DE2209833C3 - Herstellung eines Amylaseinhibitors - Google Patents
Herstellung eines AmylaseinhibitorsInfo
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Description
Gegenstand älterer Patentanmeldungen (deutsche Patentanmeldung P 20 64 092.0, brit Patentanmeldung
Nr. 59 939/71) ist die Erkenntnis, daß eine Reihe von
Actinomyceteii Inhibitoren von Glycosidhydrolasen,
und zwar insbesondere Inhibitoren für Glycosidhydrolasen, vorzugsweise kohlenhydratspaltender Enzyme des
Verdauungstraktes, bilden. Eine Gruppe dieser Inhibitoren ist relativ hitzestabil und bei Raumtemperatur
säure- und alkalistabil. Diese Inhibitoren gehören chemisch in die Klasse der Oligo- oder Polysaccharide
bzw. deren Derivate.
In den genannten Patentanmeldungen, z. B. in den Beispielen 28 — 38 der deutschen Patentanmeldung, wird
die Gewinnung eines derarigen Amylaseinhibitors aus dem zur Ordnung Actinomycetales gehörenden Actinoplanaceen-Stamm SE 50 beschrieben. Die Kulturlösungen optimaler Fermentationen dieses Stammes enthalten ca. 30 000-40 000 AIE/ml, die daraus gewonnenen
reinsten Inhibitoren besitzen spezifische Aktivitäten von3-8 ■ WAmylase-InhibitorEinheiten (AI E)/g.
Aufgabe der Erfindung ist die Ermittlung eines Verfahrens zur Herstellung eines Amylaseinhibitors, bei
dem wesentlich höhere Ausbeuten und reinere Produkte als nach dem Verfahren der genannten Patentanmeldungen erhalten werden.
Dabei wurde gefunden, daß bei Verwendung einer Variante des Stammes SE 50, nämlich des Stammes
SE 50/13, und bei Verwendung von Nährlösungen mit einem hohen Stärkegehalt, Kulturbrühen mit Gehalten
von 100 000-110 000 AIE/ml erhalten werden.
Die erfindungsgemäß einzusetzende Variante SE 50/13 erhält man, wenn man Kulturen des Stammes
SF 50 auf Nähragrarplatten ausstreicht oder anderweitig auf dem Nähragrar verteilt und nach mehrtätiger
Bebrütung, z. B. bei 28° C, die sich entwickelten Kolonien abimpft und auf ihre Fähigkeit, Amylaseinhibitor zu produzieren, prüft. Man kann die Ausbeute an
Varianten in bekannter Weise erhöhen, wenn man die Kultur vor dem Ausstreichen Mutagenen aussetzt.
Außerdem hat es sich gezeigt, daß sich das inhibierende Prinzip bei neutralen pH-Werten (5-8)
direkt aus der Kulturlösung an Aktivkohle adsorbieren und mit wäßrigen Alkoholen oder Aceton, besonders
bei sauren pH-Werten (1 —3), wieder desorbieren läßt. Da bei sauren pH-Werten (1 -3) überraschenderweise
nur spurenweise Adsorption des inhibierenden Prinzips, dagegen aber sehr starke Adsorption der die Kulturbrühen verunreinigenden Farbstoffe an die Kohle stattfindet, kann man mit einer derartigen Voradsorption der
Kulturlösungen bei sauren pH-Werten reinere Inhibitoren mit höherer spezifischer Aktivität gewinnen. [A b b.:
Diese zeigt die Adsorption des amylaseinhibierenden Prinzips und der braunen Farbstoffe (gemessen als
Extinktion bei 550 nm) aus der Kulturlösung bei sauren b;'.w. neutralen pH-Warten.]
.1°
35
40
fio notwendigerweise in allen Nährlösungen mehr Amylaseinhibitor bilden als der Eiternstamm. Es hat sich
jedoch gezeigt, daß besonders hohe Ausbeuten an Amylaseinhibitor gebildet werden, wenn man in der
Nährlösung mit Stärkegehalten von 4 - 6% arbeitet.
