DK148798B

DK148798B - Fremgangsmaade til fremstilling af 1-desoxynojirimycin ud fra organismer af slaegten bacillus, samt en kultur af en bacillus-stamme til anvendelse herved

Info

Publication number: DK148798B
Application number: DK577577AA
Authority: DK
Inventors: Werner Frommer; Lutz Mueller; Delf Schmidt; Walter Puls; Hans-Peter Krause; Ulrich Heber
Original assignee: Bayer Ag
Priority date: 1976-12-23
Filing date: 1977-12-23
Publication date: 1985-09-30
Also published as: JPH0117677B2; AT363054B; NL185461B; GB1554090A; DK148798C; JPS6427487A; JPH0224519B2; FR2378854B1; DK577577A; US4307194A; CH635616A5; FR2385733A1; NL185461C; ES465339A1; ATA918377A; JPS5379097A; FR2378854A1; NL7714141A; FR2385733B1

Description

148798

Det er kendt, at en række af actinomyceter, fremfor alt actinoplanaceer, danner inhibitorer for glycosidhydrola-ser, fortrinsvis fordøjelseskanalens kulhydratspaltende enzymer (tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.064.092).

Det er endvidere kendt, at nojirimycin, et bakteriosta-tisk virkende antibiotikum fra stammer af slægten Streptomyces, hæmmer visse mikrobielle α-glucosidaser (T. NIWA et al. Agr.

Biol. Chem. 34, 966 (1970)).

Nojirimycin fremstilles ifølge T. NIIDA et al. (J. Antibiotics, Ser. A. 20, 62 (1967)) ved dyrkning af organismer af slægten Streptomyces. Ved hydrogenering ad kemisk vej af 2 148798 antibiotiket nojirimycin kan der som beskrevet af S. INOYE et al. (Tetrahedron 23, 2125 (1968) fremstilles en forbindelse med sumformlen CgH^O^N (CgH-^O^NCl for hydrochloridet) , der ifølge forfatterne har strukturformlen

H

JL CHo0H

Η0'|^>λ3-'ΝΗ B0Nr^s(.

H 0H H H

og for hvilken der er foreslået navnet "1-desoxynojirimycin". 1-Desoxynojirimycin er virksomt som glycosidhydrolaseinhibi-tor.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af 1-desoxynojirimycin, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en mikroorganismestamme valgt blandt Bacillus amyloliquefaciens DSM 7 og Bacillus subtilis DSM 704 dyrkes i en næringsopløsning ved en temperatur på ca. 15-80°C i ca. 1-8 dage under beluftning i en sædvanlig gæringsbeholder, cellerne fracentrifugeres, og 1-desoxynojirimycin isoleres fra kulturvæsken eller celleekstrakterne ved sædvanlige rensningsoperationer. Opfindelsen angår desuden en biologisk ren kultur af en mikroorganismestamme til anvendelse ved udøvelse af fremgangsmåden, hvilken kultur er ejendommelig ved, at mikroorganismestammen er Bacillus subtilis DSM 704.

Ifølge den foreliggende opfindelse er det for første gang muligt at fremstille 1-desoxynojirimycin i en arbejdsgang ved direkte mikrobiologisk syntese med gode udbytter uden omvejen via det relativt ustabile og dermed vanskeligt håndterlige nojirimycin.

Det er overordentligt overraskende og kunne ikke forudses, at 1-desoxynojirimycin produceres af de nævnte organismer af slægten Bacillus, da disse mikroorganismer i almindelighed egner sig mindre som sekundærstof-producenter og eventuelt i det væsentlige danner peptidagtige sekundære stoffer.

De nævnte mikroorganismestammer dyrkes på følgende måde: 3 148798

Med podemateriale fra stammerne podes kulturkolber med næringsopløsninger, der muliggør vækst af disse stammer. Der kan f.eks. anvendes en næringsopløsning, der pr. liter indeholder 5 g pepton og 3 g kødekstrakt, men i princippet kan der anvendes mange andre typer af næringsopløsninger, der indeholder egnede carbon- og nitrogenkilder, og næringssalte. Næringsopløsningernes pH-værdi kan varieres inden for vide grænser, men der vælges fortrinsvis en begyndelses-pH-værdi af næringsopløsningen mellem 6,0 og 8,0.

Som carbonkilde i næringsopløsningen kan der anvendes de mest forskelligartede organiske stoffer. Der kan f.eks. nævnes kulhydrater, organiske syrer og alkoholer.

Som nitrogenkilde kan der anvendes gærekstrakter, sojamel, peptoner, kødekstrakt og mange andre organiske stoffer.

Koncentrationerne af carbon- og nitrogenkilderne samt af næringssaltene, hvoraf der f.eks. kan nævnes ferrosulfat, calciumcarbonat og magnesiumsulfat, kan varieres inden for vide grænser. I mange tilfælde kan en særlig tilsætning af næringssalte helt undgås, da de ofte findes i de komplekse nitrogenkilder som iblanding.

