JPH09295976A - 神経保護作用物質ｃｕ３９、その製造法および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 神経細胞保護剤として有効な化合物を提供す
る。 【解決手段】 次式（Ｉ）で示される化合物ｃｕ３９ま
たはその塩。 【化１】 ストレプトミセス属に属し、化合物ｃｕ３９の生産能を
有するｃｕ３９生産菌を培養し、培養物からｃｕ３９を
採取することを特徴とする上記式（Ｉ）で示される化合
物ｃｕ３９の製造法。上記の化合物ｃｕ３９またはその
塩を含有してなる医薬組成物、特に神経細胞保護剤、脳
細胞変性抑制剤もしくは脳細胞壊死抑制剤。 【効果】 化合物ｃｕ３９は神経細胞保護作用を有して
おり、特に神経細胞保護剤、脳細胞変性抑制剤もしくは
脳細胞壊死抑制剤として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】〔発明の背景〕

【発明の属する技術分野】本発明はグルタミン酸毒性の
抑制作用を有し、神経細胞保護作用を有する新規生理活
性物質ｃｕ３９、その製造法および使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】脳梗塞、脳卒中、心拍動の停止、脳損傷
などから生じる脳虚血、あるいは酸素欠乏症により引き
起こされる脳神経細胞の変性および壊死は、興奮性アミ
ノ酸であるグルタミン酸、アスパラギン酸が原因である
と考えられている。現在までこれら脳神経細胞の変性お
よび壊死を抑制する手段として、グルタミン酸の拮抗剤
の探索に多くの努力が払われてきたにもかかわらず、有
効で満足すべき薬剤が今なお見出し得ないのが現状であ
る。

【０００３】〔発明の概要〕

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記の希求に
応え、グルタミン酸の毒性による細胞壊死の抑制に有効
な化合物を創製し、特に神経細胞保護剤として有用な化
合物を提供することを目的とするものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】Ｎ−１８−ＲＥ−１０５
細胞系（neuroblastoma-primary retina hybrid cells
）に対してグルタミン酸を添加すると、シスチンの細
胞内取り込みが阻害され、それにともないグルタチオン
の細胞内濃度の減少を引き起こし、細胞の酸化ストレ
ス、すなわち細胞内の活性酸素、過酸化物の蓄積を生じ
させ、その結果、細胞の変性、壊死をもたらすと考えら
れている（Neuron, 2, 1547(1989) 、J. Pharmacol.Ex
p.Ther., 250, 1132(1989) ）。本発明者等はこの評価
系を用い、グルタミン酸に起因する細胞壊死を抑制する
化合物を鋭意探索した結果、新規生理活性物質ｃｕ３９
が細胞壊死を抑制する作用を有することを見出し、この
知見に基づきさらに検討を加えて本発明を完成させるに
至った。

【０００５】すなわち、本発明による新規化合物は下式
（Ｉ）で示されるものである。本発明はまた、この化合
物の製造法にも関する。すなわち、本発明による下式
（Ｉ）で示される化合物ｃｕ３９の製造法は、ストレプ
トミセス属に属し、化合物ｃｕ３９の生産能を有するｃ
ｕ３９生産菌を培養し、培養物からｃｕ３９を採取する
ことを特徴とするものである。本発明は更に、この化合
物の用途、具体的には医薬組成物、特に神経細胞保護
剤、脳細胞変性抑制剤および脳細胞壊死抑制剤に関す
る。すなわち、本発明による上記医薬は、下式（Ｉ）で
示される化合物ｃｕ３９またはその塩を有効成分として
含有してなるものである。

【化３】

【０００６】〔発明の具体的説明〕

【発明の実施の形態】新規化合物ｃｕ３９ 上記式（Ｉ）で示される新規化合物ｃｕ３９は、後述の
ようにグルタミン酸毒性の抑制作用を有し、神経細胞保
護作用を有する新規生理活性物質である。このような特
性により、本発明の化合物ｃｕ３９は医薬組成物、特に
脳神経細胞の変性による疾患の予防剤もしくは治療剤と
して有用である。

