JPH10265491A - 新規テルペン系化合物０４０６ｔｐ−１ - Google Patents
新規テルペン系化合物０４０６ｔｐ−１Info
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- JPH10265491A JPH10265491A JP9261106A JP26110697A JPH10265491A JP H10265491 A JPH10265491 A JP H10265491A JP 9261106 A JP9261106 A JP 9261106A JP 26110697 A JP26110697 A JP 26110697A JP H10265491 A JPH10265491 A JP H10265491A
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- C12P19/58—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound through only acyclic carbon atoms to a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. bleomycin, phleomycin
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 下記化１に示される化学構造式を有する
化合物０４０６ＴＰ−１又はその医薬的に許容される
塩。 【化１】 （式中、Ａｃはアセチル基、Ｍｅはメチル基を表わ
す。） 【効果】 すぐれた抗腫瘍作用、免疫抑制作用を有す
る。
化合物０４０６ＴＰ−１又はその医薬的に許容される
塩。 【化１】 （式中、Ａｃはアセチル基、Ｍｅはメチル基を表わ
す。） 【効果】 すぐれた抗腫瘍作用、免疫抑制作用を有す
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規化合物０４０
６ＴＰ−１、その製造法及び用途に関するものである。
新規化合物０４０６ＴＰ−１は、微生物、特に放線菌の
培養物から分離採取された従来未知の新規テルペン系化
合物であって、すぐれた生理活性、特にすぐれた抗腫瘍
作用及び免疫抑制作用を有するものである。従って、本
発明に係る新規テルペン系化合物は、抗腫瘍剤として癌
の治療剤及び／又は予防薬として有効に利用することが
出来る。また、本発明に係る新規テルペン系化合物は、
免疫抑制剤、例えば臓器移植、皮膚移植における拒絶反
応の抑制や自己免疫疾患の治療剤及び／又は予防薬とし
て有効に利用することができる。
６ＴＰ−１、その製造法及び用途に関するものである。
新規化合物０４０６ＴＰ−１は、微生物、特に放線菌の
培養物から分離採取された従来未知の新規テルペン系化
合物であって、すぐれた生理活性、特にすぐれた抗腫瘍
作用及び免疫抑制作用を有するものである。従って、本
発明に係る新規テルペン系化合物は、抗腫瘍剤として癌
の治療剤及び／又は予防薬として有効に利用することが
出来る。また、本発明に係る新規テルペン系化合物は、
免疫抑制剤、例えば臓器移植、皮膚移植における拒絶反
応の抑制や自己免疫疾患の治療剤及び／又は予防薬とし
て有効に利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】抗腫瘍剤として数多くの新規化合物が発
見され、また、新規化合物も合成され、その一部は実用
化されている。たしかに従来より知られている抗腫瘍剤
にはすぐれたものが各種知られているが、効果はもとよ
り、安全性、生産性の面からもう一段の改良が求められ
ている。また、近年、アレルギー性疾患、膠原病、自己
免疫性疾患あるいは結合組織病と称される一群の病態に
種々の免疫抑制剤が使用され、その効果に注目が集まっ
ている。同様に肝臓、心臓、腎臓等の臓器移植の際の拒
絶反応抑制にも適用され、年々その重要性を増してい
る。
見され、また、新規化合物も合成され、その一部は実用
化されている。たしかに従来より知られている抗腫瘍剤
にはすぐれたものが各種知られているが、効果はもとよ
り、安全性、生産性の面からもう一段の改良が求められ
ている。また、近年、アレルギー性疾患、膠原病、自己
免疫性疾患あるいは結合組織病と称される一群の病態に
種々の免疫抑制剤が使用され、その効果に注目が集まっ
ている。同様に肝臓、心臓、腎臓等の臓器移植の際の拒
絶反応抑制にも適用され、年々その重要性を増してい
る。
【０００３】この分野におけるある種の免疫細胞に特異
性及び選択性の高い薬物として開発された物質として、
シクロスポリンＡ（A.Rciegger et al., Agents and Ac
tions, vol.6, pp.468-475(1976)）が開発されており、
シクロスポリンＡは、ヘルパーＴ細胞のインターロイキ
ン２（IL-2）産生を抑制するが、サプレッサーＴ細胞の
IL-2 産生を抑制せず、その結果移植片の拒絶を阻止す
ることが明らかにされ、現在、腎臓、骨髄移植等の臓器
移植で著しい成果を上げ、臨床で使用されている。しか
し、この薬物は場合によって急性腎中毒、軽度の神経病
変、歯肉肥厚等の副作用を生じせしめる等の問題が指摘
されている。
性及び選択性の高い薬物として開発された物質として、
シクロスポリンＡ（A.Rciegger et al., Agents and Ac
tions, vol.6, pp.468-475(1976)）が開発されており、
シクロスポリンＡは、ヘルパーＴ細胞のインターロイキ
ン２（IL-2）産生を抑制するが、サプレッサーＴ細胞の
IL-2 産生を抑制せず、その結果移植片の拒絶を阻止す
ることが明らかにされ、現在、腎臓、骨髄移植等の臓器
移植で著しい成果を上げ、臨床で使用されている。しか
し、この薬物は場合によって急性腎中毒、軽度の神経病
変、歯肉肥厚等の副作用を生じせしめる等の問題が指摘
されている。
【０００４】また、１９８４年に発見されたマクロライ
ド抗生物質タクロリムス（tacrorims; FK506）(T.Kino
et al., J.Antibiot., vol.40, pp.1249-1255(1987)）
は免疫抑制剤として好ましい結果が得られている。しか
し、生産性が低いことやタクロリムス関連物質が微量に
同時生産されることなどからタクロリムスの生産性の向
上などで問題をかかえており、今後の発展の制約条件と
なる可能性が大きいこと、さらに、膵臓及び腎臓への障
害があること、また、シクロスポリンＡとの作用点が類
似していることもあり、より安全性の高い、作用点の異
なる新規物質の開発が強く望まれていた。
ド抗生物質タクロリムス（tacrorims; FK506）(T.Kino
et al., J.Antibiot., vol.40, pp.1249-1255(1987)）
は免疫抑制剤として好ましい結果が得られている。しか
し、生産性が低いことやタクロリムス関連物質が微量に
同時生産されることなどからタクロリムスの生産性の向
上などで問題をかかえており、今後の発展の制約条件と
なる可能性が大きいこと、さらに、膵臓及び腎臓への障
害があること、また、シクロスポリンＡとの作用点が類
似していることもあり、より安全性の高い、作用点の異
なる新規物質の開発が強く望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
当業界における要望に応えるためになされたものであっ
て、抗腫瘍剤及び免疫抑制剤の技術開発の流れに沿いス
クリーニングを重ねた結果、今迄に知られていない新規
な化合物に抗腫瘍活性があること及び免疫抑制活性を有
することを見い出し、本発明を完成させた。本発明は、
従来既知の物質より更にすぐれた抗腫瘍活性を有する新
規な化合物及び免疫抑制活性を有する新規な化合物を提
供する目的でなされたものである。
当業界における要望に応えるためになされたものであっ
て、抗腫瘍剤及び免疫抑制剤の技術開発の流れに沿いス
クリーニングを重ねた結果、今迄に知られていない新規
な化合物に抗腫瘍活性があること及び免疫抑制活性を有
することを見い出し、本発明を完成させた。本発明は、
従来既知の物質より更にすぐれた抗腫瘍活性を有する新
規な化合物及び免疫抑制活性を有する新規な化合物を提
供する目的でなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、新規な抗