Da dannelsen af den omhandlede inhibitor ofte er stærkt afhængig af næringssubstratets sammensætning, er det anbefalel-sesværdigt at dyrke stammerne i forskellige næringsopløsninger for at optimere produktionsydelsen. Tilsvarende forslag fremgår af eksemplerne.

Af næringsopløsningen fyldes f.eks. 100-200 ml i en 1--liters Erlenmeyer-kolbe, der steriliseres på kendt måde, podes med stammen, der skal dyrkes, og kolberne inkuberes ved 15-80°C på rystemaskiner. Hvis kulturen udviser vækst, hvilket i almindelighed kan ses efter 1-10 dage, for det meste efter 1-5 dage, udtages der en prøve på f.eks. 5 ml, og cellerne skilles fra denne prøve ved filtrering eller centrifugering. Af kulturvæskerne anvendes 1-100 pi ved den i det følgende beskrevne test, og hæmmekapaciteten pr. ml beregnes.

Cellerne ekstraheres to gange med hver gang 5 volumener (beregnet på cellevolumenet) acetone og derpå en gang med 5 vo- 4 148798 lumener diethylether. De forenede ekstrakter inddampes til tørhed, optages i vand og lyophiliseres. Lyophilisaterne anvendes i koncentrationer på 10-1000 jig/ml ved den i det følgende beskrevne test.

Amylasetest

En amylase-inhibitor-enhed (1 AIE) defineres som den mængde inhibitor, der inhiberer 2 amylaseenheder 50%. En amylaseenhed (AE) er den mængde enzym, der i løbet af 1 minut under de nedenfor angivne testbetingelser spalter et mikroækvivalent gluco-sidiske bindinger i stivelse. Antallet af mikroækvivalenter spaltede bindinger bestemmes kolorimetrisk med dinitrosalicylsyre som mikroækvivalenter dannet, reducerende sukker og angives ved hjælp af en maltosemålekurve som mikroækvivalenter maltoseækvivalenter.

Til gennemførelse af testen sættes der til 0,1 ml amylaseopløsning (20-22 AE/ml) 10-1000 ^ig inhibitor eller 1-100.^il af kulturopløsningen, der skal testes, i 0,4 ml 0,02 M natriumglycerolphosphat-puffer/0,001 M calciumchlorid med en pH-værdi på 6,9, og blandingen bringes i ligevægt i et vandbad på 35°C i 10-20 minutter. Derefter inkuberes der i 5 minutter ved 35°C med 0,5 ml af en til 35°C forvarmet, 1% stivelsesopløsning, og derpå tilsættes der 1 ml di-nitrosalicylsyre-reagens (ifølge P. Bernfeld, Colowich-Kaplan,

Meth. Enzymol., bind 1, side 149). Til farveudvikling opvarmes blandingen i 5 minutter på et kogende vandbad, hvorefter den afkøles, og der tilsættes 1 ml destilleret vand. Extinktionen ved 540 nm måles mod en tilsvarende fremstillet blindværdi uden amylase. Til bedømmelse aflæses den efter inhibitortilsætningen stadig virksomme amylaseaktivitet på en i forvejen optaget amylase-målekurve, og deraf beregnes den procentuelle hæmning af den anvendte amylase. Den procentuelle hæmning beregnes som funktion af forholdet ^ig inhibitor *

AE

5 148798 i beregnet på tørstof XX AE i ikke inhiberet blanding fra samme serie 50%'s hæmningspunktet aflæses på kurven og omregnes til AIE/mg inhibitor.

Saccharasetest

En saccharase-inhibitor-enhed (SIE) defineres som den mængde inhibitor, der inhiberer 2 saccharaseenheder 50%. En saccharase-enhed (SE) er den mængde enzym, der i løbet af 1 minut under de nedenfor angivne betingelser spalter 1 ^imol saccharose til glucose og fructose. Antallet af ^imol dannet glucose bestemmes kvantitativt ved hjælp af glucoseoxidasereaktionen under betingelser, hvorved en yderligere saccharosespaltning på grund af saccharasen ikke mere finder sted. Til gennemførelse af testen sættes der til 0,05 ml af en til 0,12 SE indstillet saccharaseopløsning [Solu-biliseret saccharase fra svinetyndtarmsmucosa ifølge B. Borgstrom, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. 12, (1958), side 1997. Fortyndet med 0,1 M natriummaleinatpuffer med en pH-værdi på 6,0 til et tilsvarende SE-indhold.] 1-20 jag inhibitor eller 1-20 ^il af opløsningen, der skal testes, og der fyldes op med 0,1 M natrium-maleinatpuffer med en pH-værdi på 6,0 til 0,1 ml. Blandingen bringes i ligevægt i 10 minutter ved 35°C, og derefter tilsættes der 0,1 ml af en til 35°C forvarmet 0,05 M saccharoseopløsning i 0,1 M na-triummaleinatpuffer med en pH-værdi på 6,0. Der indkuberes i 20 minutter ved 35°C, og saccharasereaktionen standses ved tilsætning af 1 ml glucoseoxidasereagens [glucoseoxidasereagenset fremstilles ved opløsning af 2 mg glucoseoxidase (Fa. Boehringer, renhedsgrad I) i 100 ml 0,565 M tris-HCl-puffer med en pH-værdi på 7,0 og påfølgende tilsætning af 1 ml detergentopløsning (2 g "Triton X 100" + 8 g 95%'s ethanol til analysebrug), 1 ml dianisidinopløs-ning (260 mg o-dianisidin, 2HC1 i 20 ml vand) og 0,5 ml 0,1%, vandig peroxidaseopløsning (Fa. Boehringer, lyophilisat, renhedsgrad II).], og der inkuberes i yderligere 30 minutter ved 35°C. Derefter tilsættes der 1 ml 50%'s svovlsyre, og der måles ved 545 nm mod en tilsvarende blindværdi. Til bedømmelse beregnes den procentuelle hæmning af den anvendte saccharase og omregnes ud fra 50%'s hæmningspunktet ved hjælp af en glucosemålekurve til SIE/g eller SIE/1.

