JP3066166B2

JP3066166B2 - 新規化合物ｈｃ３４、その使用および製造

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Publication number: JP3066166B2
Application number: JP1944892A
Authority: JP
Inventors: 藤一敏新; 勝上正原
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 1992-01-08
Filing date: 1992-01-08
Publication date: 2000-07-17
Anticipated expiration: 2015-07-17
Also published as: JPH05186493A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】〔発明の背景〕

【産業上の利用分野】本発明は新規物質に、さらに詳し
くは抗腫瘍性を有する新規化合物ＨＣ３４に関する。

【０００２】

【従来の技術】抗腫瘍物質に関しては、既に多数のもの
が医薬として実用化されている。一般に、化学物質の生
理活性はその化学構造に依存するところが大きいため、
抗腫瘍性を有する新規な化合物に対しては、不断の希求
があると言えよう。

【０００３】〔発明の概要〕

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の希求
に応えるものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明による
新規化合物は、次式（Ｉ）で示される化合物ＨＣ３４ま
たはその付加塩である。本発明は、また、この物質の使
用に関する。すなわち、本発明による抗腫瘍剤は、次式
（Ｉ）で示される化合物ＨＣ３４またはその付加塩を有
効成分として含むものである。本発明は、さらにまた、
この物質の製造法に関する。すなわち、本発明による次
式（Ｉ）で示されるＨＣ３４の製造法は、ストレプトミ
セス属に属しＨＣ３４の生産能を有する菌株を適当な培
地で好気的に培養し、その培養物よりＨＣ３４を得るこ
と、を特徴とするものである。

【化４】

【０００５】〔発明の具体的説明〕新規化合物ＨＣ３４１）化学構造本発明による新規化合物ＨＣ３４は、前記の式（Ｉ）で
示される化学構造を有する。この化学構造は、次のよう
にして決定されたものである。後述するように、ＨＣ３
４の分子式は、Ｃ₃₀Ｈ₄₈Ｏ₄Ｎ₂である。本データおよ
びＨＣ３４のプロトン核磁気共鳴スペクトル（図１）お
よび炭素１３核磁気共鳴スペクトル（図２）の解析、さ
らにＨＭＢＣ（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒｍｕｌｔ
ｉｐｌｅｂｏｎｄｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）実験
を行なうことにより、ＨＣ３４の構造を前記式（Ｉ）の
ように決定した。２）物理化学的性状 (1) 外観：白色粉末 (2) 融点：１５１−１５３℃（分解） (3) 比旋光度〔α〕²²D （ｃ０．１、メタノール中）：
−３° (4) ＦＡＢ−マススペクトル（ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ）⁺
501 (5) 高分解ＦＡＢ−マススペクトル（ｍ／ｚ）：（Ｍ＋
Ｈ）⁺ 計算値：501.3692（Ｃ₃₀Ｈ₄₉Ｏ₄Ｎ₂）、実測値：501.
3697 (6) 紫外吸収スペクトル λmax nm（ε）：メタノール中：235(35000)、240(35800)、268(13700) (7) 赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ錠）：図３に示す。 (8) プロトン核磁気共鳴スペクトル（500 メガヘルツ、
重ピリジン中）：図１に示す。 (9) 炭素１３核磁気共鳴スペクトル（125 メガヘルツ、
重ピリジン中）：図２に示す。 (10)ＨＭＢＣスペクトル（重ピリジン中）：図４に示
す。 (11)溶解性：クロロホルム、メタノール、ピリジン、ジ
メチルスルホキシド、酢酸エチルに可溶。水、ヘキサ
ンに不溶。 (12)Ｒf 値（メルク社製〔シリカゲル６０Ｆ₂₅₄〕使
用）：クロロホルム−メタノール（４：１）０．４２式（Ｉ）で示される化合物は、塩基性の窒素原子の位置
において酸付加塩があり得る。本発明化合物は、これら
の付加塩をも包含するものである。酸付加塩を形成すべ
き酸としては、例えば無機酸、例えば塩酸、硫酸、硝
酸、リン酸など、あるいは有機酸、例えば酢酸、プロピ
オン酸、マレイン酸、オレイン酸、パルミチン酸、クエ
ン酸、コハク酸、酒石酸、フマル酸、グルタミン酸、パ
ントテン酸、ラウリルスルホン酸、などをあげることが
できる。なお、酸付加塩を医薬として使用する場合に
は、酸は薬学上許容されるものでなければならない。

