NO813407L - Alfa-amylaseinaktivator, fremgangsmaater til dets fremstilling, middel paa basis av denne inaktivator, samt dens anvendelse - Google Patents

Description

I DE-OS 27 01 890 omtales en a-amylaseinhibi - tor som utvinnes ved fermentering av streptomyse tendae 4158 (ATCC 31210) samt dets varianter og mutanter. Det er ifølge sin kjemiske struktur et peptid og har evnentil rever-sibelt å";inaktivere a-amylase. På grunn av disse egenskaper kan det anvendes til regulering, av blodsukker speilet.

Det er nå funnet at ved anvendelse av en for-bedret fremgangsmåte til fremstilling og rensning av ct-amylaseinaktivatorer, i det følgende også betegnet som HOE 4-67, kan inaktivatoren fremstilles på enklére måte i større renhet, og det høyrene stoff, består av to komponenter i det følgende betegnet som HOE 467-A og HOE 467-B,

Hvis intet annet er sagt, forståes i.<:.>:det fore.-gående og følgende ved a-amylaseinaktivator såvel blandingen som også enkeltkomponentene.

Oppfinnelsen vedrører følgelig en a-amylaseinaktivator, bestående av komponentene HOE 467-A og HOE 467-B eller av komponentene HOE 467-A eller HOE 467-B samt en fremgangsmåte til dens fremstilling og oppdeling i de to komponenter.

For a-amylase-inaktivator HOE 467,ifølge oppfinnelsen, samt for de to enkeltkomponenter HOE 467-A Og HOE 467-B er den i DE-OS 27 01 890 angitte substansbeskrivelser riktig med inntak av følgende vesentlige forskjeller:

Den hår en øket enzymatisk virkning og består

av de 2 komponenter HOE 467-A og HOE 467-B som erkarakterisert vedfølgende data:

HOE 467-A erkarakterisert vedfølgende aminosyre-sammensetning:

HOE 467-B har følgende aminosyre sammen setning:

Bestemmelsen av Trp foregikk ved absorpsjons-måling i UV-lys. De øvrige aminosyrer ble bestemt etter hydrolytisk spalting.

De isoelektriske punkter av de to komponenter adskiHer seg lite, de er avhengig av ionestyrken samt be-stemmelsesmetoder (Biochemisches Tasvhenbuch, utgitt av H.M. Rauen, Springer Verlag, 196-4). De ved isoelektrisk foku-sering (R.C.Allen, H.R. Maurer: Elektrophoresis and Iso-electric Focusing in Polyacrylamid Gel, W. de Gruyter, Berlin, 1974) oppnådde verdier utgjør:

Den høyrene a-amylaseinaktivator HOE 467-A ifølge oppfinnelsen er viderekarakterisert vedat dens endegruppe er asparaginsyren at den be står /av 74 aminosyrer med følgende sekvens: Asp-Thr-Thr-Val-Ser-Glu-Pro-Ala-Pro-Ser-Cys-Val-Thr-Leu-Tyr-Gin-Ser-Trp-Arg-Tyr-Ser-Gin-Ala-Asp-Asn-Gly -Cus -Ala-Glu-Thr-Val -Thr-Val -Lys-Val-Val -T<yr>-Glu-Asp-Asp -Thr-Glu-Gly-Leu-Cys-Tyr-Ala-Val-Al a-Pro-Gly-Gin-Ile-Thr-Thr -Val - Gly-Asp-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-His-Gly-His-Ala-Arg-Tyr-Leu-Ala-Arg-Cys-Leu og mellom Cys 11 og Cys 27 samt mellom Cys 45 og Cys 73 har disulfidbrper. Dens molekylve kt be-regner seg på grunn av sammensetningen til 7958.

For bestemmelse av aminosyre sammen setning ble HOE 467-A spaltet hydrolytisk idet det av glutamin (Gin)

og asparagin (Asn) oppstod de tilsvarende syrer Glu og Asp.

Inaktivatoren HOE 467-B er et ved den N-terminale kjedeende forkortet avbygningsprodukt av HOE 467-A. Således kan f. eks. ved en av de mulige avbygningsprodukter serin være den terminale gruppe.