【０００７】１） 化学構造 本発明の新規化合物ｃｕ３９は、該ｃｕ３９のプロトン
核磁気共鳴スペクトル、炭素１３核磁気共鳴スペクト
ル、紫外部吸収スペクトル、赤外部吸収スペクトル、及
び質量分析スペクトルを詳細に検討した結果、決定され
たものである。

【０００８】２） 物理化学的性質 （１）外観 黄色粉末 （２）融点 １８４〜１８６℃ （３）溶解性 酢酸エチル、アセトン、クロロホルム、
メタノール、エタノールに易溶。 （４）Ｒｆ値 ０．２（ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ＝５０：
１），Merck Kieselgel ６０Ｆ₂₅₄ （５）ＨＲＦＡＢ−ＭＳスペクトル（ｍ／ｚ） 観測値 ３７９．１１９８（Ｍ＋Ｈ）⁺ 計算値 ３７９．１１８２ （６）比旋光度 ［α］²¹ _Ｄ （ｃ ０．０２，ＭｅＯ
Ｈ）−２．５゜ （７）紫外部吸収スペクトル 図１（ＭｅＯＨ）および図２（ＭｅＯＨ＋ＮａＯＨ）に
示す。 λ_max ^MeOHｎｍ（ε） ２０８（15,400），２３
９（28,100），２６６（13,500），４０６（4,700 ） λ_max ^MeOH+NaOH ｎｍ（ε） ２４０（24,100），３２
８（4,500 ）５１７（2,500 ） （８）赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒディスク法） 図３に示す。 Ｖ_max （ｃｍ^-1） ３４９０，１６７５（ｓｈ），１６
５０，１５８５，１４６０，１２７５，１２２０ （９）プロトン核磁気共鳴スペクトル（５００メガヘル
ツ、重ＤＭＳＯ中） 図４に示す。データは第１表にまとめられている。 （10）炭素１３核磁気共鳴スペクトル（１２５メガヘル
ツ、重ＤＭＳＯ中） 図５に示す。データは第１表にまとめられている。 （11）分子式 Ｃ₂₂Ｈ₁₈Ｏ_６

【０００９】 第 １ 表
No. δ_Ｃ δ_Ｈ No. δ_Ｃ δ_Ｈ
２ １７２．５ １１ １６１．３ ３ １１０．６ ６．３５ １１ａ １１６．７ ４ １７８．３ １２ １８７．０ ４ａ １２４．０ １２ａ １１９．７ ５ １５３．３ １２ｂ １５５．６ ６ １１８．７ ８．４７ １３ ６２．２ ５．１３ ６ａ １３６．０ １４ ３８．０ ２．７３ ７ １８１．５ １５ ２６．７ １．８９ １．７３ ７ａ １３２．１ １６ １１．４ ０．９２ ８ １１８．７ ７．６７ １７ １７．６ １．３７ ９ １３６．６ ７．７６ １１−ＯＨ １２．６８ １０ １２４．７ ７．３７ １３−ＯＨ ５．６６

【００１０】式（Ｉ）で示される化合物ｃｕ３９は、−
ＯＨの位置において塩基付加塩があり得る。本発明化合
物ｃｕ３９は、この付加塩をも包含するものである。塩
基付加塩としては、例えば、アルカリ金属化合物（例え
ば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど）との塩、ア
ルカリ土類金属化合物（例えば水酸化カルシウム、水酸
化マグネシウムなど）との塩、アンモニウム塩、有機塩
基（例えばトリエチルアミン、エタノールアミンなど）
との塩をあげることができる。なお、塩基付加塩を医薬
として使用する場合には、塩基は薬学上許容されるもの
でなければならないことは言うまでもない。

