JP7057945B2 - 上皮間葉転換誘導細胞阻害剤 - Google Patents

上皮間葉転換誘導細胞阻害剤 Download PDF

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Description

NPMD NITE P-02304
クロスレファレンス
本願は日本国特許庁に対して２０１６年９月２６日に出願された日本国特許第２０１６－１８６９７０号からの優先権を主張する。本願が優先権を主張する日本国特許第２０１６－１８６９７０号記載の内容は全て参照によりそのまま本願に組み込まれる。また、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
本発明は、新規ナナオマイシン類（ｎａｎａｏｍｙｃｉｎ）化合物、その製造方法、及びナナオマイシンを有効成分として含有する医薬組成物及び上皮間葉転換（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ：ＥＭＴ）誘導細胞阻害薬に関する。
上皮細胞は、様々な刺激により間葉系細胞へと形質転換することが知られている。この形質転換は上皮間葉転換と呼ばれ、正常な細胞においては創傷治癒や繊維化にかかわると考えられている。
ナナオマイシンＡ及びＢは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ＯＳ－３９６６から新規の抗生物質として見出された化合物であり、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ ＫＰ－１３への抗菌作用が報告されている（非特許文献１）。
Ｈａｒｕｏ Ｔａｎａｋａら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（１９７５）Ｖｏｌ．ＸＸＶＩＩＩ；Ｎｏ．１１：ｐｐ．８６０－８６７．
本発明は、上皮間葉転換により間葉細胞化した細胞に対して選択的に傷害を与える新規化合物を提供することを目的とする。
本発明者らは種々の化合物の探索を行い、その生物活性について鋭意検討を行った結果、新規物質であるナナオマイシン及びその誘導体が、上皮間葉転換により間葉細胞化した細胞に対して選択的に傷害を与えることを見出した。
本発明はかかる知見に基づきなされたものであり、よって、本発明は以下の発明に関する。
（１） 下記式（Ｉ）で表される化合物若しくはそのエステル誘導体又はそれらの塩若しくは水和物若しくは溶媒和物（以下、本明細書において「本発明の前記式（Ｉ）で表わされる化合物等」ということがある）
Figure 0007057945000001
 ［式中、Ｒ１は、Ｃ１～６アルキル基を示し、Ｒ２は、Ｃ１～６アルコキシカルボニル基、カルボキシ基、又は水酸基で置換されたＣ１～６アルキル基を示し、Ｒ３は、以下のいずれかで表される基を示す。］
Figure 0007057945000002
Figure 0007057945000003
Figure 0007057945000004
Figure 0007057945000005
 （２） （１）に記載の化合物において、Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２がカルボキシ基である化合物を生産する能力を有する放線菌に属する微生物を培地で培養し、培養物中に該化合物を蓄積せしめ、該培養物から該化合物を採取することを特徴とする、請求項１に記載の化合物において、Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２がカルボキシ基である化合物の製造方法。
（３） （１）に記載の化合物において、Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２がカルボキシ基である化合物を生産する能力を有する放線菌に属する微生物が、ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）Ｋ１５－０５９１（受領番号 ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２３０４）である請求項２に記載の製造方法。
（４） ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）Ｋ１５－０５９１（受領番号 ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２３０４）。
（５） （１）に記載の化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
（６） （１）に記載の化合物を有効成分として含有する上皮間葉転換が誘導された細胞を傷害するための薬剤。
よって、一態様において本発明は、ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）Ｋ１５－０５９１株の培養液から単離された、式（Ｉ）で表わされる、新規化合物ナナオマイシン類又はそのエステル誘導体あるいはそれらの塩又は水和物を提供するものである。
本発明の式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒ１は、直鎖又は分岐状のＣ１～６アルキル基である。本明細書において、「Ｃ１～６アルキル基」とは、直鎖又は分岐状の炭素数が１～６個の飽和炭化水素基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔ－ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、２，３－ジメチルプロピル基、ヘキシル基、及びシクロヘキシル基などが挙げられ、好ましくは、Ｃ１～５アルキル基であり、より好ましくは、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔ－ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、又は２，３－ジメチルプロピル基である。更に好ましくは、Ｃ１～３アルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、及びｉ－プロピル基、であり、最も好ましくは、メチル基、エチル基、又はプロピル基である。
本発明の式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒ２は、Ｃ１～６アルコキシカルボニル基、カルボキシ基（ＣＯＯＨ基）、又は水酸基で置換されたＣ１～６アルキル基である。本明細書において、「Ｃ１～６アルコキシカルボニル基」とは、（Ｃ１～６アルキル基）－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－基のことであり、該アルキル基部分は直鎖状であっても分岐状であってもよい。Ｃ１～６アルコキシカルボニル基とは、前記アルキル基部分の炭素原子数が１～６個であることを意味する。Ｃ１～６アルコキシカルボニル基としては、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、１－プロピルオキシカルボニル基、２－プロピルオキシカルボニル基、２－メチル－１－プロピルオキシカルボニル基、２－メチル－２－プロピルオキシカルボニル基、２，２－ジメチル－１－プロピルオキシカルボニル基、１－ブチルオキシカルボニル基、２－ブチルオキシカルボニル基、２－メチル－１－ブチルオキシカルボニル基、３－メチル－１－ブチルオキシカルボニル基、２－メチル－２－ブチルオキシカルボニル基、３－メチル－２－ブチルオキシカルボニル基、１－ペンチルオキシカルボニル基、２－ペンチルオキシカルボニル基、３－ペンチルオキシカルボニル基、２－メチル－１－ペンチルオキシカルボニル基、３－メチル－１－ペンチルオキシカルボニル基、２－メチル－２－ペンチルオキシカルボニル基、３－メチル－２－ペンチルオキシカルボニル基、１－ヘキシルオキシカルボニル基、２－ヘキシルオキシカルボニル基、３－ヘキシルオキシカルボニル基などが挙げられる。