NO844422L - Nye polypeptider med alfa-amylasehemmende virkning, fremgangsmaate til deres fremstilling, deres anvendelse og farmasoeytiske preparater - Google Patents

Nye polypeptider med alfa-amylasehemmende virkning, fremgangsmaate til deres fremstilling, deres anvendelse og farmasoeytiske preparater

Info

Publication number
NO844422L
NO844422L NO844422A NO844422A NO844422L NO 844422 L NO844422 L NO 844422L NO 844422 A NO844422 A NO 844422A NO 844422 A NO844422 A NO 844422A NO 844422 L NO844422 L NO 844422L
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
polypeptide
amylase
amino acids
cyclic
formula
Prior art date
Application number
NO844422A
Other languages
English (en)
Inventor
Laszlo Vertesy
Dominique Tripier
Harald Ritzel
Original Assignee
Hoechst Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Ag filed Critical Hoechst Ag
Publication of NO844422L publication Critical patent/NO844422L/no

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K7/00Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/36Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01Peptide or protein sequence
    • Y10S930/26Containing cys-cys disulfide bridge between nonadjacent cysteine residues

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Oppfinnelsen vedrører nye biologisk aktive cykliske polypeptider. De har o-amylasehemmende egenskaper og kan derfor anvendes i.human- og veterinærmedisin, i den medisinske diagno-stikk samt i stivelsens bioteknologi.
Polypeptidene ifølge oppfinnelsen erkarakterisert vedat de består av 10-200 aminosyrer og har følgende formel I
hvori
Z. betyr Gin, Asn eller Met
S betyr Ser eller Thr
Y betyr Phe, Tyr eller Asn
AS betyr en polypeptidkjede av 5-25 naturlige aminosyrer som på sin side kan være substituert ved ytterligere naturlige aminosyrer eller peptidkjeder,
idet det er unntatt a-amylaseinaktivatoren tendamistat (HOE 467), samt den fra kulturfiltratet av Streptomyces violaceoruber ATCC 31209 fremstilte -amylaseinhibitor.
Oppfinnelsen vedrører spesielt cykliske polypeptider med formel I, hvori Z betyr Gin, S betyr Ser, Y betyr Tyr og AS betyr en polypeptidkjede av 12 aminosyrer, substituert med 2 peptidkjeder.
Av polypeptidene ifølge oppfinnelsen er peptidet med formel Ia
som i det følgende også betegnes som Ai-3688, samt følgende strukturvarianter foretrukket: 1-desalanin-derivatet AI-3688a (aminosyren 1 er ikke Ala, men Thr),
peptidet AI-3688 b som adskiller seg fra AI-3688 ved at den 14. aminosyren Gin ble utvekslet med Glu,
peptidet AI-3688 c som adskiller seg fra AI-3688 ved at 34. aminosyren Gin ble utvekslet med Glu,
peptidet AI-3688 d som adskiller seg fra AI-3688 a ved at
13. aminosyren Gin ble utvekslet mot Glu (dette peptid er 1-desalanin-derivatet av AI-3688 b).
peptidet AI-3688 e som adskiller seg fra AI-3688 a ved at den 33. aminosyren Gin ble utvekslet med Glu (dette peptid er 1-desalamin-derivatet av AI 3688 c),
peptidet AI-3688 f som adskiller seg fra AI-3688 ved at så vel den 14. som også den 34. aminosyren Gin ble utvekslet med Glu, og
peptidet AI-3688 g som er 1-desalanin-derivatet av AI-3688 f.
Ved disse peptider betyr Z Gin, S betyr Ser, Y betyr Tyr og AS en polypeptidkjede av 12 aminosyrer, som der disubstituert med 2 peptidkjeder av 8 eller 7 resp. 11 aminosyrer. Pep-tidene har 3 6 resp. 35 aminosyrer. Den aminoterminale ende av aminosyresekvensen befinner seg ved alanin (1) resp.
Thr. Ved peptiden AI-3688 består det mellom Cys (9) og Cys (25) en disulfidbro. Disulfidbroene befinner seg ved variantene på tilsvarende steder.
I det ovennevnte og følgende omtales de i inhibitoren inne-holdte aminosyrer ved symboler slik de anvendes i boken av L. Stryer "Biochemistry", W.H. Freeman&Company, San Fran-cisco, 1972, side 14 og følgende.
Videre vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte til fremstilling av de cykliske polypeptider med formel I, farmasøytiske preparater inneholdende en forbindelse med formel I, anvend-elsen som legemiddel, diagnostikum og reagens.
Spesielt vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte til fremstilling av polypeptidet AI-3688 samt av variantene AI-3688 a-g, farmasøytiske preparater inneholdende AI-3688 eller en variant og deres anvendelse som legemiddel, diagnostikum og reagens.
