CN101998998A - 氨基糖化合物及其生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种化合物，该化合物具有α-淀粉酶抑制活性、并且可用作医药组合物(特别是用于治疗糖尿病的医药组合物)的有效成分。本发明人对在由链霉菌属放线菌Streptomyces sp-6982菌株所产生的化合物中具有α-淀粉酶抑制活性的化合物进行了研究，发现氨基糖化合物具有α-淀粉酶抑制作用，从而完成了本发明。本发明的氨基糖化合物具有α-淀粉酶抑制作用，可用作糖尿病、肥胖、NASH(非酒精性脂肪肝炎)的预防剂或治疗剂，特别是可用作餐后高血糖的改善剂。

Description

氨基糖化合物及其生产方法
技术领域
本发明涉及氨基糖化合物，该氨基糖化合物可用作医药组合物(特别是用于治疗糖尿病的医药组合物)的有效成分。
背景技术
进餐所摄取的多糖类，一部分在口腔和胃内被来源于唾液的α-淀粉酶消化，接下来，大部分在十二指肠和空肠内被来源于胰脏的α-淀粉酶消化，由此形成二糖类或寡糖。它们被局部存在于小肠上皮微绒毛膜上的以麦芽糖酶、蔗糖酶为代表的葡萄糖苷酶水解为单糖，该单糖被肠道吸收。如果被吸收的单糖进入血中、血糖值升高的话，胰脏会分泌胰岛素，使得从肝脏释放的糖减少，同时，使肌肉或脂肪组织的糖摄取增加，由此使升高的血糖值降低，并保持其恒常性。
但是，在糖尿病病情下，由于胰岛素分泌不足、或者胰岛素抗性(胰岛素作用不充分)，从而会陷入餐后高血糖或空腹高血糖等慢性血糖控制不全的状态。
近年来，通过大规模的临床试验，已经证实了：要抑制糖尿病并发症的发病以及进展，餐后高血糖的矫正是非常重要的。已经表明，即使餐后高血糖为轻度的，也会成为心血管死亡的独立危险因子。根据上述的背景，人们正认识到针对餐后高血糖(例如，餐后2小时的血糖值为200mg/dL以上的状态)的药物治疗的重要性和必要性。
作为餐后高血糖的治疗药物，临床上实际使用的是作为消化酶抑制剂的葡萄糖苷酶抑制剂(例如，阿卡波糖或伏格列波糖)。但是，存在由葡萄糖苷酶抑制而引起消化器官症状(腹部膨胀感、腹泻、软便、鼓肠、放屁等)这样的副作用的问题。
另外，作为与此不同的餐后高血糖治疗药物(消化酶抑制剂)，可以列举α-淀粉酶抑制剂。如果抑制了葡萄糖苷酶的话，会产生大量的未消化的寡糖(二糖类)副产物；而即使抑制了α-淀粉酶，未消化的寡糖(二糖类)副产物的量也很少，因此，不会引起腹泻等消化器官症状，可以期待能够发挥抑制糖吸收的作用。
关于具有α-淀粉酶抑制活性的氨基糖化合物，已有数个报道。例如，有人报道了从链霉菌属的放线菌中分离得到萃他丁(トレスタチン)衍生物(下式，式中n表示1～3)(专利文献1)。
[化学式2]
Figure BPA00001235058700021
另外，有人报道了以六氢-3，5，6-三羟基-1H-氮杂
Figure BPA00001235058700022
为必须骨架的麦芽糖寡糖化合物(专利文献2)。
[化学式3]
Figure BPA00001235058700023
(式中，n表示0～3，X表示H或疏水性基团)
另外，下式中n为0至3的、末端具有还原糖结构的化合物是已知的(非专利文献1)。
[化学式4]
Figure BPA00001235058700031
该非专利文献中所公开的Acarviostatin IV 03(n＝3)的分子式为C94H156N4O64，虽然与本申请中的n＝4的化合物相同，但是该化合物为末端具有还原糖结构的化合物，在这一点上与本申请中的n＝4的化合物在结构上不同。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开昭54-163511号公报
专利文献2：美国专利第6596696号说明书
非专利文献
非专利文献1：Carbohydrate Research，343(2008)，882-892
发明内容
发明要解决的问题
本发明提供一种可用作医药组合物(特别是用于治疗糖尿病的医药组合物)的有效成分的化合物。
解决问题的手段
作为α-淀粉酶抑制剂，必须在消化道内显示出稳定性。在消化道内不稳定是指：其分解产物被吸收，从而可能引起预料不到的副作用。
本发明人为了探求医药品，对微生物所产生的物质进行了深入研究，结果发现，链霉菌属的放线菌6982菌株产生具有优异的α-淀粉酶抑制活性的化合物，从而完成了本发明。
即，本发明涉及式(I)所示化合物或其盐；含有式(I)所示化合物或其盐的组合物；含有式(I)所示化合物或其盐、以及赋型剂的医药组合物；以及，式(I)所示化合物或其盐的生产方法。
[化学式5]
(式中，n表示4、5或6)
另外，本发明涉及具有α-淀粉酶抑制活性的、分子式为C94H156N4O64、C113H187N5O76或C132H218N6O88的化合物(但是，不包括末端具有还原糖结构的化合物)或其盐，以及含有这些化合物或其盐的组合物，其中所述化合物或其盐是这样获得的：在培养基中，对能够产生具有α-淀粉酶抑制活性的化合物或其盐的链霉菌属微生物进行培养，并从其培养液中回收该化合物或其盐。
本发明还涉及含有式(I)所示化合物或其盐的用于预防或治疗糖尿病的医药组合物，即，含有式(I)所示化合物或其盐的糖尿病治疗剂。
另外，本发明还涉及：式(I)所示化合物或其盐在制备用于预防或治疗糖尿病的医药组合物中的用途；或者式(I)所示化合物或其盐用于预防或治疗糖尿病的用途；以及，预防或治疗糖尿病的方法，包括给患者施用有效量的式(I)所示化合物或其盐。
发明效果
式(I)所示化合物或其盐具有α-淀粉酶抑制作用，可用作糖尿病、肥胖、NASH(非酒精性脂肪肝炎)等的预防剂或治疗剂。而且，与葡萄糖苷酶抑制剂不同的是，其不会引起腹泻等消化器官症状，可以期待能够发挥抑制糖吸收的作用。
附图说明
图1示出化合物A的1H-NMR谱图。