腫瘍作用を有する物質及び新規な免疫抑制作用を有する
物質を得ることを目的として、天然物、特に微生物の代
謝産物について広く検索を行い、より有効な抗腫瘍作用
及び免疫抑制作用を有する物質について検索を行った結
果、Nocardia brasiliensis IFM0406株（FERM BP-549
8）が培養液中に抗腫瘍作用と免疫抑制作用の両方の性
質を有する物質を生成蓄積することを発見した。そし
て、更に本物質についてその物理化学的性質を詳細に調
べ、化学構造を明らかにしたところ、従来知られていな
い新規物質であることが確認された。本物質は請求項１
に記載した様に、一般式（１）で示されるテルペン系の
新規な化合物であった。発明者らは本化合物を０４０６
ＴＰ−１と命名した。
腫瘍作用を有する物質及び新規な免疫抑制作用を有する
物質を得ることを目的として、天然物、特に微生物の代
謝産物について広く検索を行い、より有効な抗腫瘍作用
及び免疫抑制作用を有する物質について検索を行った結
果、Nocardia brasiliensis IFM0406株（FERM BP-549
8）が培養液中に抗腫瘍作用と免疫抑制作用の両方の性
質を有する物質を生成蓄積することを発見した。そし
て、更に本物質についてその物理化学的性質を詳細に調
べ、化学構造を明らかにしたところ、従来知られていな
い新規物質であることが確認された。本物質は請求項１
に記載した様に、一般式（１）で示されるテルペン系の
新規な化合物であった。発明者らは本化合物を０４０６
ＴＰ−１と命名した。
【０００７】すなわち本発明は、下記化２に示される一
般式（１）を有する新規な化合物０４０６ＴＰ−１又は
医薬的に許容し得る塩に関するものである。
般式（１）を有する新規な化合物０４０６ＴＰ−１又は
医薬的に許容し得る塩に関するものである。
【０００８】
【化２】
【０００９】（但し式中、Ａｃはアセチル基、Ｍｅはメ
チル基を表わす。）
チル基を表わす。）
【００１０】また、本発明は、新規テルペン系化合物０
４０６ＴＰ−１又はその医薬的に許容される塩を有効成
分とする新規な抗腫瘍剤及び免疫抑制剤にも関するもの
である。以下、本発明について詳述する。
４０６ＴＰ−１又はその医薬的に許容される塩を有効成
分とする新規な抗腫瘍剤及び免疫抑制剤にも関するもの
である。以下、本発明について詳述する。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明に係る化合物０４０６ＴＰ
−１の物理化学的性質は、下記表１に示される。
−１の物理化学的性質は、下記表１に示される。
【００１２】
【表１】
【００１３】化合物の1Ｈ ＮＭＲ及び13Ｃ ＮＭＲス
ペクトルの内、有意なシグナルは、それぞれ下記表２、
表３に示される。
ペクトルの内、有意なシグナルは、それぞれ下記表２、
表３に示される。
【００１４】
【表２】
【００１５】
【表３】
【００１６】本発明に係る化合物０４０６ＴＰ−１は、
例えばNocardia brasiliensis IFM0406株（FERM BP-549
8）によって生産される。
例えばNocardia brasiliensis IFM0406株（FERM BP-549
8）によって生産される。
【００１７】Nocardia brasiliensis IFM0406株の菌学
的性質は、形態学的にはオートミール寒天培地（ＩＳＰ
−３）で培養した時、形態学的にはアクチノミセーテス
（Actinomycetes）の一種に見られる様な分岐した長い
菌糸と気中菌糸体を有していた。また、培養時間を長く
することによって、桿菌様胞子が数個と気中菌糸および
栄養菌糸の断列が観察された。栄養菌糸断列が観察され
たことから形態学的にNocardia属に属するものと推定さ
れた。各種培地でのNocardia brasiliensis IFM0406株
の培養的性質を下記表４に示した。また、生理学的性質
について表５に示した。
的性質は、形態学的にはオートミール寒天培地（ＩＳＰ
−３）で培養した時、形態学的にはアクチノミセーテス
（Actinomycetes）の一種に見られる様な分岐した長い
菌糸と気中菌糸体を有していた。また、培養時間を長く
することによって、桿菌様胞子が数個と気中菌糸および
栄養菌糸の断列が観察された。栄養菌糸断列が観察され
たことから形態学的にNocardia属に属するものと推定さ
れた。各種培地でのNocardia brasiliensis IFM0406株
の培養的性質を下記表４に示した。また、生理学的性質
について表５に示した。
【００１８】
【表４】
【００１９】
【表５】
【００２０】本菌株を培地（２％グルコースを含むブレ
インハート・インフュージョン）中で、２５０rpmで３
０℃、７２時間振とう培養し、培地中に生育した菌体を
遠心分離（３０００rpm×１０分）で集め、蒸留水で２
回洗浄した。更に菌体をエタノールで洗い、次いで真空
乾燥し、乾燥菌体とした。この乾燥菌体の細胞壁のアミ
ノ酸組成、糖組成、脂質組成をBergey's Manual of Det
erminative Bacteriology 9th ed., Williams, Baltimo
re, 1993に基づいて調べた。アミノ酸分析結果よりメソ
-ジアミノピメリン酸、糖分析結果よりアラビノース、
ガラクトースが検出された。また脂質分析の結果からミ
コール酸の存在が確認され、そのTypeはNocardia Type
であった。菌体脂質成分であるイソプレノイド・キノン
は主たる成分としてＭＫ−８（Ｈ４）ｃｙｃｌｅまた、
微量成分としてＭＫ−８（Ｈ４）、ＭＫ−８（Ｈ）、Ｍ
Ｋ−９（Ｈ２）が確認された。また、表４に示したアデ
ニン、カゼイン、ヒポキサンチン、チロシンの資化性、
さらには糖から酸の産出パターン及び抗菌剤に対する感
受性のパターン（Mikami ＆ Yazawa, Susceptibility p
attern of pathogenic Nocardia to some selected ant
imicrobial agentsand their usefulness in the ident
ification work in a clinical laboratory: Bull. JFC
C「日本微生物株保存連盟会誌」5 : 89、1989）から、
本菌株はNocardia brasiliensisと同定された。
インハート・インフュージョン）中で、２５０rpmで３
０℃、７２時間振とう培養し、培地中に生育した菌体を
遠心分離（３０００rpm×１０分）で集め、蒸留水で２
回洗浄した。更に菌体をエタノールで洗い、次いで真空
乾燥し、乾燥菌体とした。この乾燥菌体の細胞壁のアミ
ノ酸組成、糖組成、脂質組成をBergey's Manual of Det
erminative Bacteriology 9th ed., Williams, Baltimo
re, 1993に基づいて調べた。アミノ酸分析結果よりメソ
-ジアミノピメリン酸、糖分析結果よりアラビノース、
ガラクトースが検出された。また脂質分析の結果からミ
コール酸の存在が確認され、そのTypeはNocardia Type
であった。菌体脂質成分であるイソプレノイド・キノン
は主たる成分としてＭＫ−８（Ｈ４）ｃｙｃｌｅまた、
微量成分としてＭＫ−８（Ｈ４）、ＭＫ−８（Ｈ）、Ｍ
Ｋ−９（Ｈ２）が確認された。また、表４に示したアデ
ニン、カゼイン、ヒポキサンチン、チロシンの資化性、
さらには糖から酸の産出パターン及び抗菌剤に対する感
受性のパターン（Mikami ＆ Yazawa, Susceptibility p
attern of pathogenic Nocardia to some selected ant
imicrobial agentsand their usefulness in the ident
ification work in a clinical laboratory: Bull. JFC
C「日本微生物株保存連盟会誌」5 : 89、1989）から、
本菌株はNocardia brasiliensisと同定された。
【００２１】また表６に示したＧ＋Ｃ含量及びＤＮＡ相
同性の検討結果も、本菌がNocardiabrasiliensisである
ことを支持するものであった。
同性の検討結果も、本菌がNocardiabrasiliensisである