Fremgangsmåten til fremstilling av polypeptidene med formel I erkarakterisert vedat streptomycetes som frembringer et polypeptid med formel I kultiveres i et fermenteringsmedium i submersfremgangsmåten, polypeptidet isoleres på i og for seg kjent måte fra mycelet eller kulfurfiltratet og renses. Av Streptomycetene er Streptomyces aureofaciens spesielt egnet.
AI-3688 og strukturvariantene AI-3688 a-g fremstilles fortrinnsvis av mycelet og kulturfiltratet av Streptomyces aureofaciens FH 1656. Denne stamme er deponert ved den tyske samling av mikroorganismer (DSM) under registreringsnummer DSM 2790. Det kan imidlertid anvendes også variantene og mu-tantene av denne stamme ved fremstilling av AI-3688 og strukturvariantene .
De taksonomiske egenskaper av Streptomyces aureofaciens DSM 2790 tilsvarer omtalen av Streptomyces aureofaciens ifølge Bergley's Manual of Determinative Bacteriology, 8. opplag, forlag Williams&Wilkins Corp. Baltimore, 1974. Forskjellen til de omtalte stammer består i stoffskifteproduktet. Cykliske peptider som stoffskifteprodukter av Streptomyces aureofaciens-stammer er hittil ikke blitt omtalt. Følgelig er stammen ny. Oppfinnelsen vedrører derfor også Streptomyces aureofaciens DSM 2790.
Ved fremstillingen av AI-3688 går man hensiktsmessig fram
som følger:
Streptomyces aureofaciens DSM 2790 dyrkes i et vandig nær-ingsmedium under submerse og fortrinnsvis aerobe betingelser, inntil man får en tilstrekkelig konsentrasjon av AI-3688. Næringsmediumet inneholder på den ene side karbonkilder,
som eksempelvis kullhydrater, på den annen side nitrogen-kilder,hvortil det regnes egnede nitrogenforbindelser, som f.eks. pr.oteinholdige materialer. Spesielt karbonleverende forbindelser er glukose, sakkarose, glycerol, maltekstrakt, stivelse, olje, fett og lignende. Foretrukkede nitrogen-leverende stoffer er eksempelvis maissvellevann, gjærekstrak-ter, soyamel, fiskemel, magermelkpulver, fordøyet kasein eller kjøttekstrakt. Det kan også anvendes såkalte "synte-tiske" næringsoppløsninger. Det kan videre være nyttig å til-sette sporelementer som f.eks. zink, magnesium, jern, kobolt og mangan til fermenteringsmediumet.
Fermenteringen som fører til dannelse av AI-3688, kan gjennom-føres i et vidt temperaturområde. Eksempelvis gjennomføres den ved temperaturer mellom 10 og 40°C, fortrinnsvis mellom omtrent 25 og 35°C. Mediets pH-verdi holder man likeledes ved verdier som er beforderlige på veksten av mikroorgan-ismene, eksempelvis ved verdier mellom 4,0 og 9,0, foretrinns-vis mellom 5,0 og 8,0. I avhengiget av næringsmedier som f.eks. det kvalitative og kvantitative sammensetning og fer-menteringsbetingelser som f.eks. luftingsgrad, temperatur eller pH-verdi, foregår dannelsen av AI-3688 i kulturoppløs-ningen vanligvis etter ca. 2-10 dager.
AI-3688 befinner seg så vel i mycelet som også i fermenter-ingens kulturfiltrat.Hovedmengden av AI-3688 er vanligvis'å finne i kulturfiltratet. Derfor adskilles fortrinnsvis den vandige fase fra mycelet, eksempelvis ved filtrering eller sentrifugering og AI-3688 isoleres fra de respektive faser ved i og for seg kjente fremgangsmåter og renses. Hertil egner det seg et stort antall fremgangsmåter som eksempelvis kromatografi på ioneutvekslere, molekylærsikter eller adsorp-sjonsharpikser, krystallisering, oppløsningsmiddel- resp. saltutfellinger, ultrafiltrering, Craig-fordeling o.l.
En foretrukket fremgangsmåte til fremstilling av AI-3688 består i at man adsorberer inhibitoren fra kulturfiltratet på en egnet harpiks som f.eks. på polystyrenbasis, adskiller den oppladede harpiks og isolerer inhibitoren AI-3688 ved eluering med egnede pufferoppløsninger, som f.eks. fosfat- eller bikar-bonatpufferoppløsning eller med eventuelt vannholdige organ-iske oppløsningsmidler som f.eks. metanol, etanol, aceton fortrinnsvis imidlertid med vandig isopropanol. De inhibitor-holdige eluater konsentrer man ved ultrafiltrering på kjent måte, idet det samtidig foretas en avsalting. Den ionefattige vandige oppløsning av AI-3688 oppdeles deretter på en ioneut-vekslersøyle kromatografisk på i og for seg kjent måte. Fortrinnsvis anvender man DEAE-cellulose eller DEAE-modifisert cellulose (f.eks. DEAE-"Sephadex") som ioneutveksler, brukbar er imidlertid også et stort antall andre handelsvanlige kat-ioner og anionutvekslere. Siste trinn av isoleringen er an-vendelsen av en molekylarsikt (f.eks. "Biogel" P-6 eller "Sephadex"). De resulterende vandige oppløsninger av det rene material tørkes deretter f.eks. ved hjelp av lyofiliser-ing. Den spesifikke aktivitet utgjør 1,5 x 10 4 a-amylase-inhibitorenheter pr. mg faststoff.