Kultiviert man z. B. in einer Nährlösung, die neben
2% Stärke noch 1% Glucose, 0,5% Caseinhydrolysat, 1% Hefeextrakt und 0,4% CaCO3 enthält, 3 Tage bei
28° C, so erhält man mit dem Stamm SE 50 Nährlösungen, die 30-40000 AIE/ml und mit dem Stamm
Se 50/13 Nährlösungen, die 50-60 000 AIE/ml enthält
In einer Nährlösung der Zusammensetzung 5% Stärke, 1% Hefeextrakt, 0,2% K2HPO4 erhält man nach
3tägiger Fermentation dagegen mit dem Stamm SE 50 50-60000 AIE/ml, mit dem Stamm SE 50/13
100-130 000 AIE/ml.
Die Ausbeute an Amylaseinhibitor ist vom Gehalt an Stärke abhängig. Bis etwa 5,5-6% Stärke in der
Nährlösung steigt der Gehalt an Amylaseinhibitor an. Bei höheren Konzentrationen werden die Nährlösungen zu viscos, so daß andere Einflüsse, wie z. B. die
schlechte O2-Versorgung, während der Fermentation
die Ausbeute vermindern.
Die übrigen Bestandteile der Nährlösung können stark schwanken. Man kann anstelle der Stickstoffquellen Caseinhydrolysat -l- Hefeextrakt nur die entsprechende Menge Hefeextrakt oder Caseinhydrolysat
verwenden oder beide durch andere Stickstoffquellen, wie z. B. Pepton, ersetzen.
Auch das Puffersystem, bestehend aus der Anfangseinstellung, dem CaCO3 und dem Kaliumphosphat, kann
verschieden zusammengesetzt sein. Es muß nur gewährleistet sein, daß der pH-Wert während der
Fermentation selbstverständlich in physiologischen Grenzen, d. h. zwischen 5,0 und 8,5, am besten zwischen
6,0 und 7,8, bleibt. Dies kann auch durch automatische Säuren-Laugen-Zugabe erreicht werden.
Andere Zucker, wie Glucose, können, in kleinen Konzentrationen zugesetzt, die Fermentation, besonders das Anwachsen, beschleunigen.
Der Stamm SE 50 ist im Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn/Holland unter der Nummer
CBS 961.70 und der Stamm SE 50/13 unter der Nummer CBS614J1 hinterlegt.
Die Erfindung ist also durch den Patentanspruch definiert.
Amylasetesi
Eine Amylase-Inhibitor-Einheit (1 AIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Amylaseeinheiten zu
50% inhibiert. Eine Amylaseeinheit (AE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten
angegebenen Testbedingungen I μ Äquivalent glucosidischer Bindungen in der Stärke spaltet. Die μνβΐ
gespaltenen Bindungen werden als μ\α\ gebildeter
reduzierender Zucker mit Dinitrosalicylsäure kolorimetrisch bestimmt und mit Hilfe einer Maltoseeichkurve
als μ VaI Maltoseäquivalente angegeben. Zur Durchführung des Testes werden 0,1 ml Amylaselösung (20 — 22
AE/ml) mit 0-10μg Inhibitor oder 0-20 μΐ der zu
testenden Lösung in 0,4 ml 0,02 m Natiriumglycerophosphatpuffer/0,001 m CaCb pH 6,9 versetzt und etwa
10-20 Minuten in einem Wasserbad von 350C äquilibriert. Dann wird 5 Minuten mit 0,5 ml einer auf
350C vorgewärmten 1% Stärkelösung (Stärke, löslich, der Firma Merck, Darmstadt, Nr. 1252) bei 35° C
inkübicrt und anschließend mit! m! Dinitrosä!icw!säur£-
Reagens (nach P. Bernfeld in Colowick-Kaplan,
Meth. Enymol, Band 1, Seite 149) versetzt Zur
Farbentwicklung wird der Ansatz 5 Minuten auf dem siedenden Wasserbad erhitzt, dann abgekühlt und mit
10 ml destilliertem Wasser versetzt. Die Extinktion bei
540 nm wird gegen einen entsprechend angesetzten Leerwert ohne Amylase gemessen. Zur Auswertung
wird aus einer vorher aufgenommenen Amylaseeichicurve die nach Inhibitorzusatz noch wirksame Amylaseaktivität
abgelesen und daraus die prozentuale Hemmung der eingesetzten Amylase errechnet Die prozentuale
Hemmung wird als Funktion des Quotienten
μ% Inhibitor*)
AE**)
·) Bezogen auf Trockensubstanz.
