NO853460L - Nye pseudooligosakkarider med alfa-glukosidasehemmende virkning, fremgangsmaate til deres fremstilling og deres anvendelse samt farmasoeytiske preparater. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører nye, biologisk aktive pseudooligosakkarider og deres fysiologisk tålbare salter. De har a-glukosidase-, dvs. f.eks. a-amylase- og disakkaridasehemmende egenskaper og kan derfor anvendes i human- og veterinærmedisin,

i dyreernæring samt i stivelsens bioteknologi.

Pseudooligosakkaridene ifølge oppfinnelsen har følgende generelle formel I.

hvori 1 betyr 1 eller 2,

m betyr 1, 2 eller 3,

n betyr et helt tall fra 1-20.

De har basisk karakter samt reduserende egenskaper.

Oppfinnelsen vedrører spesielt pseudooligosarridene med

formel I, hvori 1=1 eller 2 og n = 1, 2, 3 eller 4.

Spesielt foretrukket er forbindelser med formel I, hvori

1 = 1, m = 2 og n = 1: C44H74N2<0>32

molekylvekt 1142 (W-46 A),

1 = 1, m = 2 og n = 2: C5Q<Hg>4<N>2<0>37

molekylvekt 1304 (W-46 B),

1 = 1, m = 2 og n = 3: C56<Hg>4<N>2<0>42

molekylvekt 1466 (W-46 C).

samt deres fysiologisk tålbare salter med syrer. Pseudooligosakkaridene med formel I betegnes i det følgende også

som inhibitorene W-46 resp. W-46 A, B og C. Forbindelsene isoleres enten som blanding eller som enkelte forbindelser.

Oppfinnelsen vedrører videre en fremgangsmåte, til fremstilling av pseudoøligosakkaridene med formel I, farmasøytiske preparater inneholdende forbindelser med formel I, samt anvendelsen som legemiddel, diagnostikum og reagens.

Spesielt vedrører oppfinnelsen fremgangsmåte til fremstilling av inhibitorene W-46 A, B og C, farmasøytiske preparater inneholdende disse forbindelser og deres anvendelse som legemiddel, diagnostikum og reagens.

Fremgangsmåten til fremstilling av pseudooligosakkaridene

med formel I erkarakterisert vedat et pseudooligosakkarid med formel I frembringende Streptomycet kultiveres i et - fermentasjonsmedium i submersfremgangsmåte, inhibitorene isoleres fra mycelet eller kulturfiltratet på i og for seg kjent måte og renses. Av Streptomycetene av Streptomyces galbus subsp. FH 1716 egnet. Denne stamme er;deponert ved Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) under regi-streringsnummer DSM 3007. Det kan imidlertid også anvendes variantene og mutantene av denne stamme til fremstilling av inhibitoren W-46.

De taksonomiske egenskaper av Streptomyces galbus subsp.

FH 1716, DSM 3007r tilsvarer beskrivelsen av Streptomyces galbus ifølge Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. opplag, Verlag Williams & Wilkins Corp. Baltimore, 1974. Forskjeller til de beskrevne stammer består i noen fysiologiske trekk.. Som sammenlignings- og referansestamme er det herved blitt valgt Streptomyces galbus DSM 40480,

trekkene er sammenlignet i følgende tabell 1.

Streptomyces galbus-stammen med fysiologiske trekk med fysiologiske trekk fra spalte I, som er gjengitt i tabell 1, er hittil enda ikke omtalt i litteraturen. Følgelig er stammen Streptomyces galbus subsp.FH 1716, DSM 3007 ny. Oppfinnelsen vedrører derfor også Streptomyces galbus

FH 1716, DSM 3007.