Den rene inhibitor AI-3688 er et fargeløst polypeptid, hvis aminosyreanalyse viser nærvær av de fleste naturlige aminosyrer. Den har ovennevnte formel Ia.
Det kan, spesielt ved lengere fermentering, forekomme at inhibitoren AI-3688 ikke er enhetlig. I dette tilfellet kan det gjennomføres en oppdeling i de enkelte komponenter ved hjelp av HPLC-teknikk, fortrinnsvis ved hjelp av HPLC på Reversed Phase RP 18 bærere med en vann-acetonitril-blanding (95:5) som elueringsmiddel. De således fremstilte komponenter har de angitte strukturer AI-3688 a, b, c, d, e, f resp. g. Strukturvariantene er virksomme på samme måte som AI-3688.
Det er for AI-3688 og AI-3688 a-g karakteriserende at de mangler de naturlige aminosyrer met, Ile, Leu, Lys og His.
Det ultrafiolette lys absorberes i vann av AI-3688 med X- s.
1%
maks. = 275 nm, E , =21. Det isoelektriske punkt utgjør
lemc^Jbestemt ved isoelektrisk fokusering 4,2,. Inhibitoren AI-3688 er lett oppløselig i vann og vandige pufferoppløsninger, bare i nærheten av det isoelektriske punkt avtar oppløselig-heten.
Ved den ovennevnte aminosyresammensetning og naturllig ved strukturen adskiller AI-3688 seg samt AI-3688 a-g fra alle kjente a-amylaseinhibitorer, og således foreligger her nye stoffer.
Den kjemiske struktur - som gjengitt i formel I a,
viser aminosyresekvensen av AI-3688 samt dessuten nærværet av en ring, som dannes av 17 aminosyrer ved sammenknytning av Cys (stilling 9) med Cys (stilling 25). Ifølge P.Y.
Chou og G.D. Fasmann (Advances in Enzymology, bind 47,
side 45-148, utgitt av John Wiley&Son, 1978) muliggjør primærstrukturen på grunn av den rommelige egenart av de enkelte deltagende aminosyrer og deres sammenknytning,
dvs. deres sekvens og deres ringdannelse, tilbakeslutninger til peptidenes sekundærstruktur. Det ble med inhibitoren AS-3688 gjennomført en Chou/Fasman-analyse. Derved er det overraskende funnet at delsekvensen av ringen: -Gln-Ser-Trp-Arg-Tyr- på eksponerte steder, dvs. rommelig fremragende for biokjemiske reaksjoner innbygges på egnet
måte.i molekylet og til sist er ansvarlig for virkningen. Det er videre blitt funnet at ved åpningen av ringen som inneholder .17 aminosyrer, f.eks. ved oppløsning av svovel-svovelbindingen av cystinet bevirkes en endring av den rommelige struktur, hvorved ovennevnte avgjørende delsekvens derved ikke mer rommelig fremtrer, og den enzymhemmende virkning går tapt. Ved ringåpning dannede kjemiske derivater av a—amylaseinhibitoren AI-3688 er biologisk og biokjemisk in-aktive (sammenlign eksempel 4). Karakteristisk for a-amylaseinaktivatoren ifølge oppfinnelsen og vesentlig for deres hemmevirkning er at det foreligger en stor, av 10-30 fortrinnsvis av 17 aminosyrer bestående ring, og i denne ring er det inneholdt aminosyresekvensen -Z-S-Trp-Arg-Y-, spesielt -Gln-ser-Trp-Arg-Tyr-. Sammensetningen av delsekvensen som polypeptidene ifølge oppfinnelsen har påvirker styrken av den enzymhemmende virkning lite. Heller ikke er naturen av ring-dannelsen av det cykliske peptid vesentlig: hverken den kjemiske bindingstype av cykliseringen eller måten, dvs. om fremstilt biologisk eller syntetisk, er betydningsfull for virkningen, det vesentlige er nærværet av et ringsystem som inneholder den angitte aminosyredelsekvens.
Undersøkelser med den i det tyske Offenlegungsschrift
27 16 050 omtalte fra Streptomyces violaceoruber ATCC 31209 isolerte a-^amylaseinaktivator viser at den angitte delsekvens samt nærvær av et ringsystem er ansvarlig for hemmevirkningen Undersøkelsen ble gjennomført som følger.
Bestemmelse av delsekvensen av a-amylaseinhibitoren fremstilt fra Streptomyces violaceoruber ATCC 31209: Sekvenseringen av den reduktive eller oksydative ringåpning lineærisertea—amylaseaktivatoren foregikk med Beckmann-"Sequenator" i
0,2 molart puffersystem ("Quadrol") automatisk med aminosyre-fenyltiohydantoin (PTH) metoden. Mellom stoffets to cystein-rester ble det bl.a. funnet følgende delsekvenser:
-Tyr-Phe-Gln-Ser-Trp-Arg-Tyr-Thr-Asp-Val-His-.
Egenskapene av inhibitorene ifølge oppfinnelsen er med hensyn til anvendelse som terapeutikum interessant mot diabetes og prediabetes samt adipositas og understøttelse av diett. på grunn av deres egenskaper er de også verdifulle som reagens for diagnostiske formål.