图2示出化合物A的13C-NMR谱图。
图3示出化合物B的1H-NMR谱图。
图4示出化合物B的13C-NMR谱图。
图5示出化合物C的1H-NMR谱图。
图6示出化合物C的13C-NMR谱图。
图7示出当负载碳水化合物时，化合物A的血糖升高抑制作用。
(A)为血糖值随时间的变化，(B)示出AUC。
图8示出当负载碳水化合物时，化合物A的胰岛素升高抑制作用。(A)为胰岛素值随时间的变化，(B)示出AUC。
图9示出化合物A的HPLC色谱图。
图10示出化合物B的HPLC色谱图。
图11示出化合物C的HPLC色谱图。
具体实施方式
例如，在本发明的化合物(I)中，n为4的化合物如下式所示。
[化学式6]
式(I)所示化合物中可以存在几何异构体。本说明书中虽然只记载了式(I)所示化合物为异构体的一种形态，但是本发明也包括除此之外的其他异构体，并且也包括异构体分离后的物质、或者它们的混合物。
另外，式(I)所示化合物中可以存在基于不对称碳原子的光学异构体。本发明也包括式(I)所示化合物的光学异构体分离后的物质、或者它们的混合物。
另外，本发明还包括式(I)所示化合物的可药用的前药。可药用的前药是指这样的化合物：其具有通过加溶剂分解或者在生理学条件下能够转换成氨基、羟基等的基团。作为形成前药的基团，例如可以列举文献Prog.Med.，5，2157-2161(1985)、或文献“医药品的开发”(广川书店，1990年)第7卷分子设计163-198中记载的基团。
另外，式(I)所示化合物的盐是指式(I)所示化合物的药学上可接受的盐，有时形成酸加成盐。具体来说，可以列举与无机酸(如，盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等)、或有机酸(如，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、扁桃酸、酒石酸、二苯甲酰酒石酸、二对甲苯酰酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸等)形成的酸甲醇盐。
另外，本发明也包括式(I)所示化合物及其盐的各种水合物或溶剂合物、以及多晶形物质。本发明还包括用各种放射性或非放射性同位素标记后的化合物。
在本说明书中，对“末端具有还原糖的化合物”没有特别的限定，例如可以列举acarbose(阿卡波糖)、Acarviostatin I03、Acarviostatin II03、Acarviostatin III03、Acarviostatin IV03之类的末端具有带有游离的醛基(或酮基)的糖的天然物等化合物。
(生产方法)
可以采用属于链霉菌属的、并且具有能够生产本发明化合物或其可药用的盐的能力的微生物，来制备该化合物。作为这样的微生物，优选为从采自日本冲绳县西表岛的土壤中分离得到的属于链霉菌属的Streptomyces sp-6982(ストレプトマイセスエスピ-6982)菌株。该菌株的菌学性状如下。
Streptomyces sp-6982菌株是从采自日本冲绳县西表岛的土壤样本中分离得到的。用于研究该菌株的形态、培养性状、生理学性质的培养基和方法主要根据文献Shirling，E.B.和D.Gottlieb：Method for characterization of Streptomyces species.Int.J.Syst.Bacteriol.16，313-340，1966、以及文献Waksman，S.A.：The actinomycetes Vol.2：Classification，identification and description of genera and species：The Williams and Wilkins Co.，Baltimore，1961。在培养温度为30℃、培养天数为14天的条件下培养后进行观察。
在酵母提取物-淀粉琼脂培养基中培养后，通过光学和扫描电子显微镜进行观察，由此来判定形态。将含有2.0g粉末状酵母提取物S(和光纯药株式会社制造)、10g可溶性淀粉以及16g琼脂的1L自来水所形成的溶液，用1M的NaOH水溶液调节pH为7.2，然后用高压锅灭菌，从而制得酵母提取物-淀粉琼脂。在酵母提取物-淀粉琼脂中判断孵育温度。在Pridoham-Gottlieb的培养基(Pridoham，T.G.和D.Gottlieb：The utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as an acid for species determination：J.Bacteriol.56：107-114，1948)中判断碳源的利用性。
颜色名称引用自文献Kornerup，A.和J.H.Wanscher：Methuen Handbook of Colour，Methuen，London，1978。
根据Becher等人的方法(Becker，B.，M.P.Lechevalier，R.E.Gordon和H.A.Lechevalier：Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole-cell hydrolysates：Appl.Microbiol.12，421-423，1964)来分析细胞壁的氨基酸。
根据中川等人的方法(中川恭好、川崎浩子，放线菌的分类和鉴定，83-117页，2001年，日本放线菌学会编：东京，日本学会事务中心)来确定16SrDNA的碱基序列。