Ved fremstillingen av inhibitorene W-46 går man hensiktsmessig frem som følger: Streptomyces galbus FH 1716 dyrkes i vandig næringsmedium under submerse og fortrinnsvis aerobe betingelser inntil man får tilstrekkelig konsentrasjon av inhibitoren W-46. Næringsmediet inneholder på den ene side karbonkilder som eksempelvis kullhydrater, på den annen side nitrogenkilder, hvortil hører noen nitrogenforbindelser som f.eks. protein-holdige materialer. Foretrukkede karbonleverende forbindelser er glukose, sakkarose, glycerol, maltekstrakt, stivelse, olje, fett og lignende. Foretrukkede nitrogenleverende stoffer er eksempelvis maissvellevann, gjærekstrakter, soya-mel, fiskemel, magermelkpulver, fordøyet kasein eller kjøtt-ekstrakt. Det kan også anvendes såkalte "syntetiske" næringsoppløsninger. Det kan videre være nyttig å tilsette sporelementer som f.eks. zink, magnesium, jern, kobolt eller mangan til fermentasjonsmediet.

Fermentasjonen som fører til dannelse av inhibitoren W-46

kan gjennomføres i et vidt temperaturområde. Eksempelvis gjennomføres den ved temperaturer mellom 10 og 40°C, fortrinnsvis mellom omtrent 20 og 35°C. Mediet pH-verdi holder man likeledes ved verdier som er beforderlig for veksten av mikroorganismen, eksempelvis ved pH-verdier mellom 4,0

og 10,0, fortrinnsvis mellom 6, 0 og 9, 0 . I avhengighet av næringsmediet som f.eks. dets kvalitative og kvantitative sammensetning og fermentasjonsbetingelsene som f.eks. luft-ingsgrad, temperatur eller pH-verdi, foregår dannelsen av inhibitoren W-4 6 i kulturoppløsningen vanligvis etter ca. 1-10 dager.

inhibitorene W-46 befinner seg så vel i mycel som også i kulturfiltratet fra fermenteringen. Hovedmengden åv det ønskede'stoffskifteprbdukt W-46 er vanligvis å finne i kuiturfiltratet.''Derfor adskilies fordélaktige den vandige fase fra myc;el, 'eksempelvis ved filtrering eller sentrifugering, og det ønskede produkt isoleres fra de respektive faser ved i og for seg kjente'fremgangsmåter og rensesl Hertil egner det seg et stort antall fremgangsmåter som eksempelvis kromatografi på ioneutvekslere, molekylsikter eller adsorpsjonsharpikser, oppløsningsmiddel- resp. saltfellinger, ultrafiltrering, Carig-fordeling og andre: En foretrukket fremgangsmåte til fremstilling av komponentene W-4 6 A, B resp. C består i at man adsorberer inhibitorene på kulturfiltratet på en egnet harpiks, f.eks. på polystyren-basis, adskiller denne oppladede harpiks og isolerer de nevnte inhibitorer ved eluering med egnede pufferoppløsninger som f.eks. fosfat- eller Na-acetat-pufferoppløsning eller med eventuelt vannholdige organiske oppløsningsmidler som f.eks. metanol, etanol, aceton, fortrinnsvis imidlertid med vandig isopropanol. Inhibitorholdige eluater konsentreres ved ultrafiltrering på kjent måte, idet det samtidig foretas en avsalting. Den ionefattige vandige oppløsning av de nevnte inhibitorer oppdeles deretter på en ioneutveksler-søyle kromatografisk på i og for seg kjent måte. Fortrinnsvis anvendes sterkt eller svakt sure kationutvekslere,

f.eks. på styren-divinylbenzen-kopolymerisatbasis, som som funksjonelle grupper har -SO^H eller -COOH-grupper ("Dowex 50 W"), ("Amberlite CG 120") eller på basis av modifiserte sulfopropylcellulose (SP-"Sephadex") som ione-utveksler, brukbare er imidlertid også et stort antall andre handelsvanlige kationutvekslere. Det siste trinn av isoleringen er anvendelsen av en molekylsikt, f.eks.

på polyakrylamid-gel-basis ("Biogel P-6") eller på basis modifisert cellulose ("Sephadex"). De resulterende vandige oppløsninger av det rene material tørkes deretter, f.eks.

ved lyofilisering. Den spesifikke aktivitet utgjør 4 x 10 4a-amylaseinhibitorenheter pr. mg faststoff.