Stivelsesholdige nærings- og nytelsesmidler fører hos dyr og mennesker til en økning av blodsukkeret og derved også til en øket insulinsekresjon av pankreas. Hyperglykemi kommer i stand ved oppspalting av stivelsen i fordøyelseskanalen under innvirkning av amylase og maltase til glukose.
Hos diabetikere er hyperglykemi spesielt utpreget og langvarig.
Den alimentære hyperglykemi samt hypeinsulinemi ved stivelses-opptak lar seg nedsette ved amylaseinhibitoren ifølge oppfinnelsen spesielt ved hjelp av AI-3688. Denne virkning er dosisavhengig. Amylaseinhibitoren ifølge oppfinnelsen lar seg derfor anvende som terapeutikum ved diabetes, prediabetes og adipositas samt til understøttelse av dietten. For dette formål lønner det seg en administrering, spesielt til mål-tidene. Doseringen som skal rette seg etter pasientens vekt samt individuelle behov, utgjør ca. 10-500 mg pr. dose, som hensiktsmessig tas til hvert måltid. Doseringen kan imidlertid i begrunnede enkelttilfeller også ligge høyere eller lavere.
Amylaseinhibitoren ifølge oppfinnelsen egner seg spesielt til oral administrering. Den kan anvendes som rent stoff, men også i form av en farmasøytisk tilberedning under anvendelse av vanlige hjelpe- og bærestoffer. Også en kombinert anvendelse med andre legemidler som blodsukkersenkende eller lipid-senkende stoffer kan være av fordel. Da høyeremolekylære peptider som sådanne heller ikke nevneverdig resorberes fra fordøyelseskanalen, er det av stoffene ifølge oppfinnelsen ikke å vente noen toksikologisk betenkelige bivirkninger. På grunn av den ikke sedvanlige aminosyresammensetning er også eventuelle proteolytiske spaltprodukter å anse som fysiolo- gisk ufarlige. Følgelig kunne det ved oral inngivning også høye doser av amylaseinhibitor AI-3688 på forsøksdyrene ikke sees"påfallende symptomer. For undersøkelse av farmakolo-giske virkninger av amylaseinhibitoren fikk fastende hann-Wistar-rotter med en vekt mellom 200 og 250 g hemmstoffet AI-3688 ifølge oppfinnelsen administrert oralt samtidig med 2 g stivelse pr. kg kroppsvekt. Ved bestemmelse av blod-sukkerkonsentrasjonen i blodprøver som ble tåtet før, under og etter applikasjonen av a>amylaseinhibitoren, ble prepar-atets virkning bevist.
Ved siden av blodsukkerregulering kan man anvende polypeptidene ifølge oppfinnelsen også til hemming av spyttamylasen. Dette enzym bevirker fordøying av stivelses i munnen, og det således dannede sukker befordrer kariesangrep på tennene. Forbindelsen ifølge oppfinnelsen kan derfor anvendes til å hindre eller nedsestte dannelsen av karies.
Videre kan de anvendes som biokjemiske reagenser samt som diagnostiske midler.
AmYi<§§>eprøyer
En amylaseinhibitorenhet (AIE) er definert som den inhibitor-mengde som under prøvebetingelsene formår å hemme to amylase-enheter (AE) til 50%. En amylaseenhet er etter interna-sjonal overenskomst den enzymmengde som i løpet av 1 minutt spalter 1 \ x ekvivalent glukosidiske bindinger i stivelsen.
De uval spaltede glukosidiske bindinger bestemmes som^val reduserende sukker fotometrisk med dintrosalizylsyre. Angiv-elsene er beregnet som^mol maltose, som fastslås ved hjelp av en maltose-vurderingslinje.
Prøvene gjennomføres som følger:
a-amylase fra svinepankreas og oppløsningene som skal under-søkes forinkuberes sammen i 1,0 ml 20 mM fosfatpuffer,
pH 6,9, + 10 mM NaCl 10-20 min. ved 37°C. Den enzymatiske
startes ved tilsetning av 1,0 ml oppløselig stivelse (0,25%
i den angitte puffer) ifølge Zulkowski. Etter nøyaktig 10 minutter stoppes reaksjon med 2,0 ml dinitrosalizylsyre-fargereagens (ifølge Boehringer Mannheim: Biochemica-Informa-tion II) og oppvarmes til fargefremkalling i 5 minutter i kokende vannbad. Etter avkjøling måles ekstinksjonen ved 546 nm mot reagensblindverdi. Den 50%-ige hemming bestemmes sammenlignet til uhemmet enzymreaksjon ved anvendelse av forskjellige inhibitormengder grafisk ved hjelp av sannsyn-lighet sopp f øring .
Eksemp_el_l
Til fremstilling av AI-3688 foregikk podningsvirkningen (dyrking av mikroorganismer) som vanlig i mikrobiologisk praksis, fra en frysetørket permanentform av organismen Streptomyces aureofaciens FH 1656, DSM 2790, over enkelt-kolonipassasjer og skråsmårør. Den for fermenteringen nødvendige masseproduksjon av sporer ble likeledes gjennom-ført på fast næringsbunn i Roux-flasker.