【００１１】化合物ｃｕ３９の製造 本発明の化合物ｃｕ３９は、以下で詳説するような微生
物の培養法により得ることができるが、このような方法
に限定されることはなく合目的的な任意の方法、例え
ば、類縁化合物の合成化学的または微生物学的修飾によ
って製造することも、あるいは全合成化学的に製造する
ことも可能であろう。また、遺伝子工学的手法によるこ
ともできるであろう。すなわち、化合物ｃｕ３９の生産
に関与する遺伝子を微生物に組み込み、得られた形質転
換体を培養し、この培養物から目的化合物を分離して得
ることも可能であろう。微生物の培養法による場合に
は、菌株としては、例えばストレプトミセス属に属し、
ｃｕ３９生産能を有するものを使用しうる。具体的に
は、下記で詳説するところの、本発明者等の単離に係わ
るストレプトミセス・エスピーｃｕ３９株が、ｃｕ３９
生産能を有する菌株であることが本発明者によってこの
度明らかにされたことから、この菌を好ましく用いるこ
とができる。その他の菌株としては、グルタミン酸に起
因する細胞壊死抑制能を指標として抗生物質生産菌単離
の常法に従って自然界から単離したものが用いられう
る。また、ストレプトミセス・エスピーｃｕ３９株を含
め、各種ｃｕ３９生産菌を放射線照射、その他の変異処
理に付してｃｕ３９生産能を高めることもできるであろ
う。こうして得られた変異菌株は、いずれも以下で詳説
する培養法による本発明の化合物ｃｕ３９の製造におい
て好ましく用いることができる。

【００１２】＜ｃｕ３９株＞化合物ｃｕ３９の生産能を
有するストレプトミセス属に属する一菌株で、本発明者
等が自然界（長野県根羽村の土壌）から単離して得たｃ
ｕ３９株の菌学的性質は、以下のとおりである。 １）形態 ｃｕ３９菌株は、グリセロール・アスパラギン寒天培
地、スターチ無機塩寒天培地、チロシン寒天培地、栄養
寒天培地、イースト・麦芽寒天培地及びオートミール寒
天培地上で、菌の生育は良好である。しかし、このなか
で菌糸の着生も良好な培地は、スターチ無機塩寒天培地
及びイースト・麦芽寒天の２培地のみである。グリセロ
ール・アスパラギン寒天培地、栄養寒天培地及びオート
ミール寒天培地は菌の生育は良好であるが、菌糸の着性
は乏しい。また、シュクロース・硝酸塩寒天培地は菌の
生育及び菌糸の着性も乏しい。基生菌糸より生じた気菌
糸は、単純分枝をなして伸長し、数多くの胞子が連鎖す
る。その形態は、直線上、ループ、およびゆるい螺旋状
を呈する。通常、胞子の連鎖は５０個以上で、形は卵型
で、大きさは１．１〜０．６μｍ×０．６〜０．５μｍ
であり、その表面はこぶ状である。胞子嚢、鞭毛胞子、
菌核等の特殊形態は、認められない。 ２）各種培地上の生育状態 ｃｕ３９株を各種培地に２７℃、３週間培養した結果
は、第２表に示す通りである。 ３）生理的性質 ｃｕ３９株の生理的性質は、第３表に示す通りである。 ４）炭素源の利用性 ｃｕ３９株の炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ
寒天培地上）は第４表に示す通りである。 ５）ジアミノピメリン酸の分析 細胞壁構成アミノ酸の一つであるジアミノピメリン酸を
分析した結果、ＬＬ−ジアミノピメリン酸が検出され
た。以上の菌学的性状から、ｃｕ３９株は、ストレプト
ミセス属の一菌株と判断され、以下のような特徴を有す
る。 （１）胞子鎖は直線状〜ループ〜ゆるい螺旋状で、胞子
の表面はこぶ状である。 （２）気菌糸はスターチ無機塩寒天培地およびイースト
・麦芽寒天培地上で、良く着性する。また、その色は明
るいオリーブ灰で、裏面の色は暗い黄茶及び暗い赤茶色
である。 （３）チロシン寒天培地、ペプトン・イースト・鉄寒天
培地、及びトリプトン・イースト液体培地でメラニン様
色素が認められる。可溶性色素はいずれの培地でも認め
られない。 （４）糖の利用性は、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロー
ス、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、シュクロー
ス、イシノトール、Ｌ−ラムノース、ラフィノース及び
Ｄ−マンニトールで陽性である。