Det etter den nevnte fremgangsmåte fremstilte stoff er riktignok i det vesentlige fritt for forurensninger, må imidlertid ikke være kjemisk enhetlig. Ved fornyet ione-utvekslerkromatografi f.eks. på "SP-Sephadex", molekylær-siktkromatografi, HPLC-adskillelse f.eks. på NP^-gruppe-holdige Reversed-Phase-bærermaterial ("Lichrosorb" Nr^-bærer) med acetonitril-vann (3:1)-blandinger og ved tilsvarende generelt vanlige fremgangsmåter kan det ved produktene av de enkelte fermentasjonscharger være mulig en oppdeling i biologisk virksomme komponenter. De tre hovedsaklig fore- kommende^kom<p>onenter har- fått navnene ot-amylaseinhibitor W-46 A, W-46 B og W-46 C. Ved siden- av disse forbindelser forekommer dessuten ytterligere inhibitorisk virksomme pseudooligosakkarider.

De rene ihhibitorrer W-46 er fargeløse, amorfe pseudooligosakkarider. De inneholder nitrogen og har svak basisk karakter. Således vandrer inhibitorene W-4 6 i høyspennings-elektroforesen i sure puffere, som f.eks. vandige maursyre/ eddiksyre-blandinger som kationer i retningen katoden. Stoffene ifølge oppfinnelsen omfatter glukose i bundet form: ved deres sure hydrolyse oppstår glukose ved siden av andre, for det meste nitrogenholdige spaltingsprodukter.

Det er videre karakteristisk for inhibitorene W-46 at de

har reduserende egenskaper, som, som vanlig i sukkerkjemien, kan påvises med trifenyltetrazoliumklorid (TTC).

I litteraturen er det allerede omtalt flere a<->glukosidase-inhibitorer med pseudooligosakkaridkarakter. E. Truscheit

et al., Angew. Chem. 93, sl 738-755 (1981), T. Tajiri et al., Agric. Biol. Chem. 47, s. 671-679 (1983), K. Yokose et al.,

J. Antibiotics,,-36,,s.ll57-1175 (1983 ).

Ved den generelle formel I, men også delvis ved den reduserende egenskap adskiller inhibitorene W-46 ifølge oppfinnelsen seg ved alle kjente or-glukosidase-inhibitorér, således foreligger her nye stoffer. De utmerker seg ved en liten polaritet og fremstillbare mikrobiologisk i gode utbytter.

Egenskapene av inhibitorene ifølge oppfinnelsen er interes-sante med hensyn til anvendelse som terapeutikum mot Diabetes og Prediabetes samt Adipositas og understøttelse av diett.

På grunn av disse egenskaper er de også verdifulle som reagens for diagnostiske formål.

Stivelsesholdige nærings- og nytelsesmidler fører hos dyr og mennesker til en økning av blodsukkeret og-derved også

til en øket insulinsekresjon av Pankreas. Hyperglykemi

kommer i stand ved oppspalting av stivelsen i fordøyelses-kanalen under innvirkning av amylase og maltase til glukose.

Hos diabetikere er hyperglykemi spesielt utpreget og lang-varig .

Den alimentære hyperglykemi samt hyperinsulinemien etter stivelsesopptak lar seg minske ved amylase-inhibitorene ifølge oppfinnelsen spesielt ved W-46 A, B og-C. Denne virkning er dosisavhengig. Amylase-inhibitorene ifølge oppfinnelsen lar seg derfor anvende som terapeutikum ved Diabetes, Prediabetes og Adipositas samt til understøttelse

av diett. For dette formål lønner det seg med en oral administrering, spesielt til måltidene. Den dosering som skal rette seg etter pasientens vekt samt det individuelle behov, utgjør ca. 5-500 mg pr. dose, som hensiktsmessig tas til hvert måltid. Doseringen kan imidlertid i begrunnede enkelttilfeller også ligge høyere eller lavere.