Med sporeavsvømmingen av Roux-flaske i 100 ml sterilt vann ble det podet et vegetativt fermenterings-fortrinn i en Fernbach-flaske (arbeidsvolum 1,2 1).
<32Y2§>^<§£>^<2D£§li2>2<:>Etter 48 timers forkultur (se ovenfor) ble 200 1 hovedfermenteringsmedium inokulert med 1,2 1 podningsstoff fra Fernbach-flasken.
Medium:
Inkubasjonen foregikk ved 28°C under omrøring med en omkretshastighet på 5 m/sek. og 0,1 vvm luftningsgrad i 5 dager. pH-verdien falt under fermenteringen og ble styrt med natriumhydroksyd på 5,5-6,0. Etter 5 dager ble det høstet, utbyttet utgjorde 60 mg AI-3688 pr. liter kulturoppløsning.
Eksermoel_2
180 1 fermenteringsoppløsning ifølge eksempel 1 ble ved hjelp av en sentrifuge befridd for cellemasse og den klare flytende fase innstilt på pH 4,9. Deretter påførte man opp-løsningen på en søyle som inneholdt 15 1 polystyren-adsorp-sjonsharpiks ("Diaion" HP-20), ettervasket med 30 1 vann og eluert med vann, som var tilsatt økende mengde isopropanol. Blandingen som inneholdt 25% isopropanol oppløste inhibitoren AI-3688 fra søylen. Disse aktive eluater (25 1) ble konsen-trert ved ultrafiltrering og under vanntilsetning samt ytterligere ultrafiltrering avsaltet så lenge inntil retenatet ikke mer inneholdt påvisbare salter. Det resulterende konsen-trat (1,5 1) adskilte man på DEAE-modifisert cellulose (DEAE-"Sephadex"), som var blitt ekvilibrert med 1/15 m fosfatpuffer, pH 5,6. Ved anlegg av en ekstra koksaltgradient ble a-amylaseaktiviteten eluert. De tilsvarende fraksjoner ble avsaltet. Man konsentrerte i ultrafiltreringsceller ("Amicon"), som var ekvilibrert med 1/15 m fosfatpuffer,
pH 5,6. Ved anlegg av en ekstra koksaltgradient ble a -amylasehemmeaktiviteten eluert. De tilsvarende fraksjoner ble avsaltet. Man konsentrerte igjen i ultrafiltreringsceller ("Amicon"). Sluttrensingen foregikk på polyacrylamid-gel ("Biogel P-6") med rent vann som elueringsmiddel. De AI-366-holdige fraksjoner av denne søyle ble samlet og frysetørket. Det fremkom 1,2 g av et fargeløst pulver med 1,5 x IO<4>a - amylaseinhibitorenheter pr. mg.
Eksempel_3
Fremstillingen av et flerekomponentholdig AI-3688-inhibitor-kompleks foregikk som angitt i eksempel 1, imidlertid ble den der angitte fermenteringstid utvidet fra 5 til 8 dager. Opp-arbeidelsen av fermenteringsoppløsningen foregikk ifølge eksempel 2, idet imidlertid det resulterende fargeløse stoff (0,9 g) ikke var kjemisk enhetlig. 100 mg av dette pulver oppløses i 1 ml vann/acetonitril )5:5 v/v) og påføres på en stålsøyle (med indre mål 3,2 x 25 cm<2>), som var fylt med "reversed phase-Kieselgel RP18". Elueringen foregikk med oppløsningsmiddelblandingen vann-acetonitril (95:5) som med trifluoreddiksyre var inntilt på pH 2,1. Ved et ved hjelp av stempelpumper frembragt arbeidstrykk på 70 bar, innstiller det seg en gjennomstrømningshastighet på 8 ml pr. minutt. Søyleutstrømningen kontrollerte man ved bestemmelse av ultra-fiolettadsorpsjonen ved 276 nm. Etter 41-43 minutter ble det vasket flere absorberende forbindelser fra søylen som alle adskilt samlet ble undersøkt på a-amylasehemmende virkning, inndampet i vakuum og deretter frysetørket. De enkelte fraksjoner ble med en Beckman-sekvenser 890 C undersøkt på enhet-lighet og aminosyresekvensen bestemt.
Herved viste analysen av
topp 1 en aminosyresekvens, hvis struktur tilsvarte formel Ia,
idet imidlertid aminosyren 34 (Glu) var utvekslet mot Gin (= AI-3688 c)
topp 2 en aminosyresekvens, hvis struktur tilsvarte formel Ia
(= AI 3688)
topp 3 en aminosyresekvens som omtalt i formel Ia, imidlertid
var aminosyre 14 (Gin) erstattet med Glu (= AL-3688 b)
topp 4 l-Des-Ala-AI-3688 (=AI-3688 a)
topp 5 en blanding av to l-Des-Ala-AI-3688-forbindelser, i en var aminosyren 33 (Glu) erstattet med Gin, (= AI-3688 e) i den andre aminosyren 13 (Gin) med Glu (= AI-3688 d).
Den spesifikke a-amylasehemmeaktiviteten av alle forbind-
4
eiser utgjorde (1,5 + 0,1) x 10 AIE pr. mg.
Eksemgel_4_
(Ringspalting, påvisning av det virksomme prinsipp).
10 mg AI-3688 ifølge eksempel 2 ble oppløst i 5 ml fosfatpuffer, pH 7,0. En liten prøve ble uttatt til prøven og deretter blandet med 10 mg ditioerytrit. Etter 18 timers standtid ved værelsestemperatur ble reaksjonsoppløsningen undersøkt sammenlignet med utgangsoppløsningen på a-amylasehemmende virkning. Mens utgangsstoffet med 1,5 x 10 4 AIE pr. mg var fullt aktivt, var virkningen av reaksjonsoppløs-ningen under påvisningsgrensen.