【００１３】上記性状より、ｃｕ３９株はストレプトミ
セス属に属すると考えられる。ストレプトミセス属の既
知菌種について、生理的性質、糖の利用性、及び菌体の
色及び形状等を文献、ＩＳＰ（インターナショナル・ス
トレプトミセス・プロジェクト）の記載（E.B.Shirling
and D.Gottlieb:Int.J.Syst.Bact.１８巻（1968) ；１
９巻（1969) ；２２巻（1972) について検索したが、該
当する種がなかった。そこでｃｕ３９菌株をストレプト
ミセス・エスピー（Streptomyces sp.）ｃｕ３９とす
る。尚、ｃｕ３９菌株は工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託申請され、平成８年３月２２日、ＦＥＲＭ
ＢＰ−５４８２として受託されている。

【００１４】 第 ２ 表
培地 生育 気菌糸 裏面色 可溶性色素
シュクロース・ 貧弱 なし うす黄茶 なし 硝酸塩寒天培地
グルコース・アス 中程度 貧弱 明るい茶 なし パラギン寒天培地 にぶ黄茶
グリセロール・アス 良好 貧弱 にぶ赤味橙 なし パラギン寒天培地 黄味灰
スターチ無機塩 良好 豊富 うす黄色 なし 寒天培地 明るいオリーブ灰 〜暗い黄茶
チロシン 良好 中程度 明るい茶 なし 寒天培地 黄色白〜明るい茶灰 〜暗い赤茶
栄養寒天培地 良好 貧弱 黄茶 なし 黄味白
イースト・麦芽 良好 豊富 暗い赤茶 なし 寒天培地 明るいオリーブ灰
オートミール 良好 貧弱 明るい茶 なし 寒天培地 明るいオリーブ灰 〜黄味白

【００１５】 第 ３ 表 生育温度範囲 １５〜４０℃ メラニン様色素 チロシン寒天培地 陽性 ペプトン・イースト・鉄寒天培地 陽性 トリプトン・イースト液体培地 陽性 スターチの加水分解 陰性 ゼラチンの液化 陽性 脱脂乳の凝固 陰性 脱脂乳のペプトン化 陽性 硝酸塩の還元能 陰性

【００１６】第 ４ 表 Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｌ−グルコース ＋ Ｄ−フラクトース ＋ シュクロース ＋ イノシトール ＋ Ｌ−ラムノース ＋ ラフィノース ＋ Ｄ−マンニトール ＋

【００１７】＜培養／ｃｕ３９の生産＞化合物ｃｕ３９
は、ストレプトミセス属に属するｃｕ３９生産菌を適当
な培地で好気的に培養し、その培養物から目的物を採取
することによって製造することができる。培地は、ｃｕ
３９生産菌が利用しうる任意の栄養源を含有するもので
あり得る。具体的には、例えば、炭素源としてグルコー
ス、ガラクトース、麦芽糖、およびグリセロールなどが
使用でき、窒素源として大豆粉、魚粉、綿実粕、乾燥酵
母、酵母エキスおよびコーンスティープリカーなどの有
機物ならびにアンモニウム塩または硝酸塩、例えば、硫
酸アンモニウム、硝酸ナトリウムおよび塩化アンモニウ
ムなどの無機塩が利用できる。また、必要に応じて、塩
化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウムのほか、
各種燐酸塩、重金属塩などの無機塩類を添加することが
できる。醗酵中の発泡を抑制するために、常法にしたが
って適当な消泡剤、例えばシリコーン油を添加すること
もできる。