For de to komponenter HOE 4-67-A og HOE 4-67-B utgjør den spesifikke... hemmevirkning mot a-amylase fra svinepankreas hver gang 1,7 . 10 AIE/g.

Hemmevirkningen ble bestemt i den nedenfor omtalte amylaseprøve.

Amylaseprøve

En amylaseinhibitorenhet (AIE) er definert som

den inhibitormengde som under prøvebetingelsene formår å

hemme to amylaseenheter (EA) til 50 %. En amylaseehhet er etter internasjonal overenskommelse den enzymmengde som i løpet av 1 munutt spalter 1 u ekvivalent glucosidiske bind-inger i stivelse. De uVal spaltede glycosidiske bind-

inger bestemmes som uVal redusert^sukker fotometrisk med dinitrosalisylsyre. Angivelsene er beregnet som uMol maltose, som fastsåles ved hjelp av en mal to se-beregningsgrad.

Prøvene gjennomføres som følger:

a-amylase fra svinepankreas og oppløsningen som skal undersøkes forinkuberes sammen i 1,0 ml 20 mM fosfat - puffer, pH 6,9 + 10 mM NaCl 10-20 minutter ved 37°C. Den enzymatiske reaksjon startes ved tilsetning av 1,0 ml opp-løselig stivelse i følge Zulkowski (0,25 % i den angitte puffer). Etter nøyaktig 10 minutter stoppes reaksjonen

med 2,0 ml dinitr osal isyl syre-f arvereagen s (ifølge Boeringer Mannheim: Biochemica-Information II) og oppvarmes til farvefremkalling 5 minutter i kokende vannbad. Etter avkjøling måles ekst inksj onen ved 54-6 nm mot reagensbl indverdi. Den 50 %- ige hemming bestemmes sammenlignet til uhemmet enzym-reaksjon ved anvendelse av forskjellige inhibitormengder grafisk ved hjelp av en sannsynlighetsoppføring.

Ved fremstilling av a-amylaseinaktivatoren ifølge oppfinnelsen, betjener man seg ifølge oppfinnelsen av stammen streptomyces tendae 4-158 (ATCC 31210) eller den avledede stammes streptomyces tendae HAG 1266 (DSM 1912). Inaktivatoren utvinnes fra kulturoppløsningen. Anvendelsen av stammen streptomyces tendae HAG 1266 er foretrukket.

Oppfinnelsen vedrører også stammens streptomyces

tendae HAG 1266.

Den nye stamme adskiller seg fra stammen streptomyces tendae ATCC 31210 ved hjelp av viktige egen skaper. Påfallende er de.forskjellige morfologiske karakteristika begge : stammer og likeledes nye for den fermentative fremstilling og isolering av a-amylaseinaktivatoren ifølge oppfinnelsen avgjørende egenskaper som den hurtige vekst og den rundt ca. 4-0 % økede a-amylase-inaktivator -produk-sjon skapasitet. Melanindannelsen som manifisterer seg ved streptomyse tendae ATTC 31210 med en brunsort farve av kulturoppløsningen og av kulturfiltratet og som stiller opparbeidelsen foran visse renseproblemer reduseres ved den nye stamme HAG 1266 ved hjelp av genetiske inngrep til ca. 1/10 og endres også kvalitativt den farvemessige for-skyvning. Melaminpigmentene viser nå en gulrødlig farve-spektrum. Elimineringen av denne melamintype ved opparbeidelsen er uten problem.

De to a-amylase-inaktivator•produserende stammer er sammenlignet ifølgende tabell:;';

Stammen streptomyces tendae HAG 1266 er depo-nert i den tyske samling av mikroorganismer (DSM) under re-gistreringsnummer DSM 1912.

Fermenteringen gjennomføres hensiktsmessig analogt i;;det som er beskrevet i DE OS 27 01 890.