【０００６】ＨＣ３４の製造１）概要化合物ＨＣ３４は現在のところ微生物の培養によっての
み得られているが、類縁化合物の合成化学的修飾によっ
て製造することも、あるいは全合成化学的に製造するこ
ともできよう。また、遺伝子工学的手法によることもで
きよう。即ち、化合物ＨＣ３４の産生に関与する遺伝子
を適当な微生物に導入し、この様な形質転換微生物を培
養し、この培養物から得ることも可能であろう。微生物
の培養による場合の菌株としては、例えば、ストレプト
ミセス属に属するＨＣ３４生産能を有するものが使用さ
れる。具体的には、本発明者らの分離した Streptomyce
s sp. ＨＣ３４株がＨＣ３４を生産することが本発明者
らによって明らかにされているが、その他の菌株につい
ては、抗生物質生産菌単離の常法によって適当なものを
自然界より分離することが可能である。また、Streptom
yces sp. ＨＣ３４株を含めてＨＣ３４の生産菌を放射
線照射その他の変異処理に付して、ＨＣ３４の生産能を
高める余地も残されている。遺伝子工学的手法もまた可
能であることは前記したところである。化合物ＨＣ３４
は、常法によって前記したような酸付加塩の形にするこ
とができる。

【０００７】２）ＨＣ３４株ＨＣ３４生産能を有するストレプトミセス属の菌株とし
て本発明者らの見出しているＨＣ３４株は、下記の内容
のものである。 (1) 由来および寄託番号ＨＣ３４株は、群馬県桐生市で採取した土壌から分離さ
れたものであり、平成３年１２月１６日に工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託されて、「微工研条寄第３６
８０号」（FERM BP-３６８０）の番号を得ている。 (2) 菌学的性状ＨＣ３４株の菌学的性状は以下の通りである。 (i) 形態ＨＣ３４株は、グリセロール・アスパラギン寒天培地で
の生育は貧弱であり、チロシン寒天培地および栄養寒天
培地では中程度であるが、シュクロース硝酸塩寒天培
地、グルコース・アスパラギン寒天培地、スターチ無機
塩寒天培地、イースト・麦芽寒天培地、および、オート
ミール寒天培地では良く生育する。気菌糸の着生は、グ
ルコース・アスパラギン寒天培地、スターチ無機塩寒天
培地、イースト・麦芽寒天培地およびオートミール寒天
培地で良く生育する。基生菌糸より生じた気菌糸は、単
純分枝をなして伸長し、胞子の連鎖は１０−５０個程度
で、胞子鎖は直鎖およびループ状である。胞子形は円筒
形または長円形で大きさは、０．５〜０．７×０．７〜
１．６μｍであり、その表面は平滑である。胞子嚢、鞭
毛胞子、菌核などの特殊形態は認められない。 (ii)各種培地上の生育ＨＣ３４株を各種培地に２７℃、３週間培養した結果
は、表１に示す通りである。 (iii) 生理的性質ＨＣ３４の生理的性質は、表２に示す通りである。 (iv)炭素源の利用性ＨＣ３４の炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒
天培地上）は、表３に示す通りである。 (v) ジアミノピメリン酸の分析細胞壁構成のアミノ酸の１つである、ジアミノピメリン
酸を分析した結果、ＬＬ−ジアミノピメリン酸が検出さ
れた。以上の菌学的性状を要約すると、次の通りである。 (1) 胞子鎖は直鎖、またはループ状で、胞子の表面は平
滑である。 (2) 気菌糸の着生は、グルコース・アスパラギン寒天培
地、スターチ無機塩寒天培地、イースト・麦芽寒天培地
およびオートミール寒天培地上で良好である。また、そ
の色は灰味黄緑〜明るいオリーブ灰〜明るい緑味灰であ
り、裏面の色は緑味白〜暗い黄茶〜黄味白〜ピンク白〜
にぶ赤紫〜暗い赤〜赤紫を示す。 (3) チロシン寒天培地、ペプトン・イースト・鉄寒天培
地、トリプトン・イースト液体培地のいずれでも、メラ
ニン様色素は認められないが、うす赤色の可溶性色素が
認められる。 (4) Ｌ−ラムノース、および、ソルビトールは、資化さ
れない。