【００１８】培養方法としては、抗生物質の生産の場合
に一般的に行われている方法と同様に、好気的液体培養
法が最も適している。培養温度は２０〜３０℃が適当で
あるが、２５〜３０℃が好ましい。この方法でのｃｕ３
９の生産量は、震盪培養、通気撹拌培養ともに培養５日
目頃に最高に達する。このようにしてｃｕ３９の蓄積さ
れた培養物が得られる。培養物中では、ｃｕ３９はその
一部は菌体外（すなわち、培養液中）に存在するが、そ
の大部分は菌体中に存在する。

【００１９】このような培養物からｃｕ３９を採取する
には、合目的的な任意の方法が利用可能である。その一
つの方法は抽出の原理に基づくものであって、具体的に
は、菌体外（すなわち、培養液中）のｃｕ３９について
はこれを水不混和性のｃｕ３９用溶媒（前記参照）、例
えば、酢酸エチルなどで抽出する方法、あるいは、菌体
内のｃｕ３９については濾過、遠心分離などで得た菌体
集体をメタノール、エタノール、アセトンなどで処理し
て回収する方法などがある。菌体を分離せずに培養物そ
のままを上記の抽出操作に付すこともできる。適当な溶
媒を用いた交流分配法も抽出の範疇に含めることができ
る。培養物からｃｕ３９を採取する他の方法は、吸着の
原理に基づくものであって、既に液状となっているｃｕ
３９含有物、例えば培養濾液あるいは上記のようにして
抽出操作を行うことによって得られる抽出液を対象とし
て、適当な吸着剤、例えばシリカゲル、活性炭、合成吸
着剤（例えば、「ダイヤイオンＨＰ２０」（三菱化学社
製））などを用いて目的のｃｕ３９を吸着させ、その
後、適当な溶媒にて溶離させることによってｃｕ３９を
得ることができる。このようにして得られたｃｕ３９溶
液を減圧濃縮乾固すれば、ｃｕ３９粗標品が得られる。

【００２０】このようにして得られるｃｕ３９の粗標品
をさらに精製するためには、上記の抽出法および吸着法
に、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィなどの操作を
必要に応じて適宜組み合わせて必要回数実施すればよ
い。例えば、シリカゲルなどの吸着剤、「セファデック
スＬＨ−２０」（ファルマシア社製）などのゲル濾過剤
を用いたカラムクロマトグラフィ、シリカゲルなどの吸
着剤を用いた薄層クロマトグラフィ、「ＣＡＰＣＥＬＬ
ＰＡＫ」（資生堂社製）、「ＯＤＳ」などのシリカ系
充填カラム（順相あるいは逆相カラム）を用いた高速液
体クロマトグラフィ、あるいは向流分配法を適宜組み合
わせて精製を行ない、化合物ｃｕ３９の純品を得ること
ができる。本発明による化合物ｃｕ３９は、常法によっ
て前記したような塩基付加塩の形にすることができる。

【００２１】化合物ｃｕ３９の用途 本発明の化合物ｃｕ３９は、後述のように、グルタミン
酸に起因する細胞壊死を強く抑制する作用を示した。従
って、本発明の化合物ｃｕ３９およびその塩の有効な対
象疾患しては、たとえば脳梗塞、脳卒中、心拍動の一次
停止、脳損傷から生じる脳虚血、酸素欠乏症により引き
起こされる諸症状、脳内新生物質や外傷圧による頭蓋内
圧上昇にともなう諸症状、さらに脳浮腫や痴呆症などの
疾病などがあげられ、本発明の化合物ｃｕ３９およびそ
の塩は、これらの疾病の予防または治療に用いることが
できる。すなわち、本発明は有用な脳卒中予防剤もしく
は脳卒中後遺症治療剤、とりわけ脳神経細胞保護作用、
脳細胞変性作用および脳細胞壊死抑制作用を有する薬剤
を提供する。従って、本発明による化合物ｃｕ３９は上
記疾病の予防剤または治療剤としての医薬（医薬組成
物）、特に神経細胞保護剤、脳細胞変性抑制剤もしくは
脳細胞壊死抑制剤として使用することができる。