De ferdige fermentering soppiøsninger av streptomyces tendae ATCC 31210 og HAG 1266 inneholder enzymer som betraktelig kan minske den virksomme stoffkonsentrasjon under opparbeidelsen. Dessuten kan stoffene være tilstedé som f. eks. melamin i fullstendig adskillelse, bare vanskelig å oppnå med de kjente fremgangsmåter.

Det er nå funnet at den nødvendige adskillelse

av inaktivatoren fra kultiiroppl øsningen lett kan gjennomføres ved anvendelse av såkalt adsorpsjonsharpikser (DE-PS 12 74

128, US-PS 35 31 963).

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen til fremstilling av a-amylaseinaktivatorer erkarakterisert vedat man kulti-verer streptomyces tendae ATCC 31210 eller HAG 1266 og fra kulturen adskiller inaktivatoren ved hjelp av adsorpsjonsharpikser eller Reversphase-Chromatographie, og deretter renser.

Egnede ha-delsvanlige harpikser som f. eks. poly styrenharpikser . Til anvendelsen, br inge s harpiksen i berøring med kulturfiltratet. Kulturvæskens pH verdi innstilles på 2-8, fortrinnsvis 4-6. Den faste harpiks ad-sorberer inaktivatoren HOE 476 selektivt, hvorimot de uønskede enzymer samt den største delen av forurensningen kan fjernes ved filtrering da de forblir ubundet i oppløsningen. Gjen-vinning av HOE 467 fra harpiksen foregår hensiktsmessig enten ved vasking med egnede vandige pufferoppløsninger som f. eks. fosfatpuffer, eller med vandige oppløsninger av organiske opp-løsning smidl er som f. eks. lavere alifatiske alkoholer, aceton, acetonitril eller andre. Den ytterligere rensning av den nå anrikede inaktivator HOE 467 foregår etter kjente fremgangsmåter .

Den omtalte adskillelse med adsorpsjonsharpikser beror på prinsippet med fordeling av forskjellige polare for-bindelser. For den nødvendige hurtige adskillelse lar det seg dessuten anvende ytterligere fordelingsmetoder. Så-

ledes er viderefordelinger egnet i form av Reversphase-Chromatographie (G. Schwendt, Chromatographische Trennmetoden,

Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1979), idet det finner anvendelse enten handelsbærere eller selv fremstilte f. eks. silaniserte bærere. Endelig skal det også henvises til væske-væskeskillefremgangsmåte, f. eks. med vandig polyetylen-glykol., vandige fosfatpuffer-systemer, slik de prinsipielt er beskrevet éksempelvis i DE-OS 26 39 129-

Det er i DO-OS 27 01 890 omtalt at ioneut-vekslere som f. eks. •DEAE-cellulose egner seg til rensning av a-amylaseinaktivatoren HOE 4-67. Herved ble som vanlig i ioneutvekslerkromatografi valgt pH verdier som sikrer en nødvendig ioniseringsgrad. Det ble nå overraskende funnet at man gjennomfører rensningene mot regelen i nærheten av isoelektriske punkt, dvs. ved en liten ioniseringsgrad fylles HOE 4-67 to komponenter. Egnet er til adskillelse pH-området .på 4-, 4- - 6, fortrinnsvis på 4,8 - 5,3» Derved fastholdes en komponent av det virksomme stoff av ioneut-veksleren og kan utløses fra denne bare ved endring av pH-verdien eller ved økning av saltkonsentrasj one.n. Dette stoff kalles HOE 467-A. Den andre komponent forblir under de nevnte betingelser med eller mindre ubundet av ioneut-veksleren, og kan således lett vaskes fra bæreren. Denne komponent nevnes HOE 467-B.

Skjønt komponentene fremkommer tilstrekkelig rene for en farmasøytisk anvendelse, kan det dessuten gjennomføres en ekstrarensning.