Amylase-inhibitorene ifølge oppfinnelsen egner seg spesielt til oral administrering. De kan anvendes som rent stoff,

som deres fysiologisk tålbare salter med syrer, men også

i form av en farmasøytisk tilberedning under anvendelse av de vanlige hjelpe- og bærerstoffer. Også en kombinert anvendelse med andre legemidler som blodsukkersenkende eller lipidsenkende stoffer kan være av fordel. Da høyere-molekylære sakkarider som sådanne ikke eller ikke nevne-verdig resorberes fra fordøyelseskanalen, er det av stoffene ifølge oppfinnelsen ikke å vente toksiologisk betenkelige bivirkninger. Følgelig kunne det etter oral inngivning også høyere doser av amylase-inhibitorene W-4 6

på forsøksdyr ikke sees påfallende symptomer. Til under-søkelse av den farmakologiske virkning av amylase-inhibitoren fikk fastende, hann-Wistar-rotter med en vekt mellom 200 Og 250 g et hemstoff ifølge W-46 eller en blanding samtidig med 2 g stivelse pr. kg legemsvekt administrert oralt. Ved bestemmelse av blodsukkerkonsentrasjonen i blodprøver som ble tatt før, under og etter applikasjon av

a-amylaser-inhibitoren, ■ ble preparatets- virkning bevist . ■

Ved siden av blodglukosereguleringen kan man anvende oligo-sakkaridene ifølge oppfinnelsen også til hemming av spytt-a-amylasen. Dette-enzym bevirker fordøyelse av stivelse i munnen, og det således dannede sukker befordrer kariesangrep på tennene. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan derfor anvendes til å hindre eller nedsette dannelsen av karies.

Videre kan.de anvendes- som.biokjemiske reagenser samt som diagnostisk middel.

En amylase-inhibitorenhet (AIE) er definert som den inhibi-tormengde som under prøvebetingelsene formår å hemme to amylase-enheter (AE) 50%. En amylase-enhet er ifølge internasjonal overenskomst den enzymmengde som i 1 minutt spalter 1 u ekvivalent glukosidiske bindinger i stivelse.

De uval spaltede glukosidiske bindinger bestemmes som uval ~-reduserende sukker fotometrisk med dinitrosalizylsyre. Angivelsene er beregnet som umol maltose, som fastslås

ved hjelp av en maltose-Justeringslinje.

prøvene gjennomføres som følger:

ct-amylase fra svinepankreas og oppløsningene som skal under-søkes forinkuberes sammen i 1,0 ml 20 mM fosfatpuffer,

pH 6,9, + 10 mM' NaCl i"10-20 minutter ved 37°C. Den enzymatiske reaksjon" startes ved tilsetning av 1,0 ml oppløselig stivelse (0,25% i den angitte puffer) ifølge Zulkowski. Etter nøyaktig 10 minutter stoppes reaksjonen

med 2,0 ml dinitrosalizylsyre-fargereagens (ifølge Boeh-ringer Mannheim: Biochemica-Information II) og oppvarmes til fargefremkalling 5 minutter i kokende vannbad.

Etter avkjøling måles ekstinksjonen ved 546 nm mot reagens-blindverdi. Den 50%-ige hemming bestemmes sammenlignet til uhemmet enzymreaksjon ved anvendelse av forskjellige inhibiotmengder grafisk ved hjelp av sannsynlighetsopp-føring.

Eksemgel_l

Til fremstilling av W-46 foregikk podningsdyrkningen (dyrk-ning av mikroorganismen), som vanlig i mikrobiologisk praksis, fra en frysetørket permanentform av organismen Streptomyces galbus, FH 1716 DSM 3007, over enkeltkolonipassasje og skrå-rør. Den for fermenteringen nødvendige masseproduksjon av sporer ble likeledes gjennomført på fast næringsbunn i Roux-flasker.

De podede rør og Roux-flaskene ble dyrket 7 dager ved 30°C og deretter holdt ved 4°C. Sporene ble avsvømmet med 10 ml sterilisert Aqua destillata eller fysiologisk kok-saltoppløsning fra den faste næringsbunn. 5 ml av suspen-sjonen tjente til poding av en 2000 ml Erlenmeyer-kolbe som var fylt med 500 ml sterilisert vandig næringsoppløs-ning med en pH-verdi på 7,7 og følgende sammensetning (angivelser i vekt-%).