Claims (11)

1- Cykliske polypeptider, karakterisert ved at de består av
10-200 aminosyrer og har følgende formel I
hvori Z betyr Gin, Asn eller Met S betyr Ser eller Thr Y betyr Phe, Tyr eller Asn AS betyr en polypeptidkjede av 5-25 naturlig aminosyrer, som på sin side kan være substituert med ytterligere naturlige aminosyrer eller peptidkjeder, unntatt a-amylaseinaktivatorenT endamistat (HOE 467) samt den fra kulturfirtratet fra Streptomyces violaceoruber ATCC 31209 fremstilte a-amylaseinhibitor.
2. Cykliske polypeptider ifølge krav 1, karakterisert ved at i formel I betyr Z Gin, S betyr Ser, Y betyr Tyr og AS betyr en polypeptidkjede av 12 aminosyrer, som er substituert med 2 peptidkjeder.
3. Cyklisk polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at det har formel Ia
4. Fremgangsmåte til fremstilling av et cyklisk polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at det kultiveres en Streptomycetes som frembringer polypeptidet i et fermen-tas j onsmedium i submersfremgangsmåten, polypeptidet isoleres fra mycelet eller kulturfiltratet på i og for seg kjent måte og renses.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at Streptomyces aureofaciens DSM 2790 kultiveres og fra kulturfiltratet isoleres polypeptidet AI-3688 og renses.
6. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at et innhold av polypeptid ifølge krav 1.
7. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det inneholder polypeptid ifølge krav 3.
8. Anvendelse av polypeptid ifølge krav 1 til hemming av Q^amylasen.
9. Anvendelse av polypeptider ifølge krav 1 til behandling av diabetes, prediabetes og adipositas.
10. Anvendelse av polypeptider ifølge krav 1 som diagnostikum, reagens eller profylaktikum mot karies.
11. Streptomyces aureofaciens DSM 2790.
NO844422A 1984-01-21 1984-11-06 Nye polypeptider med alfa-amylasehemmende virkning, fremgangsmaate til deres fremstilling, deres anvendelse og farmasoeytiske preparater NO844422L (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3402021 1984-01-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NO844422L true NO844422L (no) 1985-07-22