【０００８】表１培地生育気菌糸裏面色可溶性色素シュクロース・良好中程度緑味白なし硝酸塩寒天培地青味白グルコース・アス良好良好緑味白なしパラギン寒天培地灰味黄緑グリセロール・貧弱貧弱ピンク白なしアスパラギンピンク白寒天培地スターチ無機塩良好良好にぶ赤紫うす赤寒天培地明るいオリーブ灰チロシン寒天培地中程度貧弱暗い黄茶うす赤暗い黄茶栄養寒天培地中程度貧弱黄味白なし黄味白イースト・麦芽良好良好暗い赤うす赤寒天培地明るい緑味灰オートミール良好良好赤紫うす赤寒天培地明るい緑味灰

【０００９】表２生育温度８〜３０℃ メラニン様色素チロシン寒天培地陰性ペプトン・イースト・鉄寒天培地陰性トリプトン・イースト液体培地陰性スターチの加水分解陰性ゼラチンの液化陰性脱脂乳の凝固陰性脱脂乳のペプトン化陰性硝酸塩の還元能陰性

【００１０】表３糖利用性Ｌ−アラビノース ± Ｄ−キシロース＋Ｄ−グルコース＋Ｄ−フラクトース＋シュクロース＋イノシトール＋Ｌ−ラムノース − ラフィノース ± Ｄ−マンニトール＋ガラクトース＋ソルビトール − Ｄ−マンノース＋マルトース＋

【００１１】上記性状をＩＳＰ（インターナショナル・
ストレプトミセス・プロジェクト）の記載（E.B.Shirli
ng and D.Gottlieb:Int.J.Syst.Bact)、および、バージ
ーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリ
オロジー(Bergey's Manualof Systematic Bacteriolog
y) の記載と対比し、ストレプトミセス属に属する菌株
であると同定した。本菌株は、Streptomyces sp. ＨＣ
３４として、工業技術研究所に寄託された（微工研条寄
第３６８０号（FERM BP-３６８０））。

【００１２】培養／ＨＣ３４の生産化合物ＨＣ３４は、ストレプトミセス属に属するＨＣ３
４生産菌を適当な培地で好気的に培養し、その培養物か
ら目的物を採取することにより製造することができる。
培地は、ＨＣ３４生産菌が利用し得る任意の栄養源を含
有するもので有り得る。具体的には、例えば、炭素源と
してグルコース、シュークロース、マルトース、ポテト
スターチ、コーンスターチおよび油脂類などが使用で
き、窒素源として大豆粉、綿実粕、乾燥酵母、酵母エキ
ス、ソヤフレークおよびコーンスティープリカーなどの
有機物ならびにアンモニウム塩または硝酸塩、例えば硫
酸アンモニウム、硝酸ナトリウムおよび塩化アンモニウ
ムなどの無機物が利用できる。また、必要に応じて、塩
化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化
コバルト、燐酸塩、重金属塩など無機塩類を添加するこ
とができる。発酵中の発泡を抑制するために、常法に従
って適当な消泡剤、例えばシリコーン油を添加すること
もできる。培養方法としては、一般に行なわれている抗
生物質の生産方法と同じく、好気的液体培地培養法が最
も適している。培養温度は、２０〜３０℃が適当である
が、２５〜３０℃が好ましい。この方法でＨＣ３４の生
産量は、振盪培養、通気攪拌培養ともに培養５−７日間
で最高に達する。このようにして、ＨＣ３４の蓄積され
た培養物が得られる。培養物中では、ＨＣ３４はその一
部は培養濾液中に存在するが、その大部分は菌体中に存
在する。このような培養物からＨＣ３４を採取するに
は、合目的的な任意の方法が利用可能である。その一つ
の方法は、抽出の原理に基づくものであって、具体的に
は、培養濾液中のＨＣ３４についてはこれを水不混和性
のＨＣ３４用溶媒（前記ＨＣ３４の物理化学的性状の項
参照）、例えば酢酸エチルなどで抽出する方法、あるい
は菌体内のＨＣ３４については濾過、遠心分離などで得
た菌体集体をメタノール、エタノール、アセトンなどで
処理して回収する方法などがある。菌体を分離せずに培
養物そのままを上記の抽出操作に付すこともできる。適
当な溶媒を用いた向流分配法も抽出の範疇に入れること
ができる。培養物からＨＣ３４を採取する他の一つの方
法は、吸着の原理に基づくものであって、既に液状とな
っているＨＣ３４含有物、例えば培養濾液あるいは上記
のようにして抽出操作を行なうことにより得られる抽出
液を対象として、適当な吸着剤、例えばシリカゲル、活
性炭、「ダイヤイオンＨＰ−２０」（三菱化成社製）な
どを用いて目的のＨＣ３４を吸着させ、その後、適当な
溶媒にて溶離させることによって、ＨＣ３４を得ること
ができる。このようにして得られたＨＣ３４溶液を減圧
濃縮乾固すれば、ＨＣ３４粗標品が得られる。このよう
にして得られたＨＣ３４の粗標品を更に精製するために
は、上記の抽出法および吸着法にゲル濾過法、高速液体
クロマトグラフィーなどを必要に応じて組合せて必要回
数行なえばよい。例えば、シリカゲルなどの吸着剤、
「セファデックスＬＨ−２０」（ファルマシア社製）な
どのゲル濾過剤を用いたカラムクロマトグラフィー、
「ＹＭＣパック」（山村科学社製）などを用いた高速液
体クロマトグラフィーおよび向流分配法を適宜組合せて
実施することができる。具体的には、例えば、ＨＣ３４
粗標品を「セファデックスＬＨ−２０」カラムに付し、
クロロホルム−メタノール（１：１）混合液で活性画分
を溶出させ、濃縮乾固するとＨＣ３４の純品が得られ
る。得られる粗精製あるいは精製ＨＣ３４は、必要に応
じ、常法によって前記したような酸付加塩あるいは塩基
付加塩の形にすることができる。