Ｃ１～６アルコキシ基として、好ましくはＣ１～５アルコキシ基であり、より好ましくは、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロピルオキシカルボニル基、ｉ－プロピルオキシカルボニル基、ｎ－ブチルオキシカルボニル基、ｓｅｃ－ブチルオキシカルボニル基、ｔ－ブチルオキシカルボニル基、イソブチルオキシカルボニル基、ペンチルオキシカルボニル基、イソペンチルオキシカルボニル基、及び２，３－ジメチルプロピルオキシカルボニル基であり、更に好ましくは、Ｃ１～３アルコキシカルボニル基（メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基及びプロピルオキシカルボニル基）であり、より更に好ましくは、メトキシカルボニル基又はエトキシカルボニル基である。
本明細書において、水酸基で置換されたＣ１～６アルキル基とは、１個の水酸基で置換された、前記Ｃ１～６アルキル基を意味し、例えば、ヒドロキシメチル基、１－ヒドロキシエチル基、２－ヒドロキシエチル基、１－ヒドロキシプロピル基、２－ヒドロキシプロピル基、１－ヒドロキシブチル基、２－ヒドロキシブチル基、３－ヒドロキシブチル基、１－ヒドロキシペンチル基、２－ヒドロキシペンチル基、３－ヒドロキシペンチル基、４－ヒドロキシペンチル基、１－ヒドロキシヘキシル基、２－ヒドロキシヘキシル基、３－ヒドロキシヘキシル基、４－ヒドロキシヘキシル基、５－ヒドロキシヘキシル基、及びヒドロキシシクロヘキシル基などが挙げられ、好ましくは、１個の水酸基で置換されたＣ１～３アルキル基であり、例えば、ヒドロキシメチル基、１－ヒドロキシエチル基、２－ヒドロキシエチル基である。
本発明の式（Ｉ）で表される化合物として、以下の式で表されるナナオマイシンＨが含まれる。
Figure 0007057945000006
また、別の態様において、本発明は、前記式で表わされるナナオマイシンＨを生産する能力を有する放線菌に属する微生物を培地で培養し、培養物中前記式で表わされるナナオマイシンＨを蓄積せしめ、該培養物から前記式で表わされるナナオマイシンＨを採取することを特徴とする、前記式で表わされるナナオマイシンＨの製造方法に関する。
本明細書において、ナオマイシンＨとは、以下の物性を有する化合物である：
（１）性状：白色粉末または淡黄色粉末
（２）分子量：８０４
（３）分子式：Ｃ３３Ｈ４４Ｎ２Ｏ１９Ｓ
（４）高分解能質量分析による［Ｍ＋Ｈ］＋ 理論値（ｍ／ｚ）８０５．２３０７、実測値（ｍ／ｚ）８０５．２３３７
（５）比旋光度：［α］Ｄ ２５．７＝－７．６７５（ｃ＝０．１、メタノール）
（６）紫外部吸収極大（メタノール中）λｍａｘ（ε）：２３１（４０２００）、２７０（１６６４３，ｓｈ）、３５３（１３３４６）
（７）赤外部吸収極大νｍａｘ（ＫＢｒ錠）：３４１２，１６３７ｃｍ－１に極大吸収を有する
（８）１Ｈ ＮＭＲ（重メタノール中）δ ｐｐｍ：１．７５２（３Ｈ，ｄ，８．０），１．９０７（３Ｈ，ｓ），２．０５３（１Ｈ，ｄ，１２．０），２．２７８（１Ｈ，ｄｄ，９．５，１２．０），２．４３３（１Ｈ，ｄｄ，８．０，１２．５），２．６１２（２Ｈ，ｄ，６．０），２．８０８（１Ｈ，ｄｄ，５．０，１２．５），３．１５１（１Ｈ，ｔ，９．５），３．３０９（１Ｈ，ｄｄ，９．５，１０．０），３．３４（１Ｈ，ｄｄ，２．５，９．５），３．４３（１Ｈ，ｄｄ，３．０，１０．０），３．５９２（１Ｈ，ｄｄ，９．５，１０．０），３．６４５（１Ｈ，ｄｄ，７．０，１２．０），３．７１９（１Ｈ，ｄｄ，９．５，１０．０），３．７７２（１Ｈ，ｄｄ，９．５，１０．０），３．８１９（１Ｈ，ｄｄｄ，２．５，７．０，１０．０），３．８５（１Ｈ，ｄｄ，２．５，１２．０），３．８５（１Ｈ，ｄｄ，３．５，１０．０），４．１１８（１Ｈ，ｄｄ，２．５． ３．０），４．２２（１Ｈ，ｄｄ，８．０，１５．０），４．４４（１Ｈ，ｄｄ，５．０，９．０），４．７（１Ｈ，ｄｄｄ，６．０，６．０，９．５），５．０４２（１Ｈ，ｄ，３．５），７．２４２（１Ｈ，ｄｄ，１．０，８．５），７．５７（１Ｈ，ｄｄ，１．０，８．０），７．６９８（１Ｈ，ｄｄ，８．０，８．５）
（９）１３Ｃ ＮＭＲ（重メタノール中）δ ｐｐｍ：１６．２，２２．６，３１．５，３３．６，４１．５，５４．２，５５．６，６０．１，６２．８，６４．６，７２．３，７２．８，７３．２，７３．４，７４．０，７４．１，７４．４，７５．５，７６．４，７７．５，８０．４，１００．１，１１６．０，１２０．０，１２４．６，１３４．７，１３７．９，１６２．８，１７２．０，１７３．６，１７５．６，１９０．６，２００．５
（１０）溶解性：水、エタノール及びメタノールに易溶、アセトン及びヘキサンに難溶。
本発明の式（Ｉ）で表される化合物として、以下の式で表されるナナオマイシンＩが含まれる。
Figure 0007057945000007
また、別の態様において、本発明は、前記式で表わされるナナオマイシンＩを生産する能力を有する放線菌に属する微生物を培地で培養し、培養物中前記式で表わされるナナオマイシンＩを蓄積せしめ、該培養物から前記式で表わされるナナオマイシンＩを採取することを特徴とする、前記式で表わされるナナオマイシンＩの製造方法に関する。
本明細書において、ナナオマイシンＩとは、以下の物性を有する化合物である：
（１）性状：淡黄色粉末又は淡黄色非晶質固体
（２）分子量：４８１
（３）分子式：Ｃ２１Ｈ２３ＮＯ１０Ｓ
（４）高分解能質量分析による［Ｍ＋Ｈ］＋ 理論値（ｍ／ｚ）４８２．１１１５、実測値（ｍ／ｚ）４８２．１１２９
（５）比旋光度：［α］Ｄ ２6＝－１４２.７（ｃ＝０．１、メタノール）
（６）紫外部吸収極大（メタノール中）λｍａｘ（ε）：２０４（１５３９２）、２３１（１５９６９）、２６７（ｓｈ）、３５３（５０５０）
（７）赤外部吸収極大νｍａｘ（ＫＢｒ錠）：３４５１，１６４６，１５２７ｃｍ－１に極大吸収を有する
（８）１Ｈ ＮＭＲ（重ジメチルスルホキシド中）δ ｐｐｍ：１．６１（３Ｈ，ｄ，７．２），１．７２（１Ｈ，ｓ），１．８２（１Ｈ，ｄ，１３．５），２．１３（１Ｈ，ｄｄ，１３．５，１２．０），２．３３（１Ｈ，ｄｄ，１２．６，８．４）, ２．３９（１Ｈ，ｄｄ，１５．３，９．０），２．５４（１Ｈ，ｄｄ，１５．３，３．６），２．６４（１Ｈ，ｄｄ，１２．６，４．８），４．１３（１Ｈ，ｑ，７．２），４．１９（１Ｈ，ｍ），４．５０（１Ｈ，ｍ），７．２８（１Ｈ，ｄ，８．１），７．４５（１Ｈ，ｄ，７．６），７．７２（１Ｈ，ｄｄ，８．１，７．６）
（９）１３Ｃ ＮＭＲ（重ジメチルスルホキシド中）δ ｐｐｍ：１５．５，２２．２，２９．９，３１．９，４０．３，５１．３，５８．４，６２．８，７２．６，７５．９，１１４．４，１１８．６，１２３．６，１３２．９，１３７．０，１６０．３，１６９．２，１７１．３，１７２．１，１８９．２，１９８．７
（１０）溶解性：ＤＭＳＯ、メタノールに易溶。ヘキサン、酢酸エチル及びクロロホルムに難溶。
本発明の式（Ｉ）で表される化合物として、以下の式で表されるナナオマイシンＪが含まれる。
Figure 0007057945000008