【００２２】医薬として使用する場合の本発明化合物ｃ
ｕ３９は、合目的的な任意の投与経路、具体的には、動
物の場合には腹腔内投与、皮下投与、静脈または動脈へ
の血管内投与および注射による局所投与などの方法が、
またヒトの場合は静脈内投与、動脈内投与、注射による
局所投与、腹腔、胸腔への投与、経口投与、皮下投与、
筋肉内投与、舌下投与、経皮吸収、または直腸投与によ
り投与することができる。本発明化合物を薬剤として投
与する場合は、投与方法、投与目的によってきまる適当
な剤型、具体的には、注射剤、懸濁剤、錠剤、粉末剤、
顆粒剤、散剤、カプセル剤、軟膏剤、クリーム剤、座剤
等の形態で投与することができる。経口または直腸内投
与の場合は徐放化製剤の形態で用いてもよい。これらの
製剤を製造するには、化合物ｃｕ３９に悪影響を与えな
い限り、製薬上許容される種々の補助剤、すなわち担体
あるいはその他の助剤、具体的には溶剤、可溶化剤、等
張化剤、防腐剤、無痛化剤、乳化剤、抗酸化剤、賦形
剤、結合剤、滑沢剤、安定剤等を必要に応じて添加する
ことができる。溶剤としては、例えば水、生理食塩水等
が、可溶化剤としては、例えばエタノール、ポリソルベ
ート剤が、等張化剤としては例えばブドウ糖、生理食塩
水、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール等が、防腐剤
としては例えばベンジルアルコール、パラオキシ安息香
酸イソブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラ
オキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸ブチル、パ
ラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸メチ
ル、安息香酸、チモール、白糖、ハチミツ等が、無痛化
剤としては例えばベンジルアルコール、クロルブタノー
ル、リドカイン、プロカイン等が、賦形剤としては、例
えば乳糖、デンプン、結晶セルロース、マンニトール、
マルトース、リン酸水素カルシウム、軽質無水ケイ酸、
炭酸カルシウム等が、乳化剤としては例えばポリソルベ
ート類、ヤシ脂肪酸、メチルセルロース、精製卵黄レシ
チン、精製ラノリン、ゼラチン、Ｄ−ソルビトール等
が、抗酸化剤としては例えばアスコルビン酸、クエン
酸、酢酸トコフェロール、没食子酸プロピル、天然ビタ
ミンＥ、大豆レシチン等が、結合剤としては、例えばデ
ンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセ
ルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロ
ース、アラビアゴム等が、崩壊剤としては、例えばデン
プン、カルボキシメチルセルロースカルシウム等が、滑
沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タル
ク、硬化油等が、安定剤としては、例えば乳糖、マンニ
トール、マトルース、ポリソルベート類、マクロゴール
類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等があげられる。
また、必要に応じて、グリセリン、ジメチルアセトアミ
ド、７０％乳酸ナトリウム、界面活性剤、塩基性物質
（例えば、エチレンジアミン、エタノールアミン、炭酸
ナトリウム、アルギニン、メグルミン、トリスアミノメ
タン）を添加することもできる。これらの成分を用い
て、注射剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の剤型に製造
することができる。製剤において、本発明化合物ｃｕ３
９の含有量は製剤形態により広範囲に変えることが可能
である。

【００２３】化合物ｃｕ３９の投与量は、動物実験の結
果および種々の状況を勘案して、連続的または間欠的に
投与したときに総投与量が一定量を越えないように定め
られる。具体的な投与量は、投与方法、患者または被処
理動物の状況、例えば年齢、体重、性別、感受性、食事
（食餌）投与時間、併用する薬剤、患者またはその病気
の程度に応じて変化することは言うまでもなく、また一
定の条件のもとにおける適量と投与回数は、上記指針を
もとにして専門医の適量決定試験によって決定されなけ
ればならない。具体的には、成人１日あたり０．１〜１
００ｍｇ程度であるが、上記のように年齢、病態、症状
の程度に応じて適宜増減されることが望ましい。