6 148798

Maltasetest

En maltase-inhibitor-enhed (MIE) defineres som den mængde inhibitor, der inhiberer to maltaseenheder 50%. En maltaseenhed (ME) er den mængde emzym, der i løbet af 1 minut under de nedenfor angivne testbetingelser spalter 1 ^imol maltose i 2 ^imol glucose. Antallet af ^ixnol dannet glucose bestemmes kvantitativt ved hjælp af glucoseoxidasereaktionen under betingelser, hvorved en yderligere maltosespaltning på grund af maltasen ikke mere finder sted. Til gennemførelse af testen sættes der til 0,05 ml af en til 0,060-0,070 ME indstillet maltaseopløsning [solubiliseret maltase fra svinetyridtarmsmucosa ifølge B. Borgstrom, A. Dahlquist,

Acta Chem. Scand. 12, (1958), side 1997. Fortyndet med 0,1 M na-triummaleinatpuffer med en pH-værdi på 6,0 til et tilsvarende ME-indhold.] 1-20 ^ig inhibitor eller 1-20 jul af opløsningen, der . skal testes, og med 0,1 M natriummaleinatpuffer med en pH-værdi på 6,0 fyldes der op til 0,1 ml af en til 35°C forvarmet 0,05 M maltoseopløsning i 0,1 M natriummaleinatpuffer med en pH-værdi på 6,0. Der inkuberes i 20 minutter ved 35°C, og maltasereaktio-nen standses ved tilsætning af 1 ml glucoseoxidasereagens [se ovenfor], og der inkuberes i yderligere 30 minutter ved 35°C. Derefter tilsættes der 1 ml 50%'s svovlsyre, og der måles ved 545 nm mod en tilsvarende blindværdi.

Til bedømmelse beregnes den procentuelle hæmning af den anvendte maltase og omregnes ud fra 50%'s hæmningspunktet ved hjælp af en glucosemålekurve til MIE/g eller MIE/1.

B. subtilis DSM 704 og B. Amyloliquefaciens DSM 7 (ATCC 23 350) er deponeret under de angivne DSM-numre ved Deutsche Saramlung fur Mikroorganismen (DSM), Gottingen, og kan fås derfra.

Stammen DSM 704, som er isoleret fra en jordprøve, er hidtil ukendt og beskrives i tabellen nedenfor. Stammen DSM 7 er kendt fra litteraturen og er opført i "Catalogue of Strains 1974" fra DSM.

Til udvinding af glycosid-hydrolase-inhibitorerne dyrkes de ovenfor anførte stammer i de ovenfor beskrevne næringsopløsninger. Derved skal der tages hensyn til, at hver stamme 7 148798 til optimal produktion i praksis kræver en næringsopløsning, der er specielt sammensat, både kvalitativt og kvantitativt.

Efter 1-10 dages inkubering ved 15-80°C i rystekolber eller i gæringsbeholdere af forskellig størrelse skilles cellerne fra kulturopløsningen, og alt efter inhibitorens optræden koncentreres det virksomme princip fra kulturopløsningen og/eller fra cellerne.

Fra kulturvæskerne vindes inhibitoren ved lyophilise-ring eller fældning med salte eller vandopløselige, organiske opløsningsmidler (f.eks. lavere alkoholer og ketoner) eller ved adsorption af det virksomme stof på ionbyttere.

Fra cellerne vindes inhibitoren ved ekstraktion med organiske opløsningsmidler, f.eks. alkoholer, ketoner, ethere, estere og sulfoxider.

Herved centrifugeres gæringsblandingen ved 3000-20000, fortrinsvis 6-10000 omdr./min., i 10-60 minutter, fortrinsvis 30 minutter, eller filtreres, fortrinsvis under tryk og under anvendelse af filterhjælpemidler, og skilles på denne måde i kulturvæske og celleremanens.