1,00% glukose

0,40% kaseinpepton

0,40% Kjøttekstrakt

0,25% NaCl

0,05% Gjærekstrakt

0,05% Leverpulver

Kolben ble rystes ved 220 opm 48 timer ved 30°C på en ryste-maskin. Deretter ble denne forkultur overført til en 12

liter fermenterer som var fylt med 9 liter sterilisert vandig næringsoppløsning og hadde en pH-verdi på 7,4. Næringsopp-løsningens sammensetning for hovedkulturen var følgende (angivelser i vekt-%).

2, 0%.:kgøttekstrakt

2,0% maltekstrakt

1,0% kalsiumkarbonat

0,1% skumdemper

ad 100% vann.

Hovedkulturen ble omrørrt ved 28°C i _2ager med 850 opm, lufttilføreselen utgjorde 420 liter pr. time. Etter 18,

24, 30, 36, 40, 44 og 48 timer ble det bestemt innholdet av -amylase-inhibitor ifølge forskriftene av R. Bender et al., Anal. Biochem. 137, 307-312 (1984). Stammen Str. galbus FH 1716 ga under de omtalte forsøks- og kultur-betingelser gjennomsnittlig 5 x 10 3 AIE/ml ved en slutt-

pH på 9,0 .

Eksemp_el_2

8 liter fermenteringsoppløsning ifølge eksempel 1 ble ved hjelp av en sentrifuge befridd for cellemasse og den klare flytende fase. ;ble; innstilt på. pH 9,5.- Deretter på-førte, man oppløsningen.på, en. søyle som inneholdt 0,8 liter polystyren-adsorpsjonsharpiks ("Diaion" HP-20), etter-

vasket med 1,5 liter vann og eluerte med vann, hvortil det var blitt satt økende mengder isopropanol. Bland-

ingen som inneholdt 10% isopropanol oppløste inhibitoren W-46 fra søylen. Disse aktive eluater (1,2 liter) ble konsentrert ved ultrafiltrering og avsaltet under vanntil-setning samt ytterligere ultrafiltrering så lenge inntil retenatet ikke mer inneholdt påvisbare salter. Det resulterende konsentrat (0,2 liter) skilte an på sulfopropyl-modifisert cellulose ("SP-Sephadex"), som var overført i

syreform (H+<->form). Ved anlegg av en ammonium-acetatgradient, pH 5 (0-0,5 molar) ble de a-amylasehemmende aktivitetinnehold-ende fraksjoner eluert. De tilsvarende fraksjoner ble konsentrert i ultrafiltreringsceller ("Amicon") og avsaltet. Sluttrensingen foregikk på polyakrylamidgel ("Biogel" P-6)

med rent vann som elueringsmiddel. De W-46-holdige fraksjoner av denne søyle ble samlet og frysetørket. Det fremkom 1,5 g av et lysebeige amorft pulver med en a-amylasehemmende virkning på 4 x 10^ AIE pr. mg stoff. På fig. 1 er det gjn-gitt IR-spekteret (i KBr), på fig. 2 NMR-spekteret (i DMSO).

Eksempel_3

100 mg av inhibitorblandingen W-46 fremstilt ifølge eksempel 2, ble oppløst i 0,01% fosfatpuffer, pH 7,8 og adskilt på

150 g Lichrosorb RP 18-bærer i en stålsøyle under HPLC-betingelser. Som elueringsmiddel tjente herved 95% 0,01%-ig fosfatpuffer, pH 7,8, med 5% acetonitril, deteksjonen av eluatet foregikk ved hjelp av UV-adsorpsjonsmåling ved " — 210 nm. Etter 4, 5,8 og 7,5 minutter ble det fremstilt inhibitorisk virksomt material adskilt fra søylen. Disse fraksjoner ble inndampet, avsaltet og frysetørket.

Deres analyse ga:

Topp I (etter 4 minutter HPLC), C: 45,8%, H: 6,4%, N:l,9%,

0: 4 6,0%. Ved FAB-massespektrometri ble det funnet en M + H+<->topp på 1467 (W-46 C).