【００２４】〔実験例〕

【実施例】以下は、化合物ｃｕ３９の生理活性試験およ
び製造例によって本発明を更に詳細に説明するものであ
る。 ［ｃｕ３９の生理活性試験］ （１）神経細胞系ハイブリドーマＮ−１８−ＲＥ−１０
５細胞を用いる活性測定法 ｉ）Ｎ−１８−ＲＥ−１０５細胞の培養：Ｎ−１８−Ｒ
Ｅ−１０５細胞（大阪大学たんぱく質研究所より入手）
の培養は、１０％ＦＣＳおよびＨＡＴ（hypoxanthine
０．１ｍＭ、aminopterin ４０μＭ、thymidine ０．１
４ｍＭ、シグマ社製）を含むダルベッコ変法ＭＥＭ（Ｄ
ＭＥＭ）中で、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で行い、３日
毎に継代した。 ii）活性評価試験（検鏡法）：Ｎ−１８−ＲＥ−１０５
細胞が９６穴マイクロプレートに６．２５×１０³ cell
s ／ｃｍ² となるように播種した。２４時間培養後、終
濃度が１０ｍＭとなるようにグルタミン酸を添加した。
２４時間後、顕微鏡下にて細胞の生死を観察した。 iii)活性評価試験（ＬＤＨ法）：乳酸脱水素酵素の細胞
外への流出量（ＬＤＨ法）は和光純薬工業株式会社製の
ＬＤＨ−細胞毒性テストワコーを用いて下記のように測
定した。グルタミン酸添加２４時間後、培養上清と細胞
を分離し、細胞を０．５％ Triton Ｘ−１００（０．１
Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）にて処理した。この培養
上清と細胞抽出液の乳酸脱水素酵素の活性を測定した。
酵素活性の比較は乳酸脱水素酵素の基質５０ｍｌ（ＤＬ
−乳酸リチウム緩衝液（５０ｍｇ／ｍｌ）に溶解したニ
トロブルーテトラゾリウム、ジアホラーゼ、ＮＡＤ）に
培養上清あるいは細胞抽出液を５０ｍｌ添加し、室温で
４５分間放置した後、１００ｍｌの１Ｎ塩酸で反応を停
止させた。その後、マイクロプレートリーダーにより５
６０±１０ｎｍの吸光度を測定した。細胞障害率は次式
により算出した。 細胞障害率（％）＝（Ｓ−Ｎ）／（Ｐ−Ｎ）×１００ Ｓ：検体での吸光度 Ｎ：ネガティブコントロールでの吸光度 Ｐ：ボジティブコントロールでの吸光度

【００２５】（２）結果 本発明の化合物ｃｕ３９はＮ−１８−ＲＥ−１０５細胞
に対するグルタミン酸毒性を抑制した（ＥＤ₅₀＝４０ｎ
Ｍ）。

【００２６】［ｃｕ３９の製造］ １）培養 使用した培地は、ＫＧ培地（グルコース ２．５％、大
豆粉 １．５％、乾燥酵母 ０．２％、ＣａＣＯ_３
０．４％；ｐＨ６．２）である。上記培地２０ｍｌを試
験管に入れ、ストレプトミセス・エスピー（Streptomyc
es sp.）ｃｕ３９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４８２）をス
ラントより１白金耳接種し、ロータリーシェーカーで２
７℃にて２日間震盪培養した。上記培地１００ｍｌを５
００ｍｌイボ付き三角フラスコ２０本に分注後滅菌した
ものに前培養液を１ｍｌずつ加え、ロータリーシェーカ
ーで２７℃にて５日間震盪培養した。