また、別の態様において、本発明は、前記式で表わされるナナオマイシンJを生産する能力を有する放線菌に属する微生物を培地で培養し、培養物中前記式で表わされるナナオマイシンJを蓄積せしめ、該培養物から前記式で表わされるナナオマイシンJを採取することを特徴とする、前記式で表わされるナナオマイシンJの製造方法に関する。
本明細書において、ナナオマイシンＪとは、以下の物性を有する化合物である：
（１）性状：淡黄色粉末又は淡黄色非晶質固体
（２）分子量：６４３
（３）分子式：Ｃ２７Ｈ３４Ｎ２Ｏ１４Ｓ
（４）高分解能質量分析による［Ｍ＋Ｈ］＋ 理論値（ｍ／ｚ）６４３．１８０３、実測値（ｍ／ｚ）６４３．１８３３
（５）比旋光度：［α］Ｄ ２6＝－１２５.５（ｃ＝０．１、メタノール）
（６）紫外部吸収極大（メタノール中）λｍａｘ（ε）：２０４（２４０７５）、２３２（１８７４６）、２６７（ｓｈ）、３５３（５７７８）
（７）赤外部吸収極大νｍａｘ（ＫＢｒ錠）：３４６３，１６４３，１５２７ｃｍ－１に極大吸収を有する
（８）１Ｈ ＮＭＲ（重メタノール中）δ ｐｐｍ：１．７６（３Ｈ，ｄ，７．２），１．８７（１Ｈ，ｓ），２．０６（１Ｈ，ｄ，１４．１），２．２７（１Ｈ，ｄｄ，１４．１，４．８），２．４０（１Ｈ，ｄｄ，１２．６，９．０）, ２．６１（１Ｈ，ｄ，６．０），２．７７（１Ｈ，ｄｄ，１２．６，５．１），３．３７（１Ｈ，ｄｄ，９．０，９．０），３．６８（１Ｈ，ｄｄ，１０．０，９．０），３．６９（１Ｈ，ｄｄ，１２．０，６．０）， ３．７６（１Ｈ，ｄｄ，１０．０，３．０），３．７９（１Ｈ，ｄｄ，１２．０，３．０），３．７９（１Ｈ，ｄｄｄ，９．０，６．０，３．０），４．２１（１Ｈ，ｑ，７．２），４．５０（１Ｈ，ｄｄ，９．０，５．１），４．６９（１Ｈ，ｍ），５．０３（１Ｈ，ｄ，３．０），７．２４（１Ｈ，ｄ，８．４，０．９），７．５６（１Ｈ，ｄ，７．５，０．９），７．６９（１Ｈ，ｄｄ，８．４，７．５）
（９）１３Ｃ ＮＭＲ（重メタノール中）δ ｐｐｍ：１６．１，２２．４，３１．３，３３．８，４１．６，５３．７，５６．１，６０．１，６２．８，６４．６，７２．４，７２．６，７３．２，７５．５，７７．５，９２．４，１１６．０，１１９．９，１２４．６，１３４．６，１３７．９，１６２．６，１７２．１，１７３．２，１７５．６，１９０．７，２００．５
（１０）溶解性：ＤＭＳＯ、メタノールに易溶。ヘキサン、酢酸エチル及びクロロホルムに難溶。
本発明の式（Ｉ）で表される化合物として、以下の式で表されるナナオマイシンＫが含まれる。
Figure 0007057945000009
また、別の態様において、本発明は、前記式で表わされるナナオマイシンＫを生産する能力を有する放線菌に属する微生物を培地で培養し、培養物中前記式で表わされるナナオマイシンＫを蓄積せしめ、該培養物から前記式で表わされるナナオマイシンＫを採取することを特徴とする、前記式で表わされるナナオマイシンＫの製造方法に関する。
本明細書において、ナナオマイシンＫとは、以下の物性を有する化合物である：
（１）性状：橙色粉末又は橙色非晶質固体
（２）分子量：５４７
（３）分子式：Ｃ２５Ｈ２９Ｎ３Ｏ９Ｓ
（４）高分解能質量分析による［Ｍ＋Ｈ］＋ 理論値（ｍ／ｚ）５４８．１６９７、実測値（ｍ／ｚ）５４８．１７０９
（５）比旋光度：［α］Ｄ ２6＝－２００.１（ｃ＝０．１、メタノール）
（６）紫外部吸収極大（メタノール中）λｍａｘ（ε）：２０４（１８４８８）、２３５（２６９６７）、３５６（５９０７）
（７）赤外部吸収極大νｍａｘ（ＫＢｒ錠）：３４３２，１６７７，１５２７ｃｍ－１に極大吸収を有する
（８）１Ｈ ＮＭＲ（重メタノール中）δ ｐｐｍ：１．８７（３Ｈ，ｂｒ ｄ），１．９４（１Ｈ，ｄ，４．９），２．２７（１Ｈ，ｄｄ，１２．０，１２．０），２．５７（１Ｈ，ｄ，１４．９，８．０），２．７０（１Ｈ，ｄｄ，１４．９，４．０）, ３．１０-３．２８（２Ｈ，ｍ），３．２５（９Ｈ，ｓ），３．９５（１Ｈ，ｂｒ ｄ），４．２８（１Ｈ，ｑ，６．９），４．８６（１Ｈ，ｏｖｅｒｌａｐ），７．０３（１Ｈ，ｓ），７．２４（１Ｈ，ｄ，８．２），７．４１（１Ｈ，ｄ，６．９）， ７．６６（１Ｈ，ｂｒ ｔ）
（９）１３Ｃ ＮＭＲ（重メタノール中）δ ｐｐｍ：１６．２，２７．４，３２．１，４１．８，５２．９，６３．５，６４．５，７５．４，７７．０，７９．４，１１６．１，１２０．５，１２２．２，１２４．５，１３２．７，１３４．８，１３８．１，１３８．６，１６３．０，１７１．０，１７５．２，１９０．７，２００．３
（１０）溶解性：ＤＭＳＯ、メタノールに易溶。ヘキサン、酢酸エチル及びクロロホルムに難溶。
本明細書において、本発明の式（Ｉ）で表わされる化合物の塩とは、式（Ｉ）で表わされる化合物に金属等が配位して形成する錯塩を意味する。また、本発明の式（Ｉ）で表わされる化合物の水和物又は溶媒和物及び本発明の式（Ｉ）で表わされる化合物の塩の水和物又は溶媒和物も本発明に包含される。好ましくは、本発明の式（Ｉ）で表わされる化合物の塩、及び、本発明の式（Ｉ）で表わされる化合物の水和物又は溶媒和物及び本発明の式（Ｉ）で表わされる化合物の塩の水和物又は溶媒和物は、薬理学的に許容されるものである。また、本発明の式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩は結晶であってもよいし、非晶体であってもよい。
本発明の化合物は、上記化合物の他、これらの化合物の薬理学的に許容されるエステル誘導体を包含する。ここで、「薬理学的に許容されるエステル誘導体」は、生体内において代謝されて、本願発明の化合物を与える基を含む化合物であって、医薬として体内に投与することが許容可能なエステルのことである。本明細書において、エステルは、エステル結合した化合物の他、アミド結合した化合物を含む。エステルは、生体内のエステラーゼにより分解されて活性型の化合物を与えてもよい。例えば、エステルとしては、置換され又は置換されていない、低級アルキルエステル、低級アルケニルエステル、低級アルキルアミノ低級アルキルエステル、アシルアミノ低級アルキルエステル、アシルオキシ低級アルキルエステル、アリールエステル、アリール低級アルキルエステル、アミド、低級アルキルアミド、水酸化アミドを挙げることができる。エステルとして、好ましくは、プロピオオン酸エステル又はアシルエステルである。
本発明の化合物は不斉炭素を有することがあることから、光学異性体が存在することがある。本発明の化合物としては、右旋性（＋）又は左旋性（－）の何れの化合物であってもよいし、ラセミ体などのこれらの異性体の混合物であってもよい。また、本発明の化合物は、特に断らない限り、いずれの互変異性体、又は幾何異性体（例えば、Ｅ体、Ｚ体など）も含むものである。
あるいは、本発明は、前記式（Ｉ）で表わされる化合物若しくはそのエステル誘導体又はそれらの塩若しくは水和物を有効成分として含有する医薬組成物に関する。
更に、本発明は、前記式（Ｉ）で表わされる化合物若しくはそのエステル誘導体又はそれらの塩若しくは水和物を有効成分として含有する医薬組成物に関する。別の態様において、本発明は、前記式（Ｉ）で表わされる化合物若しくはそのエステル誘導体又はそれらの塩若しくは水和物を有効成分として含有する、上皮間葉転換が誘導された細胞を障害するための薬剤に関する。本明細書において、「上皮間葉転換が誘導された細胞を傷害するための薬剤」とは、上皮細胞から間葉細胞への転換が誘導された細胞に特異的に傷害を与え、殺傷し、又はアポトーシスを誘導するための薬剤を意味する。