Family

ID=6225535

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO844422A NO844422L (no) 1984-01-21 1984-11-06 Nye polypeptider med alfa-amylasehemmende virkning, fremgangsmaate til deres fremstilling, deres anvendelse og farmasoeytiske preparater

Country Status (17)

Country Link
US (1) US4623714A (no)
EP (1) EP0151246B1 (no)
JP (1) JPS60152500A (no)
KR (1) KR850005454A (no)
AT (1) ATE56728T1 (no)
AU (1) AU580973B2 (no)
CA (1) CA1230841A (no)
DE (1) DE3483260D1 (no)
DK (1) DK520784A (no)
ES (1) ES539678A0 (no)
FI (1) FI844289L (no)
GR (1) GR80840B (no)
HU (1) HU192495B (no)
IL (1) IL73472A0 (no)
NO (1) NO844422L (no)
PT (1) PT79840B (no)
ZA (1) ZA848651B (no)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3508384A1 (de) * 1985-03-08 1986-11-06 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Hemmung humaner speichel- und pankreasamylase durch monoklonale antikoerper
CA2128044C (en) * 1993-08-05 2007-02-20 Klaus-Dieter Bremer Pharmaceutical compositions comprising a glucosidase and/or amylase inhibitor, and a lipase inhibitor
WO2005051298A2 (en) 2003-11-19 2005-06-09 Metabasis Therapeutics, Inc. Novel phosphorus-containing thyromimetics
US7262318B2 (en) * 2004-03-10 2007-08-28 Pfizer, Inc. Substituted heteroaryl- and phenylsulfamoyl compounds
US20050288340A1 (en) * 2004-06-29 2005-12-29 Pfizer Inc Substituted heteroaryl- and phenylsulfamoyl compounds
AP2007003979A0 (en) * 2004-11-23 2007-06-30 Warner Lambert Co 7-(2h-pyrazol-3-yl)-3,5-dihyroxy-heptanoic acid derivatives as hmg co-a reductase inhibitors for thetreatment of lipidemia
US7741317B2 (en) 2005-10-21 2010-06-22 Bristol-Myers Squibb Company LXR modulators
US7888376B2 (en) 2005-11-23 2011-02-15 Bristol-Myers Squibb Company Heterocyclic CETP inhibitors
JP5498168B2 (ja) 2006-12-01 2014-05-21 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー アテローム性動脈硬化および循環器疾患の治療のためのcetp阻害剤としてのn−((3−ベンジル)−2,2−(ビス−フェニル)−プロパン−1−アミン誘導体
US8969514B2 (en) 2007-06-04 2015-03-03 Synergy Pharmaceuticals, Inc. Agonists of guanylate cyclase useful for the treatment of hypercholesterolemia, atherosclerosis, coronary heart disease, gallstone, obesity and other cardiovascular diseases
MX354786B (es) 2007-06-04 2018-03-21 Synergy Pharmaceuticals Inc Agonistas de guanilato ciclasa utiles para el tratamiento de trastornos gastrointestinales, inflamacion, cancer y otros trastornos.
CA2726917C (en) 2008-06-04 2018-06-26 Synergy Pharmaceuticals Inc. Agonists of guanylate cyclase useful for the treatment of gastrointestinal disorders, inflammation, cancer and other disorders
WO2010009319A2 (en) 2008-07-16 2010-01-21 Synergy Pharmaceuticals Inc. Agonists of guanylate cyclase useful for the treatment of gastrointestinal, inflammation, cancer and other disorders
US20120046364A1 (en) 2009-02-10 2012-02-23 Metabasis Therapeutics, Inc. Novel Sulfonic Acid-Containing Thyromimetics, and Methods for Their Use
JP2013528172A (ja) 2010-05-21 2013-07-08 ファイザー・インク 2−フェニルベンゾイルアミド
US20130156720A1 (en) 2010-08-27 2013-06-20 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating or preventing metabolic syndrome and related diseases and disorders
US9616097B2 (en) 2010-09-15 2017-04-11 Synergy Pharmaceuticals, Inc. Formulations of guanylate cyclase C agonists and methods of use
JP2014513923A (ja) 2011-03-04 2014-06-19 ファイザー・インク Edn3様ペプチドおよびその使用
US20150050371A1 (en) 2012-03-09 2015-02-19 Biotropics Malaysia Berhad Extract Formulations of Rhodamnia Cinerea And Uses Thereof
EP2970384A1 (en) 2013-03-15 2016-01-20 Synergy Pharmaceuticals Inc. Agonists of guanylate cyclase and their uses
WO2014151200A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Synergy Pharmaceuticals Inc. Compositions useful for the treatment of gastrointestinal disorders
EP2986599A1 (en) 2013-04-17 2016-02-24 Pfizer Inc. N-piperidin-3-ylbenzamide derivatives for treating cardiovascular diseases
JP6606491B2 (ja) 2013-06-05 2019-11-13 シナジー ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド グアニル酸シクラーゼcの超高純度アゴニスト、その作成および使用方法
DK3186242T3 (da) 2014-08-29 2021-12-20 Tes Pharma S R L Alfa-amino-beta-carboxymuconsyre-semialdehyd-decarboxylasehæmmere
WO2016055901A1 (en) 2014-10-08 2016-04-14 Pfizer Inc. Substituted amide compounds
AR109950A1 (es) 2016-10-14 2019-02-06 Tes Pharma S R L INHIBIDORES DE LA ÁCIDO a-AMINO-b-CARBOXIMUCÓNICO SEMIALDEHÍDO DESCARBOXILASA
KR20210111248A (ko) 2018-11-20 2021-09-10 테스 파마 에스.알.엘. α-아미노-β-카르복시뮤콘산 세미알데하이드 데카르복실라제의 저해제
BR112021013807A2 (pt) 2019-01-18 2021-11-30 Astrazeneca Ab Inibidores de pcsk9 e seus métodos de uso