Således renses inaktivator HOE 467-A, f. eks. ved kromatografi i nærvær eller fravær av en dissosierende puffer, fortrinnsvis urinstoff (6-8Mu->av en vandig oppløsning) over DEAE- eller kationutveksler-søyler som f. eks. karboksy-metylcellulose-søyler, og isoleres etter vanlige metoder. Denne ekstrarensning gjennomføres f. eks. for bestemmelse

av aminosyre sekvensen.

a-amylase inaktivatoren ifølge oppfinnelsen er resistent overfor enzymatisk avbygning. Dens egenskaper er med hensyn til dets anvendelse som legemiddel interessant, spesielt som terapeutikum mot diabetes og prediabetes samt

adipositas, samt dets anvendelse til understøttelse av diett. Ved anvendelsen kan det såvel anvendes enkeltkomponentene

som også blandingen av HOE 4.67-A og HOE 4.67-B.

Oppfinnelsen omfatter også et farmasøytisk middel inneholdende amylaseinaktivatoren ifølge oppfinnelsen samt dens anvendelse.

Stivel sesholdig nærings- og nytelsesmiddel fører hos dyr og mennesker til enøkning av blodsukkeret og derved også til en formeret insulinsekresjon av pankreas. Hyperglykemi kommer i stand ved avspaltning av stivelse i for-døyelse skanalen under innvirkning av amylase og maltase til gluko se.

Hos diabetikere er denne hyperglykemi spesielt utpreget og langvarig. Ved adipøse virker den formerede insulinsekresj on på lipogenesen og minsker lipolysen.

Den alimentære hyperglykemi samt hyperin sulinemi etter stivelsesopptak lar seg unngå ved amylase inaktivatoren ifølge oppfinnelsen. Denne virkning er dpsisavhengig. ■ Amylase^inaktivatoren ifølge oppfinnelsen lar seg derfor anvende som terapeutikum ved diabetes, prediabetes og adipositas, samt til understøttelse av diett. For dette formål lønner det seg en administrering spesielt til måltidene. Doseringen som skal rette seg etter pasientens vekt samt det individuelle behov utgjør ca. 10 000 til 300 000 AIE, den kan imidlertid i enkelte tilfelle også ligge lavere eller høyere.

Amylase-inaktivatoren ifølge oppfinnelsen egner seg spesielt til oral administrering. Den kan anvendes som rent stoff men også i form av en farmasøytisk tilberedning under anvendelée av de vanlige hjelpe- og bærestoffer som f. aks. talkum, magne siumstearat, melkesukker, stivelse eller polyetylenglykoler. Som administreringsform egner det seg eksempelvis tabletter, kapsler eller også et granulat.

Også en kombinert anvendelse med andre legemidler som blodsukker senkende eller lipidsenkende stoffer kan være av fordel.

Da høyeremolekulære peptider som sådanne ikke eller ikke

i nevneverdig grad resorberes fra fordøyelseskanalen, er det av stoff ifølge oppfinnelsen ikke å vente noen toksi-kologiske betenkelige bivirkninger. På grunn av den ikke-uvanlige aminosyre sammensetning er også eventuelt proto-lytiske spaltningsprodukter å anse som fysiologisk ufarlige. Følgelig kan ved oral inngivning også av høyere doser av amylase-inaktivatoren på forsøksdyr ikke sees på vanlige symptomer. Også ved intravenøs applikasjon på mus (1 g/kg) ble inaktivatoren ifølge oppfinnelsen målt ved 24-timers iakttagelsestid uten synlige toksisk virkning.

For undersøkelse av den farmakologiske virkning av amylase-ianktivatoren fikk fastende han Wistar-rotter med en vekt mellom 200 og 250 g inaktivatoren ifølge oppfinnelsen samtidig med 2 g stivelse pr. kg legemsvekt, ad-ministrértporalt etter at det umuddelbart på forhånd ble tatt en blodprøve for bestemmelse av utgangsblodsukker-verdien. Ytterligere blodprøve ble tatt etter 15 og 30 minutter, samt etter 1, 2, 3 og 5 timer fra halevenen. Blod-sukkerbestemmelsene ble gjennomført etter metodene av Hoffman i Autoanalyzer (J. Biol. Chem. 120, 51,(1 937)).

NZO-mus har en ødelagt gluko setolerans. De egner seg derfor spesielt godt for undersøkelser hvor blod-glukose speilet påvirkes. Forsøksanordningen tilsvarer den hos rotter. Blodprøvenesble tatt fra .' orbitalvene-plexus. Blodsukkerforiøpet følges over 3 timer.