本発明の医薬組成物は、好ましくは上皮細胞から間葉細胞への転換が誘導された細胞に特異的に傷害を与える。本明細書において、上皮細胞から間葉細胞への転換が誘導された細胞に特異的に傷害を与えるとは、上皮細胞にはほとんど傷害を与えないが、上皮細胞から間葉細胞に転換された細胞には傷害を与えることを意味する。ここで、ほとんど障害を与えないとは、全く毒性がないことを意味するものではなく、医薬として用いた場合に問題とならない程度に毒性がないことを意味し、例えば、３０μＭで全く毒性を示さないか、又は、１００μＭで８５％以上の生存率を示すことを意味する。
また、本発明において医薬組成物、細胞障害剤、治療薬、予防薬、転移抑制剤、及び浸潤抑制剤（以下「医薬組成物等」という）としては、その種類が特に限定されるものではなく、剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製することができる。また、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解又は懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明の化合物を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水或いはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。経口投与用又は非経口投与用の任意の製剤形態で提供される。例えば、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤又は液剤等の形態の経口投与用医薬組成物、静脈内投与用、筋肉内投与用、若しくは皮下投与用などの注射剤、点滴剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、吸入剤、坐剤などの形態の非経口投与用医薬組成物として調製することができる。注射剤や点滴剤などは、凍結乾燥形態などの粉末状の剤形として調製し、用時に生理食塩水などの適宜の水性媒体に溶解して用いることもできる。
本発明の化合物は、上皮間葉転換した細胞に対して特異的に傷害を与えることができる。
図１はコンフルエント状態および薄まき状態におけるナナオマイシンＨのＭＤＣＫ細胞に対する増殖抑制・毒性効果（ＭＴＳアッセイ）を示すグラフである。縦軸に吸光度４９０ｎｍ、横軸にＤＭＳＯ（コントロール）またはナナオマイシンＨ処理群、左がＢＳＦ添加、右がＴＧＦを添加させ、上皮間葉転換を誘導させた群になる。 図２は移動する細胞への薬剤の影響を観察した結果を示す写真である。（Ａ：ＤＭＳＯ（コントロール）、Ｂ：ナナオマイシンＨ），スケールバー：１００μｍ 図３はＴＧＦ－βにより上皮間葉転換誘導したＭＤＣＫ細胞に対する、ナナオマイシン類の殺細胞効果を示すグラフである。コントロールとして、ＴＧＦ－βを加えない群にはＢＳＡを加えた。上段は、ナナオマイシン類を５μｇ／ｍｌで添加した結果を示し、下段はナナオマイシン類を５０μｇ／ｍｌ（ただし、ナナオマイシンＨのみ１００μｇ／ｍｌ）で添加した結果を示す。縦軸は、ナナオマイシン類添加前の細胞数を１とした場合の細胞生存率を表す。白抜きグラフはＭＤＣＫ細胞を６０００細胞播種したウェルの結果を示し、黒塗りグラフはＭＤＣＫ細胞を２０００細胞播種したウェルの結果を示す。横軸のＢＳＡはＴＧＦ－β未添加のコントロール群を表し、ＴＧＦはＴＧＦ－β添加群を表す。「Ｈ」、「Ｉ」、「Ｊ」及び「Ｋ」はそれぞれ添加したナナオマイシン類の種類を表す。
本発明の前記式（Ｉ）で表わされる化合物若しくはそのエステル誘導体又はそれらの塩若しくは水和物は、ナオマイシンＨを生産する能力を有する放線菌に属する微生物を培地で培養し、培養物中ナオマイシンＨを蓄積せしめ、該培養物からナナオマイシンを採取（分離・抽出・精製）することにより、あるいは、得られたナナオマイシンを更に化学的に変換又は修飾することにより製造することができる。
本発明のナオマイシン類（ナナオマイシンＨ、ナナオマイシンＩ、ナナオマイシンＪ、及びナナオマイシンＫ）の製造方法において、「ナオマイシン類を生産する能力を有する放線菌に属する微生物」は、放線菌に属する菌であって、ナオマイシン類を生産する能力を有する微生物であれば特に限定されない。本発明のナオマイシン類の製造方法に用いることのできる菌株には、上記菌株の他、その変異株をはじめ、放線菌に属するナオマイシンＨを生産する能力を有する菌のすべてが含まれる。微生物が「ナオマイシンＨを生産する能力を有する放線菌に属する微生物」であるか否かは、例えば、以下の方法により決定することができる。スターチ２．４％、グルコース０．１％、ペプトン０．３％、カツオエキス０．３％、酵母エキス０．５％、炭酸水素カルシウム０．４％からなる液体培地（ｐＨ ７．０）１００ｍＬを含む５００ｍＬ容三角フラスコに、液体培地で培養した被験微生物１ｍＬを植菌し、２７℃で３日間振盪培養後、得られた種培養液を、スターチ５．０％、グリセロール０．５％、脱脂小麦胚芽１．０％、ドライ酵母１．０％、炭酸水素カルシウム０．５％からなる液体培地（ｐＨ７．０）１００ｍＬを含む５００ｍＬ容三角フラスコに、１ｍＬ植菌し、２７℃で８日間振盪培養することにより得られた培養物の中に、ナオマイシンＨが存在すれば当該微生物はナオマイシンＨを生産する能力を有する放線菌に属する微生物であると決定することができる。好ましくは、ナオマイシンＨを生産する能力を有する放線菌に属する微生物は、石川県七尾市の土壌より分離された、ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）Ｋ１５－０５９１株である。本微生物は、２０１７年９月２６日付にて、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に受領番号 ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２３０４として寄託されている。
本明細書において、「変異株」とは、人工的又は自然界における変異誘発刺激によりＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｋ１５－０５９１株とは異なる菌学的性状又は遺伝子を有する株のことであり、このような変異株にはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｋ１５－０５９１株から派生した菌株の他、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｋ１５－０５９１株を派生させた元の菌株も含まれる。本明細書において、変異株は実際の派生の痕跡の有無を問うものではなく、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｋ１５－０５９１株遺伝子（例えば、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）と高い相同性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上など）を有する遺伝子を有する菌株もまた変異株に含まれる。また、このような変異株は、ナナオマイシン類の産生能を維持している限り、人工的に作製したものであるか、天然から採取したものであるかを問わない。