ことを支持するものであった。
【００２２】
【表６】
【００２３】この様に本菌株は、Nocardia brasiliensi
sに分類されるが、化合物０４０６ＴＰ−１を生産する
ことで極めて特徴的であった。Nocardia brasiliensis
IFM0406は、工業技術院生命工学工業技術研究所に国際
寄託した（FERM BP-5498）。
sに分類されるが、化合物０４０６ＴＰ−１を生産する
ことで極めて特徴的であった。Nocardia brasiliensis
IFM0406は、工業技術院生命工学工業技術研究所に国際
寄託した（FERM BP-5498）。
【００２４】本発明に係る化合物０４０６ＴＰ−１は、
Nocardia brasiliensis IFM0406（FERM BP-5498）株に
よって生産されるほか、Nocardia属に属する他の菌株に
よっても生産されることが確認されており、化合物０４
０６ＴＰ−１の生産はこれらの微生物からＸ線照射、γ
線照射、ナイトロジェンマスタード、Ｎ−メチル−Ｎ′
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、２−アミノプリ
ン、エチルメタンスルホネート等を使用した変異処理に
より取得できる人工変異株ならびに自然変異株を含めて
化合物０４０６ＴＰ−１を生産しうるすべての変異株の
使用も広く包含するものである。
Nocardia brasiliensis IFM0406（FERM BP-5498）株に
よって生産されるほか、Nocardia属に属する他の菌株に
よっても生産されることが確認されており、化合物０４
０６ＴＰ−１の生産はこれらの微生物からＸ線照射、γ
線照射、ナイトロジェンマスタード、Ｎ−メチル−Ｎ′
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、２−アミノプリ
ン、エチルメタンスルホネート等を使用した変異処理に
より取得できる人工変異株ならびに自然変異株を含めて
化合物０４０６ＴＰ−１を生産しうるすべての変異株の
使用も広く包含するものである。
【００２５】本発明に係る一般式（１）で示される新規
化合物０４０６ＴＰ−１は、化学合成法によって製造で
きるほか、上記のように微生物によっても製造すること
ができる。
化合物０４０６ＴＰ−１は、化学合成法によって製造で
きるほか、上記のように微生物によっても製造すること
ができる。
【００２６】後者の場合、本発明に係る一般式（１）で
示される新規化合物０４０６ＴＰ−１はNocardia属に属
する該化合物生産菌、例えばNocardia brasiliensis IF
M0406が資化しうる炭素源及び窒素源を含む培地で培養
して製造することが出来るが好気的深部培養条件（例え
ば振とう培養、通気攪拌培養等）で生産せしめることが
好ましい。
示される新規化合物０４０６ＴＰ−１はNocardia属に属
する該化合物生産菌、例えばNocardia brasiliensis IF
M0406が資化しうる炭素源及び窒素源を含む培地で培養
して製造することが出来るが好気的深部培養条件（例え
ば振とう培養、通気攪拌培養等）で生産せしめることが
好ましい。
【００２７】炭素源としては、グルコース、グリセロー
ル、シュークロース、澱粉、デキストリンその他の炭水
化物を使用することが好ましい。窒素源としては、オー
トミール、イースト抽出物、牛肉抽出物、ツナ肉抽出
物、ペプトン、グルテンミール、綿実粉、大豆ミール、
コーンスティープリカー、乾燥イースト、小麦胚芽、落
花生粉、チキン骨肉ミール等を使用するのが好ましい
が、アンモニウム塩（例えば、硝酸アンモニウム、硫酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム等）、尿素、アミノ
酸等の無機及び有機の窒素化合物も有利に使用すること
が出来る。
ル、シュークロース、澱粉、デキストリンその他の炭水
化物を使用することが好ましい。窒素源としては、オー
トミール、イースト抽出物、牛肉抽出物、ツナ肉抽出
物、ペプトン、グルテンミール、綿実粉、大豆ミール、
コーンスティープリカー、乾燥イースト、小麦胚芽、落
花生粉、チキン骨肉ミール等を使用するのが好ましい
が、アンモニウム塩（例えば、硝酸アンモニウム、硫酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム等）、尿素、アミノ
酸等の無機及び有機の窒素化合物も有利に使用すること
が出来る。
【００２８】これらの炭素源及び窒素源は併用すること
が有利であるが、必ずしも純粋なものを使用する必要は
ない。純粋でないものには、生長因子や微量要素が含ま
れているため、これを使用することが望ましい為であ
る。必要ならば、例えば炭酸ナトリウム、炭酸カリウ
ム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウ
ム、塩化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウ
ム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩等のような無機
塩類を培地に添加することが出来る。必要ならば、特
に、培地が発泡するのであれば、流動パラフィン、動物
油、植物油、鉱物油、シリコン等の消泡剤を加えること
が出来る。
が有利であるが、必ずしも純粋なものを使用する必要は
ない。純粋でないものには、生長因子や微量要素が含ま
れているため、これを使用することが望ましい為であ
る。必要ならば、例えば炭酸ナトリウム、炭酸カリウ
ム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウ
ム、塩化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウ
ム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩等のような無機
塩類を培地に添加することが出来る。必要ならば、特
に、培地が発泡するのであれば、流動パラフィン、動物
油、植物油、鉱物油、シリコン等の消泡剤を加えること
が出来る。
【００２９】目的物質を大量に工業生産するには、他の
発酵生産物の場合と同様に、通気攪拌培養するのが好ま
しい。少量生産の場合は、フラスコを用いる振とう培養
が好適である。また、培養を大きなタンクで行う場合、
化合物０４０６ＴＰ−１の生産工程において菌の生育遅
延を防止するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌
を接種培養した後、次に培養物を大きな生産タンクに移
してそこで生産培養するのが好ましい。この場合、前培
養に使用する培地及び生産培養に使用する培地の組成
は、両者ともに同一であってもよいし必要があれば両者
を変えてもよい。
発酵生産物の場合と同様に、通気攪拌培養するのが好ま
しい。少量生産の場合は、フラスコを用いる振とう培養
が好適である。また、培養を大きなタンクで行う場合、
化合物０４０６ＴＰ−１の生産工程において菌の生育遅
延を防止するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌
を接種培養した後、次に培養物を大きな生産タンクに移
してそこで生産培養するのが好ましい。この場合、前培
養に使用する培地及び生産培養に使用する培地の組成
は、両者ともに同一であってもよいし必要があれば両者
を変えてもよい。
【００３０】培養は通気攪拌条件で行うのが好ましく、
例えばプロペラやその他機械による攪拌、ファーメンタ
ーの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹込み等既
知の方法が適宜使用される。通気用の空気は滅菌してお
くのが良い。
例えばプロペラやその他機械による攪拌、ファーメンタ
ーの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹込み等既
知の方法が適宜使用される。通気用の空気は滅菌してお
くのが良い。
【００３１】培養温度は、化合物０４０６ＴＰ−１生産
菌が本物質を生産する範囲で適宜変更しうるが、通常は
１０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で培養するのが