8 148798

Tabel

Egenskaber af stammen DSM 704_

Stave, længde, u 2-4 bredde, 0,6-0,8

Gram-reaktion +

Sporer ellipsoid/cylindrisk + rund terminal/subterminal + central/paracentral + sporemodercelle, opsvulmet

Bevægelighed +

Maksimal væksttemperatur Vækst positiv ved oc 55 Vækst negativ ved °C 60

Catalase +

Anaerob vækst -

Voges-Proskauer-reaktion + pH-værdi VP-medium 5/6 Æggeblomme-reaktion Vækst pH-værdi 5,7 +

NaCl 5% +

NaCl 7% +

NaCl 10 +

Lysozym (0,001%)

Syredannelse ud fra D-glucose + L-Arabinose + D-Xylose + D-Mannitol +

Gasdannelse ved fra glucose

Nedbrydning af

Stivelse +

Casein +

Gelatine +

Tyrosin Hippurat

Udnyttelse af

Citrat +

Propionat -

Desaminering af phenylalanin

Reduktion af NO^ til NO^ +

Gasdannelse ud fra nitrat

Indo! 9 148798

Stammen DSM 704 tilordnes på grund af sporedannelsen og den aerobe vækst slægten Bacillus. De bestemte morphologi-ske og fysiologiske kendetegn hos stammen DSM 704 svarer til arten Bacillus subtilis.

Identificeringen er foretaget ifølge angivelserne af R.E. Gordon, W.C. Haynes, C. Hor-Nay Pong: The Genus Bacillus, Washington 1973.

Isoleringen af inhibitoren fra den foreliggende kulturvæske kan foregå på forskellig måde: a) Inddampning af kulturvæsken ved formindsket tryk (10-50 mm Hg) ved badtemperaturer på 20-100°C, fortrinsvis 40--80°C, til ca. 1/5-1/50 af udgangsvolumenet. Den inddampede ekstrakt filtreres eller centrifugeres, og det klare filtrat (den klare ovenstående væske) lyophiliseres, eventuelt efter forudgående afsaltning.

b) Udfældning af inhibitoren fra kulturvæsken (eller den ifølge a) inddampede kulturvæske) ved tilsætning af vandopløselige, organiske opløsningsmidler, f.eks. alkoholer eller ketoner, fortrinsvis methanol, ethanol eller acetone, indtil et indhold på 60-90%. Da der ved en lavere koncentration af opløsningsmiddel udfældes inaktive ledsagestoffer, egner denne fældningsmetode sig særlig godt til fraktioneret fældning til fra-skillelse af uønskede ledsagestoffer.

c) Udsaltning af inhibitoren fra ekstrakterne (eller de ifølge a) inddampede ekstrakter), f.eks. med ammoniumsulfat, na-triumchlorid osv. Det udfældede bundfald samles ved centrifugering eller filtrering og vaskes enten direkte med acetone og ether og tørres i vakuum eller dialyseres i vand efter genopløsning og lyophiliseres.

Foruden inhibitoren findes der hyppigt i kulturvæskerne uønskede ledsagestoffer. Fraskillelsen af disse kan foregå ifølge gængse metoder.

Udvindingen af inhibitoren fra cellerne foregår ved flere ganges ekstraktion af cellerne med organiske opløsningsmidler, fortrinsvis to gange 10-20 minutters ekstraktion med 3-5 volumener acetone (beregnet på det fugtige volumen af cellerne) 148798 ίο og derpå en 5-10 minutters ekstraktion med ether. Acetone- og etherekstrakterne inddampes til tørhed i vakuum, optages i vand og lyophiliseres.

Ved dyrkning af stammen DSM 7 i en næringsopløsning med sammensætningen A (jf. eksempel 4) fås der efter 4 dages dyrkning over 400.000 SIE/1, og ved en dyrkning af denne stamme i en næ-ringsopløsning S g (jf. eksempel 3) fås der efter 6 dages dyrkning over 300.000 SIE/1.

Ved adsorption på stærkt sure kationbyttere på Inform og påfølgende desorption med vandig ammoniakopløsning samt inddampning og lyophilisering af desorbatet fås der en råinhibitor med ca. 40.000 SIE/g. Ved ekstraktion af råinhibitoren med methanol, inddampning af ekstrakten til tørhed, genopløsning i vand og chro- matografering af den vandige opløsning på svagt sure ionbyttere på dextran- eller cellulosebasis, især carboxymethylcellulose, desorption med fortyndede uorganiske syrer, fortrinsvis med 0,001--0,1 N saltsyre, inddampning af de saccharase-inhibitoraktive fraktioner og lyophilisering af disse fraktioner fås der et koncentreret råprodukt med ca. 250.000 SIE/g. Ved chromatografering af det koncentrerede råprodukt på modificeret dextran ("Sepha-dex ® LH 20") i methanol, inddampning af de saccharase-inhibi-toraktive fraktioner og tilsætning af koncentrerede, uorganiske syrer, fortrinsvis koncentreret saltsyre, til en pH-værdi på 1-3 fås der et krystallinsk produkt med 540.000 SIE/g. Dette stof er chromatografisk rent. Sumformlen bestemmes til CgH^O^N og C6H14°4NC·'· ^or kydrochloridet. På grund af dets fysiske egenskaber (IR-, NMR-, UV-spektre, smeltepunkt, specifik drejning) og de kemiske egenskaber (periodat-oxidation, elementaranalyse) er det identisk med 1-desoxynojirimycin.