ナナオマイシン類を生産する能力を有する放線菌に属する微生物を培養するための培地には、栄養源として、放線菌の栄養源として使用し得るものを含有することができる。例えば、市販のペプトン、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、綿実粉、落花生粉、大豆粉、酵母エキス、ＮＺ－アミン、カゼインの水和物、硝酸ソーダ、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の窒素源、グリセリン、スターチ、グルコース、ガラクトース、マンノース等の炭水化物、あるいは脂肪等の炭素源、及び食塩、リン酸塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム等の無機塩を単独あるいは組み合わせて使用することができる。その他、培地には、必要に応じて微量の金属塩、消泡剤として動・植・鉱物油等を添加することもできる。これらのものは生産菌を利用したマングロマイシン類の生産の役だつものであればよく、公知の放線菌の培養材料はすべて用いることができる。
また、ナナオマイシン類を生産する能力を有する放線菌に属する微生物の培養は、生産菌が発育しナナオマイシン類を生産できる温度範囲（例えば、１０℃～４０℃、好ましくは、２５～３０℃）で数日～２週間振盪培養することにより行うことができる。培養条件は、本明細書の記載を参照しながら、使用するナナオマイシン類生産菌の性質に応じて適宜選択して行なうことができる。
ナナオマイシン類の採取は、培養液より酢酸エチル等の水不混和性の有機溶媒を用いて抽出することにより行うことができる。本抽出法に加え、脂溶性物質の採取に用いられる公知の方法、例えば吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーよりのかき取り、遠心向流分配クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を適宜組合わせあるいは繰返すことによって純粋になるまで精製することができる。
本発明の前記式（Ｉ）で表わされる化合物若しくはそのエステル誘導体又はそれらの塩若しくは水和物は、ナナオマイシン類を適宜、化学的変換又は修飾することにより合成することができる。あるいは、本発明の前記式（Ｉ）で表わされる化合物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｋ１５－０５９１株を生産菌として用いて、上述のナナオマイシン類の産生及び精製と同様の方法で単離することにより取得することができる。
本発明の医薬組成物は、通常の薬学的に許容される担体を用いて、常法により製剤化することができる。本発明の前記式（Ｉ）で表わされる化合物等を有効成分として含有する医薬組成物を製剤化するための剤型に制限はなく錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等の固形剤、溶液、懸濁液、乳剤などの液状製剤として経口的に、あるいは、静脈内、筋肉内、皮下などの注射剤、坐剤、貼付剤などとして非経口的に使用することができる。経口用固形製剤を調製する場合は、主薬に賦形剤、更に必要に応じて、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えた後、常法により溶剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等とする。注射剤を調製する場合には、主薬に必要によりｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤等を添加し、常法により皮下又は静脈内用注射剤とすることができる。
本発明はさらに、それを必要とする患者に有効量の本発明の前記式（Ｉ）で表わされる化合物若しくはそのエステル誘導体又はそれらの塩若しくは水和物を投与することを備える、上皮間葉転換が発症又は増悪化に関係し又は寄与する疾患又は障害の治療方法又は予防方法に使用することができる。例えば、本発明の前記式（Ｉ）で表わされる化合物等を治療又は予防目的で使用する場合、本発明の前記式（Ｉ）で表わされる化合物等を有効成分として含有する医薬組成物を、経口投与形態、又は注射剤、点滴剤等の非経口投与形態で投与することができる。本発明の前記式（Ｉ）で表わされる化合物等を哺乳動物等に投与する場合、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等として経口投与してもよいし、又は、注射剤、点滴剤として非経口的に投与してもよい。投与量は、症状、年齢、性別、体重、投与形態等により異なるが、例えば成人に経口的に投与する場合には、通常１日量は０．１－１０００ｍｇである。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
（実施例１） ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）Ｋ１５－０５９１株の菌学的性状
本発明者等によって石川県七尾市の土壌より新たに、ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）Ｋ１５－０５９１株を分離した。ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）Ｋ１５－０５９１株の菌学的性状は以下の通りであった。
（Ｉ）形態的性質
栄養菌糸は各種寒天培地上でよく発達し、分断は観察されない。気菌糸はスターチ無機塩寒天で豊富に着生し、黄色の色調を呈する。約０．１μｍの気菌糸を形成する。胞子のう及び遊走子は見出されない。
（ＩＩ）各種培地上での性状
イー・ビー・シャーリング（Ｅ．Ｂ．Ｓｈｉｒｌｉｎｇ）とデー・ゴットリーブ（Ｄ．Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）の方法（インターナショナル・ジャーナル・オブ・システィマティック・バクテリオロジー、１６巻、３１３頁、１９６６年）によって調べた本菌株の培養性状を表１に示す。色調は標準色として、カラー・ハーモニー・マニュアル第４版（コンテナー・コーポレーション・オブ・アメリカ・シカゴ、１９５８年）を用いて決定することができ、色票名は括弧内のコードと併せて記されている。以下は特記しない限り、２７℃、１週間目の各培地における観察の結果である。
Figure 0007057945000010
（ＩＩＩ）生理学的諸性質
（１）メラニン色素の生成：陽性
（２）チロシナーゼ反応：陽性
（３）Ｈ２Ｓ産生：陰性
（４）スターチの加水分解：陽性
（５）ゼラチンの液化（単純ゼラチン培地）（２１～２３℃）：陽性
（６）脱脂乳のペプトン化（３７℃）：陽性
（７）脱脂乳の凝固（３７℃）：陽性
（８）セルロースの分解：弱い陽性
（９）生育温度範囲：１５～４５℃
（１０）炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地）
利用する：Ｄ－グルコース、Ｄ－キシロース、Ｄ－マンニトール、Ｌ－アラビノース、スクロース、ラムノース、ラフィノース
利用しない：Ｄ－フルクトース、ｉ－イノシトール
（ＩＶ）細胞の化学組成
細胞壁のジアミノピメリン酸はＬＬ型である。
（Ｖ）１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のうち約１４００塩基配列を決定し、ＤＮＡデータベースに登録され公開されているストレプトマイセス属に属する菌株およびその他の放線菌のデータを用いた近隣結合法による系統解析の結果から、本菌株はストレプトマイセス属に分類することが妥当であり、ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）に最も近縁である。
（ＶＩ）結論