【００１３】ＨＣ３４の用途本発明による化合物ＨＣ３４は、抗腫瘍活性を有すると
いう点で有用である。１）生物活性 (1) in vitro抗腫瘍活性マウスの腫瘍細胞であるＰ３８８細胞を使用した。Ｕ底
９６穴マイクロプレートを用い、培地で被試験物質を順
次に段階希釈し、５×１０³／ウェルの細胞を加え、５
％ＣＯ₂インキュベーター中、３７℃で２日間培養後、
細胞数をカウントした。細胞数がコントロールの５０％
に減少した濃度をＩＣ₅₀（μｇ／ml）とした。培地は、
ＲＰＭＩ１６４０に牛胎児血清（１０％）、ペニシリ
ン（１００Ｕ／ｍｌ），ストレプトマイシン（１００μ
ｇ／ml），２−メルカプトエタノール（５．０×１０^-5
Ｍ）を加えたものを使用した。被験物質は水に難溶なの
で、メタノールに溶解後、培地で希釈した。結果：ＩＣ₅₀ ０．３μｇ／ml (2) in vivo 抗腫瘍効果ヒト大腸癌であるＣｏ３をヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ
ｎｕ／ｎｕ，メス、６週齢）の皮下に移植し、腫瘍が
１００mm³程度になった時点で各群の腫瘍体積の平均が
均一になるように１群５匹ずつ群分けし、ＨＣ３４をそ
れぞれの濃度で静脈内に５日間連続投与した。投与開始
日の腫瘍の大きさを１としたときの無処置の対照群の１
６日目の腫瘍の大きさをＣ₁₆，処置群の大きさをＴ₁₆と
し、腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩＲ）＝（１−Ｔ₁₆／Ｃ₁₆）
×１００を求めた。この結果は表４に示されている。表４ＨＣ３４のＣｏ３に対する腫瘍増殖抑制効果投与量（mg／kg／日）ＴＧＩＲ（％）８６５２５２