Det er kendt, at der hos dyr og mennesker efter optagelse af kulhydratholdige næringsmidler og drikkevarer (f.eks. kornstivelse, kartoffelstivelse, frugt, frugtsaft, øl, chokolade) optræder hyperglykæmier, der bevirkes som følge af en hurtig nedbrydning af kulhydraterne ved hjælp af glycosidhydrolaser (f.eks. spyt- og pankreasamylase, maltaser, saccharaser) efter følgende skema 11 148798

Stivelse eller glycogen maltose --—£§§§_> glucose

Saccharose glucose + fructose.

Disse hyperglykæmier er hos diabetikere særlig stærke og udpræget langvarige. Hos personer med adipositas bevirker den alimen-tære hyperglykæmi ofte en særlig stærk udskillelse af insulin, der på sin side fører til en forøget fedtaflejring og en formindsket fedtnedbrydning. I forbindelse med sådanne hyperglykæmier optræder der ved personer med normalt stofskifte og med adipositas som følge af insulinudskillelsen hyppigt en hypoglykæmi.

Det er kendt, at både hypoglykamier og fødemængder, der opholder sig i maven, fremmer produktionen af mavesaft, der på sin side udløser eller begunstiger en opståen af gastritis eller ulcus ventri-culi eller duodeni.

Det er endvidere kendt, at kulhydrater, især saccharose, spaltes af mikroorganismer i mundhulen og derved fremmer dannelsen af caries.

Malabsorption af kulhydrater, f.eks. som følge af intestinal saccharasemangel, bevirker diarre. Egnede doser af en gluco-sidase-inhibitor bevirker en kunstig malabsorption og er derfor egnet til at modvirke en obstipation.

Den her omhandlede inhibitor egner sig derfor som tera- peutikum ved følgende indikationer: adipositas, hyperlipopro-teinami, atherosclerose, diabetes, prædiabetes, gastritis, obstipation samt caries.

Til udvidelse af virkningsspektret kan det være anbefa-lelsesværdigt at kombinere inhibitorer for glycosidhydrolaser, der gensidigt supplerer hinandens virkning. Der kan her være tale om at kombinere den her omhandlede inhibitor med andre inhibitorer.

I mange tilfælde er det også fordelagtigt at anvende kombinationer af den her omhandlede inhibitor med kendte, orale an-tidiabetika (β-cytotrope sulfonylurinstofderivater og/eller blodsukkervirksomme biguanider) samt med blodlipidsænkende virksomme stoffer, f.eks. clofibrat, nicotinsyre, cholestyramin.

12 148798

Forbindelsen kan indgives uden fortynding, f.eks. som pulver eller i et gelatinehylster eller i kombination med et bærestof i et farmaceutisk præparat.

Den her omhandlede inhibitor har endvidere den egenskab, at den hos dyr i høj grad kan påvirke forholdet mellem andelen af uønsket fedt og andelen af ønsket fedtfattigt kød (magert kød) til gunst for det magre kød. Dette er af særlig betydning ved opdræt og hold af landbrugsnyttedyr, f.eks. ved svineavl, men også af stor betydning ved opdræt og hold af andre nyttedyr og pryddyr. Anvendelsen af inhibitoren kan endvidere føre til en betydelig rationalisering af fodringen af dyrene, både tidsmæssigt, mængdemæssigt og kvalitetsmæssigt. Da den bevirker en vis forsinkelse af fordøjelsen forlænges næringsstoffernes opholdstid i fordøjelseskanalen, hvorved der muliggøres en fodring ad libitum, som er forbundet med færre omkostninger. Endvidere fås der ved anvendelse af den her omhandlede inhibitor i mange tilfælde en betydelig besparelse af værdifuldt proteinfoder.

Det virksomme stof kan således anvendes inden for praktisk talt alle områder af dyreernæring som middel til formindskelse af fedtaflejring samt besparelse af foderprotein.

Det virksomme stofs virkning er herved i vidt omfang uafhængig af dyrenes art og køn. Det virksomme stof viser sig særlig værdifuldt ved dyrearter, der i det hele taget eller i bestemte perioder af deres liv har en tilbøjelighed til forøget fedtaflejring.

