PL91664B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia inhibitora amylazy.Opis patentowy RFN DOS nr 20 64 092 i opis patentowy Wielkiej Brytanii nr 1374 751 oparte sa na stwierdzeniu, ze caly szereg Actinomycetes tworzy inhibitory glikozydohydrolaz, a zwlaszcza inhibitory glikozydohydrolaz, korzystnie enzymów przewodu pokarmowego, rozszczepiajacych weglo¬ wodany. Ta grupa inhibitorów jest wzglednie od¬ porna na wysokie temperatury. Inhibitory te na¬ leza pod wzgledem chemicznym do klasy oligo- lub polisacharydów, lub ich pochodnych.W wymienionych opisach patentowych, np. w przykladzie XXVIII—XXXVIII wymienionego opi¬ su patentowego RFN DOS opisany jest sposób uzyskiwania takiego inhibitora amylazy ze szczepu SE-50 Actinoplanaceae, nalezacego do rzedu Acti- nomycetales. Roztwory, hodowane z optymalnych fermentacji tego szczepu, zawieraja okolo 3000— 40 000 AIE/ml i uzyskane z nich najczystsze in¬ hibitory wykazuja aktywnosc wlasciwa, wynoszaca 3 — 8X106 jednostek inhibitora amylazy AIE/g.Szczep SE-50 jest zlozony w Centraalbureau Voor Schimmelcultures w Baarn w Holandii pod nu¬ merem CBS 961.70, a szczep SE 50/13 pod nume¬ rem CBS 614.71.Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia inhibitora amylazy, wedlug którego otrzymuje sie produkty czystsze i z wyzsza wydajnoscia, niz wedlug znanych sposobów. Stwierdzono, ze przy so zastosowaniu szczepu SE 50/13 numer CBS 614.71 oraz pozywki o wysokiej zawartosci skrobi uzys¬ kuje sie ciecze pofermentacyjne o zawartosci in¬ hibitora amylazy 100.000—110.000 AIE/ml.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze szczep CBS 614.71 w pozywce, zawierajacej we¬ giel, azot oraz sole mineralne, a takze 3°/o skrobi lub wiecej, korzystnie 4—6P/o poddaje sie fermen¬ tacji przy pH = 5,0—8,5 i w temperaturze 15—60°C, a nastepnie z roztworu kulturowego i ewentualnie z grzybni izoluje sie inhibitor amylazy zwykla me¬ toda, korzystnie metoda adsorpcyjno-desorpcyjna, po czym ewentualnie oczyszcza.Róznice morfologiczne miedzy szczepem SE 50/13 (CBS 614.71) a szczepem SE 50 (CBS 961.70) sa prawie nieistotne. Szczep SE 50/13 zarodnikuje na poszczególnych pozywkach tylko troche slabiej, niz szczep SE 50.Charakterystyka szczepu SE 50/13 Grzybnia Postac zarodni Wielkosc zarodni Postac zarodników Wielkosc zarodników Ulozenie zarodników w zarodni (Spg) Melanina 80 0,4—l,3|Ji nieregularna, pofal¬ dowana, pomarszczo¬ na 4—15^ ± kulista ca l[x zwiniete lancuszki, ulozone równolegle cpc^i Ty +/ + 91 66491664 Redukcja azotanu Mleko peptonizacja Skrobia — hydroliza Wzrost w temperaturze: °C 26°C 32°C 37°C 42°C Kazamina-Peptcn Agar Czapka (CPC) Pepton-Agar Czapka (PC) Agar Czapka (Cz) Mleko Agar (Ca) Tyrozyna — Agar (Ty) Platki drozdzowe-drozdze Agar (HaH) „Emerson" — Agar E (Drozdze — skrobia-Agar) Skrobia-Agar W=.wzrost SM—podloze grzybni Spg=zarodnia SP=barwnik