以上、本菌の菌学的性状を要約すると次のとおりである。細胞壁中のジアミノピメリン酸はＬＬ型である。豊富に着生する気菌糸はらせん状を形成する。コロニーは黄土色を呈し、メラニン色素は産生する。これらの結果および１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の解析結果から、本菌株はストレプトマイセス属に属する１菌種であると判断された。本菌株はストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）Ｋ１５－０５９１として、２０１７年９月２６日付にて独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に寄託した（受領番号 ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２３０４）。
（実施例２）ナナオマイシンＨの取得
スターチ２．４％、グルコース０．１％、ペプトン（極東製薬工業株式会社製）０．３％、カツオエキス（極東製薬工業株式会社製）０．３％、酵母エキス（オリエンタル酵母工業株式会社製）０．５％、炭酸水素カルシウム０．４％からなる液体培地（ｐＨ ７．０）１００ｍＬを含む５００ｍＬ容三角フラスコに１００本に、液体培地で培養したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｋ１５－０５９１（受領番号 ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２３０４）を各１ｍｌずつ植菌し、２７℃で３日間振盪培養した。得られた種培養液を、スターチ５．０％、グリセロール０．５％、脱脂小麦胚芽（日清ファルマ株式会社製）１．０％、ドライ酵母（ＪＴフーズ株式会社製）１％、炭酸水素カルシウム０．５％からなる液体培地（ｐＨ７．０）１００ｍＬを含む５００ｍＬ容三角フラスコに１００本に、各１ｍＬずつ植菌し、２７℃で６日間振盪培養した。
培養の終了した５００ｍＬ容三角フラスコ１００本にそれぞれ１００ｍＬのエタノールを加えて１時間激しく撹拌した。次にその抽出液中のエタノールを減圧留去し、得られた水溶液に１０Ｌの酢酸エチルを加えよく撹拌後、酢酸エチル層を回収した。エバポレーターを用い、濃縮乾固して４．７ｇの粗精製物１を得た。これを少量のメタノールに溶解し、シリカゲル（ＭＥＲＣＫ社製）オープンカラムクロマトグラフィーを用いて、クロロホルム－メタノール溶媒系で段階溶出（１００：０，１００：１，５０：１，１０：１，１：１，０：１００）させ、ナナオマイシンＨを含む１：１画分および０：１００画分（粗精製物２）を１７７４ｍｇ得た。
粗精製物２を少量のメタノールに溶解し、ＯＤＳ（富士シリシア化学株式会社社製）オープンカラムクロマトグラフィーを用いて、メタノール－水系で段階溶出（メタノール濃度０％，２０％，３０％，４０％，５０％，６０％，７０％，８０％，９０％，１００％）し、ナナオマイシンＨを含む２０％画分（粗精製物３）を３９２ｍｇ得た。粗精製物３をメタノールに溶解し、高速液体クロマトグラフィーにてオクタデシルシリルカラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－４，φ１４×２５０ｍｍ，流速６．５ｍＬ／ｍｉｎ，検出２５４ｎｍ）に注入し、０．１％ギ酸含有３０％メタノール水で溶出した。保持時間２２分付近のピークを分取し、減圧濃縮によりナナオマイシンＨを淡黄色粉末として４．１ｍｇ得た。
得られたナナオマイシンＨの理化学的性状を測定した結果、次の通りであった。
ナナオマイシンＨ
（１）性状：白色粉末または淡黄色粉末
（２）分子量：８０４
（３）分子式：Ｃ３３Ｈ４４Ｎ２Ｏ１９Ｓ
（４）高分解能質量分析による［Ｍ＋Ｈ］＋ 理論値（ｍ／ｚ）８０５．２３０７、実測値（ｍ／ｚ）８０５．２３３７
（５）比旋光度：［α］Ｄ ２５．７＝－７．６７５（ｃ＝０．１、メタノール）
（６）紫外部吸収極大（メタノール中）λｍａｘ（ε）：２３１（４０２００）、２７０（１６６４３，ｓｈ）、３５３（１３３４６）
（７）赤外部吸収極大νｍａｘ（ＫＢｒ錠）：３４１２，１６３７ｃｍ－１に極大吸収を有する
（８）プロトン核磁気共鳴スペクトル：重メタノール中の化学シフト（ｐｐｍ）を表１に示す。（表中、ｓは一重線、ｄは二重線、ｍは多重線、Ｈはプロトンの数を示す。）
（９）カーボン核磁気共鳴スペクトル：重メタノール中の化学シフト（ｐｐｍ）を表１に示す。
（１０）溶剤に対する溶解性：水、エタノール、メタノールに易溶。アセトン、ヘキサンに難溶。
Figure 0007057945000011
以上のとおり各種理化学的性状が得られたナナオマイシンＨに一致する化合物はこれまで報告されていないことから、ナナオマイシンＨは新規物質であると考えられる。
（実施例３）ＴＧＦ－βにより上皮間葉転換誘導されたＭＤＣＫ（イヌ上皮細胞株）に対する影響
細胞培養用ディッシュにイヌ腎臓尿細管上皮由来細胞株ＭＤＣＫ（以下、「ＭＤＣＫ細胞」という。）を、イーグル最少必須培地（以下、「ＭＥＭ培地」という。）（１０％ウシ胎児血清アルブミン、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１％ピルビン酸ナトリウム，１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液、１％グルタミン）中、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターでセミコンフルエントに維持されるように継代培養を行った。この細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ溶液で処理し、終濃度１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－βと０．００１％のＢＳＡを含む前記培地に細胞を播種し、３日間培養した。ブランクとしてＴＧＦ－βを加えず、ＢＳＡのみを添加した培地中で同様に３日間培養した細胞を用意した。これらの細胞を９６ウェルにＭＤＣＫ細胞を２０，０００細胞／ウェル（コンフルエント状態）および２，０００細胞／ウェル（薄まき状態）で調整した。
それぞれのウェルに終濃度５０μｇ／ｍｌになるようにＤＭＳＯに溶解したナナオマイシンＨ（終濃度０．５％ＤＭＳＯ）あるいはナナオマイシンメチルエステル体（終濃度０．５％ＤＭＳＯ）を添加して、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養し、形態観察および生細胞定量キット（ＭＴＳアッセイ）で毒性・増殖試験を行った。その結果を図１に示した。ナナオマイシンＨはコンフルエント状態ではほとんど毒性を示さなかったが，薄まき状態になって４０％程度の細胞毒性を示した（ＤＭＳＯ比）。一方でＴＧＦβを処理してＥＭＴを誘導した細胞群では，ほとんどの細胞が死滅した。
（実施例４）移動細胞に対する毒性
光照射に応じて細胞パターニングが可能な機能性基板（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， ２０１２， Ｖｏｉ． ３３， ｐｐ． ２４０９－２４２８；Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，印刷中）を利用して，幾何学的に規定された円形領域（φ＝１５０μｍ）にＭＤＣＫ細胞のコロニーを形成した後，その後に２次照射によって細胞移動を誘導した。この際に，終濃度５０μｇ／ｍｌのナナオマイシンＨおよび０．５％ＤＭＳＯ，５０μｇ／ｍｌのナナオマイシンＨメチルエステル体および０．５％ＤＭＳＯ，もしくはＤＭＳＯのみを添加した培地を用意し，これらの培地中での細胞の移動挙動を，培養装置を装着した位相差顕微鏡下で観察した。
ＤＭＳＯのみを含む培地では，コロニーが拡大していく様子が観察されるが，ナナオマイシンＨやナナオマイシンＨメチルエステル体を添加したほうではコロニー周りの細胞が選択的に死んでいく様子が観察された。ＭＤＣＫ細胞は先導端に上皮間葉転換した細胞を出現させて集団で移動するため，この結果から上皮間葉転換した細胞に特異的に効果をしていることがわかった（図２）。
