzneimitteln wie blutzuckersenkenden oder lipidsen-
2"> kenden Substanzen kann von Vorteil sein. Da höhermolekulare Peptide als solche nicht oder nicht
nennenswert aus dem Verdauungstrakt resorbiert werden, sind von der erfindungsgemäßen Substanz
keine toxikologisch bedenklichen Nebenwirkungen zu
in erwarten. Aufgrund der nicht außergewöhnlichen
Aminosäurezusanimensetzung sind auch evtl. proteolytische Spaltprodukte als physiologisch unbedenklich
anzusehen. Dementsprechend konnten bei oraler Gabe auch hoher Dosen des Amylaseinhibitors an Versuchstie-
)i re keine auffälligen Symtome erkannt werden. Auch bei
intravenöser Applikation an Mäusen (! g/kg) wurde der erfindungsgemäße Inhibitor bei 24stündiger Beobachtungszeit
ohne erkennbare toxische Wirkung vertragen. Zur Prüfung der pharmakologischen Wirkung des
■to Amylase-Inhibitors erhielten nüchterne, männliche
Wistar-Ratten mit einem Gewicht zwischen 200 und 250 g den erfindungsgemäßen Hemmstoff gleichzeitig
mit 2 g Stärke pro kg Körpergewicht oral verabreicht, nachdem unmittelbar zuvor eine Blutentnahme zur
•>5 Bestimmung des Ausgangsblutzuckerwertes erfolgte. Weitere Blutentnahmen erfolgten nach 15 und 30 Minuten
sowie nach I, 2, 3 und 5 Stunden aus der Schwanzvene. Die Blutzuckerbestimmungen wurden
nach der Methode von Hoffman im Autoanal»zer
(J. Biol.Chem. 120.51 (1937))durchgeführt.
NZO-Mäuse weisen eine gestörte Glucosetoleranz auf. Sie eignen sich deshalb besonders gut für
Untersuchungen bei denen der Blutglucosespiegel beeinflußt wird. Die Versuchsanordnung entspricht der
bei Ratten. Die Blutentnahme erfolgt aus dem Orbitalvenen-Plexus. Der Blutzuckerverlauf wird über
3 Stunden verfolgt.
In analoger Weise wird der Wirkstoffnachweis an NMRI-Mäusen erbracht. Die Blutentnahmen erfolgen
ebenfalls aus dem Orbitalvenen-Plexus und der Blutzukkerverlauf wird über 3 Stunden verfolgt.
Unter diesen Versuchsanordnungen zeigten die mit dem erfindungsgemäßen Inhibitor behandelten Tiere
einen gegenüber unbehandcltcn Tieren geringeren,
bz protrahierten Blutzuckeranstieg.
Amylasetest
Eine Amylase-Inhibitoreinheit (AIE) ist definiert als
Eine Amylase-Inhibitoreinheit (AIE) ist definiert als
27 Ol
die Inhibitormenge, die unter den Testbedingungen zwei Amylaseeinheiten (AE) zu 50% zu hemmen vermag.
Eine Amylasecinheit ist nach internationaler Übereinkunft die Enzymmenge, die in einer Minute I μ
Äquivalent glucosidischer Bindungen in der Stärke spaltet. Die μ VaI gespaltener glucosidischer Bindungen
werfen als μ VaI reduzierender Zucker photometrisch
mit Dinitrosalizylsäure bestimmt. Die Angaben sind als
μΜοΙε Maltose berechnet, die anhand einer Maltose-Eichgeraden ermittelt werden, ι"
Die Teste werden folgendermaßen durchgeführt:
a-Amylase aus Schweinepankreas und die zu testende
Lösung werden gemeinsam in 1,0 ml 20 mM Phosphatpuffer, pH6,9 + 1OmMNaCI 10-20 min bei 37°C
vorinkubiert Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe von 1,0 ml löslicher Stärke nach Zulkowski
(0,25% in dem angegebenen Puffer) gestartet. Nach genau 10 min wird die Reaktion mit 2,Om! Diniirosaiizylsäure-Farbreagenz (nach Boehringer Mannheim:
Biochemica-Information 11) abgestoppt und zur Farbentwicklung 5 min im siedenden Wasserbad erhitzt. Nach
dem Abkühlen wird die Extinktion bei 546 nm gegen den Reagentienleerwert gemessen. Die 50%ige Hemmung wird im Vergleich zur ungehemmten Enzymreaktion durch Einsatz verschiedener Inhibitormengen
graphisch mittels der Wahrscheinlichkeitsauftragung bestimmt.