podloza — + + + + + + + + + + — W.SM.SP.Spg.W.SM.SP.W.SM.SP.W.SM.SP.W.SM.SP.Spg.W.SM.SP.Spg.W.SM. bardzo dobry brazowe Agar brazowy _• bardzo dobry brazowe ciemnobrazowy bardzo dobry brazowe brazowy dobry pomaranczowo- brazowe ciemnobrazowy sredni ciemne, jak Agar czarno-brazowy <+) dobry brazowe brazowy — sredni do dobrego brazowe Skrobia — hydroliza+ Spg. + Szczep SE 50/13 otrzymuje sie w sposób, pole¬ gajacy na tym, ze rozciera sie kultury szczepu SE 50 na plytkach pozywki agarowej lub rozpro¬ wadza sie w pozywce agarowej i po wielodniowej inkubacji np. w temperaturze 28°C przeszczepia sie rozwiniete kolonie i bada sie je na zdolnosc produkowania inhibitora amylazy. Wydajnosc wa¬ riantów mozna zwiekszyc w znany sposób, podda¬ jac kultury przed rozprowadzeniem dzialaniu mu- tagenów.Skladnik hamujacy mozna adsorbowac bezpo¬ srednio z cieczy pofermentacyjnych weglem ak¬ tywnym w obojetnym srodowisku przy wartosciach pH=6—8 i ponownie desorbowac alkoholami z do¬ datkiem wody lub acetonem, zwlaszcza w kwas¬ nym srodowisku przy wartosciach pH=l—3.Poniewaz przy kwasnych wartosciach pH—1—3 niespodziewanie zachodzi tylko sladowa adsorpcja na weglu skladnika hamujacego, a jednoczesnie bardzo silna adsorpcja barwników, zanieczyszcza¬ jacych ciecze pofermentacyjne, stosujac wiec ta¬ ka wstepna adsorpcje cieczy pofermentacyjnych przy kwasnych wartosciach pH mozna uzyskac 13 33 40 45 BI czystsze inhibitory o wiekszej aktywnosci wlasci¬ wej.Fig. na rysunku przedstawia adsorpcje, powo¬ dujaca hamowanie dzialania amylazy i brazowych barwników (mierzone jako ekstynkcja przy 500 mm) z cieczy pofermentacyjnych przy kwasnych wzglednie obojetnych wartosciach pH.Fig. na rysunku przedstawia adsorpcje na weglu aktywnym barwników i skladnika, hamujacego amylaze, z roztworów kultury szczepu SE 50/13.Krzywe 1 i 2 przedstawiaja aktywnosci w AIE/ ml (prawa os y), krzywa 1 przy wartosci pH=2,2, a krzywa 2 przy wartosci pH—6,5, po traktowa¬ niu weglem aktywnym w ilosciach podanych na osi x.Krzywe 3 i 4 przedstawiaja ekstynkcje przy 550 nm (lewa os y) po traktowaniu weglem ak¬ tywnym w ilosci, podanej na osi x, przy czym krzywa 3 przy wartosci pH=6,5, a krzywa 4 przy wartosci pH=2,l.Otrzymane w wyzej podany sposób warianty nie musza oczywiscie wytwarzac we wszystkich po¬ zywkach zwiekszonej ilosci inhibitora amylazy, niz szczep macierzysty.W przypadku prowadzenia hodowli, np. w po¬ zywce, zawierajacej oprócz 2% skrobi jeszcze 1% glikozy, 0,5% hydrolizatu kazeiny, 1% wyciagu drozdzowego i 0,4% CaCOs w ciagu 3 dni w tem¬ peraturze 28°C otrzymuje sie ze szczepem SE 50 ciecze pofermentacyjne, zawierajace 30—40O00 AIE/ml, natomiast ze szczepem SE 50/13 ciecze, zawierajace 50—60000 AIE/ml.W pozywce o skladzie 5% skrobi, 1% wyciagu drozdzowego, 0,2%K8HPO4 otrzymuje sie po 3 dniowej fermentacji szczepu SE 50 50—60000 AIE/ml, a