利用日本国立遗传学研究所网站的FASTA检索进行同源性检索：(a)http://www.ddbj.nig.ac.jp；(b)D.J.Lipman，W.R.Pearson：Rapid and sensitive protein similarity search，Science，227，1435-1441(1985)以及(c)W.R.Pearson，D.J.Lipman：Improved tools for biological sequence comparison，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，2444-2448(1988)，基准菌株的16SrDNA碱基序列来自日本国立遗传学研究所的数据库(http://www.ddbj.nig.ac.jp)。
利用Clustal W软件包，根据相邻结合法来绘制系统树(Clustal W Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.：CLUSTAL W：improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice.Nucleic Acid Res.22，4673-4680，1994)。
另外，根据下述文献中所示的江崎等人的方法可以确认Streptomyces sp-6982菌株与其近缘菌株的DNA同源性。
(a)Ezaki，T.，Hashimoto，Y.，Takeuchi，T.，Yamamoto，H.，Liu，S.L.，Matsui，K.和Yabuuchi，E.，J Clin Microbiol.，26，(1988)1708-1731
(b)Ezaki，T.，Hashimoto，Y.和Yabuuchi，E.，Int J Syst Bacteriol.，39，(1989)224-229。
本说明书中，“近缘菌株”是指与Streptomyces sp-6982菌株的16SrDNA碱基序列同源性为97％以上的菌株。另外已知的是，在16SrDNA碱基序列同源性不足97％的情况下，该菌株被判断为其他的种。
文献Stackebrandt，E.和Goebel，B.M.，Int J Syst Bacteriol.，44，(1994)846-849。
(1)形态特征
基生菌丝非常发达，并且不规则地分枝。气生菌丝呈不完全的螺旋状，并且由10个以上的分节孢子链形成。孢子的表面光滑、形状呈椭圆形、大小为1.2×1.0μm。未观察到菌核、孢子囊、基生菌丝的断裂、以及游走子。
(2)培养性状
发现气生菌丝在酵母提取物-淀粉琼脂、酵母提取物-麦芽提取物琼脂、燕麦片琼脂、无机盐-淀粉琼脂、甘油-天冬酰胺琼脂上示出很好的着生，而在酪氨酸琼脂上勉强着生。在蛋白胨-酵母提取物-铁琼脂上未发现有气生菌丝着生。气生菌丝的颜色为灰褐色、褐灰色。生长背面的颜色为黄褐色、褐色带浅棕色、灰黄色、淡黄色、褐橙色、淡橙色。在胰化蛋白胨-酵母提取物培养基和蛋白胨-酵母提取物-铁琼脂上，未发现有类黑素色素的产生。未发现有可溶性色素的产生。菌体内的色素不随pH而变化。
在这些培养基上的生长情况示于表1中。缩写表示以下的含义。G：生长，A：气生菌丝，R：生长背面的颜色，S：可溶性色素
[表1]
Figure BPA00001235058700091
(3)细胞壁类型
对整个菌体分解物进行分析，结果可以确认存在有作为氨基酸的LL-二氨基庚二酸。
(4)生理学性质
D-葡萄糖、蔗糖、D-木糖、D-果糖、L-鼠李糖、棉子糖、L-阿拉伯糖、肌醇、D-甘露醇的利用性为阳性。表2示出了Streptomycessp-6982菌株的生理学特征。
[表2]
Figure BPA00001235058700101
(5)16SrDNA碱基序列的解析
Streptomyces sp-6982菌株的16SrDNA部分碱基序列示于后面的序列表中。根据同源性检索的结果，同源性为99.2％的淡青链霉菌Streptomyces glaucescens DSM40716菌株(登录号：X79322)为最近缘的菌株。另外，与作为链霉菌属基准种的基准菌株的白色链霉菌Streptomyces albus NBRC 13014菌株(登录号：AB184275)的同源性为96.2％。另外，在通过16SrDNA部分碱基序列而绘制的系统树中，与链霉菌属的各个品种形成相同的聚簇(cluster)。
(6)鉴定
参考下述文献(a)～(d)，根据形态观察、化学分析、以及16SrDNA碱基序列解析结果，可以认为本菌株属于链霉菌属。
(a)Euzeby，J.P.：List of Bacterial names with standing in nomenclature：a folder available on the internet.Int.J.Syst.Bacteriol.，1997，47，pp.590-592
(b)Waksman，S.A.等：The nomenclature and classification of the actinomycetes.Journal of Bacteriology，1943，46，pp.337-341
(c)Williams，S.T.：Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology，Vol.4，1989
(d)Zhang，Z.等：A proposal to revive the genus Kitastospora Int.J.Syst.Bacteriol.，1997，47，pp.1048-1054
由此将本菌株命名为Streptomyces sp-6982菌株。该菌株被国际保藏于日本独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏编号为FERM BP-10802(保藏日为2007年3月22日)。
另外，由于微生物会发生人工或自然变异，因此本发明的Streptomyces sp-6982菌株除了包括天然分离得到的微生物之外，也包括经紫外线、X射线、化学药品等人工变异后的微生物、以及它们的天然变异菌株。