よい。培養時間は、培養条件や培養量によっても異なる
が、通常は約１日〜１週間である。
菌が本物質を生産する範囲で適宜変更しうるが、通常は
１０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で培養するのが
よい。培養時間は、培養条件や培養量によっても異なる
が、通常は約１日〜１週間である。
【００３２】発酵終了後、培養物から目的とする化合物
０４０６ＴＰ−１を回収する。すなわち、菌体は、直接
水及び／又は有機溶媒による抽出、あるいは、これを機
械的に又は超音波等既知の手段を用いて破壊した後、水
及び／又は有機溶媒で抽出した後、常法に従って回収、
精製する。培養液の場合は、直接、溶媒で抽出してもよ
いし、また、培養液の濾過又は遠心分離後、減圧濃縮、
凍結乾燥、ｐＨ調節、アニオン又はカチオン交換樹脂、
活性炭、粉末セルロース、シリカゲル、アルミナ、吸着
性樹脂等の担体に接触させて化合物０４０６ＴＰ−１を
吸着させた後、これを担体から溶出すればよい。
０４０６ＴＰ−１を回収する。すなわち、菌体は、直接
水及び／又は有機溶媒による抽出、あるいは、これを機
械的に又は超音波等既知の手段を用いて破壊した後、水
及び／又は有機溶媒で抽出した後、常法に従って回収、
精製する。培養液の場合は、直接、溶媒で抽出してもよ
いし、また、培養液の濾過又は遠心分離後、減圧濃縮、
凍結乾燥、ｐＨ調節、アニオン又はカチオン交換樹脂、
活性炭、粉末セルロース、シリカゲル、アルミナ、吸着
性樹脂等の担体に接触させて化合物０４０６ＴＰ−１を
吸着させた後、これを担体から溶出すればよい。
【００３３】回収、精製方法としては、抗生物質採取の
際の常法が適宜利用され、例えば、水、有機溶媒これら
の混合溶媒による溶媒抽出；クロマトグラフィー；単一
溶媒又は混合溶媒からの再結晶等常法が適宜単独である
いは組合わせて使用できる。
際の常法が適宜利用され、例えば、水、有機溶媒これら
の混合溶媒による溶媒抽出；クロマトグラフィー；単一
溶媒又は混合溶媒からの再結晶等常法が適宜単独である
いは組合わせて使用できる。
【００３４】化合物０４０６ＴＰ−１の回収、精製は上
記の様に既知の方法を適宜利用して行うが、例えば次の
様にしてもよい。先ず、培養物を遠心分離またはＭＦ膜
で処理することにより菌体を除いた後、疎水性の吸着樹
脂に吸着させ、吸着画分をメタノールで溶出し、この溶
出画分を減圧濃縮し、更にＤＥＡＥクロマトグラフィー
に吸着させ、トリス−塩酸緩衝液で溶出すればよい。溶
出液を減圧濃縮し、更に再クロマトすることにより更に
精製度を向上させ、必要によって凍結乾燥すればよい。
記の様に既知の方法を適宜利用して行うが、例えば次の
様にしてもよい。先ず、培養物を遠心分離またはＭＦ膜
で処理することにより菌体を除いた後、疎水性の吸着樹
脂に吸着させ、吸着画分をメタノールで溶出し、この溶
出画分を減圧濃縮し、更にＤＥＡＥクロマトグラフィー
に吸着させ、トリス−塩酸緩衝液で溶出すればよい。溶
出液を減圧濃縮し、更に再クロマトすることにより更に
精製度を向上させ、必要によって凍結乾燥すればよい。
【００３５】本発明化合物０４０６ＴＰ−１を医薬とし
て投与する場合、本発明化合物をそのまま又は医薬的に
許容される無毒性かつ不活性の担体中に、例えば、０．
１％〜９９．５％好ましくは０．５％〜９０％含有する
医薬組成物として投与される。
て投与する場合、本発明化合物をそのまま又は医薬的に
許容される無毒性かつ不活性の担体中に、例えば、０．
１％〜９９．５％好ましくは０．５％〜９０％含有する
医薬組成物として投与される。
【００３６】担体としては、固形、半固形、又は液状の
希釈剤、充填剤、及びその他の処方用の助剤一種以上が
用いられる。医薬組成物は、投与単位形態で投与するこ
とが望ましい。本発明医薬組成物は、経口投与、組織内
投与、局所投与（経皮投与等）、又は経直腸的に投与す
る事ができる。これらの投与方法に適した剤型で投与さ
れるのはもちろんである。
希釈剤、充填剤、及びその他の処方用の助剤一種以上が
用いられる。医薬組成物は、投与単位形態で投与するこ
とが望ましい。本発明医薬組成物は、経口投与、組織内
投与、局所投与（経皮投与等）、又は経直腸的に投与す
る事ができる。これらの投与方法に適した剤型で投与さ
れるのはもちろんである。
【００３７】抗腫瘍剤または免疫抑制剤としての用量
は、年齢、体重等の患者の状態、投与経路、病気の性質
と程度等を考慮した上で調整することが望ましい。多量
に投与するときは、一日数回に分割して投与することが
望ましい。１０〜２０００mg／日程度の投与が一般的で
ある。
は、年齢、体重等の患者の状態、投与経路、病気の性質
と程度等を考慮した上で調整することが望ましい。多量
に投与するときは、一日数回に分割して投与することが
望ましい。１０〜２０００mg／日程度の投与が一般的で
ある。
【００３８】経口投与は固形又は液状の用量単位、例え
ば、末剤、散剤、錠剤、糖衣剤、カプセル剤、ドロップ
剤、舌下錠その他の剤型によって行う事ができる。
ば、末剤、散剤、錠剤、糖衣剤、カプセル剤、ドロップ
剤、舌下錠その他の剤型によって行う事ができる。
【００３９】末剤は、活性物質を適当な細かさにする事
により製造される。散剤は、活性物質を適当な細かさと
成し、次いで同様に細かくした医薬用担体、例えば、澱
粉、マンニトールの如き可食性炭水化物その他と混合す
ることにより製造される。必要に応じ、風味剤、保存
剤、分散剤、着色剤、香料その他のものを混じても良
い。
により製造される。散剤は、活性物質を適当な細かさと
成し、次いで同様に細かくした医薬用担体、例えば、澱
粉、マンニトールの如き可食性炭水化物その他と混合す
ることにより製造される。必要に応じ、風味剤、保存
剤、分散剤、着色剤、香料その他のものを混じても良
い。
【００４０】カプセル剤は、まず粉末状となった末剤や
散剤あるいは顆粒化したものを、例えばゼラチンカプセ
ルのようなカプセル外皮の中へ充填することにより製造
される。滑沢剤や流動化剤、例えばコロイド状のシリ
カ、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸
カルシウム、固形のポリエチレングリコールの如きもの
を粉末状態のものに混合し、然るのちに充填操作を行う
事もできる。崩壊剤や可溶化剤、例えばカルボキシメチ
ルセルロース、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムを添加
すれば、カプセル剤が摂取された時の医薬品の有効性を
改善する事ができる。また、本品の微粉末を植物油、ポ
リエチレングリコール、グリセリン、界面活性剤中に懸
濁分散し、これをゼラチンシートで包んで軟カプセル剤
とすることもできる。
散剤あるいは顆粒化したものを、例えばゼラチンカプセ
ルのようなカプセル外皮の中へ充填することにより製造
される。滑沢剤や流動化剤、例えばコロイド状のシリ
カ、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸
カルシウム、固形のポリエチレングリコールの如きもの
を粉末状態のものに混合し、然るのちに充填操作を行う
事もできる。崩壊剤や可溶化剤、例えばカルボキシメチ
ルセルロース、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムを添加
すれば、カプセル剤が摂取された時の医薬品の有効性を
改善する事ができる。また、本品の微粉末を植物油、ポ
リエチレングリコール、グリセリン、界面活性剤中に懸
濁分散し、これをゼラチンシートで包んで軟カプセル剤
とすることもできる。
【００４１】錠剤は、粉末混合物を作り、顆粒化若しく
はスラグ化し、次いで崩壊剤又は滑沢剤を加えたのち打
錠することにより製造される。
はスラグ化し、次いで崩壊剤又は滑沢剤を加えたのち打
錠することにより製造される。
【００４２】粉末混合物は、適当に粉末化された物質を
上述の希釈剤やベースと混合し、必要に応じ結合剤（例
えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、アルギン
酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルア
ルコールなど）、溶解遅延化剤（例えばパラフィンな