Inhibitoren kan både anvendes som det rene virksomme stof og det ved fremstillingen opnåede rå, virksomme stof, eventuelt efter en grovrensning.

9

Eksempel 1 13 148798

Poder man en 1-liters Erlenmeyer-kolbe, der indeholder 120 ml af en næringsopløsning med sammensætningen 2,0% majsstivelse 1,0% glucose 0,5% caseinhydrolysat 1,0% gærekstrakt indstillet til en pH-værdi på 7,2 med natriumcarbonat + 0,4% calciumcarbonat

Sterilisation i 30 minutter ved 121°C

med en sporesuspension af stammen DSM 704 og inkuberer kolben ved 28°C på en rundrystemaskine, har kulturopløsningen efter 5 dage en aktivitet på 70 SlE/ml.

Eksempel 2

Poder man en 1-liters Erlenmeyer-kolbe, der indeholder 120 ml af en næringsopløsning med sammensætningen 7,5% maltekstrakt 0,3% caseinhydrolysat 0,7% gærekstrakt 0,3% calciumcarbonat 0,3% kaliumhydrogenphosphat ledningsvand, sterilisation i 30 minutter ved 121°C efter sterilisationen indstillet til en pH-værdi på 6,6-6,8 med kaliumcarbonat med en sporesuspension af stammen DSM 704 og inkuberer kolben ved 28°C på en rundrystemaskine, har kulturopløsningen efter 5 dage en aktivitet på 197 SIE/ml.

Eksempel 3 - Næringsopløsning

Poder man en 140-liters gæringsbeholder, der indeholder 100 1 næringsopløsning med sammensætningen 14 148798 7,5% maltekstrakt 0,3% caseinhydrolysat 0,7% gærekstrakt 0,3% kalciumcarbonat 0,3% kaliumhydrogenphosphat ledningsvand, sterilisation i 30 minutter ved 121°C,efter sterilisationen indstillet til en pH-værdi på 6,6-6,8 med kaliumcarbonat med 1,2 liter forkultur, der er fremstillet ved inkubering af 10 1-liters Erlenmeyer-rystekolber med hver 120 ml næringsopløsning af samme sammensætning, med stammen DSM 704 og inkuberer under omrøring og beluftning i 5 dage ved 28°C, fås der en kulturvæske, der indeholder 260 SIE/ml.

Eksempel 4 - Næringsopløsning A

Poder man en 1-liters Erlenmeyer-koble, der indeholder 120 ml af. en næringsopløsning med sammensætningen 3,0% sojamel 3,0% glycerol 0,2% calciumcarbonat ledningsvand

sterilisation i 30 minutter ved 121°C

med en sporesuspension af stammen DSM 7 og inkuberer kolben ved 28°C på en rundrystemaskine, har kulturopløsningen efter 4 dage en aktivitet på 437 SIE/ml.

Eksempel 5

Poder man en 1-liters Erlenmeyer-kolbe, der indeholder 120 ml af en næringsopløsning ifølge eksempel 1, med en sporesuspension af stammen DSM 7 og inkuberer kolben ved 28°C på en rundry stemaskine, har kulturopløsningen efter 5 dage en aktivitet på 162 SIE/ml.

Eksempel 6 15 148798

Poder man en 1-liters Erlenmeyer-kolbe, der indeholder 120 ml af en næringsopløsning med sammensætningen 1,0% glucose 1,0% opløselig stivelse 0,5% caseinhydrolysat 0,75% kødekstrakt 0,75% peptoner 0,5% gærekstrakt 0,1% kaliumhydrogenphosphat 0,3% natriumchlorid 0,1% MgS04 · 7 H20 ledningsvand, indstillet til en pH-værdi på 7,2 med natrium-carbonat, sterilisation i 30 minutter ved 121°C, med en sporesuspension af stammen DSM'7 og inkuberer kolben ved 28°C på en rundrystemaskine, har kulturopløsningen efter 5 dage en aktivitet på 36,4 SIE/ml.

Eksempel 7

Poder man en 1-liters Erlenmeyer-kolbe, der indeholder 200 ml af en næringsopløsning ifølge eksempel 3, med en sporesuspension af stammen DSM 7 og inkuberer kolben ved 28°C, har kulturopløsningen efter 6 dage en aktivitet på 224 SIE/ml.

Eksempel 8

Poder man en 140-liters gæringsbeholder, der indeholder 100 1 næringsopløsning ifølge eksempel 4, med 1,2 liter forkultur, der er fremstillet ved inkubering af 10 1-liters Erlen-meyer-rystekolber med hver 120 ml næringsopløsning med samme sammensætning, med stammen DSM 7 og inkuberer under omrøring og be-luftning i 5 dages ved 28°C, fås der en kulturvæske, der indeholder 286 SIE/ml.