**) AE im nicht inhibierten Ansatz der gleichen Serie.
**) AE im nicht inhibierten Ansatz der gleichen Serie.
aufgetragen, der 50% Hemmungspunkt aus der Kurve abgelesen und auf Al E/mg Inhibitor umgerechnet.
Zur Herstellung derartiger hochaktiver Inhibitoren wird der Stamm SE 50/13 in einer Nährlösung aus 5%
Stärke, 1% Hefeextrakt und 0,2% K2HPO4 3 Tage bei
28° C in Schüttelkolben oder Fermentern verschiedener Größe fermentiert. Nach Beendigung der Fermentation
stellt man zur Entfärbung den ganzen, braungefärbten Ansatz mit halbkonz. HNO3 auf pH 1—3, an-, besten
2 — 2,5, ein und versetzt mit 2—10g, am besten 5g,
Aktivkohle/Liter Kulturlösung. Anschließend trennt man das Mycel und die Aktivkohle durch Zentrifugieren
oder Filtrieren, evtl. unter Zuhilfenahme eines Filterhilfsmittels, ab und gewinnt aus dem klaren, hellgelben
Überstand bzw. Filtrat nach Neutralisation mit NH3 die Aktivität durch Einengen und fraktionierte Alkoholfällung
nach Beispiel 38 der deutschen Patentanmeldung P 20 64 092.0 oder durch Adsorption an Aktivkohle.
Dazu wird das neutralisierte Filtrat mit 0,3—1,5g,
vorzugsweise 0,75-1 g, Aktivkohle pro 106 AIE versetzt, 10—120 Minuten, vorzugsweise 20-30 Minuten,
bei Raumtemperatur gerührt und abfiltriert — evtl. unter Zuhilfenahme von Filterhilfsmittel. Vom Kohlerückstand
wird das inhibierende Prinzip mit 30 — 60%, am besten 50%, Äthanol oder 30-60%, am günstigsten
50%, Dioxan oder 20-50%, am besten 35%igem, Acetan bei am günstigsten sauren pl ί-Werten von 2 — 3
desorbiert.
Es ist bekannt, daß bei Tieren und Menschen nach Aufnahme von stärkehaltigen Nahrungs- und Genußmitteln
Hyperglykämien auftreten, die infolge einer raschen Spaltung der Stärke durch Amylasen des
Verdauungstraktes nach folgendem Schema
Stärke
Amylase, Maltase
Glucose
bewirkt werden. Diese Hyperglykämien sind bei Diabetikern besonders stark und anhaltend ausgeprägt.
Bei Adipösen bewirkt die aiimentäre Hyperglykämie oftmals eine besonders starke Insulinsekretion, die
ihrerseits zu vermehrtem Fettaufbau und vermindertem Fettabbau führt. Im Anschluß an eine derartige
Hyperglykämie tritt bei stoffwechselgesunden und adipösen Personen infolge der Hyperinsulinämie häufig
eine Hypoglykämie auf. Bekannt ist, daß sowohl Hypoglykämie als auch im Magen verweilender
Speisebrei die Produktion von Magensaft fördern, der seinerseits die Entstehung einer Gastnüs, eines Ulcus
duodeni oder ventriculi auslöst oder begünstigt.
Es hat sich nun gezeigt daß nach erfindungsgemäßer Methode gewonnener und isolierter und gereinigter
Amylaseinhibitor die aiimentäre Hyperglykämie und Hyperinsulinämie nach Belastung von Ratten und
Menschen mit gekochter und ungekochter Stärke erheblich vermindert Der erfindungsgemäß erhaltene
Inhibitor eignet sich deshalb als Therapeuticum für die
folgenden Indikationen:
Adipositas, Hyperlipämie (Atherosklerose), Diabetes,
ι ο Prädiabetes, Ulcus ventriculi et duodeni.