Der Stamm Streptomyces tendae 4158 wird auf w
Schrägröhrchen mit einem Nährboden folgender Zusammensetzung geimpft:
50 g Haferflocken
ad. 1000 ml H2O pHA 7,2
Das beimpfte Röhrchen wird 7 Tage bei 300C
bebrütet und danach bei +4° C gehalten. Die Sporen werden mit 10 ml sterilisiertem A. dest oder physiologischer NaCl-Lösung von dem Schrägröhrchen abgeschwemmt. 1,0 ml der Suspension dient zur Beimpfung «ο
eines 300 ml Erlenmeyerkolbens, der mit 35 ml sterilisierter Nährlösung mit einem pH-Wert von 7,7 und
folgender Zusammensetzung beschickt ist:
1% Glucose
1% Sojamehl
0,25% NaCl pH 7,7.
Der Kolben wird bei 220 Upm 48 Stunden bei +300C
auf einer Schüttelmaschine bei einer Amplitude von 4 cm geschüttelt Danach werden je 5 ml dieser
Vorkultur in mehrere Erlenmexerkolben überführt, die
mit 35 ml sterilisierter Nährlösung beschickt sind und einen pH-Wert von 83 haben. Die Zusammensetzung
dieser Hauptkultur ist folgende:
4% Stärke
0,4% Cornsteep liq.
1.0% Glucose
0,8% (NH4J2HPO4
0,4% Sojamehl
1,0% Pepton pHA83-
Die Hauptkulturen werden ebenfalls bei +300C mit
220 Upm auf einer Schüttelmaschine mit einer Amplitude von 4 cm 2—3 Tage geschüttelt Am ersten, zweiten
und dritten Kulturtag wird der Gehalt an «-Amylase-Inhibitor gemäß Testvorschrift bestimmt
Der Stamm Streptomyces tendae 4158 liefert unter den beschriebenen Versuchs- und Kulturbedingungen
60 durchschnittlich 100 ΑΕΙ/ml bei einem End-pH von 5,2.
Beispiel 2
Beispiel 2
Ansatz wie im Beispiel 1, jedoch wird als Hauptkultur ein Fermentationsgefäß von 3001 Gesamtvolumen
gewählt, das mit 2001 einer sterilisierten Nährlösung folgender Zusammensetzung beschickt ist:
40/0 | Stärke |
0,4% | Cornsteep liq. |
1,0% | Glucose |
0,8% | (NH4)jHPO4 |
1,0% | Caseinpepton |
0,1% | DesmophenpHA83—8,5. |
Die Sterilisationszeit für den Ansatz beträgt 45 min bei 121°C und 1 bar, wobei die Glucose separat
sterilisiert und nach Abkühlung des Fermenters auf Betriebstemperatur steril zugeführt wurde.
Der pH-Wert soll nach der Sterilisation 6,8 betragen und wird nach Bedarf mit sterilisierter Säure (2 η
H3PO4) oder Lauge (2 η NaOH) auf diesen Wert
eingestellt. Beimpft wird die Hauptstufe mit 201 entsprechend 10% einer wie unter Beispiel 1 beschriebenen und in einem Kleinfermenter von 301 Totalvolumen hergestellten Vorkultur.
Es wird 50 bis 70Std. bei 300C fermentiert Die
Belüftung beträgt 6 mVStd. bei einer Rührung von 250 Upm und einem Überdruck von 0,3 bar.
Durch die Probenahme wird der Fermentationsverlauf hinsichtlich der Inhibitoraktivität, des Substratabbaues, der Biomasseentwicklung und des physikalischtechnischen Verhaltens der Kulturlösung (Oberflächenspannung, Viskosität, Dichte, osmotischer Druck)
überwacht und verfolgt.
Die maximale Inhibitoraktivität wird ab der 60. Kulturstundc mit durchschnittlich !05AIEZm! erreicht
Danach wird der Fermenterinhalt der Aufarbeitung zugeführt.
Ansatz wie in Beispiel 1 und Beispiel 2, jedoch wird als Hauptstufe ein Biorekator von 40001 Gesamtvolumen benutzt der mit 25001 folgender Nährlösung
beschickt ist:
6% | Stärke |
1,0% | Glucose |
0,4% | Cornsteep liq. |
0,8% | (NH4J2HPO4 |
1,0% | Soypepton |
0,1% | Desmophen pHA 7,0—73. |
Die Sterilisationszeit für diesen Ansatz beträgt 60 min bei 121°C und 1 bar, wobei die Glucose separat
sterilfiltrieit und nach Abkühlung des Fermenters auf
Betriebstemperatur diesem unter sterilen Bedingungen zugepumpt wird
Der pH-Wert wird — wenn nötig — mit steriler Säure
(H3PO4) oder Lauge (NaOH) auf einen Anfangswert von
7,0—73 eingestellt
Beimpft wird mit 2001 einer unter Beispiel 2 beschriebenen und hergestellten Vorkultur.