以上の結果から、ナナオマイシンＨおよびナナオマイシンＨメチルエステル体は上皮間葉転換が誘導された細胞の増殖抑制効果があることが示された。
（実施例５）ナナオマイシンＩ、Ｊ及びＫの取得
スターチ２．４％、グルコース０．１％、ペプトン（極東製薬工業株式会社製）０．３％、カツオエキス（極東製薬工業株式会社製）０．３％、酵母エキス（オリエンタル酵母工業株式会社製）０．５％、炭酸水素カルシウム０．４％からなる液体培地（ｐＨ ７．０）１００ｍＬを含む５００ｍＬ容三角フラスコに６０本に、液体培地で培養したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｋ１５-０５９１（受領番号 ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２３０４）を各１ｍｌずつ植菌し、２７℃で３日間振盪培養した。得られた種培養液を、スターチ５．０％、グリセロール０．５％、脱脂小麦胚芽（日清ファルマ株式会社製）１．０％、ドライ酵母（ＪＴフーズ株式会社製）１％、炭酸水素カルシウム０．５％からなる液体培地（ｐＨ７．０）１００ｍＬを含む５００ｍＬ容三角フラスコに６０本に、各１ｍＬずつ植菌し、２７℃で６日間振盪培養した。
培養の終了した５００ｍＬ容三角フラスコ６０本を遠心分離により菌体と上清に分け、得られた上清をＨＰ-２０カラムに通し、水で洗浄した。吸着物をメタノール３Ｌで溶出し、エバポレーターを用い、濃縮乾固して３．２ｇの粗精製物１を得た。これを少量のメタノールに溶解してシリカゲルに吸着させ、シリカゲル（ＭＥＲＣＫ社製）オープンカラムクロマトグラフィーを用いて、クロロホルム－メタノール溶媒系で段階溶出（５０：１，２５：１，１０：１，６：４，４：６，０：１）させ、ナナオマイシンＩおよびＪを含む４：６画分（粗精製物１）およびナナオマイシンＫを含む０：１００画分（粗精製物２）をそれぞれ１．０２ｇ、０．６５ｇ得た。
粗精製物１を少量のメタノールに溶解し、ＯＤＳ（富士シリシア化学株式会社社製）オープンカラムクロマトグラフィーを用いて、メタノール－水系で溶出（メタノール濃度０％から１００％までの６０分間グラディエント）し、ナナオマイシンＩを含む画分（粗精製物３）を４１６ｍｇ、及びナナオマイシンＪを含む画分（粗精製物４）を１６３ｍｇ得た。粗精製物３をメタノールに溶解し、ＯＤＳ（富士シリシア化学株式会社社製）オープンカラムクロマトグラフィーを用いて、メタノール－水系で溶出（メタノール濃度０％から１００％までの６０分間グラディエント）し、ナナオマイシンＩを含む画分（粗精製物５）を２８ｍｇ得た。粗精製物５を高速液体クロマトグラフィーにてオクタデシルシリルカラム（Ｉｎａｒｔｓｉｌ ＯＤＳ-４，φ１０×２５０ｍｍ，流速４．０ｍＬ／ｍｉｎ，検出ＰＤＡ）に注入し、０．１％ギ酸含有２０％メタノール水で溶出した。保持時間１５分付近のピークを分取し、減圧濃縮によりナナオマイシンＩを淡黄色粉末として９．４ｍｇ得た。粗精製物４をメタノールに溶解し、ＯＤＳ（富士シリシア化学株式会社社製）オープンカラムクロマトグラフィーを用いて、メタノール－水系で溶出（メタノール濃度０％から１００％までの６０分間グラディエント）し、ナナオマイシンＪを含む画分（粗精製物６）を９５ｍｇ得た。粗精製物６を高速液体クロマトグラフィーにてオクタデシルシリルカラム（ＹＭＣ-Ｔｒｉａｒｔ C-１８，φ２０×２５０ｍｍ，流速１０．０ｍＬ／ｍｉｎ，検出ＰＤＡ）に注入し、０．１％ギ酸含有１５％メタノール水で溶出し、ナナオマイシンＪを含む画分（粗精製物７）を得た。粗精製物７を高速液体クロマトグラフィーにてオクタデシルシリルカラム（ＹＭＣ-Ｔｒｉａｒｔ ＰＦＰ，φ１０×２５０ｍｍ，流速４．０ｍＬ／ｍｉｎ，検出ＰＤＡ））に注入し、０．１％ギ酸含有２０％メタノール水で溶出した。保持時間１０分付近のピークを分取し、減圧濃縮によりナナオマイシンＪを淡黄色粉末として５．５ｍｇ得た。粗精製物２を少量のメタノールに溶解し、ＯＤＳ（富士シリシア化学株式会社社製）オープンカラムクロマトグラフィーを用いて、メタノール－水系で溶出（メタノール濃度０％から１００％までの６０分間グラディエント）し、ナナオマイシンＫを含む画分（粗精製物８）を７４ｍｇ得た。粗精製物８を高速液体クロマトグラフィーにてオクタデシルシリルカラム（ＹＭＣ-Ｔｒｉａｒｔ ＰＦＰ，φ１０×２５０ｍｍ，流速４．０ｍＬ／ｍｉｎ，検出ＰＤＡ））に注入し、０．１％ギ酸含有１５％メタノール水で溶出した。保持時間１２分付近のピークを分取し、減圧濃縮によりナナオマイシンＫを橙色粉末として１６．８ｍｇ得た。
得られたナナオマイシンＨ、Ｉ、Ｊ及びＫの理化学的性状を測定した結果、次の通りであった。
ナナオマイシンＩ
（１）性状：淡黄色粉末又は淡黄色非晶質固体
（２）分子量：４８１
（３）分子式：Ｃ２１Ｈ２３ＮＯ１０Ｓ
（４）高分解能質量分析による［Ｍ＋Ｈ］＋ 理論値（ｍ／ｚ）４８２．１１１５、実測値（ｍ／ｚ）４８２．１１２９
（５）比旋光度：［α］Ｄ ２6＝－１４２.７（ｃ＝０．１、メタノール）
（６）紫外部吸収極大（メタノール中）λｍａｘ（ε）：２０４（１５３９２）、２３１（１５９６９）、２６７（ｓｈ）、３５３（５０５０）
（７）赤外部吸収極大νｍａｘ（ＫＢｒ錠）：３４５１，１６４６，１５２７ｃｍ－１に極大吸収を有する
（８）プロトン核磁気共鳴スペクトル：重ジメチルスルホキシド中の化学シフト（ｐｐｍ）を表３に示す。（表中、ｓは一重線、ｄは二重線、ｍは多重線、Ｈはプロトンの数を示す。）
（９）カーボン核磁気共鳴スペクトル：重ジメチルスルホキシド中の化学シフト（ｐｐｍ）を表３に示す。
（１０）溶解性：ＤＭＳＯ、メタノールに易溶。ヘキサン、酢酸エチル及びクロロホルムに難溶。
Figure 0007057945000012
本明細書において、ナナオマイシンＪとは、以下の物性を有する化合物である：
（１）性状：淡黄色粉末又は淡黄色非晶質固体
（２）分子量：６４３
（３）分子式：Ｃ２７Ｈ３４Ｎ２Ｏ１４Ｓ
（４）高分解能質量分析による［Ｍ＋Ｈ］＋ 理論値（ｍ／ｚ）６４３．１８０３、実測値（ｍ／ｚ）６４３．１８３３
（５）比旋光度：［α］Ｄ ２6＝－１２５.５（ｃ＝０．１、メタノール）
（６）紫外部吸収極大（メタノール中）λｍａｘ（ε）：２０４（２４０７５）、２３２（１８７４６）、２６７（ｓｈ）、３５３（５７７８）
（７）赤外部吸収極大νｍａｘ（ＫＢｒ錠）：３４６３，１６４３，１５２７ｃｍ－１に極大吸収を有する
（８）プロトン核磁気共鳴スペクトル：重メタノール中の化学シフト（ｐｐｍ）を表４に示す。（表中、ｓは一重線、ｄは二重線、ｍは多重線、Ｈはプロトンの数を示す。）
（９）カーボン核磁気共鳴スペクトル：重メタノール中の化学シフト（ｐｐｍ）を表４に示す。
（１０）溶解性：ＤＭＳＯ、メタノールに易溶。ヘキサン、酢酸エチル及びクロロホルムに難溶。
Figure 0007057945000013
本明細書において、ナナオマイシンＫとは、以下の物性を有する化合物である：
（１）性状：橙色粉末又は橙色非晶質固体
（２）分子量：５４７
（３）分子式：Ｃ２５Ｈ２９Ｎ３Ｏ９Ｓ
（４）高分解能質量分析による［Ｍ＋Ｈ］＋ 理論値（ｍ／ｚ）５４８．１６９７、実測値（ｍ／ｚ）５４８．１７０９
（５）比旋光度：［α］Ｄ ２6＝－２００.１（ｃ＝０．１、メタノール）
（６）紫外部吸収極大（メタノール中）λｍａｘ（ε）：２０４（１８４８８）、２３５（２６９６７）、３５６（５９０７）
（７）赤外部吸収極大νｍａｘ（ＫＢｒ錠）：３４３２，１６７７，１５２７ｃｍ－１に極大吸収を有する