Dosierung:
1000-100 000 AIE/kg ein oder mehrmals täglich
vor und/oder während und/oder nach den Mahlzeiten p. os.
Zubereitungsformen:
Tablette, Dragee, Kapsel, Lösung, Suspension, Granulat, Kaugummi und als Zusatz zu stärkehaltigen
Lebens- und/oder Genußmitteln.
Vergleich
Beimpft man einen l-Liter-Erlenmeyerkolben mit
120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 2% Stärke, 1% Glucose, 0,5% Caseinhydrolysat, 1,0%
Hefeextrakt, 0,4% CaCO3.(Sterilisation: 30 Minuten
121°C, pH vor der Sterilisation auf 7,2 mit KOH eingestellt) mit 1 ml einer Vorkultur des Stammes
SE 50/13 (gewonnen in einer Nährlösung der Zusammensetzung 3% Glycerin, 3% Sojamehl, 0,2% CaCO3,
Sterilisation: 30 Minuten 121°C, pH nach Sterilisation 7,2) und bebrütet auf einer Rundkettelmaschine bei
280C, so erhält man nach 3tägiger Fermentation eine Kulturbrühe,die 55 000AIEZmI enthält.
Versuch 1
Arbeitet man nach dem Vergleich, jedoch mit einer Nährlösung der Zusammensetzung 5% Stärke, 1,0%
Hefeextrakt, 0,2% K2HPO4, so erhält man eine
Kulturbrühe,die 108 000 AlE/ml enthält.
Versuch 2
Beimpft man eine Nährlösung der Zusammensetzung 4% Stärke, 0,7% Hefeextrakt nach dem Vergleich mit
dem Stamm SE 50/13, so erhält man nach 3tägiger Fermentation eine Kulturbrühe mit 80 ΓΟ0 AlE/ml.
Versuch 3
55
55
Beimpft man eine Nährlösung der Zusammensetzung
5% Stärke, 1,0% Hefeextrakt, 0,4% K2HPO4 nach dem
Vergleich mit dem Stamm SE 50/13, so erhält man nach 4tägiger Fermentation eine Kulturbrühe mit 105 000
AI E/ml.
Versuch 4
Beimpft man eine Nährlösung der Zusammensetzung
fts 6% Stärke, 1,3% Hefeextrakt, 0,2% K2HPO4 nach dem
Vergleich mit dem Stamm SE 50/13, so erhält man nach 4iagigcr Fermentation eine Kuiturbrühe mit i2öööÖ
AI E/ml.
Versuch 5
Beimpft man einen Glasfermenter mit 8 Ltr. Nährlösung nach Versuch 1 mit einem 3 Tage alten
Schüttelkolben und bebrütet unter intensiver Rührung und Belüftung 3 Tage bei 28° C, so erhält man eine
Kulturbrühe, die 105 000 AIE/ml enthält.
IO
6 Ltr. Fermentationsbrühe (105 · 10* AIE/Ltr, Gesamtaktivität 630· 106AIE) nach Versuch 5 werden
nach dem Abkühlen auf 20° C mit halbkonzentrierter HNO3 auf pH 2,5 eingestellt, mit 30 g Carboraffin-Aktivkohle versetzt und 10 Minuten gerührt. Anschließend ,5
wird 15 Minuten bei 10 000 Upm zentrifugiert und der
klare, hellgelbe Überstand (5,1 Ltr, 100 ■ 10« AIE/Ltr,
Gesamtaktivität 510 · 10* AIE) nach Neutralisation mit NH3 auf 500 ml eingeengt (970 · 10« AIE/Ltr, Gesamtaktivität 485 · 10* AIE). Die 500 ml Konzentrat wurden
45 Minuten mit 200g Amberlite IRA 410Cl- gerührt,
abgenutscht und mit Vs Vol.-400 ml Methanol versetzt,
um die Hauptmenge der höhermolekularen Stärkeabbauprodukte (zusammen mit noch vorhandenen Aktivkohleresten) auszufällen. Es wird 5 Minuten bei
5000 Upm zentrifugiert. Die 850 ml überstand (450 ■ 10« AIE/Ltr, Gesamtaktivität 380 · ΙΟ6 AIE)
werden unter intensivem Rühren in 4 Ltr. Trockensprit eingetropft. Die weiße, flockige Fällung wird abgenutscht, 3mal mit Trockensprit und 2mal mit Äther ,0
gewaschen und im Vakuum bei 50° C getrocknet. Ausbeute: 36 g eines weißen Pulvers mit 10 · 106 AIE/g
(Gesamtaktivität 360 ■ 106AIE) = SZ0Zo Ausbeute (bezogen auf Aktivität).