Die Fermentationszeit beträgt 70Std, wobei bei
einer Temperatur von 300C, einer Belüftung von eONmVStd, einem Überdruck von 0,5 bar und bei
18Ö Upm fermentiert wird-
Durch Probenahme — wie unter Beispiel 2 beschrieben — werden alle wichtigen Prozeß, Organismen- und
Aktivitätsdaten über die gesamte Fermentationszeit
27 Ol 890
ίο
verfolgt.
Nach 70stündiger Fermentation ist eine durchschnittliche Aktivitätskonzentration von 95 AIE/ml erreicht.
Die Fermentation wird daraufhin abgebrochen und die Kulturlösung der Aufarbeitung zugeführt.
101 einer filtrierten Kühlflüssigkeit mit einer
Wirksamkeit von 100 AIE/ml wird in einem Sprühtrockner getrocknet und ergibt 400 g eines hellbraunen
Pulvers. Dieses wird dann zur Entfettung mit einer Mischung von 1 I Methanol und 1 1 Chloroform
gründlich durchgerührt und anschließend abgenulscht. Das noch lösungsmittelfeuchte, ungelöste Produkt in
dem die Wirksubstanz enthalten ist, wird in 31 Wasser gelöst, auf pH 6,5 gestellt und mit 4,51 Methanol
versetzt. Es entsteht hierbei ein heller, flockiger Niederschlag, der durch Zentrifugieren entfernt und
verworfen wird, da er nur vernachlässigbare Mengen des «-Amylasehemmstoffes enthält. Der dunkle Überstand der Methanolfällung, der den gewünschten
Inhibitor enthält, wird dann im Vakuum vom Methanol befreit und die nun auf 2,5 1 aufkonzentrierte Lösung
gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Das Retenat enthält 9 g Trockensubstanz (spez. Aktivität
96 Al E/mg). Das Retenat wird anschließend bei pH 5,5
mit Ammoniumsulfat auf 50% Sättigung gebracht, wozu bei 250 ml 79 g des Salzes erforderlich sind. Bei dem
Aussalzen entsteht ein Niederschlag, der rund 90% der aktiven Substanz enthält. Nach dem Zentrifugieren wird
der Überstand verworfen. Den Niederschlag löst man erneut in destilliertem Wasser und bei pH 8 wird wieder
mit Ammoniumsulfat versetzt, aber diesmal zunächst nur bis zu 15% Sättigung und nach Entfernen des
Niederschlages weiter bis 35% Sättigung. Der Niederschlag der Aussaizung zwischen 15 und 35% beinhaltete
die Hauptmenge des Amylaseinhibitors. Diese fraktionierte Fällung wird wiederholt
Das entstandene Produkt ist nach Dialyse und Trocknung 360 mg mit einer spez. Aktivität von
992 AlE/mg. 350 mg dieser Rohsubstanz werde dann in
Sephades® G-50 fine in einer 100 cm langen und 1,21 fassenden Glassäule aufgetrennt und angereichert Als
Quell- und Elutionsmittel dient wäßrige 5 Millimolar-Phosphatpufferlösung von pH 8, dem 0,02% Natriumazid zugesetzt worden ist Die Rohsubstanz wird in
15 ml des gleichen Puffers gelöst und auf die Säule aufgetragen. Die Elution erfolgt während zwei Tagen,
wobei Fraktionen von 15 ml Inhalt abgenommen werden. Die vier aktivsten Fraktionen werden gesammelt, salzfrei dialysiert und gefriergetrocknet Sie
ergeben 60 mg eines weißen Pulvers mit einer Aktivität von 2520 AIE «-Amylaseinhibitor/mg.
22001 Kulturflüssigkeit werden auf 6° gekühlt und
nach Zusetzung von 2% Kieselgur über einer Kammerpresse filtriert. Der Filterkuchen (ca. 450 kg
feucht) wird verworfen, das klare Filtrat (17501 mit
einer Aktivität von 95 AIE/ml) wird nach Zugabe von 500 g Natriumazid über einen Fallstromverdampfer auf
1201 eingeengt Das erhaltene Konzentrat wird auf Γ C
gekühlt und mit 1201 vorgekühkern Aceton langsam
unter Rühren versetzt Zur vollständigen Fällung wird dann noch V« Stunde gerührt und nach Zugabe von 1 kg
Kieselgur über eine Schenkpresse geklärt Der Feststoff mit dem Filterhilfsmittel wird verworfen. Das acetonische Filtrat das die Wirksubstanz enthält, wird unter
Rühren und Kühlen mit 3801 Aceton vermengt, wodurch eine ungefähr 80%ige acetonische Suspension
entsteht. Der entstandene (2.) Niederschlag enthält den gewünschten Amylaseinhibitor.