Topp II (etter 5,8 minutter HPLC), C: 46,1%, H: 6,5%, N: 2,1%, 0: 45,4%. FAB-massespektrometri (FAB-MS), M + H+<->topp: 1305 (W-46 B).

Topp III (etter 7,5 minutter HPLC), C: 46,3%, H: 6,5%,

N: 2,5%, 0: 44,8%, FAB-MS, M + H+<->topp: 1143 (W-46 A).

Eksemgel_4_ i.

100 mg av det ifølge eksempel 2 fremstilte material ble opp-løst i 0,5 ml vann, innstilt ved 0°C med saltsyre til pH 1

og blandet med 5 ml aceton. Den resulterende utfelling ble samlet ved sentrifugering, opptatt i vann og frysetørket.

Man får hypokloridet av inhibitorblandingen W-4 6.

Eksemp_el_5

Endringer av blodglukoseøkningen av stivelsesbelastet rotte

i avhengighet av oralt administeret dose av inhibitor-blandingen W-4 6.

Metode:

Forsøksdyr var 45 hann-Albino-rotter. Dyrene hadde 18 timer før og under forsøket ingen tilgang til for. Hver 8-10 dyr fikk 0,3, 0,6 og 1,0 mg/kg inhibitor W-46 ifølge eksempel 2 sammen med 2 g/kg stivelse suspendert i springvann ved hjelp av sluksonde peroralt. Applikasjonsvolumet utgjorde 1 mg/100 g legemsvekt. 18 kontrolldyr fikk bare stivelses-suspensjon. Umiddelbart før samt 0,5, 1, 2, 3 og 5 timer etter behandlingen ble det tatt 10 ul blodprøver hver gang og blodglukosen bestemt enzymatisk.

Resultater:

Inhibitor-blandingen W-46 nedsatte dosisavhengig den postprandiale blodglukoseøkningen etter stivelsesbelastning.

1 timer etter behandling bevirket o,3, 0,6 og 1 mg/kg inhibitor W-46 en minst 16, 23 og 25%-ig nedsettelse av blodsukkerøkningen i forhold til kontrollverdiene. Dosisavhengigheten er sikret statistisk. Grenseverdi-

dosen for den midlere prosentuelle blodglukoseøkning over 3 timer utgjorde 0,4 mg/kg.

Claims (11)

1. Pseudooligosakkarider med formel I

hvori 1=1 eller 2, m = 1, 2 eller 3, n = et helt tall fra 1-20, samt deres fysiologisk tålbare salter med syrer.

2. Pseudooligosakkarider ifølge krav 1, karakterisert ved at i formel I betyr 1=1, m = 1 eller 2 og n = 1, 2, 3 eller 4.

3. Fremgangasmåte til fremstilling av pseudooligosakkrider ifølge krav 1, karakterisert ved at det kultiveres et pseudooligosakkarid med formel I frembringende Streptomycet i et fermentasjonsmedium i submersfremgangsmåten, pseudooligosakkaridene fra mycel eller kulturfiltrat isoleres på i og for seg kjent måte og renses og overføres ventuelt til et psysiologisk tålbaret salt med en syre.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at Streptomyces galbus subsp. FH 1716 kultiveres og fra kulturfiltratet isoleres pseudooligosakkaridet og renses.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at det isoleres et pseudooligosakkarid med formel I, hvori 1=1, m = 1 eller

2 og b =1,2, 3 eller 4.

6. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved et innhold av pseudooligosakkarid ifølge krav 1.

7. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det inneholder et pseudooligosakkarid med formel I, hvori 1=1, m = 1 eller 2, og n = 1, 2, 3 eller 4.

8. Anvendelse av pseudooligossarider ifølge krav 1 til hemming av a-glukosidase.

9. Anvendelse av psuedooligosakkarider ifølge krav 1 til behandling av Diabetes, Prediabetes og Adipositas.

10. Anvendelse av pseudooligosakkarider ifølge krav 1 som diagnostikum reagens eller profylaktikum mot karies.

11. Streptomyces galbus subsp. FH 1716, DSM 3007.