将属于链霉菌属、且具有能够产生具有α-淀粉酶抑制活性的化合物的能力的微生物(优选为具有能够产生本发明的氨基糖衍生物的能力的微生物；进一步优选为Streptomyces sp-6982菌株)接种到含有营养源的培养基中，并进行嗜氧发育，从而可以获得本发明的氨基糖衍生物。
培养时所用的培养基只要是能够使所用的微生物生长的培养基即可，可以使用合成的培养基、半合成的培养基、或天然培养基。
作为营养物质，只要使用能够使本发明菌株资化(資化)的营养源即可。例如，作为氮源，可以使用黄豆面(きな粉)、脱脂大豆粉、蛋白胨、肉末、玉米浆(コ一ンステイ一プリカ一)、棉籽粉、花生粉、大豆粉、酵母提取物、干燥酵母、NZ胺、酪蛋白的水解物、鱼粉、硝酸钠、硝酸铵等无机或有机氮源。作为碳源，可以使用马铃薯淀粉、玉米淀粉等淀粉；糖蜜、糊精、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、海藻糖、果糖、木糖、鼠李糖、甘露醇、甘油等碳水化合物或脂肪等，优选为淀粉和黄豆面。
另外，根据需要可以添加Na、K、Mg、Ca、Zn、Fe等的硫酸盐、盐酸盐、硝酸盐、磷酸盐、碳酸盐等作为金属盐，优选碳酸钙和/或氯化钠。根据需要还可以适当地使用通常已知的氨基酸类、或油酸甲酯、猪油、硅酮油、表面活性剂等促进生长的化合物或消泡剂。除了这些物质之外，只要是可用于该生产菌株的、并且有利于产生本发明化合物的物质，也可以根据需要来使用。
培养时，可以与一般的制造抗生素时的培养同样地进行，并且其培养方法可以是固体培养也可以是液体培养。液体培养时，可以实施静置培养、振荡培养、搅拌培养中的任意一者，例如，可以在通气搅拌培养条件下进行。作为培养条件，培养温度为生产菌株能够发育、并且能够产生本发明化合物的温度，即，可以适当地适用15～42℃的范围，优选为20～30℃，更优选为23～27℃。pH可以适当地适用4～9的范围，优选为6～8。培养时间根据各种条件而不同，通常适当地适用1～30天的范围，优选为4～10天。
从培养物中分离目标化合物时，可以适当地采用分离微生物代谢产物时所用的通常的萃取、分离、纯化手段。对于培养物中的该物质，可以直接将培养液过滤而获得滤液，或者进行离心分离、或向培养物中加入过滤助剂后过滤而获得滤液。此时，可以向培养液中加入丙酮、MeOH、EtOH、MeCN等有机溶剂，也可以根据需要加入盐酸等以调节pH。另外，通过将滤液与适当的载体接触、使滤液中的生产物质吸附、接着用合适的溶剂来洗脱，从而分离得到该物质。例如，使滤液与Amberlite(注册商标)XAD2、Diaion(注册商标)HP20、Diaion CHP20P、或Diaion SP850之类的多孔吸附树脂接触以吸附该物质。接着，用丙酮、MeOH、EtOH、MeCN等有机溶剂与水的混合液来洗脱该物质。也可以根据需要加入盐酸等以调节pH。通过将此时的有机溶剂的混合比例从低浓度开始梯度地或者连续地提高到高浓度，从而可以有效地获得含有该物质的流份。
在本申请的化合物中，为了除去还原糖化合物等不稳定的、且难以作为单一产品而分离得到的化合物，加碱进行纯化。另外，为了确保作为药品的纯度，反复进行纯化。
式(I)所示化合物作为游离化合物、其盐、水合物、溶剂合物、或多晶型物质的形式而被分离纯化。式(I)所示化合物的盐可以通过通常的成盐反应而制得。分离、纯化时，可以采用提取、分步结晶、各种制备色谱法等常规的化学操作来进行。
在本说明书中，“回收”是指为了以单体或组合物的形式获得本发明化合物(I)而进行的操作，包括“纯化”或“分离”。
在本说明书中，“纯化”包括以“分离”本发明化合物为目的而进行的操作，也可以通过“纯化”来“分离”本发明化合物。
可以通过选择合适的原料化合物来制备各种异构体，或者利用异构体间的物理化学性质的差别来分离各种异构体。例如，采用外消旋体的一般光学拆分法(例如，与光学活性的碱或酸形成非对映异构体盐以分步结晶的方法、或者利用手性柱等的色谱法等)来获得光学异构体。
本说明书中，“色谱法”是指分析化学中广泛使用的色谱法，对其并不特别限定，例如包括气相色谱法(GC)、液相色谱法(LC)、超临界流体色谱法(SFC)等。
本说明书中，“液相色谱法(LC)”是在流动相中使用液体的色谱法的总称，对其并不特别限定，例如包括中速液相色谱法、高效液相色谱法(HPLC)等。
含有式(I)所示化合物或其盐的组合物是指在纯化或分离式(I)所示化合物的过程中得到的组合物，并可用作药品的制备原料。对该组合物并不特别限定，例如为1种或2种以上的式(I)所示化合物或其盐与Acarviostatin IV03等活性成分或其他成分形成的混合物。另外，通过色谱法进行分析，该组合物中所含的式(I)所示化合物或其盐的面积百分率为约80％以上，优选为85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上，再进一步优选为98％以上，但是并不局限于此。
含有1种或2种以上的式(I)所示化合物或其盐作为有效成分的医药组合物可以通过使用本领域中常用的赋型剂(即，药用赋型剂或药用载体等)，并采用常用的方法而制得。
可以采用经口给药(例如片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂等)，或者采用非经口给药(例如关节内、静脉内、肌肉内等的注射剂、栓剂、滴眼剂、眼软膏、经皮用的液体制剂、软膏剂、经皮用的贴剂、经粘膜的液体制剂、经粘膜的贴剂、吸入剂等)中的任意一者来进行给药。