【００１４】２）抗腫瘍剤このように、本発明のＨＣ３４は悪性腫瘍に対して抗腫
瘍性を示すことが明らかにされた。従って、本発明化合
物は、抗腫瘍剤もしくは腫瘍治療剤として使用すること
ができる。抗腫瘍剤としての本発明化合物は、合目的的
な任意の投与経路、具体的には、動物の場合には腹腔内
投与、皮下投下、静脈または動脈への血管内投与および
注射による局所投与などの方法が、またヒトの場合は静
脈内投与、動脈内投与、注射による局所投与、腹腔、胸
腔への投与、経口投与、皮下投与、筋肉内投与、舌下投
与、経皮吸収または直腸投与により投与することができ
る。本発明化合物を薬剤として投与する場合は、投与方
法、投与目的によって決まる適当な剤型、具体的には、
注射剤、懸濁剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、軟
膏剤、クリーム剤等の形態で投与することができる。こ
れらの製剤を製造するには、製薬上許容される担体ある
いは希釈剤等、具体的には溶剤、可溶化剤、等張化剤、
保存剤、抗酸化剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、安定剤等
を添加することができる。溶剤としては、例えば水、生
理食塩水等が、可溶化剤としては、例えばエタノール、
ポリソルベート剤が、賦形剤としては、例えば乳糖、デ
ンプン、結晶セルロース、マンニトール、マルトース、
リン酸水素カルシウム、軽質無水ケイ酸、炭酸カルシウ
ム等が、結合剤としては、例えばデンプン、ポリビニル
ピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセ
ルロース、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム
等が、崩壊剤としては、例えばデンプン、カルボキシメ
チルセルロースカルシウム等が、滑沢剤としては、例え
ばステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油等が、安
定剤としては、例えば乳糖、マンニトール、マルトー
ス、ポリソルベート類、マクロゴール類、ポリオキシエ
チレン硬化ヒマシ油等があげられる。また、必要に応じ
て、グリセリン、ジメチルアセトアミド、７０％乳酸ナ
トリウム、界面活性剤、塩基性物質（例えば、エチレン
ジアミン、エタノールアミン、炭酸ナトリウム、アルギ
ニン、メグルミン、トリスアミノメタン）を添加するこ
ともできる。これらの成分を用いて、注射剤、錠剤、顆
粒剤、カプセル剤等の剤型に製造することができる。本
発明化合物の投与量は、動物実験の結果および種々の状
況を勘案して、連続的または間欠的に投与したときに総
投与量が一定量を越えないように定められる。具体的な
投与量は、投与方法、患者または被処理動物の状況、例
えば年齢、体重、性別、感受性、食事（食餌）投与時
間、併用する薬剤、患者またはその病気の程度に応じて
変化することは言うまでもなく、また一定の条件のもと
における適量と投与回数は、上記指針をもととして専門
医の適量決定試験によって決定されなければならない。
具体的には、成人１日あたり０．０１mg−５００mg程
度、好ましくは０．１mg−１００mg程度である。

【００１５】〔実験例〕

【実施例】

(1) 培養使用した培地は、下記の組成の成分を１リットルの水に
溶解して、ｐＨ７．１に調整したものである。ポテトスターチ３０ｇソヤフレーク１５ｇ酵母エキス２ｇコーンスティープリカー５ｇＮａＣｌ３ｇＭｇＳＯ₄．７Ｈ₂Ｏ０．５ｇＣｏＣｌ₂．６Ｈ₂Ｏ５mg ＣａＣＯ₃ ３ｇ５００mlのイボつき三角フラスコに上記組成の培地を１
００mlずつ加え、滅菌後これにストレプトミセスsp. Ｈ
Ｃ３４株をスラントより１白金耳接種し、ロータリーシ
ェーカーで２７℃で５日間振盪培養した。 (2) ＨＣ３４の採取上記の条件で培養後、培養液（３リットル）を遠心分離
し、上清と菌体に分離した。菌体は２リットルのアセト
ンで抽出し、抽出液を濃縮してアセトンを除いた後、上
清と合わせた。これをｐＨ１０に調製し１リットルの酢
酸エチルで３回抽出し、濃縮乾固した。抽出物をシリカ
ゲル（和光純薬社製「ワコーゲルＣ２００」）のカラム
に吸着させ、クロロホルム−メタノール（１０：１）混
合液で溶出した。活性フラクションを濃縮乾固した後、
これをセファデックスＬＨ２０を用いたクロマトグラフ
ィー（溶媒：クロロホルム−メタノール（１：１））で
展開した。活性フラクションを濃縮乾固してＨＣ３４の
純品２５mgを得た。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＣ３４の重ピリジン中における５００メガヘ
ルツプロトン核磁気共鳴スペクトルを模写したものであ
る。

【図２】ＨＣ３４の重ピリジン中における１２５メガヘ
ルツ炭素１３核磁気共鳴スペクトルを模写したものであ
る。

【図３】ＨＣ３４のＫＢｒディスク法による赤外吸収ス
ペクトルを模写したものである。

【図４】ＨＣ３４の重ピリジン中におけるＨＭＢＣスペ
クトルを模写したものである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:465） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07H 1/00 - 23/00 A61K 31/00 - 49/00 A61P 1/00 - 43/00 C12P 19/600 - 19/64 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】次式（Ｉ）で示される化合物ＨＣ３４また
はその付加塩。【化１】
【請求項２】次式（Ｉ）で示される化合物ＨＣ３４また
はその付加塩を有効成分として含む抗腫瘍剤。【化２】
【請求項３】ストレプトミセス属に属し、ＨＣ３４の生
産能を有する菌株を適当な培地で好気的に培養し、その
培養物より化合物ＨＣ３４を得ることを特徴とする、次
式（Ｉ）で示されるＨＣ３４の製造法。【化３】