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2701890C2 (de) * 1977-01-19 1983-08-04 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Peptielischer Glycosidhydrolase-Inhibitor aus einem Streptomyceten und seine Verwendung
DE2716050A1 (de) * 1977-04-09 1978-10-19 Hoechst Ag Alpha-amylase-inhibitor aus einem streptomyceten und verfahren zu seiner gewinnung
ES8207217A1 (es) * 1980-10-09 1982-09-01 Hoechst Ag Procedimiento para la preparacion de un inactivador de alfa-amilasa

Also Published As

Publication number Publication date
FI844289L (fi) 1985-07-22
EP0151246A3 (en) 1987-05-27
IL73472A0 (en) 1985-02-28
AU580973B2 (en) 1989-02-09
HUT37657A (en) 1986-01-23
GR80840B (en) 1985-02-26
KR850005454A (ko) 1985-08-26
DE3483260D1 (de) 1990-10-25
HU192495B (en) 1987-06-29
DK520784D0 (da) 1984-11-01
ES8602112A1 (es) 1985-11-16
JPS60152500A (ja) 1985-08-10
ES539678A0 (es) 1985-11-16
AU3519084A (en) 1985-07-25
FI844289A0 (fi) 1984-11-01
EP0151246A2 (de) 1985-08-14
ATE56728T1 (de) 1990-10-15
PT79840B (en) 1986-11-14
PT79840A (en) 1985-02-01
US4623714A (en) 1986-11-18
DK520784A (da) 1985-07-22
EP0151246B1 (de) 1990-09-19
ZA848651B (en) 1985-06-26
CA1230841A (en) 1987-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO844422L (no) Nye polypeptider med alfa-amylasehemmende virkning, fremgangsmaate til deres fremstilling, deres anvendelse og farmasoeytiske preparater
Takeda Thermostable direct hemolysin of Vibrio parahaemolyticus
KR100610389B1 (ko) 조눌린의 펩타이드 길항제와 그 사용 방법
NO813407L (no) Alfa-amylaseinaktivator, fremgangsmaater til dets fremstilling, middel paa basis av denne inaktivator, samt dens anvendelse
NO180379B (no) Fremgangsmåte for fremstilling av et vesentlig renset insulinderivat
AU5792996A (en) Oral dosage composition for intestinal delivery and method of use of the same
CA2257240A1 (en) Fragments of leptin (ob protein)
US5912323A (en) Zonula occludens toxin receptors
US20110144001A1 (en) Highly bridged peptides from actinomadura namibiensis
US4019960A (en) Process for the production of a saccharase inhibitor
DK172818B1 (da) Antibiotisk polypeptid, fremgangsmåde til dets fremstilling samt dets anvendelse
EP0084826B1 (en) Antibiotic compound
NO853461L (no) Nye alfa-glukosidaseinhibitor, fremgangsmaate til dens fremstilling, dens anvendelse og farmasoeytiske preparater.
US3937817A (en) Pharmaceutical compositions containing a saccharase inhibitor
DK148798B (da) Fremgangsmaade til fremstilling af 1-desoxynojirimycin ud fra organismer af slaegten bacillus, samt en kultur af en bacillus-stamme til anvendelse herved
KR100997073B1 (ko) 멤노 펩타이드, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
NO853460L (no) Nye pseudooligosakkarider med alfa-glukosidasehemmende virkning, fremgangsmaate til deres fremstilling og deres anvendelse samt farmasoeytiske preparater.
JPS61134398A (ja) 新生理活性物質プリパスタチン及びその製造法
US4990500A (en) Oxirane pseudooligosaccharides, a process for their preparation, their use and pharmaceutical preparations
EP0468504A1 (en) A novel antibiotic, balhimycin, a process for its production and its use as pharmaceutical
WO2000052043A1 (fr) Polypeptide exerçant une action contre le virus de l&#39;immunodeficience humaine, gene codant pour ce polypeptide, et procede de production de ce polypeptide
KR970010137B1 (ko) 항종양 항생제 케다르시딘(kedarcidin)
NO781267L (no) Alfa-amylase-inhibitor fra en streptomycet og fremgangsmaate til deres utvinning
DD280553A5 (de) Verfahren zur herstellung des antibiotikums kedarcidin