作为用于经口给药的固体组合物，可以采用片剂、散剂、颗粒剂等。在这样的固体组合物中，将一种或两种以上的有效成分与至少一种惰性赋形剂(例如乳糖、甘露醇、葡萄糖、羟丙基纤维素、微晶纤维素、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和/或硅酸铝镁等)混合。按照常规方法，在组合物中也可以含有惰性添加剂，例如硬脂酸镁等润滑剂、羧甲基淀粉钠等崩解剂、稳定剂、溶解助剂。根据需要，片剂或丸剂也可以用糖衣或者胃溶性或肠溶性物质的膜进行包衣。
用于经口给药的液体组合物包括可药用的乳剂、溶液制剂、混悬剂、糖浆剂或酏剂等，并且含有常用的惰性稀释剂，例如纯化水或乙醇。除了惰性稀释剂以外，该液体组合物中也可以含有诸如增溶剂、润湿剂、混悬剂之类的助剂、甜味剂、矫味剂、芳香剂、防腐剂。
用于非经口给药的注射剂包括无菌的水性或非水性的溶液剂、混悬剂或乳剂。作为水性的溶剂，例如包括注射用蒸馏水或生理盐水。作为非水性的溶剂，例如有丙二醇、聚乙二醇、或诸如橄榄油之类的植物油、诸如乙醇之类的醇类、或聚山梨醇酯80(药典名)等。这样的组合物中还可以含有等渗剂、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂、或溶解助剂。它们例如可以通过可截留细菌的过滤器进行过滤、加入杀菌剂或者进行照射而被灭菌。此外，也可以将这些组合物制成无菌的固体组合物，在使用之前用无菌水或无菌的注射用溶剂进行溶解或混悬后使用。
作为外用剂，包括软膏剂、硬膏剂、霜剂、凝胶剂、贴剂、喷雾剂、洗液、滴眼剂、眼软膏等。这种外用剂包含常用的软膏基剂、洗剂基剂、水性或非水性的液体制剂、混悬剂、乳剂等。例如，作为软膏基剂或洗剂基剂，可以列举聚乙二醇、丙二醇、白凡士林、白蜂蜡、聚氧乙烯氢化蓖麻油、单硬脂酸甘油酯、十八烷醇、十六烷醇、聚桂醇、失水山梨醇倍半油酸酯等。
吸入剂或经鼻剂等经粘膜剂，可以以固体、液体或半固体的状态使用，并且可以按照以往公知的方法来制备这些经粘膜剂。可以适当地添加(例如)公知的赋形剂，还可以适当地添加pH调节剂、防腐剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂或增稠剂等。给药时可以使用合适的吸入或吹送用装置。例如，可以使用计量给药吸入装置等公知的装置或喷雾器，将化合物单独地、或作为配方后的混合物粉末来给药、或者可以将化合物与可药用的载体组合后作为溶液或悬浮液来给药。干燥粉末吸入器等可用于一次给药或多次给药，并且可以使用干燥粉末或含有粉末的胶囊。或者，也可以采用加压气溶胶喷雾等形式，通过使用适当的喷射剂(例如，氯氟烷烃、氢氟烷烃或二氧化碳等适当的气体)来给药。
通常在经口给药时，1天的给药量按体重约为0.01～100mg/kg，优选为0.1～10mg/kg，并将该剂量一次服用或者分2～4次服用。另外，使用经粘膜剂时，按体重约为0.001～100mg/kg，并将该剂量一日分为一次至多次给药。应考虑症状、年龄、性别等，根据不同的情况，适当地选择给药量。
可以将式(I)所示化合物与各种治疗剂和/或预防剂并用，其中所述治疗剂和/或预防剂是针对据认为前述式(I)所示化合物对其显示出有效性的那些疾病的治疗剂和/或预防剂。在并用时，可以同时给药，或者分别连续给药、或按所希望的时间间隔给药。同时给药时的制剂可以是复方制剂，也可以分别制成制剂。
实施例
以下基于实施例进一步详细地说明式(I)所示化合物的制备方法。本发明并不局限于下述实施例所记载的化合物。另外，式(I)所示化合物的制备方法并不仅局限于下面所示的具体实施例的制备方法，式(I)所示化合物也可以通过这些制备方法的组合、或者本领域技术人员公知的方法来制备。
本说明书中有时使用以下的缩写。
EtOH：乙醇
MeCN：乙腈
MeOH：甲醇
NaCl：氯化钠
NaOH：氢氧化钠
TFA：三氟乙酸
以下通过实施例进一步详细地说明本发明，但是，本发明并不局限于这些实施例。
实施例1
(培养)
向100mL容积的三角烧瓶中，每次30mL，分次加入含有20g可溶性淀粉、10gパインデツクス#3(松谷化学株式会社制造)、20g黄豆面以及1L蒸馏水的培养基(pH＝7.0)，在121℃下用高压锅灭菌30分钟，从而制得母种培养基。
向该母种培养基中接种1白金耳勺的Streptomyces sp-6982菌株的斜面培养物，在30℃下振荡培养3天。
向100mL容积的三角烧瓶中，每次30mL，分次加入含有100g可溶性淀粉、60g黄豆面、2.5g NaCl、2g CaCO3以及1L蒸馏水的培养基(pH＝7.0)，在121℃下用高压锅灭菌30分钟，从而制得生产培养基。
向该生产培养基中，每次2mL，分次向各烧瓶中接种上述的母种培养液，并在25℃下振荡培养7天。
对培养液进行粗纯化
用6M的HCl水溶液将通过上述方法所制得的22L培养液的pH调节为3，然后抽滤。用6M的NaOH水溶液将滤液的pH调节为7，然后利用Diaion HP20(树脂量为1.2L)，用10％的MeOH水溶液洗涤后，用25％的MeOH水溶液洗脱。
利用DOWEX 50W X1阳离子交换树脂(the Dow Chemical株式会社生产，树脂量为550mL)，并用蒸馏水、0.5M和1M的NaCl水溶液洗涤该活性流份，然后用3M的NaCl水溶液洗脱。
接着，利用ダイソ一ゲルSP-120-15/30-ODS-B(树脂量为1L，DAISO株式会社生产)，用10％、15％的MeOH水溶液洗脱，从而分别得到化合物A和B，用20％和25％的MeOH水溶液洗脱，从而得到化合物C。
(1)化合物A的纯化、分离
利用SP-120-15/30-ODS-B(树脂量为337mL)，将含有上述的通过ODS柱色谱法纯化得到的化合物A的活性流份用2％、3％的MeOH水溶液(含有0.05％的TFA)洗脱。
用6M的NaOH水溶液将该活性流份的pH调节为13，并利用Diaion HP20SS(树脂量为500mL)，用12.5％、15％的MeOH水溶液(含有0.05M的NaOH)洗脱。