ど）、再吸収剤（例えば四級塩）及び／又は吸着剤（例
えばベントナイト、カオリン、リン酸ジカルシウムな
ど）を併用してもよい。粉末混合物は、まずシロップ、
でんぷん糊、アラビアゴム、セルロース溶液又は高分子
物質溶液などの結合剤で湿らせ、次いで篩を強制通過さ
せて顆粒とする事ができる。このように粉末を顆粒化す
るかわりに、まず打錠機にかけたのち、得られる不完全
な形態のスラグを破砕して顆粒にすることも可能であ
る。
上述の希釈剤やベースと混合し、必要に応じ結合剤（例
えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、アルギン
酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルア
ルコールなど）、溶解遅延化剤（例えばパラフィンな
ど）、再吸収剤（例えば四級塩）及び／又は吸着剤（例
えばベントナイト、カオリン、リン酸ジカルシウムな
ど）を併用してもよい。粉末混合物は、まずシロップ、
でんぷん糊、アラビアゴム、セルロース溶液又は高分子
物質溶液などの結合剤で湿らせ、次いで篩を強制通過さ
せて顆粒とする事ができる。このように粉末を顆粒化す
るかわりに、まず打錠機にかけたのち、得られる不完全
な形態のスラグを破砕して顆粒にすることも可能であ
る。
【００４３】このようにして作られる顆粒は、滑沢剤と
してステアリン酸、ステアリン酸塩、タルク、ミネラル
オイルその他を添加することにより、互いに付着する事
を防ぐ事ができる。このように滑沢化された混合物を、
次いで打錠する。また薬物は、上述のように顆粒化やス
ラグ化の工程を経ることなく、流動性の不活性担体と結
合したのちに直接打錠しても良い。シェラックの密閉被
膜からなる透明又は半透明の保護被膜、糖や高分子材料
の被覆、及びワックスよりなる磨上被覆の如きも用いう
る。
してステアリン酸、ステアリン酸塩、タルク、ミネラル
オイルその他を添加することにより、互いに付着する事
を防ぐ事ができる。このように滑沢化された混合物を、
次いで打錠する。また薬物は、上述のように顆粒化やス
ラグ化の工程を経ることなく、流動性の不活性担体と結
合したのちに直接打錠しても良い。シェラックの密閉被
膜からなる透明又は半透明の保護被膜、糖や高分子材料
の被覆、及びワックスよりなる磨上被覆の如きも用いう
る。
【００４４】他の経口投与剤型、例えば溶液、シロッ
プ、エリキシルなどもまたその一定量が含有するように
用量単位形態にする事ができる。シロップは、化合物を
適当な香味化水溶液に溶解して製造され、またエリキシ
ルは、非毒性のアルコール性担体中に分散させることに
より処方される。可溶化剤や乳化剤（例えばエトキシ化
されたイソステアリルアルコール類、ポリオキシエチレ
ンソルビトールエステル類、保存剤、風味賦与剤（例え
ばペパーミント油、サッカリン）その他もまた必要に応
じ添加できる。必要とあれば、経口投与のための用量単
位処方はマイクロカプセル化してもよい。該処方は、ま
た被覆をしたり、高分子・ワックス等中にうめ込んだり
することにより作用時間の延長や持続放出をもたらす事
もできる。
プ、エリキシルなどもまたその一定量が含有するように
用量単位形態にする事ができる。シロップは、化合物を
適当な香味化水溶液に溶解して製造され、またエリキシ
ルは、非毒性のアルコール性担体中に分散させることに
より処方される。可溶化剤や乳化剤（例えばエトキシ化
されたイソステアリルアルコール類、ポリオキシエチレ
ンソルビトールエステル類、保存剤、風味賦与剤（例え
ばペパーミント油、サッカリン）その他もまた必要に応
じ添加できる。必要とあれば、経口投与のための用量単
位処方はマイクロカプセル化してもよい。該処方は、ま
た被覆をしたり、高分子・ワックス等中にうめ込んだり
することにより作用時間の延長や持続放出をもたらす事
もできる。
【００４５】非経口的投与は、皮下・筋肉内又は静脈内
注射用としたところの液状用量単位形態、例えば溶液や
懸濁剤の形態を用いることによって行いうる。これらの
ものは、化合物の一定量を、注射の目的に適合する非毒
性の液状担体、例えば、水性や油性の媒体に懸濁し又は
溶解し、次いで該懸濁液又は溶液を滅菌することにより
製造される。あるいは化合物の一定量をバイアルにと
り、然るのち該バイアルとその内容物を滅菌し密閉して
も良い。投与直前に溶解又は混合するために、粉末又は
凍結乾燥した有効成分に添えて、予備的なバイアルや担
体を準備しても良い。注射液を等張にするために非毒性
の塩や塩溶液を添加しても良い。さらに安定剤、保存
剤、乳化剤の如きものを併用する事もできる。
注射用としたところの液状用量単位形態、例えば溶液や
懸濁剤の形態を用いることによって行いうる。これらの
ものは、化合物の一定量を、注射の目的に適合する非毒
性の液状担体、例えば、水性や油性の媒体に懸濁し又は
溶解し、次いで該懸濁液又は溶液を滅菌することにより
製造される。あるいは化合物の一定量をバイアルにと
り、然るのち該バイアルとその内容物を滅菌し密閉して
も良い。投与直前に溶解又は混合するために、粉末又は
凍結乾燥した有効成分に添えて、予備的なバイアルや担
体を準備しても良い。注射液を等張にするために非毒性
の塩や塩溶液を添加しても良い。さらに安定剤、保存
剤、乳化剤の如きものを併用する事もできる。
【００４６】直腸投与は、化合物を低融点の固体、例え
ばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級エステル類
（例えばパルミチン酸ミリスチルエステル）及びそれら
の混合物を混じた座剤を用いることによって行いうる。
ばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級エステル類
（例えばパルミチン酸ミリスチルエステル）及びそれら
の混合物を混じた座剤を用いることによって行いうる。
【００４７】本発明の新規化合物０４０６ＴＰ−１の医
薬品としての有効性は、各種の試験によって確認するこ
とが出来る。抗腫瘍活性は、in vitroで培養腫瘍細胞株
に対する細胞毒性を測定する方法や腫瘍細胞を移植した
マウスを用い延命率を測定する方法で確認できる。免疫
抑制活性は、マウス同種リンパ球混合反応（ＭＬＲ）に
おける幼若化阻害活性を測定する方法やマウスを用いin
vivoで同種細胞免疫による細胞障害性Ｔ細胞の誘導に
対する抑制効果を測定することで確認できる。また０４
０６ＴＰ−１の安全性は、マウスを用いた急性毒性試験
や反復投与毒性試験によって確認できる。以下、本発明
を実施例について更に詳しく説明するが、本発明は実施
例によって限定されるものではない。
薬品としての有効性は、各種の試験によって確認するこ
とが出来る。抗腫瘍活性は、in vitroで培養腫瘍細胞株
に対する細胞毒性を測定する方法や腫瘍細胞を移植した
マウスを用い延命率を測定する方法で確認できる。免疫
抑制活性は、マウス同種リンパ球混合反応（ＭＬＲ）に
おける幼若化阻害活性を測定する方法やマウスを用いin
vivoで同種細胞免疫による細胞障害性Ｔ細胞の誘導に
対する抑制効果を測定することで確認できる。また０４
０６ＴＰ−１の安全性は、マウスを用いた急性毒性試験
や反復投与毒性試験によって確認できる。以下、本発明
を実施例について更に詳しく説明するが、本発明は実施
例によって限定されるものではない。
【００４８】
【実施例１：発酵生産及び回収精製】 （１）発酵生産 Nocardia brasiliensis IFM0406株（FERM BP-5498）を
グリセロール２％、ポリペプトン（日本製薬株式会社）
１％、ツナ肉エキス０．５％、ｐＨ７．０からなる基本
培地１０mlを５０mｌ三角フラスコに分注したものに接
種し３０℃、７２時間振とう培養した。これを更に、同
培地１．５Ｌを５Ｌの三角フラスコに分注した培地に１
％ｖ／ｖで前記種培養物を接種し、同様前培養を行っ
た。この前培養液を同培地１５０Ｌを入れた２００Ｌタ
ンク培養槽に接種し、通気量１vvm、攪拌数２００rpm
３０℃、９０時間培養した。
グリセロール２％、ポリペプトン（日本製薬株式会社）
１％、ツナ肉エキス０．５％、ｐＨ７．０からなる基本
培地１０mlを５０mｌ三角フラスコに分注したものに接
種し３０℃、７２時間振とう培養した。これを更に、同
培地１．５Ｌを５Ｌの三角フラスコに分注した培地に１