stosujac szczep SE 50/13 100—130000 AIE/ml.Wydajnosc inhibitora amylazy zalezy wiec od zawartosci skrobi. Przy zawartosci okolo 5,5—6% skrobi w pozywce zawartosci inhibitora amylazy wzrasta. Przy wiekszych stezeniach z kolei po¬ zywki staja sie geste i wydajnosc zmniejsza sie pod wplywem innych czynników, na przyklad gor¬ szego doplywu tlenu w czasie fermentacji.Pozostale skladniki pozywki moga sie znacznie zmieniac. Na przyklad zamiast hydrolizatu kazeiny i wyciagu drozdzowego, bedacych zródlem azotu, mozna stosowac tylko odpowiednia ilosc wyciagu, drozdzowego lub hydrolizat kazeiny, lub zastapic je innymi zródlami azotu, np. peptonem.Równiez uklad buforowy, skladajacy sie pier¬ wotnie z CaCOj i fosforanu potasu, moze miec rózny sklad. Nalezy tylko utrzymywac wartosc pH w czasie fermentacji w granicach fizjologicznych, to jest 5,0—8,5, korzystnie 6,0—7,8. Mozna te war¬ tosci utrzymac wprowadzajac automatycznie" kwa¬ sy lub lugi.Inne cukry takie, jak glikoza, dodane w mniej¬ szych stezeniach, moga przyspieszac fermentacje, zwlaszcza w poczatkowych etapach.Test amylazy. Jednostka inhibitora . amylazy (1 AIE) jest ilosc inhibitora, hamujaca aktywnosc dwóch jednostek amylazy o 50%. Jednostka amy¬ lazy (AE) jest ilosc enzymu, która w ciagu minu¬ ty w podanych warunkach doswiadczenia roz-91664 szczepia 1 równowaznik wiazan glikozydowych w skrobi. l|jLwal rozszczepionych wiazan glikozydowych oznacza sie kolorymetrycznie kwasem dwunitro- salicylowym jako l[x wal utworzonych cukrów re- 5 dukajacych i za pomoca krzywej wzorcowej mal¬ tozy podaje sie jakop, wal maltozy. Przy prze¬ prowadzeniu testu 0,1 ml roztworu amylazy (20— 22 AE/ml) traktuje sie 0^10 jtg inhibitora lub 0— [U testowanego roztworu w 0,4 ml buforu 0,02 io m glicerynofosforanu sodu (0,001 m Ca Cl2), o war¬ tosci pH=6,9 i utrzymuje sie przez okolo 10—20 minut na lazni wodnej w temperaturze 35°C.Nastepnie przez 5 minut inkubuje sie w tempera¬ turze 35°C z 0,5 ml ogrzanego do temperatury 35°C w 1% roztworu skrobi rozpuszczalnej (skrobia roz¬ puszczalna Firmy Merck Darmstadt nr 1252), po czym traktuje sie 1 ml reagentu dwunitrosalicylo- wego (wedlug P. Bernfeld in Colowick — Kaplan, Meth. Enzymol. tom 1, strona 149). Do wystapienia 20 barwy wsad ogrzewa sie przez 5 minut na wrzacej lazni wodnej, nastepnie chlodzi i traktuje 10 ml wody destylowanej. Ekstynkcje przy 540 mm mie¬ rzy sie w stosunku do wartosci slepej próby bez amylazy. 2d Przy obliczeniu odczytuje sie z uprzednio spo¬ rzadzonej krzywej wzorcowej amylazy aktywnosc amylazy, obecna po dodaniu inhibitora i stad obli¬ cza sie hamowanie w procentach wprowadzonej aimylazy. 