På analog måte foretas virksomt stoff-påvisning på NMRI-mus. Blodprøvene ble tatt likeledes fra orbitalvene-plexus, og blodsukkerforiøpet fulgt over 3 timer.

Under disse forsøksanordninger viste de under behandlet med inaktivatoren ifølge oppfinnelsen en i forhold til de behandlede dyr mindre protrahert blodsukkerøkning.

Eksempel 1

Stammen Streptomyces tendae HAG 1266 podes på skrårør med en næringsbunn av følgende sammensetning:

Det podede rør dyrkes 10 dager ved 28°C, og lagres deretter ved +4°C.. Porene som.løser seg lett fra det gul-aktige luftmyzel suspenderes i 10 ml sterilisert aqua dest. med 0,2 ml "Tween" 80. 10 8 -10 9 sporer, dvs. 1 ml av suspen-sjonen tjener til podning av en 300 ml Erlenmeyer-kolbe som er fylt med 35 ml sterilisert næring soppiøsning, og en pH verdi på 7,2 og følgende sammensetning:

Steril isas jonstiden utgjør 4-5 minutter ved 121°C og 1 bar. Kolben ryste.s ved 250 omdreininger pr. min. 4-0 timer ved 30°C på en rystemaskin ved en amplitude 3,5 cm. Hver gang 5 ml av denne forkultur overføres i flere Erlen-meyerkolber som er fylt med 50 ml sterilisert nær ing so pp .-1øsning og har en pH verdi på 7,4» Sammensetningen av denne hovedkultur er følgende:

Sterilisasjonstiden utgjør 45 minutter ved 121°C og 1 bar. Hovedkulturene rystes ved 25°C med 250 omdreininger pr. minutt på en rystemaskin med en amplitude på 3,5 cm.

i 96-120 timer. Ved 3. 4« og 5. kulturdag bestemmes innholdet av a-amylase-inaktivator ifølge prøvefor skriftene.

Stammen streptomyces tendae HAG 1266 gir under

de omtalte forsøk- og kul tur be tingel ser ved en slutt-pH på

6, 4 1 900 AIE/ml.

Eksempel 2

Blanding som i eksempel 1, hovedfermentering gjennomføres imidlertid i en fermenter av 15 1 samlet volum med fylling 10 1. Det anvendes følgende nærings-oppløsning ssammen setning:

pH verdien skal etter sterilisering utgjøre 6,8, og innstilles etter behov med sterilisert syre (2n H^PO^) eller lut (2n HaOH) på denne verdi. Hovedtrinnet podes med 1 liter tilsvarende 10 % av en forkultur som omtalt under eksempel 1.

Det fermenteres 50 til 70 timer ved 30°C. Luft-ingen utgjør 300 liter/time ved en omrøring på 250 Upm og et overtrykk på 0,3 bar.

Ved prøvetakning overvåkes og følges fermen-teringsf ori øpet med hensyn til inhibitoraktivitet, karbo-hydratavbygning, biomasseutvikling og kulturoppløsningens fy sikal ske-tekniske forhold (overflatespenning, viskositet, tetthet, osmotisk trykk).

Den maksimale inhibitoraktivitet oppnås fra den 60. kulturtime med gjennomsnittlig 1800 AIE/ml. Deretter tilføres fermenteringsinnholdet av opparbeidelsen.

Eksempel 3

6,5 liter kulturfiltrat fremstillet ved fra-sugning av den ifølge eksempel 2 fremstilte streptomyces-kultur, ble med iseddik under omrøring innstillet på pH 4, 9 og påført en forberedt glass-søyle. Søylen inneholdt 230 g polystyren adsorpsjonsharpiks (f. eks. "Diaion" HP 20) opp-slemmet i vann. Søylemasen utgjorde 22 x 5 cm tilsvarende

et volum på 4-30 ml. Væskegj ennomstrømningen regulerte man

således at det etter 2 timer var det passert 6,5 liter. Deretter var adsorpsjonsprosessen avsluttet, og harpiksen kunne i første rekke vaskes med rent vann og deretter elueres^med vann hvortil det var satt økende mengder isopropanol. Den gjennomstrømmende væske ble innfanget i fraksjoner på hver 1 liter, undersøkt på enzymhemm:ende virkning. De aktive fraksjoner ble samlet og inndampet i vakuum til 100 ml. Kon-sentratet inneholdt 110 000 AIE/ml.

