JP4608651B2 - 抗ガン作用を有する化合物、その製造方法及び抗ガン剤 - Google Patents
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James D. Dutcher, M. H. Von Saltza and F. E. Pansy, Antimicrob. Agents Chem, 161, 83-88 (1963) Teruyuki Sakai, Kazutoshi Shindo, Atsuo Odagawa, Akashi Suzuki, Hiroyuki Kawai, Kimiko Kobayashi, Yoichi Hayakawa, Haruo Seto and Noboru Otake, J. Antibiot., 48, 899-900 (1994) 河合 弘行、癌と化学療法 24 (11):1571-1577 (1997)
本発明で用いた96穴プレート使用のpolyHEMA培養法は、国立感染症研究所生物活性物質部の深澤、上原らが開発したものである(Hidesuke Fukazawa, Satoshi Mizuno, and Yoshimasa Uehara, Analytical Biochemstry, 228, 83-90 (1995)、Hidesuke Fukazawa, Shuji Nakano, Satoshi Mizuno and Yoshimasa Uehara, Int. J. Cancer, 67, 876-882 (1996))。
放線菌の培養抽出液1,365検体をスクリーニングした結果、富山県射水郡小杉町で採集したアオキの葉から分離したストレプトミセス・エスピー(Streptomyces sp.)TP-A0648に、足場非依存性増殖阻害活性が見出され、TP-A0648株の培養物から、下記化合物が活性物質として単離・精製された。
新規抗癌物質TT2149の生産菌
放線菌の培養抽出液1,365検体をスクリーニングした結果、富山県射水郡小杉町で採集したアオキの葉から分離したストレプトミセス・エスピー(Streptomyces sp.)TP-A0648に、足場非依存性増殖阻害活性が見出された。
TP-A0648株は富山県立大学工学部生物工学研究センター古米研究室において、富山県射水郡小杉町で採取されたアオキ(Aucuba japonica Thunb)の葉から分離された。
本菌株の分類学的検討を行うに際して、ShirlingおよびGottliebによって提唱されたISP(International Streptomyces Project)の方法(Shirling, E.B & D. Gottlieb, International Journal of Systematic Bacteriology, 16, 313-340 (1996)、Waksman, S. A. (Eds.) : 2, pp 328-334, The Williams & Wilkins Co., Baltimore (1961))に従い、培地にはISP培地を用いて20日間にわたって観察を行った。また、観察した色調は日本研事業(株)財団法人日本色彩研究所編「色名事典」(1987)に従い記載した。加えて、走査型電子顕微鏡による菌糸の観察も行った。
TP-A0648株は寒天培地上で灰色系の気菌糸を形成した。電子顕微鏡観察によって、気菌糸の形態は、表面平滑ならせん状形態で、胞子が50個以上連鎖していることが観察された。
各種寒天培地上における気菌糸、基底菌糸、可溶性色素、生育状態を表1に示す。
生育はISP-2, 4, 5, 7培地にて良好であった。基底菌糸の色調は薄い灰色から濃い灰色、黄白色を示した。可溶性色素の形成は認められなかった。
a)生育温度範囲
温度勾配インキュベータを用いて生育温度範囲を観察した結果、以下のような生育温度範囲を示した。
生育温度範囲 15〜37℃
気菌糸形成範囲 22〜36℃
生育至適温度 32〜33℃
また10〜14℃、37〜50℃の範囲では生育が認められなかった。
TP-A0648株の平板培地上における各種糖の利用能実験を行った。
糖源としてD-グルコース、L-アラビノース、D-マンニトール、D-キシロース、D-フルクトース、ラフィノース、L-ラムノース、イノシトール、スクロースの計9種類の糖を用いた。本実験にはISP-9培地を基礎培地として、これに各種糖を加えた。
9種類の糖のうち5種類の糖にて生育が確認された。生育が非常に良かったのはD-グルコースで、次に良かったのはD-フルクトース、D-キシロース、イノシトールであった。またL-アラビノースでも生育は微弱ではあるが確認されたが、L-ラムノース、D-マンニトール、サッカロース、ラフィノースでは生育が確認されなかった。
a)細胞壁アミノ酸分析
LechbalierおよびStaneckらの方法(Lechevalier, H. A. & M. P. Lechevalier, The Actinomycetes, Ed., H. Prauser, 393〜405, Jena, Gustav Fischer Verlag (1970)、
Stanech, J. L. & G. D. Roberts, Microbiol., 28, 226〜231 (1974))を用いて、細胞壁のペプチドグリカンの構成アミノ酸の分析を行い、ストレプトミセス(Streptomyces)属と同じLL-ジアミノピメリン酸を検出した。
上記LechbalierおよびStaneckらの方法を用いて、菌体中に含まれる糖の分析を行い、リボース、マンノース、グルコースおよびキシロースが検出された。
16S rDNA塩基配列法は安定に保存された性状で、解析はデータベースと照合することにより、簡便で迅速に解析することが出来るようになり、放線菌の分類を行う上で重要視されている。分析の結果、ストレプトミセス・テルモバイオラセウス(Streptomyces thermoviolaceus)と1471塩基対中1433塩基が一致し、相同性は97.42%であった。
以上の分類学的分析の結果から、本菌株をストレプトミセス・テルモバイオラセウス(Streptomyces thermoviolaceus) TP-A0648と同定した。