30 Zdolnosc hamowania w stosunku procentowym nanosi sie jako funkcje ilorazu t*g in 1 itora AEXX w którym x. podaje sie w stosunku do suchej substancji i xx, we wsadzie z tej samej serii 35 bez inhibitora; odczytuje sie z krzywej wartosc, przy której uzyskuje sie 50% hamowanie aktyw¬ nosci i przelicza na zawartosci inhibitora w AIE/mg.Dla otrzymania takich wysokoaktywnych inhibi- 40 torów szczep SE 50/13 fermentuje przez 3 dni w temperaturze 28°C, w pozywce, zawierajacej % skrobi, 1% wyciagu drozdzowego i 0,2% K2HP04, umieszczonej w kolbach wstrzasanych lub fermentorach róznej wielkosci. Po zakonczeniu 4B fermentacji w celu odbarwienia calego wsadu o barwie brazowej doprowadza sie do wartosci pH=l—3, korzystnie 2—2,5, pólsitezonym HNOa i traktuje sie 2—10 g, korzystnie 5 g wegla ak¬ tywnego/litr roztworu hodowlanego. Nastepnie od- 80 dziela sie grzybnie i wegiel aktywny przez odwi¬ rowanie lub saczenie, ewentualnie stosujac po¬ mocniczy srodek filtracyjny, z klarowanej jasno- zóltej cieczy odwirowanej wzglednie filtratu, po zobojetnieniu za pomoca NH3, uzyskuje sie czyn- ** ny skladnik przez zatezenie i frakcjonowane stra¬ canie alkoholem wedlug przykladu XXXVIII opi¬ su patentowego RFN DOS nr 2 064 092 lub ad¬ sorpcje na weglu aktywnym. W tym celu zobo¬ jetniony przesacz traktuje sie 0,3—1,5 g, korzystnie 0,75—1 g wegla aktyiwnego na IO6 AIE, miesza sie przez io—120, korzystanie 20—30 minut w tem¬ peraturze pokojowej i odsacza sie, ewentualnie stosujac pomocnicze . srodki filtracyjne. Skladnik czynny desorbujje sie z wegla aktywnego 30—60°/o, •• to krzystnie 50% etanolem lub 30^-60%, korzystnie 50%, dioksanem lub 20—60%, korzystnie 35% ace^ tonem, korzystnie przy kwasnych wartosciach pH=2—3.Wiadomo, ze u zwierzat i ludzi po przyjeciu pokarmu i uzywek, zawierajacych skrobie, wyste¬ puje hiperglikemia, powodowana szybkim roz¬ szczepieniem 6krobi przez amylazy przewodu po¬ karmowego wedlug schematu: Skrobia amylaza, maltaza glikoza Hiperglikemia wystepuje szczególnie ostro przez dluzszy czas u diabetyków. U otylych pokarmowa hiperglikemia powoduje czesto szczególnie silne wy¬ dzielanie insuliny, co powoduje zwiekszona syn¬ teze tluszczów i zmniejszona odbudowe tluszczów.W ostatecznym wyniku po tego rodzaju hinper- glikemii wystepuje u osób z normalna przemiana materii i u osób cukrzycowych w wyniku hiper- insulinemii czesto hipoglikemia. Wiadomo, ze za¬ równo hipoglikemia, jak i pokarm przebywajacy w zoladku przyspieszaja produkcje soku zoladko¬ wego, co z kolei powoduje 'lub ulatwia powstawa¬ nie Gastritis, Ulcus duodendi lub ventriculi.Okazalo sie, ze inhibitor amylazy, otrzymany, wyizolowany i oczyszczony sposobem wedlug wy¬ nalazku, zmniejsza w znacznym stopniu pokarmo¬ wa hiperglikemie i hiiperinsulinemie po podaniu szczurom i ludziom gotowanej i niegotowanej skrobd. Inhibitor, otrzymany sposobem wedlug wy¬ nalazku, mozna stosowac jako lek o nastepuja¬ cych wskazaniach: Adipositas, Hyperlipaemia (Atherosklerosis), Diabetes , Prediabetes, Ulcus ventriculi i duodendi.Dawkowanie: 1000—-100000 AIE/kg jedne lub kil¬ ka razy dziennie przed i/lub podczas iAub po po¬ silkach per os.Preparaty podaje sie w postaci tabletek, draze¬ tek, kapsulek, roztworów, zawiesin, granulatów, gumy do zucia, jako dodatek do zywnosci i/lub uzywek.Doswiadczenie w celu sprawdzenia aktywnosci inhibitorów amylazy u szczurów i ludzi: Dla wywolania pokarmowej hiperglikemii pod wplywem slcrobi podaje sie szczurom (n=6) per os 1 g gotowanej skrobi na kg wagi ciala. Kazdo¬ razowo 6 innym szczurom podaje sie razem ze skrobia inhibitor amylazy, otrzymany wedlug przykladu VII, w dawkach nizej podanych.Pobiera sie krew z retroorbitakiego splotu zyl- nego w podanych odstepach czasu po podaniu skrobi i oznacza sie w niej stezenie glikozy za pomoca Auto-Analizera [Technican, Hoffman, J. biol. Chem. 120, 51 (1937)].Dla wywolania pokarmowej hiperglikemii i hi- perinsulinemii u ludzi gotowanej skrobi. Pobiera sie krew kapilarna z opuszki palca bezposrednio przed próba i w krótkich podanych odstepach i oznacza sie w niej glikoze. W dalszych próbach stubstancje czynna dodaje sie do zawiesiny skrobd.Oznaczenie insuliny w serum iw krwi zylnej przeprowadza sie radioinimunologicznie w oparciu o metode podwójnych antycial: Hales i Randle [Bdochem. J. 88, 137 (1063].Wyniki prób zestawiono ponizej w tablicy 1, 2 i 3.91 664 7 8 Tablica 1 Srednie stezenie glikozy we krwi ( w mg) 100 ml+ls u szczurów na czczo w róznych odstepach czasu po podaniu per os skrobi+substancja czynna z przykladu III Próba kontrolna bez skrobi Próba kontrolna ze skrobia Skrobia +0,02 mega AIE/kg Skrobia +0,05 mega AIE/kg Skrobia +0,12 mega AIE/kg Skrobia +0,20 mega AIE/kg minut 67+4,9 111±7,2 105±8,8 100±9,1 86±8,5 79±4,7 imiinuit 74±13 128± 9,1 111+ 8,2 101+ 6,2 81 ± 5,3 . 77± 7j minut 69±5,0 142+6,5 119±8,6 111+5,5 97+9,4 87±5,9 minut 68±3,6 132±8,7 118+7,6 107±5,3 81+7,8 85+4,5 minut 64+8,1 132±7,5 108+7,3 99+7,9 82±8,9 70±4,6 45 minut 55+ 5,9 109± 8,1 100± 4,5 87+10 66+ 4,8 70+ 2,5 1 P < 0,05, ¦ P <0,01, P < 0,001 w stosunku do próby kontrolnej ze skrobia Tablica 2 Przecietne stezenie glikozy we krwi w mg/100 ml+ls u osób (Vp) na czczo przed (=0) i w róznych odstepach czasu po doustnym podaniu 60 g skrobi±substancja czynna z przykladu VII Próba kontrolna ze skrobia Skrobia +0,3 mega AIE/Vp Skrobia +0,6 mega AIE/Vp Skrobia +1,2 mega AIE/Vp 0( manut 96±13 99±10 88+ 4,8 93+ 9,5 115 minut 110+19 102+15 101+ 6,3 100±11 minut 159+21 132±14 108± 6,2 108± 8,3 45 minut 154+23 128+11 100± 8,5 102± 7,3 60 minut 131+34 116+16 95+ 8,6 98± 9,8 70 minut 99±21 98+ 6,1 86+ 6,4 87± 8,5 120 minut 85±15 92+12 78± 7,3 88+ 7,3 180 minut 80+14 86+11 93+ 6,4 90+ 6,2 P < 0,05, P<0 01, P < 0,001 w stosunku do próby kontrolnej ze skrobia Tablica 3 Srednie stezenie insuliny w jjl R/ml serum u osób (Vp) na czczco przed <=0) i po róznych odstepach czasu po podaniu doustnym skrobi+substancja czynna z przykladu VII Próba kontrolna ze skrobia Skrobia +0,3 mega AIE/Vp Skrobia +0,6 mega AIE/Vp Skrobia +1,2 mega AIE/Vp 0 minut ±2,0 11+1,9 U+3,3 8+3,0 minut 26+14 18+ 4,6 21+ 6,0 12± 5,9 minut 64+29 29± 8,8 18+ 6,8 13± 7,2 45 minut 59±22 26±10 17± 7,4 ± 4,7 60 minut 31+20 22.