Den således dannede nå saltfrie oppløsning ble oppført direkte på ■• en med 1/30 fosfatpuffer pH 7,5, forberedt DEAE-ioneutveksler-søyle og renset tilsvarende DAS 27 01 890, eksempel 5. Det fremkom 4 g stoff med 2500 AIE/ mg.

Eksempel'4

Til ytterligere rensning ble en glass-søyle av

2 cm diameter og 22 cm høyde tilsvarende 70 ml innhold fylt med DEAE-cellulo se som på forhånd var blitt ekvilibrert med 1/10 m natr iumace tatpuf f er, pH 4-, 9 og 0,02 % natriumazid. Nå ble det ifølge eksempel 3 dannede stoff oppløst i 10 ml

av den samme puffer, og påført på søylen. I første rekke vasket man søyleinnholdet med 100 ml acetalpuffer, deretter ble det til dette elueringsmiddel etter tilblandet koke-

salt således at det var sikret en kontinuerlig grad igjen.

Ved fraksjonert oppfanging av søylegjennomstrømninger befant HOE 467-B seg i i ennå kokesaltfri begynnelsesfraksjoner, mens HOE 467-A-komponenitene var påvisbare i de fraksjoner hvor NaCl -konsentrasjonen var 0,25 til 0,3 molar. De B- samt A-komponentene inneholdende fraksjoner ble oppsamlet, ad-skilt, dialysert mot destillert vann, og frysetørket. De farveløse stoffer hadde en virksomhet på hver

1,7" 104- AIE/mg.

Aminosyreanalysen av produktene ga etter 20 timers saltsyrehydrolyse ved hjelp av en Beckman-multikroanalysator følgende prosentuelle sammensetninger:

Eksempel1

Analogt får man av kulturoppløsningen av streptomyces tendae ATCC 31210 ct-amylaseinaktivator HOE 467-A og HOE 467-B.

Eksempel 6

a) En fremstilling av N-terminal enhetlig a-amylase-inaktivator HOE 467-A: HOE 467-A oppnådd ifølge eksempel 4 eller 5, renses ved kromatografi over en DEAE- eller karboksymetyl-cellulose i nærvær av 8M vandig urinstof f-oppi øsning som dissosierende puffer, og isoleres etter vanlige metoder.

b) Fremstilling av tryptiske peptider:

Den ifølge a) dannede a-amylase-inaktivator HOE

467-A med ren endegruppe oksyderes for oppspaltning av di-sulfidbroen enten med permaursyre eller omsettes med aziran (sammenlign C.H.W. Hirs, J. Biol. Chem. 21 9, 61 1 -621 (1 956)

og M.A. Raftery og R, D. Cole, J. Biol. Chem. 2-41, 3-457-3-461 (1 966))cpg spaltes tryptisk etter vanlige metoder. De tryptiske hydrolysater adskilles kromatografisk og renses.

c) Sekven sanaly se:

Sekvensanalyse ble gjennomført etter filmteknikken

(P. Edmann og G. Begg, Eur. J. Biochem. 1, 80-91 (1967)) under anvendelse av følgende program:

a) Quadrolprogram: Det ble avbygget den ifølge

b) med aziran omsatte a-amylaseinaktivator HOE -467-A og en

limitert tryptisk spaltet inaktivator A.

S) Propinprpgram: Her ble de øvrige peptider avbygget (sml. G. Braunitzer og B. Schrank, Hoppe-Seyler's Z. Physio. Chem. 351, 88 (1971)) og G. Braunitzer. A. Stangel og 0. Scheithauer, Hoppe-Seyler1 s Z.. Physiol. Chem 359,- M.37-U6 (1 978)).

d') Amino syre analyse :

Det ble gjennomført etter hydrolysen av de ifølge

a) dannede inaktivator med 6n saltsyre.

e) Bestemmelse av disulfodbroer:

Hertil ble det ifølge a) dannede stoff behandlet

i fortynnet maursyre med pepsin i 18 timer, spaltproduktet ble renset etter vanlige metoder.