（８）プロトン核磁気共鳴スペクトル：重ジメチルスルホキシド中の化学シフト（ｐｐｍ）を表５に示す。（表中、ｓは一重線、ｄは二重線、ｍは多重線、Ｈはプロトンの数を示す。）
（９）カーボン核磁気共鳴スペクトル：重ジメチルスルホキシド中の化学シフト（ｐｐｍ）を表５に示す。
（１０）溶解性：ＤＭＳＯ、メタノールに易溶。ヘキサン、酢酸エチル及びクロロホルムに難溶。
Figure 0007057945000014
以上のとおり各種理化学的性状が得られたナナオマイシンＨ、Ｉ、Ｊ及びＫに一致する化合物はこれまで報告されていないことから、これらナナオマイシン類は新規物質であると考えられる。
（実施例６）ＴＧＦ－βにより上皮間葉転換誘導されたＭＤＣＫ（イヌ上皮細胞株）に対するナナオマイシン類縁体の殺活性
細胞培養用ディッシュにＭＤＣＫ細胞を、ＭＥＭ培地（１０％ウシ胎児血清アルブミン、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１％ピルビン酸ナトリウム，１％ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、１％グルタミン）中、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターでセミコンフルエントに維持されるように継代培養を行った。この細胞をトリプシン-ＥＤＴＡ溶液で処理し、終濃度１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－βと０．００１％のＢＳＡを含む前記培地に細胞を播種し、３日間培養した。ブランクとしてＴＧＦ－βを加えず、ＢＳＡのみを添加した培地中で同様に３日間培養した細胞を用意した。これらの細胞を９６ウェルにＭＤＣＫ細胞を６，０００細胞／ウェルおよび２，０００細胞／ウェルで調整した。
それぞれのウェルに終濃度１００μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌになるようにＤＭＳＯに溶解したナナオマイシンＨ（終濃度０．５％ＤＭＳＯ）あるいは終濃度５０μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌになるようにＤＭＳＯに溶解したナナオマイシンＩ、ＪおよびＫ（終濃度０．５％ＤＭＳＯ）を添加して、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養し、形態観察および生細胞定量キット（ＭＴＳアッセイ）で毒性・増殖試験を行った。その結果を図３に示した。ナナオマイシンＨは６，０００細胞／ウェルで調整した試験では１００μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌにＴＧＦ－βにより上皮間葉転換誘導した細胞に対しより高い殺活性を示した。同様に、ナナオマイシンＩ、ＪおよびＫもナナオマイシンＨと同様な効果が認められた。

Claims (4)

  1. 下記式（Ｉ）で表される化合物。
    Figure 0007057945000015
     ［式中、Ｒ１は、Ｃ１～６アルキル基を示し、Ｒ２は、Ｃ１～６アルコキシカルボニル基、カルボキシ基、又は水酸基で置換されたＣ１～６アルキル基を示し、Ｒ３は、以下のいずれかで表される基を示す。］
    Figure 0007057945000016
    Figure 0007057945000017
    Figure 0007057945000018
  2. 請求項１に記載の化合物において、Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２がカルボキシ基である化合物を生産する能力を有する放線菌に属する微生物を培地で培養し、培養物中に該化合物を蓄積せしめ、該培養物から該化合物を採取することを特徴とし、ここで、該化合物を生産する能力を有する放線菌に属する微生物が、ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）Ｋ１５－０５９１（受領番号 ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０２３０４）である、請求項１に記載の化合物において、Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２がカルボキシ基である化合物の製造方法。
  3. 請求項１に記載の化合物を有効成分として含有する、医薬組成物。
  4. 下記式（Ｉ）で表される化合物を有効成分として含有する、上皮間葉転換が誘導された細胞を傷害するための薬剤。
    Figure 0007057945000019
     ［式中、Ｒ１は、Ｃ１～６アルキル基を示し、Ｒ２は、Ｃ１～６アルコキシカルボニル基、カルボキシ基、又は水酸基で置換されたＣ１～６アルキル基を示し、Ｒ３は、以下のいずれかで表される基を示す。］
    Figure 0007057945000020
    Figure 0007057945000021
    Figure 0007057945000022
    Figure 0007057945000023
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Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NAKASHIMA Takuji, et al.，Nanaomycin H: A new nanaomycin analog，Journal of Bioscience and Bioengineering，2017年02月13日，Vol.123, No.6，pp.765-770
NAKASHIMA Takuji, et al.，New compounds, nanaomycin F and G, discovered by physicochemical screening from a culture broth of Streptomyces rosa subsp. notoensis OS-3966，Journal of Bioscience and Bioengineering，2015年，Vol.120, No.5，pp.596-600
TAGUCHI Takaaki, et al.，Structure and biosynthetic implication of 5R-(N-acetyl-L-cysteinyl)-14S-hydroxy-dihydrokalafungin from a mutant of the actVA-ORF4 gene for actinorhodin biosynthesis in Streptomyces coelicolor A3(2)，The Journal of Antibiotics，2015年，Vol.68，pp.481-483
WANG Xiachang, et al.，Frenolicins C-G, Pyranonaphthoquinones from Streptomyces sp. RM-4-15，Journal of Natural Products，2013年，Vol.76，pp.1441-1447

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR101202697B1 (ko) 2010-08-11 2012-11-20 김상운 오탁방지막 구조물

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