用6M的HCl水溶液将该活性流份的pH调节为7，并利用DiaionHP20(树脂量为200mL)，用50％的MeOH水溶液洗脱。将洗脱液减压浓缩后，冷冻干燥，从而获得1.14g粉末。
利用ダイソ一パツクSP-120-5-ODS-BP(20×250mm，DAISO株式会社生产)，将溶解于水中的200mg上述粉末用2％的MeCN水溶液(含有0.05％的TFA)洗脱。
用6M的NaOH水溶液将该活性流份的pH调节为7，并上样到Diaion HP20(树脂量为50mL)，用50％的MeOH水溶液洗脱。将洗脱液减压浓缩后，冷冻干燥，从而获得136mg粉末。
再次利用ダイソ一パツクSP-120-5-ODS-BP(20×250mm)，将溶解于水中的上述粉末用2％的MeCN水溶液(含有0.05％的TFA)洗脱。
用6M的NaOH水溶液将该活性流份的pH调节为7，并利用Diaion HP20(树脂量为30mL)，用50％的MeOH水溶液洗脱。
将所得到的活性流份减压浓缩后，冷冻干燥，从而获得化合物A(65mg)。
(2)化合物B的纯化、分离
利用SP-120-15/30-ODS-B(树脂量为337mL)，将上述的通过ODS柱色谱法粗纯化而得到的流份，用3％至7％的MeOH水溶液(含有0.05％的TFA)洗脱。
用6M的NaOH水溶液将该活性流份的pH调节为13，并利用Diaion HP20SS(树脂量为250mL)，用15％、17.5％、20％的MeOH水溶液(含有0.05M的NaOH)洗脱。
用6M的HCl水溶液将该活性流份的pH调节为7，并利用DiaionHP20(树脂量为150mL)，用50％的MeOH水溶液洗脱。将洗脱液减压浓缩后，冷冻干燥，从而获得970mg粉末。
利用ダイソ一パツクSP-120-5-ODS-BP(20×250mm)，将溶解于水中的450mg上述粉末用2.2％的MeCN水溶液(含有0.05％的TFA)洗脱。
用6M的NaOH水溶液将该活性流份的pH调节为7，并利用Diaion HP20(树脂量为115mL)，用50％的MeOH水溶液洗脱。将洗脱液减压浓缩后，冷冻干燥，从而获得190mg粉末。
将溶解于水中的上述粉末再次上样到ダイソ一パツクSP-120-5-ODS-BP(20×250mm)，用2.2％的MeCN水溶液(含有0.05％的TFA)洗脱。
用6M的NaOH水溶液将该活性流份的pH调节为7，并利用Diaion HP20(树脂量为30mL)，用50％的MeOH水溶液洗脱。
将该活性流份减压浓缩后，冷冻干燥，从而获得化合物B(129mg)。
(3)化合物C的纯化、分离
利用SP-120-15/30-ODS-B(树脂量为80mL)，将上述的通过ODS柱色谱法粗纯化而得到的流份，用2％的MeOH水溶液(含有0.05％的TFA)洗脱。
用6M的NaOH水溶液将该活性流份的pH调节为13，并利用Diaion HP20SS(树脂量为200mL)，用15％、17.5％、20％的MeOH水溶液(含有0.05M的NaOH)洗脱。
用6M的HCl水溶液将该活性流份的pH调节为7，并利用DiaionHP20(树脂量为150mL)，用50％的MeOH水溶液洗脱。将洗脱液减压浓缩后，冷冻干燥，从而获得1g粉末。
利用ダイソ一パツクSP-120-5-ODS-BP(20×250mm)，将溶解于水中的上述粉末用2.2％至3.2％的MeCN水溶液(含有0.05％的TFA)洗脱。
用6M的NaOH水溶液将该活性流份的pH调节为7，并利用Diaion HP20(树脂量为30mL)，用50％的MeOH水溶液洗脱。将洗脱液减压浓缩后，冷冻干燥，从而获得236mg粉末。
再次利用ダイソ一パツクSP-120-5-ODS-BP(20×250mm)，将溶解于水中的184mg上述粉末用2.2％的MeCN水溶液(含有0.05％的TFA)洗脱。
用6M的NaOH水溶液将该活性流份的pH调节为7，并利用Diaion HP20(树脂量为30mL)，用50％的MeOH水溶液洗脱。
将所得到的活性流份减压浓缩后，冷冻干燥，从而获得化合物C(91mg)。
化合物A、B和C的物理化学性质
上述提取、分离、纯化后的化合物A、B和C分别具有以下的物理化学性质。
(1)化合物A
1)颜色和形状：白色粉末
2)酸性、中性、碱性的区分：碱性
3)比旋光度：[α]23 D+157°(c＝0.5，H2O)
4)分子式：C94H156N4O64
5)高分辨率TOF质谱：实测值[M+2H]2+1183.4624
                   理论值[M+2H]2+1183.4616
6)元素分析：作为C94H156N4O6414H2O
计算值：C 43.12，H 7.08，N 2.14
实测值：C 43.27，H 7.08，N 2.05
7)溶解性：易溶于水、DMF、DMSO，基本上不溶于丙酮、MeOH、EtOH、MeCN。
8)紫外吸收光谱(溶剂：水)：显示出末端吸收
9)红外吸收光谱(vmax(KBr)cm-1)：3330、2925、1655、1385、1150、1040、935
10)1H-NMR谱(500MHz，D2O)：如图1所示。
11)13C-NMR谱(125MHz，D2O)：如图2所示。
(2)化合物B
1)颜色和形状：白色粉末
2)酸性、中性、碱性的区分：碱性
3)比旋光度：[α]23 D+153°(c＝0.5，H2O)
4)分子式：C113H187N5O76
5)高分辨率TOF质谱：实测值[M+2H]2+1416.0548
                   理论值[M+2H]2+1416.0539
6)元素分析：作为C113H187N5O7616H2O
计算值：C 43.50，H 7.08，N 2.24
实测值：C 43.53，H 7.09，N 2.15
7)溶解性：易溶于水、DMF、DMSO，基本上不溶于丙酮、MeOH、EtOH、MeCN。
8)紫外吸收光谱(溶剂：水)：显示出末端吸收。