％ｖ／ｖで前記種培養物を接種し、同様前培養を行っ
た。この前培養液を同培地１５０Ｌを入れた２００Ｌタ
ンク培養槽に接種し、通気量１vvm、攪拌数２００rpm
３０℃、９０時間培養した。
【００４９】（２）回収精製 得られた培養液１５０Ｌを濾布濾過することにより菌体
を除き、更に０．４５μｍのポアサイズを有する限外濾
過膜（ミリポア社製ペリコンカセットシステム）で濾過
することにより除菌した。この濾液画分をダイアイオン
ＨＰ２０（三菱樹脂株式会社）カラム１５×１００cmに
吸着させ、５０％メタノール溶液で十分洗浄し、夾雑物
を除き、１００％メタノール２０Ｌで溶出した。この溶
出画分をエバポレーターで濃縮後、凍結乾燥した。
を除き、更に０．４５μｍのポアサイズを有する限外濾
過膜（ミリポア社製ペリコンカセットシステム）で濾過
することにより除菌した。この濾液画分をダイアイオン
ＨＰ２０（三菱樹脂株式会社）カラム１５×１００cmに
吸着させ、５０％メタノール溶液で十分洗浄し、夾雑物
を除き、１００％メタノール２０Ｌで溶出した。この溶
出画分をエバポレーターで濃縮後、凍結乾燥した。
【００５０】この凍結乾燥物の一部分、０．５ｇを５０
mlの２０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解
し、ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍカラム（２．５×１０
cm）に吸着させ、５００mlの同緩衝液で溶出を行った。
溶出画分中の化合物０４０６ＴＰ−１の検出は、各画分
のＨＰＬＣ分析のパターンとマウス同種リンパ球混合反
応（ＭＬＲ）による免疫抑制活性とを対比したデータを
基に行い、本化合物の溶出画分を採取した。または、同
様に各画分についてのＨＰＬＣ分析のパターンと培養腫
瘍株Ｐ３８８及びそのアドリアマイシン耐性株（Ｐ３８
８／ＡＤＲ）に対する細胞毒性とを対比したデータを基
にし、本化合物の溶出画分を採取した。
mlの２０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解
し、ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍカラム（２．５×１０
cm）に吸着させ、５００mlの同緩衝液で溶出を行った。
溶出画分中の化合物０４０６ＴＰ−１の検出は、各画分
のＨＰＬＣ分析のパターンとマウス同種リンパ球混合反
応（ＭＬＲ）による免疫抑制活性とを対比したデータを
基に行い、本化合物の溶出画分を採取した。または、同
様に各画分についてのＨＰＬＣ分析のパターンと培養腫
瘍株Ｐ３８８及びそのアドリアマイシン耐性株（Ｐ３８
８／ＡＤＲ）に対する細胞毒性とを対比したデータを基
にし、本化合物の溶出画分を採取した。
【００５１】活性画分１００mlを集め、２Ｎ塩酸溶液で
ｐＨ４．０に調整し、ＣＭトヨパール６５０Ｍカラム
（２．５×１０cm）に吸着させ、２０mM酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ４．０）５００mlで溶出した。化合物０４０６ＴＰ−
１を含む画分１００mlを集め、エバポレーターで２mlに
濃縮後、Capcell pack C18 SG120（株式会社資生堂）３
×２５cmに吸着させた。０．１５％ＴＦＡ（トリフルオ
ロ酢酸）を含むアセトニトリルを用い、１８％〜５０％
アセトニトリルの濃度勾配溶出（３０ml／min、６０mi
n）を行った。２０mlを１画分とし、各画分をＨＰＬＣ
で分析し、化合物０４０６ＴＰ−１を含む画分１００ml
を集め、エバポレーターで濃縮乾燥後、減圧真空乾燥機
で乾燥し、粉末３．６mgを得た。
ｐＨ４．０に調整し、ＣＭトヨパール６５０Ｍカラム
（２．５×１０cm）に吸着させ、２０mM酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ４．０）５００mlで溶出した。化合物０４０６ＴＰ−
１を含む画分１００mlを集め、エバポレーターで２mlに
濃縮後、Capcell pack C18 SG120（株式会社資生堂）３
×２５cmに吸着させた。０．１５％ＴＦＡ（トリフルオ
ロ酢酸）を含むアセトニトリルを用い、１８％〜５０％
アセトニトリルの濃度勾配溶出（３０ml／min、６０mi
n）を行った。２０mlを１画分とし、各画分をＨＰＬＣ
で分析し、化合物０４０６ＴＰ−１を含む画分１００ml
を集め、エバポレーターで濃縮乾燥後、減圧真空乾燥機
で乾燥し、粉末３．６mgを得た。
【００５２】
【実施例２：抗腫瘍活性】 （１）培養腫瘍細胞株に対する細胞毒性試験 培養腫瘍細胞Ｐ３８８及びＰ３８８／ＡＤＲ株を、１０
％熱不活性化牛胎児血清（ＦＣＳ）、２０μＭ ２−メ
ルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁
し、細胞浮遊液（５×１０4 cells／ml)を調製した。
％熱不活性化牛胎児血清（ＦＣＳ）、２０μＭ ２−メ
ルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁
し、細胞浮遊液（５×１０4 cells／ml)を調製した。
【００５３】被検体は、メタノールに溶解後、ＲＰＭＩ
１６４０培地を用いて希釈し、０．１mg／ml濃度から２
倍希釈を順次繰り返し調製した。細胞浮遊液１８０μｌ
と被検体液２０μｌを９６穴マイクロプレートに分注
し、５％炭酸ガス−９５％空気の湿潤環境下、３７℃で
培養した。７２時間後、臭化３−（４，５−ジメチル−
２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラ
ゾリウム（ＭＴＴ）を用いた色素定量法により細胞の生
育を測定した。すなわち、２mg／ml ＭＴＴ溶液を２０
μｌずつ各ウェルに添加し、４時間、３７℃で培養し
た。その後、２０％ドデシル硫酸ナトリウムを含む５０
％ジメチルホルムアミド溶液５０μｌを加えて放置し、
形成された紫色のホルマザン結晶を溶解させ、マイクロ
プレート吸光光度計（イムノリーダー）を用いて５７０
nmにおける吸光度を測定し、生育の指標とした。結果
は、下記数１で示される式より抑制率を算出し、被検体
濃度と抑制率の関係から、生育を５０％阻害する被検体
濃度（ＩＣ50）で表示した。
１６４０培地を用いて希釈し、０．１mg／ml濃度から２
倍希釈を順次繰り返し調製した。細胞浮遊液１８０μｌ
と被検体液２０μｌを９６穴マイクロプレートに分注
し、５％炭酸ガス−９５％空気の湿潤環境下、３７℃で
培養した。７２時間後、臭化３−（４，５−ジメチル−
２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラ
ゾリウム（ＭＴＴ）を用いた色素定量法により細胞の生
育を測定した。すなわち、２mg／ml ＭＴＴ溶液を２０
μｌずつ各ウェルに添加し、４時間、３７℃で培養し
た。その後、２０％ドデシル硫酸ナトリウムを含む５０
％ジメチルホルムアミド溶液５０μｌを加えて放置し、
形成された紫色のホルマザン結晶を溶解させ、マイクロ
プレート吸光光度計（イムノリーダー）を用いて５７０
nmにおける吸光度を測定し、生育の指標とした。結果
は、下記数１で示される式より抑制率を算出し、被検体
濃度と抑制率の関係から、生育を５０％阻害する被検体
濃度（ＩＣ50）で表示した。
【００５４】
【数１】
【００５５】その結果は表７に示した。０４０６ＴＰ−
１は培養腫瘍細胞に対して強い細胞毒性（抗癌活性）を
有しており、また、抗癌剤耐性細胞（アドリアマイシン
耐性細胞）にも強力な生育阻害活性を有しており、抗腫
瘍剤として有効であることが確認された。
１は培養腫瘍細胞に対して強い細胞毒性（抗癌活性）を
有しており、また、抗癌剤耐性細胞（アドリアマイシン
耐性細胞）にも強力な生育阻害活性を有しており、抗腫
瘍剤として有効であることが確認された。
【００５６】
【表７】
【００５７】（２）マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏ抗腫
瘍試験 ０４０６ＴＰ−１の生体内での抗腫瘍活性を調べるた
め、Ｐ３８８及びＰ３８８／ＡＤＲを移植したマウスを
用いて抗腫瘍試験を行った。０４０６ＴＰ−１及び比較
対照としてアドリアシン（一般名アドリアマイシン、協
和発酵（株））各々を１mg／ml、０．５mg／ml、０．１