+11 14± 6,8 8± 2,9 90 minut 19+14 ± 5,3 13+ 3,7 8+ 4,0 120 minut 12+6,5 14+3,1 11±3,4 9+3,3 180 minut ±5,2 11±2,4 +2,5 6+3,0 P <0,05, P <0 01, ^ ¦ P < 0,001 w stosunku do próby kontrolnej ze skrobia Przyklad I. Do 1 litrowej kolby Erlenmayera wprowadza sie 120 ml pozywki, zawierjaacej 2% skrobi, 1% glikozy, 0,5% hydrolizatu kazeiny, 1,0% wyciagu drozdzowego, 0,4% CaC03, sterylizowa¬ nej przez 30 minut w temperaturze 121°C i do¬ prowadzonej przed sterylizacja do wartosci pH=7,2 wodorotlenkiem potasu i zaszczepia sie 1 ml po- siewanej kultury szczepu SE 50/13, otrzymanej w pozywce, zawierajacej 3% gliceryny, 3% maki sojowej, 0,2% CaC03, sterylizowanej przez 30 mi¬ nut w temperaturze 121°C o pH=7,2 po sterylizacji i poddaje sie fermentacji na wytrzasarce w tem¬ peraturze 28°C, przy czym po 3 dniowej fermen- 95 OT tacji otrzymuje sie ciecz pofermentacyjna, zawie- rajaca 55000 AIE/ml.Przyklad II. Postepuje sie wedlug przykladu I, stosujac tylko pozywke, zawierajaca 5% skrobi, 1,0% wyciagu drozdzowego, 0,2% K2HP04, przy czym otrzymuje sie ciecz pofermentacyjna, za¬ wierajaca 108 000 AIE/ml.• Przyklad III. Pozywke, zawierajaca 4% skro¬ bi, 0,7% wyciagu drozdzowego zaszczepia sie we¬ dlug przykladu I szczepem SE 50/13 i po 3 dniach fermentacji otrzymuje sie ciecz pofermentacyjna, zawierajaca 80 000 AIE/ml,9 Przyklad IV. Pozywke zawierajaca 5°/a skro¬ bi, 1,0P/© wyciagu drozdzowego, 0,4% K2HP04 za¬ szczepia sie wedlug przykladu I szczepem SE 50/13 i otrzymuje sie po 4 dniowej fermentacji ciecz po¬ fermentacyjna zawierajaca 105 000 AIE/ml.Przyklad V. Pozywke, zawierajaca 6°/o skro¬ bi, l,3P/o wyciagu drozdzowego, 0,21% K2HP04 za¬ szczepia sie wedlug przykladu I szczepem SE/ia i otrzymuje sie po 4 dniowej fermentacji ciecz pofermentacyjna, zawierajaca 120 000 AIE/ml.Przyklad VI. Wedlug przykladu II zaszcze¬ pia sie 8 litrów pozywki w fermentorze szklanym 3 dniowa kultura w kolbie wstrzasanej i fermen¬ tuje sie przy intensywnym mieszaniu i napowie¬ trzaniu przez 3 dni w temperaturze 28°C, przy czym otrzymuje sie ciecz pofermentacyjna, za¬ wierajaca 105 000 AIE/ml.Przyklad VII. Ciecz pofermentacyjna w ilosci 6 litrów (105 X106 AIE/1, aktywnosc ogólna 630X Xl O8 AIE), otrzymana wedlug przykladu VI, po ochlodzeniu do temperatury 20°C, doprowadza sie do wartosci pH=2,5 pólstezonym HNOs, traktuje sie 30 g wegla aktywnego Corboraffin i miesza sie przez 10 minut. Nastepnie wiruje sie przez 15 mi¬ nut przy 10 000 obrotów/minute i klarowna jasno- zólta ciecz odwirowana (5,1 litra, 100X106 AIE/1, aktywnosc ogólna 510X106 AIE) po zobojetnieniu za pomoca NHg zateza