9)红外吸收光谱(vmax(KBr)cm-1)：3365、2930、1640、1385、1150、1045、935
10)1H-NMR谱(500MHz，D2O)：如图3所示。
11)13C-NMR谱(125MHz，D2O)：如图4所示。
(3)化合物C
1)颜色和形状：白色粉末
2)酸性、中性、碱性的区分：碱性
3)比旋光度：[α]23 D+172°(c＝0.5，H2O)
4)分子式：C132H218N6O88
5)高分辨率TOF质谱：实测值[M+2H]2+1648.6467
                   理论值[M+2H]2+1648.6462
6)元素分析：作为C132H218N6O8816H2O
计算值：C 44.22，H 7.03，N 2.34
实测值：C 44.23，H 7.09，N 2.35
7)溶解性：易溶于水、DMF、DMSO，基本上不溶于丙酮、MeOH、EtOH、MeCN。
8)紫外吸收光谱(溶剂：水)：显示出末端吸收。
9)红外吸收光谱(vmax(KBr)cm-1)：3365、2925、1635、1340、1150、1040、935
10)1H-NMR谱(500MHz，D2O)：如图5所示。
11)13C-NMR谱(125MHz，D2O)：如图6所示。
根据上述的物理化学性质，化合物A、B和C的化学结构确定如下。
[化学式7]
Figure BPA00001235058700211
式中，化合物A：n＝4；化合物B：n＝5；以及化合物C：n＝6。
另外，根据以下条件，通过高效液相色谱法(HPLC)来分析上述方法中制得的化合物A、B、C，化合物A、B、C的面积百分率(％)分别为99.0％、98.2％、98.3％。另外，将保留时间为6分钟至22分钟之间的在色谱图上所获得的各成分的峰面积的总和作为100，根据各成分的峰面积与该峰面积的总和的比值来求出面积百分率(％)。化合物A至化合物C的HPLC色谱图示于图9至图11中。
1)柱子：Unison US-C18 250-4.6mm(インタクト株式会社制造)
2)流动相：1％-7％的MeCN水溶液(含有0.05％的TFA)(0～20分钟)
3)流速：1.0ml/分钟
4)检测：UV，210nm
5)柱温：50℃
6)保留时间：化合物A 16.3分钟；化合物B 17.9分钟；化合物C 19.2分钟
(参考文献：化学便覧 応用化学編 第六版(丸善)、第8章分析·計測·管理、P.342～346)
实施例2
通过以下方法确认了本发明化合物的α-淀粉酶抑制活性。
(1)实验方法
由ICR小鼠(雄性，8周龄，购自日本SLC)、SD大鼠(雄性，8周龄，购自日本チヤ一ルスリバ一)、比格犬(雄性，35个月大，购自ナルク株式会社)以及猕猴(雄性，10岁，购自日本クレア)制备小鼠、大鼠、犬以及猴胰脏α-淀粉酶溶液。由购自Sigma-Aldrich公司的酶来制备人唾液及胰脏α-淀粉酶。将这些α-淀粉酶溶液全部用测定缓冲液(48mM NaCl、5.4mM KCl、28mM Na2HPO4、43mMNaH2PO4、35mM甘露醇，pH＝7.0)稀释成800U/mL。将各种α-淀粉酶溶液(20U，25μL)以及用测定缓冲液溶解配制的化合物(25μL)加入到96孔微板中，在37℃下孵育10分钟。然后加入淀粉溶液(5mg/mL，50μL)，在37℃下孵育10分钟。加入0.33M高氯酸溶液(50μL)使酶反应停止后，加入0.01M碘溶液(50μL)显色，并测定吸光度(660nm)。求出α-淀粉酶活性的抑制率为50％时的化合物浓度，作为IC50值。
(2)结果
本发明化合物对进行研究的所有种的α-淀粉酶均具有抑制活性，化合物A、B和C对小鼠胰脏α-淀粉酶的抑制活性(IC50值)分别为1.90nM、2.06nM和1.73nM，对大鼠胰脏α-淀粉酶的抑制活性(IC50值)分别为2.01nM、2.12nM和1.95nM，对犬胰脏α-淀粉酶的抑制活性(IC50值)分别为2.06nM、2.38nM和2.07nM，对猴胰脏α-淀粉酶的抑制活性(IC50值)分别为2.14nM、1.90nM和2.02nM，对人唾液α-淀粉酶的抑制活性(IC50值)分别为2.20nM、1.87nM和1.99nM，对人胰脏α-淀粉酶的抑制活性(IC50值)分别为2.02nM、2.11nM和2.21nM。
实施例3
通过以下方法确认了本发明化合物的经口活性。
(1)实验方法
动物使用的是雄性ICR(正常)小鼠(6周龄，购自日本SLC)。用0.5％甲基纤维素溶液将化合物制成溶解液。对禁食一晚的小鼠采血以用于测定血糖值和血浆胰岛素值，经口施用溶剂或化合物A(0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg)后立即经口给予碳水化合物溶液(75mg/mL淀粉、25mg/mL蔗糖，20mL/kg)。接着，分别在0.25小时、0.5小时和1小时后采血以用于测定血浆胰岛素值，以及分别在0.5小时、1小时和2小时后采血以用于测定血糖值。
分别采用グルコ一スCII-テストワコ一试剂(和光纯药株式会社制造)测定血糖值，采用小鼠胰岛素ELISA试剂盒(シバヤギ株式会社制造)测定血浆胰岛素浓度。试验结果以平均值±标准偏差来表示。
根据在施用化合物后直至2小时时的血糖值来计算血糖值-时间曲线下的面积(AUC)，并根据在施用化合物后直至1小时时的血浆胰岛素值来计算血浆胰岛素值-时间AUC，利用Dunnett’s multiple range test，对溶剂施用组和化合物A施用组之间进行检验，危险率小于5％时为显著性差异。
(2)结果
通过经口施用化合物A(0.3mg/kg至10mg/kg)，发现具有剂量依赖性地抑制血糖升高的作用，并且该作用在1mg/kg以上的剂量时具有显著性差异(图7)。还发现：此时，还具有剂量依赖性地且显著性地使血浆胰岛素值降低的作用(图8)。