【００２７】２）ｃｕ３９の採取 上記の条件で培養後、培養液（２リットル）を濾過し、
菌体を得た。この菌体を１リットルのアセトンで２回抽
出し、抽出液を濃縮後、０．５リットルの酢酸エチルで
３回抽出した。抽出液を合わせて無水硫酸ナトリウムで
乾燥し、濃縮乾固した。残渣を少量のクロロホルム：メ
タノール＝５０：１に溶解し、シリカゲル（メルク社
製、キーゼルゲル６０；２００ｇ）のカラム（２５ｍｍ
φ×２５０ｍｍ）に吸着させ、クロロホルム：メタノー
ル＝５０：１で溶出した。活性画分を濃縮乾固し、残渣
を少量のクロロホルム：メタノール＝５０：１に溶解
し、シリカゲルＴＬＣプレート（メルク社製、キーゼル
ゲル６０Ｆ₂₅₄ 、２０ｃｍ×２０ｃｍ；１枚）に吸着さ
せた。クロロホルム：メタノール＝５０：１で展開し、
活性画分をかきとり、クロロホルム：メタノール＝５
０：１で抽出した。濃縮乾固し、残渣を少量のクロロホ
ルム：メタノール＝１：１に溶解し、セファデックスＬ
Ｈ−２０（ファルマシア社製）のカラム（１５ｍｍφ×
４００ｍｍ）に載せ、クロロホルム：メタノール＝１：
１で溶出した。活性画分を濃縮乾固し、残渣を少量の８
５％ＭｅＯＨに溶解し、ＯＤＳ（テガシル社製）のカラ
ムを用い、移動相として８５％ＭｅＯＨを毎分３ｍｌで
送液して高速液体クロマトグラフィーを行った。その結
果得られたｃｕ３９を含む分画を減圧濃縮乾固し、３０
ｍｇの精製ｃｕ３９を得た。

【００２８】

【発明の効果】本発明による化合物ｃｕ３９は、グルタ
ミン酸の毒性の抑制作用を有し神経細胞保護作用を有し
ており、医薬組成物、特に神経細胞保護剤、脳細胞変性
抑制剤もしくは脳細胞壊死抑制剤として有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】メタノール中での化合物ｃｕ３９の紫外線吸収
スペクトルを模写したものである。

【図２】メタノール中で０．０１Ｎ ＮａＯＨを添加し
たときの化合物ｃｕ３９の紫外線吸収スペクトルを模写
したものである。

【図３】ＫＢｒディスク法による化合物ｃｕ３９の赤外
線吸収スペクトルを模写したものである。

【図４】重ＤＭＳＯ中における化合物ｃｕ３９の５００
メガヘルツプロトン核磁気共鳴スペクトルを模写したも
のである。

【図５】重ＤＭＳＯ中における化合物ｃｕ３９の１２５
メガヘルツ炭素１３核磁気共鳴スペクトルを模写したも
のである。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次式（Ｉ）で示される化合物ｃｕ３９また
   はその塩。 【化１】
2. 【請求項２】ストレプトミセス属に属し、化合物ｃｕ３
   ９の生産能を有するｃｕ３９生産菌を培養し、培養物か
   らｃｕ３９を採取することを特徴とする、次式（Ｉ）で
   示される化合物ｃｕ３９の製造法。 【化２】
3. 【請求項３】ｃｕ３９生産菌がストレプトミセス・エス
   ピーｃｕ３９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４８２）である、
   請求項２の製造法。
4. 【請求項４】請求項１に記載の化合物ｃｕ３９またはそ
   の塩を有効成分として含有してなる医薬組成物。
5. 【請求項５】請求項１に記載の化合物ｃｕ３９またはそ
   の塩を有効成分として含有してなる神経細胞保護剤。
6. 【請求項６】請求項１に記載の化合物ｃｕ３９またはそ
   の塩を有効成分として含有してなる脳細胞変性抑制剤。
7. 【請求項７】請求項１に記載の化合物ｃｕ３９またはそ
   の塩を有効成分として含有してなる脳細胞壊死抑制剤。