Aufarbeitung einer erfindungsgemäß erhaltenen
Kulturbrühe
2 Ltr. Fermentationsbrühe (100 ■ 10- AIE/itr, Gesamtaktivität 200 · 10* AIE) werden mit halbkonz.
HNO3 auf pH 2,5 eingestellt und mit 10 g Carboraffin-Aktivkohle versetzt. Nach lOminütigem Rühren werden
bei 15 000 Upm in 20 Minuten das Mycel und die Kohle
sedimentiert. Der klare Überstand (1,6 Ltr, 95- 10*
AIE/Ltr, Gesamtaktivität 152 · 106AIE) wird nach dem
Neutralisieren mit Ammoniak mit 120 g Aktivkohh versetzt und 1 Stunde gerührt. Danach werden 60 j
Clarcell als Filterhilfsmittel zugesetzt und anschließe™ abgenutscht. Der Kohlerückstand wird mit 500 m
Wasser und 500 ml 10% Äthanol gewaschen unc anschließend 2mal mit je 500 ml 35%igem Aceton, da:
vorher mit HCI auf pH 2,5 eingestellt worden war versetzt und 20 Minuten gerührt. Nach dem Rührer
wird abgenutscht und die Filtrate vereinigt (900 ml 120 · 106 AIE/Ltr, Gesamtaktivität 110 · 10* AIE). Da;
Desorbat wird mit NHj neutralisiert und auf 50 ml arr Rotationsverdampfer bei ~ 20 Torr eingeengt, mit 40 m
Methanol unter Rühren vorgefällt (Fällung verwerfen und das Filtrat in 500 ml Trockensprit unter intensiven
Rühren eingetropft. Der Niederschlag wird abge nutscht, mit Äthanol und Äther gewaschen und irr
Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Ausbeute 4,9 g mit 14 ■ 10* AIE/g s 340/0 Ausbeute, bezogen au
Aktivität der Ausgangslösung.
erfindungsgemäß erhaltenen Amylaseinhibitors
an Ratte und Mensch
Zur Erzeugung einer alimentären Hyperglykämie nach Applikation von Stärke erhalten Ratten (n=6) 1 g
gekochte Stärke/kg p. os. Jeweils 6 andere Ratter erhalten zusätzlich zur Stärke den bei der Aufarbeitung
der Kulturbrühe des Versuchs 5 erhaltenen Amylaseinhibitor in der angegebenen Dosierung. Die Blutglucose
wird in den angegebenen Zeitintervallen nach Stärkeapplikation im Blut aus dem retroorbitalen Venenplex j<
mit einem Auto-Analyzer (Technicon®, nach Hoffman: J. bioLChem. 120,51 [1937]) bestimmt.
Zur Erzeugung einer alimentären Hyperglykämie und Hyperinsulinämie bei Menschen (n—7 —8) werden 60 g
gekochte Stärke verabreicht Die Blutglucose wird unmittelbar vor Versuchsbeginn und in kurzen Abständen danach, wie oben angegeben, im Kapillarblut dei
Fingerbeere bestimmt In weiteren Versuchen wird dei Wirkstoff zu der Stärkesuspension hinzugegeben.
Insulinbestimmungen erfolgten radioimmunologisch in Anlehnung an die Doppelantikörpermethode vor
Haies und Rändle (Biochem. J. 88, 137 [1963]) inSerum aus Venenblut
Durchschnittliche Blutglucose in mg/100 ml ± Is von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach oraler
Gabe von Stärke ± Amylaseinhibitor.