1)TP-A0648株の培養
a)前培養
前培養培地にはV-22を用いた。培地組成はグルコース0.5%、トリプトン0.5%、スターチ1.0%、K2HPO4 0.1%、NZ-ケース0.3%、CaCO3 0.3%、イーストエキス0.2%で、これらの試薬を順番に熱した水道水に溶解し、1N-NaOHを用いてpHを7.0に調整した。次に、500 ml容K型フラスコに培地100 mlを分注しウレタン栓で栓をし、オートクレーブで121℃、20分間滅菌した。その後TP-A0648株をスラントから白金耳で接種し、30℃で4日間、200 rpmで回転振盪培養を行った。
培地組成はコーンスティープリカー 1.5%、マルトース 4.5%、HP-20 1.0%で、これらの試薬を順番に熱した水道水に溶解し、6N-NaOHを用いてpHを7.0に調整した。次に、500 ml容K型フラスコに培地100 mlを分注しウレタン栓で栓をし、オートクレーブで121℃、20分間滅菌した。その後、前培養を行った種母菌3 ml(3% v/v)を各々のフラスコに加え、30℃で3日間、200 rpmで回転振盪培養を行った。
a)抽出
培養終了後、培養液(80L, K型フラスコ800本)を等量の酢酸エチル(10L)で1時間攪拌抽出した。次に、濾紙で減圧ろ過し菌体を取り除いた後、酢酸エチル層を取り出し、エバポレーターにて濃縮乾固した。
酢酸エチル抽出物(6.8 g)をクロロホルムに溶解し、クロロホルムで充填したシリカゲルカラム(17g)に吸着させた。溶出にはクロロホルム(C) : メタノール(M)=100 : 0,10 : 1, 5 : 1, 2 : 1, 1 : 1, 0 : 100の順に各フラクション約70 mlずつ流した。活性成分は、C : M=2 : 1〜1 : 1の2フラクションに検出された。その2フラクションをエバポレーターにて濃縮乾固し、粗精製物質600 mgが得られた。なお、得られた5本のピークをHPLC保持時間の早い順にTT2149-A, B, C, D, Eと命名した(図1)。
HPLC:HP1100シリーズ
カラム:XTerraTMRP185 μm, 4.6×250 mm column
溶出液:アセトニトリル (C)
炭酸水素アンモニウム(NH4HCO3) 10 mM pH 8.0 バッファー(B)
(NH4HCO3 0.79g を1Lに溶解する。pH無調整)
溶媒比:C:B=40:60
流速:0.7 ml/min
次に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって得られた粗精製物から、HPLC分取により活性物質を単離した。
カラムはXTerraTMRP18(Waters, 7μm, 19×300mm)Columnを用い、流速15 ml/min、溶出液にはアセトニトリル:炭酸水素アンモニウム10mMバッファー(pH8.0)=40:60で溶出した。これにより活性成分TT2149-A〜Eを分離し、それぞれをフラクションコレクターによって分画した。
その結果、TT2149-A, B, C, D, Eをそれぞれ1.2mg, 2.0mg, 3.3 mg, 0.5mg, 0.5mg得た。
単離したTT2149-A, B, Cの純度と分子量をLC / MSとHPLCを用いて調べた。TT2149-Cに関してはLC / MSとHPLCの双方で純粋であった。しかしTT2149-A, Bの両成分はLC/MS分析において、それぞれ2成分に分離し、TT2149-Aでは先に溶出する成分が分子量565、後に溶出するほうが分子量637であると推定された。また、TT2149-Bでは、保持時間が非常に近い2種の混合物であり、分子量635と594であった。TT2149-Cの分子量は619と推定された。
1)TT2149-CのNMR解析
TT2149-Cの構造を各種機器分析により解析した(図2〜9)。1H, 13C-NMR、各種二次元NMR解析を行い、本物質の構造を以下に示すように決定した。本物質はスピカマイシンの新規類縁体である。また、本化合物の旋光度は[α]D+19.2(c 0.17, methanol)であり、スピカマイシンの値と符号が一致し、絶対値が近いものであったことから、絶対配置は同一であると結論した。
TT2149-Cの各種物理化学的性質を表3に示した。本物質はメタノール, DMSOに可溶で、白色の粉体として得られた。高分解能高速原子衝突質量分析(HRFAB-MS)では、観測値620.3776に対し、計算値が620.3772(C30H50N7O7)であったことより、分子式をC30H49N7O7と決定した。またこの分子式はNMRで決定したTT2149-Cの構造と一致した。
1)TT2149-Cの足場非依存性増殖阻害活性
ヒト卵巣癌細胞SKOV-3とヒト大腸癌細胞DLD-1の増殖に及ぼすTT2149-Cの効果を、poly-HEMA処理したシャーレ(HEMA)と非処理シャーレ(solid)において調べた。対照化合物として、類縁化合物であるスピカマイシンとセプタシジンを用いた。その結果、3化合物ともpoly-HEMAプレート上での癌細胞の増殖を非処理プレート上での増殖と比べ強く阻害した。しかし、活性の強弱に関しては大きな差は見られなかった(表5)。
TT2149-Cについて、(財)癌研究会癌化学療法センターのヒト培養癌細胞パネル(HCCパネル)において、抗癌活性評価を行った。HCCパネルは、1990年前後より米国国立研究所(NCI)で実地されてきたもので、この方法は、数十系の細胞での薬剤感受性試験と特別なデーターベースプログラムによる解析手法をドッキングさせたものである。
本研究に用いられたHCCパネルは、肺癌7系、胃癌6系、大腸癌5系、卵巣癌5系、脳腫瘍6系、乳癌5系、腎癌2系、前立腺癌2系、メラノーマ1系の計39系よりなる。これらを1つのパネルとして扱い、in vitro薬剤感受性試験を行い、その薬剤に対する感受性パターン(Finger Print)を得る。この系により、既存の抗癌剤と異なる作用様式の化合物を選別でき、また化合物の作用様式の推定を行える。
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