På grunn .av de gjennomførte operasjoner viste det seg at ifølge a) dannede stoff besto av 74- aminosyrer hvis sekvens er som følger: Asp -Thr -Thr -Val -Ser -Gl u -Pro -Al a -Pro -Seir -Cy s -Val -Thr -Leu -Tyr - Gin -Ser -Trp -Arg -Tyr -Ser -Gin -Al a -A sp-A sn-Gly -Cy s -Al a-Gl u-Thr - Val-Thr-Val-Ly s-Val-Val-Tyr-Glu-Asp-Asp-Thr-Glu-Gly-Leu-Cy s-Tyr-Al a-Val-Al a-Pro -Gly-Gin-Ile -Thr-Thr-Val -Gly-Asp-Gly-Tyr-Ile -Gly-Ser-His-Gly -Hi s - Al a-Arg -Tyr -Leu-Al a-Arg -Cys -Leu og som har de nevnte steder disulfidbroer.

Claims (9)

1. a-amylase-inaktivator bestående av HOE 1+ 61- k i aminosyrens sammensetning:

og isoelektrisk punkt 4»'35 - 0,15 eller bestående av HOE 467-B med amino syre sammensetning

og isoelektrisk ;punkt 4,53 - 0,15 eller bestående av de to komponenter HOE 467-A og HOE 467-B.

2. a-amylaseinaktivator ifølge krav i, .-k arra kterisert ved at HOE 4-67-A har en molekyl-vekt på 7958 og har 74- aminosyrer av følgende sekvens Asp -Thr -Thr -Val -Ser -Glu -Pro -Al a -Pro -Ser -Cys -Val -Thr -Leu - Tyr -Gin -Ser -Trp -Arg -Tyr-Ser -Gin -Ala-Asp -Asn -Gly -Cy s -Ala-Glu-Thr-Val -Thr-Val -Lys-Val -Val -Tyr-Glu-Asp-Asp -Thr-Glu-Gly-Leu-Cys-Tyr-Ala-Val -Al a-Pro -Gly-Gin-Ile -Thr-Thr-Val - Gly . Asp -Gly -Tyr -Ile -Gly -Ser -His -Gly -Hi s -Al a -Arg -Tyr -Leu - Ala-Arg-Cys-Leu og mellom Cas 11 og Cas 27 samt mellom Cys 45 og Cys 73 er disulfidbroer.

3. Fremgangsmåte til fremstilling av a-amylase-inaktivator ifølge krav 1, karakterisert ved at streptomyces tendae ATCC 31210 eller HAG 1266 kultiveres og fra kulturen adskilles inaktivatoren ved hjelp av adsorp-sj onsharpikser eller reversphase-chromatographie. og renses deretter.

4- Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at den .adskilte inaktivator renses ved hjelp av ioneutveksler i pH området mellom 4,4 og 6, og herved oppdeles i de to komponenter HOE 467-A og HOE 4.67-B.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at den adskilte inaktivator renses ved hjelp av ioneutveksler i pH-området mellom 4» 4 og 6, og herved oppdeles i de to komponenter HOE 4-67-A og HOE 467-B og HOE 4-67-A renses videre ved kromatografi på DEAE eller karboksymetyl cellulo se-søyl:.er i nærvær av en disso sierende puffer, og isoleres.

6. Streptomyces tendae HAG 1266.

7. Farmasøytiske preparater inneholdende a-amylase-inaktivatoren ifølge krav 1.

8. Anvendelse av a-amylaseinaktivatoren ifølge krav 1 til regulering av blodsukker speilet.

9. Fremgangsmåte til behandling av diabetes. ".pre - diabetes eller adipositas, karakterisert ved at man administrerer en virksom mengde av a-amylase-inaktivatoren ifølge krav 1.