sie do 500 ml (970X10* AIE/ /l, ogólna aktywnosc 485X106), nastepnie 500 ml koncentratu miesza sie przez 45 minut i 200 g Amberlite IRA 410 Cl, odsacza sie i traktuje sie 4/5 objetosci=400 ml metanolu w celu wytracenia wiekszej czesci wielkoczasteczkowych \produktów odbudowy razem z obecnymi jeszcze resztkami wegla aktywnego.Odwirowuje sie przez 5 minut przy 5000 obro¬ tów/minute i 850 ml odwirowanej cieczy (450X X106 AIE/1, ogólna aktywnosc 380X106 AIE) wkra- pla sie, intensywnie mieszajac, do 4 litrów suchego spirytusu. Bialy platkowaty osad odsacza sie, 3 razy przemywa suchym spirytusem i 2 razy eterem i suszy pod zmniejszonym cisnieniem w tempera¬ turze 50°C. Wydajnosc: 36 g bialego proszku o 10 X Xl O6 AIE/g, ogólna aktywnosc 360X10* AIE=57% wydajnosci (w stosunku do,aktywnosci). 1 664 Przyklad VIII. Ciecz pofermentacyjna w ilosci 2 litrów (100X106 AIE/1, ogólna aktywnosc 200X106 AIE) doprowadza sie do wartosci pH= =2,5 pólstezonym HNOs i traktuje sie 10 g wegla aktywnego Carboraffin. Po 10 minutowym miesza¬ niu przy 15000 obrotów/minute sedymentuje w 20 minutach grzybnia i wegiel. Klarowna ciecz odwirowana (1,6 litra, 75X106 AIE/iitr, aktywnosc ogólna 152X106 AIE) po zobojetnieniu io amoniakiem traktuje 120 g wegla aktywnego i mie¬ sza sie przez 1 godzine.Nastepnie dodaje sie 60 g Clarcell jako filtracyj¬ nego srodka pomocniczego i nastepnie odsacza sie. lg Pozostaly wegiel przemywa sie 500 ml wody i 500 ml 10fVo etanolu, nastepnie traktuje sie 2 razy po 500 ml ZSP/o acetonu, uprzednio doprowadzonego do wartosci pH—2,5 za pomoca HCI i miesza sie przez 20 minut. Po mieszaniu odsacza sie i przesa- ao cze laczy sie (900 ml, 120 X108 AIE/1, ogólna aktyw¬ nosc 110X10* AIE).Desorbat zobojetnia sie za pomoca NHg zateza sie do objetosci 50 ml w wyparce rotacyjnej pod cisnieniem okolo 20 torów i mieszajac wytraca sie -wstepnie 40 ml metanolu. Osad odrzuca sie, a przesacz wkrapla sie, intensywnie mieszajac, do 500 ml suchego spirytusu. Osad odsacza sie, prze¬ mywa sie etanolem, eterem i osusza sie pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze pokójo- so wej. Wydajnosc: 4,9 g o aktywnosci 14X10* AIE/ /g=34°/o wydajnosci w stosunku do aktywnosci roz¬ tworu wyjsciowego. skrobi, poddaje sie fermentacji przy wartosci pH=5,0—8,5 i w tem¬ peraturze 15—60°C, a nastepnie z roztworu kul¬ turowego i ewentualnie z grzybni izoluje sie in¬ hibitor amylazy zwykla metoda, korzystnie me- 45 toda adsorpcyjno-desorpcyjna, po czym ewentual¬ nie oczyszcza.i 91 664 ¦»0 W LZG Z-d .Nr 2 — 549/77 105 szt. A4 PL PL PL PL PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe 95 Sposób otrzymywania inhibitora amylazy, ina- mienny tym,, ze szczep CBS 614.71 Actinoplanaceae w pozywce, zawierajacej wegiel, azot oraz sole mineralne, przy czym pozywka ta zawiera takze 40 3% lub wiecej, korzystnie 4—&/* PL PL PL PL PL PL