Er wird dadurch gewonnen, daß man die Fällungsflüssigkeit ohne Rühren stehen läßt. Hierbei sinkt der
Niederschlag ab und der Überstand kann abgehebert werden. Aus dem Überand dieser zweiten Acetonfällung können geringe Mengen Niederschlag durch
ίο· Zentrifugation abgetrennt werden. Dieser Feststoff
wird bei pH 7 gelöst und der Lösung des Niederschlages (siehe unten) zugesetzt. Der im Fällungskessel verbleibende Hauptniederschlag wird in 1201 Wasser bei pH 7
gelöst und die entstandene Lösung mit einer Durchlauf
zentrifuge (Cepa®, 1700 Upm) geklärt. Dabei werden
90 g inaktive Schwebeteilchen entfernt. Die klare Wasserphase wird nun mit einer DDS-Ultrafiltrationsaniage (membran Nr. 800) auf 151 konzentriert und
dialysiert. Um die Entsalzung zu vervollständigen, wird
das Retenat mit destilliertem Wasser verdünnt und
erneut konzentriert. Nach zwei- bis dreimaliger Wiederholung ist das Retenat, in dem der Amylaseinhibitor enthalten ist, praktisch salzfrei. Aus 501 Lösung
des Retenats wird dann der Hemmstoff bei pH 5,5 durch
Zugabe von 19,5 kg Ammoniumsulfat gefällt, abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Der Niederschlag
wird erneut in 401 Wasser gelöst und diesmal bei pH 7,5 mit 12,5 kg Ammoniumsulfat präzipitiert. Nach der
Abtrennung der Klarphase in einer Röhrenzentrifuge
wird der Niederschlag wie im Beispiel 4 fraktioniert
gefällt: Aus 401 der wieder aufgelösten Substanz wird bei pH 5,5 durch Zugabe von 3,2 kg Ammoniumsulfat
zunächst ein inaktiver Niederschlag gefällt, der abgetrennt und verworfen wird. Dann wird durch weiteres
-15 Aufkonzentrieren der flüssigen Phase mit 7,4 kg
Ammoniumsulfat der Hauptteil der Aktivität aus der
Flüssigkeit abgeschieden. Dieser Niederschlag wird gesammelt, gegen destilliertes Wasser dialysiert und
gefriergetrocknet Es resultieren 114 g eines braunen
Zur weiteren Auftrennung wird eine Glassäule von 5 cm 0 und 50 cm Höhe (ungefähr 1 1 Inhalt) mit
DEAE-Sephadex A-25® gefüllt, das vorher mit V30 molarem Phosphorpuffer auf pH 7,5 und 0,02%igem
Natriumazid equilibriert worden ist Nun werden 10 g Substanz gelöst in 100 ml des gleichen Puffers und auf
die Säule aufgetragen. Zunächst wäscht man die Säule mit 11 des gleichen Puffers, dann wird zu diesem
Elutionsmittel allmählich Kochsalz so zugemischt, daß
ein kontinuierlicher Gradient gewährleistet ist Wird der
der Amylaseinhibitor in den Fraktionen, in denen die
destilliertes Wasser dialysiert Die Gefriertrocknung ergibt 5,6 g hellbraune Substanz mit einer Wirksamkeit
von 2200 AIE/mg.
Hierauf wird noch eine gelchromatographische Reinigung — wie im Beispiel 4 beschrieben —
angeschlossen. Aus den 5,6 g Material resultieren 4,1 g
eines farblosen Pulvers, dessen Aktivität 2800 AIE/mg beträgt Die Aminosäureanalyse des Produktes ergibt
nach einer 20stündigen Salzsäurehydrolyse mit Hilfe eines Beckman-Multichromanalysators folgende Zu-
b5 sammensetzung:
Asparaginsäure
Threonin
7,72%
7,66%
11 | 27 01 890 | 12 | |
535% | 230% | ||
Serin | 10,05% | Isoleucin | 5,18% |
Glutaminsäure | 3,43% | Leucin | 10,24% |
Prolin | 4,93O/o | Tyrosin | 335% |
Glycin | 5,84% | Phenylalanin | 3,01% |
Alanin | 4,26% | 5 Histidin | 1,45% |
'/2 Cystein | 7,72% | Lysin | 5,16% |
Valin | 0,41% | Arginin | |
Methionin | |||
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen | |||
Claims (2)
1. Peptidischer Glycosidhydrolase-Inhibitor, erhältlich durch Kultivieren von Mikroorganismen der
Gattung Streptorayces und Gewinnen des Inhibitors aus der Kultur, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Mikroorganismus den Stamm Streptomyces tendae4158 (ATCC-Nr. 31 210) verwendet.
2. Verwendung des Inhibitors gemäß Anspruch 1
zur Regulierung des Blutzuckerspiegels.
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