实施例4
通过以下方法确认了本发明化合物的二糖类水解酶抑制活性
(1)实验方法
将由ICR小鼠、SD大鼠、比格犬和猕猴的小肠制得的刷子缘(刷子縁)标本、以及人小肠微粒体标本(BD Biosciences；Lot 36869)制成各种二糖类水解酶液。这些二糖类水解酶液以及化合物全部采用磷酸盐缓冲液(NaCl 48mM，KCl 5.4mM，Na2HPO428mM，NaH2PO443mM，甘露醇35mM，pH＝6.0)制得。
小鼠、大鼠、犬以及猴二糖类水解酶抑制活性评价：将二糖类水解酶液(10mg/mL，40μL)以及化合物溶液(20μL)添加到96孔微板中，并在37℃下孵育10分钟。然后，添加二糖类水解酶基质(蔗糖酶：100mM蔗糖；麦芽糖酶：100mM麦芽糖；异麦芽糖酶：100mM异麦芽糖；乳糖酶：100mM乳糖；海藻糖酶：100mM海藻糖，40μL)，并在37℃下孵育30分钟。添加0.04M高氯酸溶液(100μL)使反应停止后，进行离心分离(2,000rpm，15分钟)，采用グルコ一スCII-テストワコ一试剂(和光纯药株式会社制造)测定上清中的葡萄糖浓度。根据未添加酶(0％)和未添加化合物(100％)时的情况，计算出二糖类水解酶抑制活性。
人二糖类水解酶抑制活性评价：将二糖类水解酶液(0.1mg/mL，20μL)以及化合物溶液(10μL)添加到96孔微板中，并在37℃下孵育10分钟。然后，添加二糖类水解酶基质(蔗糖酶：100mM蔗糖；麦芽糖酶：100mM麦芽糖；异麦芽糖酶：100mM异麦芽糖；乳糖酶：100mM乳糖；海藻糖酶：100mM海藻糖；20μL)，并在37℃下孵育30分钟。添加0.04M高氯酸溶液(100μL)使反应停止后，进行离心分离(2,000rpm，15分钟)，采用グルコ一スCII-テストワコ一试剂(和光纯药株式会社制造)测定上清中的葡萄糖浓度。根据未添加酶(0％)和未添加化合物(100％)时的情况，计算出二糖类水解酶抑制活性。
(2)结果
本发明化合物对进行研究的所有种的二糖类水解酶(蔗糖酶、麦芽糖酶、异麦芽糖酶、乳糖酶和海藻糖酶)均未显示出抑制活性(IC50＞10μM)。
上述试验的结果证实了：式(I)所示化合物具有α-淀粉酶抑制作用、并具有降低血糖值和血浆胰岛素值的作用，可以用于治疗糖尿病等。
工业实用性
式(I)所示化合物或其盐具有α-淀粉酶抑制作用，可用作糖尿病、肥胖、NASH(非酒精性脂肪肝炎)等的预防剂或治疗剂。另外，期待其与葡萄糖苷酶不同，可以在不引起腹泻等消化器官症状的条件下抑制糖的吸收。
序列表自由文本
序列表中示出了Streptomyces sp-6982菌株的16SrDNA部分碱基序列。
Figure IPA00001235058200011

Claims (18)

1.式(I)所示的化合物或其盐，
[化学式1]
Figure FPA00001235058600011
(式中，n为4至6)。
2.具有α-淀粉酶抑制活性、并且分子式为C94H156N4O64、C113H187N5O76或C132H218N6O88的化合物(但是，不包括末端具有还原糖结构的化合物)或其盐，该化合物或其盐是这样获得的：在培养基中，对能够产生具有α-淀粉酶抑制活性的化合物或其盐的链霉菌属微生物进行培养，并从其培养液中回收该化合物或其盐。
3.权利要求2所述的化合物(但是，不包括末端具有还原糖结构的化合物)或其盐，其中所述链霉菌属微生物为Streptomyces sp-6982菌株(FERM BP-10802号)。
4.保藏编号为FERM BP-10802号的链霉菌(Streptomyces)属放线菌、Streptomyces sp-6982菌株及其变异菌株。
5.含有式(I)所示化合物或其盐的组合物，其中所述化合物或其盐是从链霉菌属微生物的培养液中纯化或分离得到的。
6.权利要求5所述的组合物，其中所述链霉菌属微生物为Streptomyces sp-6982菌株(FERM BP-10802号)。
7.一种组合物，其特征在于，采用色谱法进行分析时，所含有的式(I)所示化合物或其盐的面积百分率为约80％以上。
8.权利要求5所述的组合物，其特征在于，采用色谱法进行分析时，所含有的式(I)所示化合物或其盐的面积百分率为约80％以上。
9.权利要求6所述的组合物，其特征在于，采用色谱法进行分析时，所含有的式(I)所示化合物或其盐的面积百分率为约80％以上。
10.用于生产具有α-淀粉酶抑制活性、并且分子式为C94H156N4O64、C113H187N5O76或C132H218N6O88的化合物(但是，不包括末端具有还原糖结构的化合物)或其盐的方法，该方法包括：在培养基中，对能够产生具有α-淀粉酶抑制活性的化合物的链霉菌属微生物进行培养，并从其培养液中回收该化合物。
11.权利要求10所述的生产方法，其中所述链霉菌属微生物为Streptomyces sp-6982菌株(FERM BP-10802号)。
12.式(I)所示化合物或其盐的生产方法，其特征在于，对链霉菌属微生物的培养液进行纯化或分离。
13.权利要求12所述的生产方法，其中所述链霉菌属微生物为Streptomyces sp-6982菌株(FERM BP-10802号)。
14.一种药物组合物，其含有权利要求1所述的化合物或其盐、以及可药用的赋型剂。
15.用于预防或治疗糖尿病的药物组合物，其含有权利要求1所述的化合物或其盐。
16.权利要求1所述的化合物或其盐在制备用于预防或治疗糖尿病的药物组合物中的用途。
17.权利要求1所述的化合物或其盐用于预防或治疗糖尿病的用途。
18.一种预防或治疗糖尿病的方法，包括给患者施用有效量的权利要求1所述的化合物或其盐。
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