S Min.
lOMin.
15 Min.
20 Min.
30 Min.
45 Min.
55±5,9
109±8,l
100±4,7
87±10
66+A8
I'<0.05
P < 0,01
Durchschnittliche Blutglucose in mg/100 ml ± Is von nüchternen Versuchspersonen (Vp.) vor (=0) und zu verschiedenen
Zeiten nach oraler Gabe von 60g Stärke± Amylaseinhibitor.
OMin.
15 Min.
30 Min.
45 Min.
Kontrolle mit Stärke Stärke+0,3 Mega AIE/Vp.
Stärke+0,6Mega AIE/Vp. Stärke+ 1,2 Mega AIE/Vp.
96±13 99±10 |
110+19 102±15 |
159 ±21 132±I4 |
I54±23 128±11 |
88 ±4,8 | 101 ±6,3 | 108 ±6,2 | 1OO±8,5 |
93 ±9,5 | 100±ll | 108 ±8,3 | 102 ±7,3 |
60 Min.
90 Min.
120 Min.
180 Min.
Kontrolle mit Stärke | Tabelle 3 | 131+34 | 99±21 | 85±15 | 80±14 |
Stärke+0,3 Mega AIE/Vp. | 116±16 | 98±6,1 | 92±12 | 86±11 | |
Stärke+0,6Mega AIE/Vp. | 95 ±8,6 | 86 ±6,4 | 78 ±7,3 | 93 ±6,4 | |
Stärke + 1,2 Mega AIE/Vp. | 98 ±9,8 | 87 + 8,5 | 88 ±7,3 | 90 ±6,2 | |
P<rno5 | P<0,01 | p<0,001 gegen | Konirolle mit Stärke. | ||
Durchschnittliche Insulinwerte in μΕ/ml Serum von nüchternen Versuchspersonen (Vp.) vor (=0) und zu verschiedenen
Zeiten nach oraler Gabe von Stärke +Amylaseinhibitor.
OMin.
15 Min.
30 Min.
45 Min.
Kontrolle mit Stärke Stärke + 0,3 Mega AIE/Vp. Stärke + 0,6 Mega AIE/Vp.
Stärke + 1,2 Mega AIE/Vp.
10±2,0
11+1,9
11 ±3,3
8 ±3,0
26±14
18±4,6
21 ±6,0
12±5,9
18±4,6
21 ±6,0
12±5,9
64±29 29 ±8,8
I8A6A.
13±7,2
59 ±22 26±10
TÖ+4J
60 Min.
90 Min.
120 Min.
180 Min.
Kontrolle mit Stärke | 31 ±20 | 19±14 | 12±6,5 | 10±5,2 |
Stärke+0,3 Mega AIE/Vp. | 22±11 | 15 ±5,3 | •14±3,1 | 11 ±2,4 |
Stärke+ 0,6 Mega AIE/Vp. | 14±J>,8 | 13±3,7 | 11 ±3,4 | 10±2,5 |
Stärke + 1,2 Mega AIE/Vp. | 8 ±2,9 | 8 ±4,0 | 9 ±3,3 | 6 ±3,0 |
p^nns | P<0,01 | P < 0,001 gegen | Kontrolle mit Stärke. |
A b b.:
an AkUvKome:
Kurven 1 und 2 bezeichnen die Aktivitäten in ΑΙΕ/μΙ
(rechte y- Achse), Kurve 1 bei pH 2.1. Kurve 2 bei pH 6,5,
nach Behandlung mit der auf der x-Achse angegebenen
Menge Aktivkohle in g.
3 und 4 ^j^ die Extinktionen bei
5χ ^ (|inke ^Αάιχ) Mch Bduaibmg ^x der auf dei
x-Achse angegebenen Menge Aktivkohle, Kurve 3 bei
pH 64. Kurve 4 bei pH 2,1.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung eines Amylaseinhibitors nach üblichen Methoden, dadurch gekennzeichnet, daß man den Actinoplanaceenstamm CBS-Nr. 614.71 und Nährlösungen mit einem Stärkegehalt von 4 bis 6% einsetzt
Priority Applications (30)
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---|---|---|---|
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