Eksempel 9 16 148798 Gæringsvæsken fra en 100-liters gæringsbeholder ifølge eksempel 3 indstilles med halvkoncentreret saltsyre til en pH-værdi på 3,0-3,5, og baktiemassen fracentrifugeres efter udfældningen. Der fås 70 liter dybbrun kulturopløsning med et SIE-indhold på 220.000 SIE/1. Denne opløsning sendes med en strømningshastighed på 20 1/time gennem en søjle med en diameter på 30 cm, der er fyldt med 12 kg "Lewatit ® SC 104” på H+-form. Gennemløbet har praktisk talt ingen saccharaseinhibitorisk aktivitet og bortkastes. Søjlen vaskes med 50 liter destilleret vand (vaskevand 1),20 liter 0,01 N saltsyre og derefter endnu engang med 20 liter destilleret vand (vaskevand II). Til desorption af aktiviteten tilføres der nu 2,5% ammoniak. Parallelt med stigningen af eluatets ledningsevne og forøgelsen af brunfarvningen elueres den saccharaseinhibitoriske aktivitet. Forløbet på 20 liter, der fås indtil ledningsevnen stiger, bortkastes, og fraktionen på 35 liter, der indeholder aktiviteten,inddampes i en rotationsfordamper og genopløses i en smule vand (koncentrat 3 liter). Koncentratet lyophiliseres. Der 288 g dybbrunt råprodukt I med 38.000 SIE/g.

Eksempel 10 Gæringsvæsken fra en 100-liters gæringsbeholder ifølge eksempel 8 indstilles med halvkoncentreret saltsyre til en pH--værdi på 3,0-3,5, og baktériemassen fracentrifugeres efter udfældningen. Der fås 60 1 dybbrun kulturopløsning med et SIE--indhold på 240.000 SIE/1. Denne opløsning sendes med en strømningshastighed på 20 liter/time gennem en søjlé med en diameter på 30 cm, der er pakket med 12 kg "Dowex ® 50 W x 4" på H+-form. Gennemløbet har praktisk talt ingen saccharaseinhibitorisk aktivitet og bortkastes. Søjlen vaskes med 50 liter destilleret vand (vaskevand I), 20 1 0,01 N saltsyre og derefter igen med 20 liter destilleret vand (vaskevand II). Til desorption af aktiviteten tilføres der nu 2,5% ammoniak. Parallelt med stigningen af eluatets ledningsevne og forøgelsen af brunfarvningen 17 148798 elueres den saccharaseinhibitoriske aktivitet. Forløbet (20 1), der fås indtil ledningsevnen stiger, bortkastes, og fraktionen (35 1) der indeholder aktiviteten indddampes i en rotationsfordamper og genopløses i en smule vand (koncentrat 3 1). Koncentratet lyophiliseres. Der fås 360 g dybbrunt råprodukt I med 24.000 SIE/g.

Eksempel 11 50 g råprodukt I ifølge eksempel 9 findeles i en morter og ekstraheres derpå med 3 x 300 ml teknisk methanol. Til dette formål homogeniseres blandingen først i 2 minutter i en Ultra-turraxhomogenisator, hvorefter den anbringes i et 40-50°C varmt vandbad og omrøres i 20 minutter. Efter hver ekstraktion filtreres der gennem et foldefilter. Remanensen, der bliver tilbage i foldefilteret efter den 3. ekstraktion, tørres i vakuum, (28,4 g). Da undersøgelsen af denne remanens kun giver en ringe specifik aktivitet, bortkastes den. De methanoliske ekstrakter forenes og inddampes til tørhed i vakuum. Den aktive remanens, der bliver tilbage i kolben, opløses i 750 ml vand (L = 2,8 mS, pH-værdi =7,2) og sendes med en strømningshastighed på 500 ml/-time gennem en søjle med dimensionerne 5 x 50 cm, der er fyldt med CM-cellulose på H+-form (CM-cellulose fra fa. Whatman, type C 52). Der eftervaskes med 5 liter vand og tilføres derefter til eluering 20 1 0,002N saltsyre. Gennemløb, vaskevand og eluat opfanges i fraktioner på ca. 0,5 liter. Den saccharase-inhibito-riske aktivitet bestemmes, og alle fraktioner, der indeholder mere end 30.000 SIE/1 forenes. Disse fraktioner er ved gennemløbet de dybbrunt farvede fraktioner 2-4 og i det lysegule eluat fraktionerne 16-35. De forenede fraktioner inddampes og lyophiliseres. Der fås 18,2 g af gennemløbsfraktionen 2-4 med en specifik aktivitet på 4.000 SIE/g (bortkastes) samt 3,1 g af det såkaldte råprodukt II med 250.000 SIE/g (ca. 50-60% renhed). Råproduktet II er stærkt hygroskopisk og flyder hen til en klæbrig masse i luften i løbet af kort tid.

Eksempel 12 18 148798 2,5 g af råproduktet II ifølge eksempel 11 opløses til fraskil-lelse af hovedmængden af de ledsagende peptider i 15 ml methanol og chromatograferes gennem en søjle med dimensionerne 5 x 90 cm, der er fyldt med "Sephadex ®LH 20", i methanol. Ved en strømningshastighed på 100 ml/time og en temperatur på 4-5°C opsamles der fraktioner på 10 ml. 10 jxl af disse fraktioner anbringes på en silikagelplade (fa. Merck) og undersøges tyndtlagschromatogra-fisk i systemet ethanol/25%'s ammoniak/vand i forholdet 80/10/10. Fraktionerne, der ifølge tyndtlagschromatografi indeholder inhibitor, forenes, inddampes til 5-10 ml og chromatograferes igen på den samme søjle. Fraktionerne analyseres ved tyndtlagschromatografi, og de inhibitorholdige fraktioner forenes, idet der kun medtages et meget snævert område. Der inddampes til tørhed. Den på denne måde LH 20-rensede inhibitor er ca. 90% ren. Til fra-skillelse af de sidste tilbageblivende peptidforureninger optages stoffet, der bliver tilbage som remanens efter inddampning, i 2-3 ml methanol, og der sættes 50 ^il koncentreret saltsyre til den gule methanoliske opløsning. Efter kort tid, eventuelt først efter flere timers henstand, udkrystalliserer inhibitoren i form af let gullige terninger. Peptiderne forbliver i moderluden. Krystallerne fracentrifugeres, vaskes en gang med iskold methanol,og det vaskede bundfald opløses derefter under opvarmning i 2 ml methanol. Der tilsættes 4 ml butanol og henstilles natten over ved 4°C. De farveløse krystaller, der er udfældet næste morgen, fracentrifugeres, vaskes en gang med iskold methanol, en gang med acetone og en gang med ehter og tørres derpå i vakuum. Udbytte: 460 mg af inhibitoren som hydrochlorid med 540.000 SIE/g.

Eksempel 13

Til påvisning af saccharase-inhibitor-komponenten i kulturopløsning eller råprodukt benyttes også følgende tyndt-lagschromatografiske metode med påfølgende enzymreaktion på pladen, hvilket muliggør påvisning af inhibitorkomponent direkte på pladen. Ved denne tyndtlagschromatografi anbringes 19 148798 1-5 p.1 af gæringsvæsken eller 1-5 jig af præparaterne på sili-kagel-færdigplader (fa. Merck, type KG 60 F 254) og pladerne udvikles i ethanol/ammoniak/vand i forholdet 8/1/1 (system I).

For at gøre saccharase-inhibitor-komponenten direkte synlig sprøjtes den udviklede og godt tørrede plade med enzymgel (20 ml/20 x 20 cm plade), og gelen får lov at størkne. Derefter inkuberes der i 5 minutter i et fugtigt kammer ved stuetemperatur, og derpå sprøjtes der til mætning med substratgel.

Efter størkningen af dette andet gellag anbringes pladen i et fugtigt kammer og inkuberes ved 40°C. Inhiberingsfarvningen (lyse pletter på rødbrun baggrund) udvikles i løbet af 60-90 minutter. På tidspunktet for den optimale farveudvikling afbrydes inkuberingen, og pladen med de derpå anbragte agarlag tørres under en blæser med varm luft.

Fremstilling af gelerne

Enzymgel: 1,5 g agarose (L'Industrie Biologique Francais) suspenderes i 100 ml 0,2 M natriummaleinatpuffer med en pH-værdi på 6,0 og opløses derpå ved opkogning. Den klare agaroseopløs-ning afkøles til 50°C, og under rotation af opløsningen tilsættes der 250 af en opløsning af "Triton X - 100" (2 g "Triton X -- 100" + 8 g ethanol til analysebrug) og 0,5 ml dianisidinop-løsning (20 mg dianisidin/1 ml acetone). Direkte før anvendelsen af gelen tilsættes der 1 ml GOD/POD-reagens (12,5 mg glucose-oxidase, renhedsgrad I, fa. Bohringer, bestillingsnr. 15423 og 2,5 mg peroxidase, renhedsgrad II, fa. Bohringer, bestillingsnr.

15302, opløst i 5 ml maleinatpuffer) og 4-5 enheder saccharase fra svinetyndtarm (fremstillet som beskrevet på side 4). Gelen skal indtil påsprøjtningen holdes ved 50°C, da den ellers ved sprøjtningsprocessen størkner i dyserne.

Substratgel: 0,5 g agarose suspenderes i 100 ml natriummaleinatpuffer med en pH-værdi på 6,0 og opløses under kogning.

Der afkøles derpå til 50°C og tilsættes 100 jil "Triton X - 100" (2 g "Triton X - 100"+ 8 g ethanol til analysebrug) og tilsættes 1 g saccharose (Serva nr. 35579).Efter opløsning af saccharosen er gelen brugsfærdig.

148790 20

Undersøgelsen af stammernes kulturopløsninger ved denne metode viser en saccharase-inhibitor-komponent med en Rf--værdi på 0,25 i system I.