mg／mlになるよう注射用蒸留水に溶解し、検液とした。
ＣＤＦ1マウス（オス、体重２０ｇ １０匹／１群）に
Ｐ３８８又はＰ３８８／ＡＤＲを２×１０5個腹腔内接
種し、翌日から１日１回、１０日間連続で各濃度の検液
を２００μｌ腹腔内に注射することにより各物質を各々
１０、５、１mg／kg体重／day投与した。投与後のマウ
スの経時的生存数を計数し、平均生存日数及び延命率を
算出した。また１０日後の平均体重も測定し、表８の結
果を得た。
瘍試験 ０４０６ＴＰ−１の生体内での抗腫瘍活性を調べるた
め、Ｐ３８８及びＰ３８８／ＡＤＲを移植したマウスを
用いて抗腫瘍試験を行った。０４０６ＴＰ−１及び比較
対照としてアドリアシン（一般名アドリアマイシン、協
和発酵（株））各々を１mg／ml、０．５mg／ml、０．１
mg／mlになるよう注射用蒸留水に溶解し、検液とした。
ＣＤＦ1マウス（オス、体重２０ｇ １０匹／１群）に
Ｐ３８８又はＰ３８８／ＡＤＲを２×１０5個腹腔内接
種し、翌日から１日１回、１０日間連続で各濃度の検液
を２００μｌ腹腔内に注射することにより各物質を各々
１０、５、１mg／kg体重／day投与した。投与後のマウ
スの経時的生存数を計数し、平均生存日数及び延命率を
算出した。また１０日後の平均体重も測定し、表８の結
果を得た。
【００５８】
【表８】
【００５９】アドリアマイシンは、それ自体の毒性のた
め５mg／kg体重／day以上の投与での治療効果は認めら
れなかった。Ｐ３８８移植系では、アドリアマイシン
（１mg／kg体重／day）投与群と０４０６ＴＰ−１投与
群ではほぼ同程度の治療効果（延命率の上昇）が認めら
れた。一方、Ｐ３８８／ＡＤＲ移植系では、移植腫瘍細
胞がアドリアマイシン耐性のため、アドリアマイシンの
治療効果は認められなかったのに対し、０４０６ＴＰ−
１投与群では著しい治療効果が認められた。これらの効
果から、０４０６ＴＰ−１は生体内において抗腫瘍効果
を示すことが示唆された。
め５mg／kg体重／day以上の投与での治療効果は認めら
れなかった。Ｐ３８８移植系では、アドリアマイシン
（１mg／kg体重／day）投与群と０４０６ＴＰ−１投与
群ではほぼ同程度の治療効果（延命率の上昇）が認めら
れた。一方、Ｐ３８８／ＡＤＲ移植系では、移植腫瘍細
胞がアドリアマイシン耐性のため、アドリアマイシンの
治療効果は認められなかったのに対し、０４０６ＴＰ−
１投与群では著しい治療効果が認められた。これらの効
果から、０４０６ＴＰ−１は生体内において抗腫瘍効果
を示すことが示唆された。
【００６０】
【実施例３：免疫抑制活性】 （１）マウス同種リンパ球混合反応試験（ＭＬＲ） 試料調製は、実施例１で製造した精製０４０６ＴＰ−１
を１mg／ml濃度で滅菌蒸留水に溶かした後、ＲＰＭＩ１
６４０培地で順次希釈した。
を１mg／ml濃度で滅菌蒸留水に溶かした後、ＲＰＭＩ１
６４０培地で順次希釈した。
【００６１】検定のマウスリンパ球混合反応（ＭＬＲ）
は、Hatanaka らの方法(Hatanakaら，J. Antibiotics,
41, 1592-1601(1988)）に準じて行った。すなわち、反
応細胞としてＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２ｂ）の脾細
胞を、刺激細胞としてＢＡＬＢ／Ｃマウス（Ｈ−２ｄ）
の脾臓細胞をマイトマイシンＣ処理したものを用い、混
合培養することによって行った。
は、Hatanaka らの方法(Hatanakaら，J. Antibiotics,
41, 1592-1601(1988)）に準じて行った。すなわち、反
応細胞としてＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２ｂ）の脾細
胞を、刺激細胞としてＢＡＬＢ／Ｃマウス（Ｈ−２ｄ）
の脾臓細胞をマイトマイシンＣ処理したものを用い、混
合培養することによって行った。
【００６２】反応細胞の調製は、以下の方法で行った。
５〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスより脾臓を摘出し、
１０％熱処理不活性化牛胎児血清（ＦＣＳ）を加えた氷
冷ＲＰＭＩ１６４０培地２０ml中でホモゲナイズ後、ガ
ーゼ濾過することで単細胞浮遊液を得た。遠心により回
収後、ＲＰＭＩ１６４０培地４mlに懸濁し、０．１５Ｍ
塩化アンモニウム、１ｍＭ炭酸水素ナトリウム及び０．
１ｍＭエチレンジアミン四酢酸四ナトリウムを含む溶液
（ｐＨ７．２）６mlを添加して０℃で１分間インキュベ
ートし、混在する赤血球細胞を除いた。これにＲＰＭＩ
１６４０培地を加え、遠心分離し、さらに３回同培地２
０mlで遠心洗浄後５０μＭ ２−メルカプトエタノー
ル、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて
５．６×１０6／mlに調製し、反応細胞浮遊液とした。
５〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスより脾臓を摘出し、
１０％熱処理不活性化牛胎児血清（ＦＣＳ）を加えた氷
冷ＲＰＭＩ１６４０培地２０ml中でホモゲナイズ後、ガ
ーゼ濾過することで単細胞浮遊液を得た。遠心により回
収後、ＲＰＭＩ１６４０培地４mlに懸濁し、０．１５Ｍ
塩化アンモニウム、１ｍＭ炭酸水素ナトリウム及び０．
１ｍＭエチレンジアミン四酢酸四ナトリウムを含む溶液
（ｐＨ７．２）６mlを添加して０℃で１分間インキュベ
ートし、混在する赤血球細胞を除いた。これにＲＰＭＩ
１６４０培地を加え、遠心分離し、さらに３回同培地２
０mlで遠心洗浄後５０μＭ ２−メルカプトエタノー
ル、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて
５．６×１０6／mlに調製し、反応細胞浮遊液とした。
【００６３】刺激細胞の調製は、５〜６週齢のＢＡＬＢ
／Ｃマウスより脾臓を摘出し、同様の方法で調製した脾
臓細胞浮遊液に２５μｇ／mlのマイトマイシンＣを添加
し、３７℃、３０分間インキュベートした。これにＲＰ
ＭＩ１６４０培地２０mlを加え、遠心分離し、さらに３
回同培地（２０ml）で遠心洗浄後、５０μＭ ２−メル
カプトエタノール、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４
０培地を用いて５．６×１０6個／mlに調製し、刺激細
胞浮遊液とした。
／Ｃマウスより脾臓を摘出し、同様の方法で調製した脾
臓細胞浮遊液に２５μｇ／mlのマイトマイシンＣを添加
し、３７℃、３０分間インキュベートした。これにＲＰ
ＭＩ１６４０培地２０mlを加え、遠心分離し、さらに３
回同培地（２０ml）で遠心洗浄後、５０μＭ ２−メル
カプトエタノール、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４
０培地を用いて５．６×１０6個／mlに調製し、刺激細
胞浮遊液とした。
【００６４】反応細胞液９０μｌと刺激細胞液９０μｌ
及び被検体液２０μｌを９６穴マイクロプレートに加
え、３７℃、５％ＣＯ2−９５％空気の湿潤条件下で９
６時間培養を行った。リンパ球の幼若化はトリチウム化
チミジンの取り込みを測定することにより調べた。９６
時間培養後各ウエルに２５μＣｉ／mlのトリチウム化チ
ミジンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を２０μl添加し、
０．５μＣｉ／ウエルずつパルス標識した。更に４時間
インキュベート後、マルチプル試料収集機を用い、グラ
スファイバー濾紙上に培養物を集めた。個々のウエルに
対応する濾紙ディスクの放射活性を液体シンチレーショ
ン測定法により測定した（ベータカウンター）。重複し
て検定したウエル毎の１分間のカウント数（ｃｐｍ）の
平均を計算し、結果はトリチウム化チミジン取り込み
（幼若化）の阻害の度合をＩＣ50で表９に表示した。対
照としてシクロスポリンＡの結果を示した。
及び被検体液２０μｌを９６穴マイクロプレートに加
え、３７℃、５％ＣＯ2−９５％空気の湿潤条件下で９
６時間培養を行った。リンパ球の幼若化はトリチウム化
チミジンの取り込みを測定することにより調べた。９６
時間培養後各ウエルに２５μＣｉ／mlのトリチウム化チ
ミジンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を２０μl添加し、
０．５μＣｉ／ウエルずつパルス標識した。更に４時間
インキュベート後、マルチプル試料収集機を用い、グラ
スファイバー濾紙上に培養物を集めた。個々のウエルに
対応する濾紙ディスクの放射活性を液体シンチレーショ
ン測定法により測定した（ベータカウンター）。重複し
て検定したウエル毎の１分間のカウント数（ｃｐｍ）の
平均を計算し、結果はトリチウム化チミジン取り込み
（幼若化）の阻害の度合をＩＣ50で表９に表示した。対
照としてシクロスポリンＡの結果を示した。
【００６５】
【表９】
【００６６】（２）マウス細胞障害性Ｔ細胞誘導試験 生体内での免疫抑制活性の指標としてマウス同種細胞免
疫による細胞障害性Ｔ細胞の誘導に対する０４０６ＴＰ
−１及び比較対照として上市免疫抑制剤であるシクロス
ポリンＡの抑制効果を調べた。試験は Fujita らの方法
（ Fujita ら，J. Antibiotics, 47, 208-215 (1994)）
に準じて行った。８週齢、メスのＣ５７ＢＬ／６マウス
（Ｈ−２ｂ）をＤＢＡ／２（Ｈ−２ｄ）由来の培養細胞
Ｐ８１５液（５×１０7個／ml ＰＢＳ液）を０．２mlマ
ウス腹腔内に投与することで免疫し、免疫当日から0.１
mg／mlの被検体を0.2〜0.3ml投与することで、１mg／kg
体重／dayの用量で５日間腹腔内投与した。
疫による細胞障害性Ｔ細胞の誘導に対する０４０６ＴＰ
−１及び比較対照として上市免疫抑制剤であるシクロス
ポリンＡの抑制効果を調べた。試験は Fujita らの方法
（ Fujita ら，J. Antibiotics, 47, 208-215 (1994)）
に準じて行った。８週齢、メスのＣ５７ＢＬ／６マウス
（Ｈ−２ｂ）をＤＢＡ／２（Ｈ−２ｄ）由来の培養細胞
Ｐ８１５液（５×１０7個／ml ＰＢＳ液）を０．２mlマ
ウス腹腔内に投与することで免疫し、免疫当日から0.１
mg／mlの被検体を0.2〜0.3ml投与することで、１mg／kg
体重／dayの用量で５日間腹腔内投与した。
【００６７】免疫９日後にマウスより脾臓を摘出し、１
０％ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ１６４０培地２０ml中でホ
モゲナイズ後、ガーゼ濾過した。遠心により回収した
後、ＲＰＭＩ１６４０培地４mlに懸濁し、０．１５Ｍ塩
化アンモニウム、１ｍＭ炭酸水素ナトリウム及び０．１
ｍＭエチレンジアミン四酢酸四ナトリウムを含む溶液
（ｐＨ７．２）６mlを添加して０℃で１分間インキュベ
ートし、混在する赤血球を除いた。これにＲＰＭＩ１６
４０培地２０mlを加え、遠心分離し、さらに３回同培地
２０mlで遠心洗浄後、１０％ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ１
６４０培地中に懸濁し、単細胞浮遊液とした後、エフェ
クター細胞として用いた。標的細胞としてＰ８１５を
０．１μＣｉのＮａ2 51ＣｒＯ4を含むダルベッコ Minim
um Essential Medium （Ｄ−ＭＥＭ）中で３７℃、３時
間インキュベートすることにより、51Ｃｒを細胞内に取
り込ませた後、Ｄ−ＭＥＭ ２０mlで３回遠心洗浄し、
１０％ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁
し、２×１０5個／mlに調製した。細胞障害活性の測定
はエフェクター細胞浮遊液１００μｌと標的細胞浮遊液
１００μｌを９６穴丸底マイクロプレートに加え、３７
℃にて４時間培養した後、遠心分離を行い、上清中に放
出される51Ｃｒ量を測定し、下記数２で示される式より
細胞障害活性を算出した。
０％ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ１６４０培地２０ml中でホ
モゲナイズ後、ガーゼ濾過した。遠心により回収した
後、ＲＰＭＩ１６４０培地４mlに懸濁し、０．１５Ｍ塩
化アンモニウム、１ｍＭ炭酸水素ナトリウム及び０．１
ｍＭエチレンジアミン四酢酸四ナトリウムを含む溶液
（ｐＨ７．２）６mlを添加して０℃で１分間インキュベ
ートし、混在する赤血球を除いた。これにＲＰＭＩ１６
４０培地２０mlを加え、遠心分離し、さらに３回同培地
２０mlで遠心洗浄後、１０％ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ１
６４０培地中に懸濁し、単細胞浮遊液とした後、エフェ
クター細胞として用いた。標的細胞としてＰ８１５を
０．１μＣｉのＮａ2 51ＣｒＯ4を含むダルベッコ Minim
um Essential Medium （Ｄ−ＭＥＭ）中で３７℃、３時
間インキュベートすることにより、51Ｃｒを細胞内に取
り込ませた後、Ｄ−ＭＥＭ ２０mlで３回遠心洗浄し、
１０％ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁
し、２×１０5個／mlに調製した。細胞障害活性の測定
はエフェクター細胞浮遊液１００μｌと標的細胞浮遊液
１００μｌを９６穴丸底マイクロプレートに加え、３７
℃にて４時間培養した後、遠心分離を行い、上清中に放
出される51Ｃｒ量を測定し、下記数２で示される式より
細胞障害活性を算出した。
【００６８】
【数２】
【００６９】細胞障害性Ｔ細胞の活性はＬｙｔｉｃ ｕ
ｎｉｔ（ＬＵ）にて表示した。ＬＵは標的細胞２×１０
4個を２０％破壊するのに必要なエフェクター細胞数を
１ＬＵとし、脾臓あたりのＬＵで示した。また同様に、
マウスを免疫後、１mg／ml の被検体を０．２〜０．３m
l投与することで１０mg／kg体重／dayの用量になるよう
５日間腹腔内投与し、細胞障害活性を測定した。これら
の結果を表１０に示した。
ｎｉｔ（ＬＵ）にて表示した。ＬＵは標的細胞２×１０
4個を２０％破壊するのに必要なエフェクター細胞数を
１ＬＵとし、脾臓あたりのＬＵで示した。また同様に、
マウスを免疫後、１mg／ml の被検体を０．２〜０．３m
l投与することで１０mg／kg体重／dayの用量になるよう
５日間腹腔内投与し、細胞障害活性を測定した。これら
の結果を表１０に示した。
【００７０】
【表１０】
【００７１】０４０６ＴＰ−１は腹腔内への投与により
同種細胞免疫マウスの脾細胞中の細胞障害性Ｔ細胞の誘
導を抑制することが示された。このことは臓器移植等で
生ずる拒絶反応を抑制（免疫抑制）しうることを示して
いる。
同種細胞免疫マウスの脾細胞中の細胞障害性Ｔ細胞の誘
導を抑制することが示された。このことは臓器移植等で
生ずる拒絶反応を抑制（免疫抑制）しうることを示して
いる。
【００７２】
【実施例４：毒性試験】 （１）急性毒性試験 ０４０６ＴＰ−１を１０mg／mlになるよう５％グルコー
ス水溶液に溶解し、検液とした。ＩＣＲ系マウス（ＳＰ
Ｆ、オス、体重２０ｇ）５頭に対して尾静脈より検液を
２００μｌ注射することにより０４０６ＴＰ−１を１０
０mg／kg体重投与した。投与後１ヶ月間の経時的生存を
観察したところ死亡例は認められなかった。よって０４
０６ＴＰ−１の尾静脈単回投与によるＬＤ50値を＞１０
０mg／kg体重と算出した。この結果から本物質の低毒性
及び安全性が示唆された。
ス水溶液に溶解し、検液とした。ＩＣＲ系マウス（ＳＰ
Ｆ、オス、体重２０ｇ）５頭に対して尾静脈より検液を
２００μｌ注射することにより０４０６ＴＰ−１を１０
０mg／kg体重投与した。投与後１ヶ月間の経時的生存を
観察したところ死亡例は認められなかった。よって０４
０６ＴＰ−１の尾静脈単回投与によるＬＤ50値を＞１０
０mg／kg体重と算出した。この結果から本物質の低毒性
及び安全性が示唆された。
【００７３】（２）反復投与毒性試験 ０４０６ＴＰ−１を１mg／ml、０．５mg／ml、０．１mg
／mlになるよう注射用蒸留水に溶解し、検液とした。比
較対照として、アドリアマイシンも同様に検液を調製し
た。ＣＤＦ1マウス（オス、体重２１〜２２ｇ １０匹
／１群）に各検液を１日１回１０日間連続で腹腔内に２
１０〜２２０μｌ注射することにより各物質を１０、
５、１mg／kg体重／day投与した。投与後の経時的生存
数と０日目、５日目、１０日目の平均体重を測定し表１
１の結果を得た。
／mlになるよう注射用蒸留水に溶解し、検液とした。比
較対照として、アドリアマイシンも同様に検液を調製し
た。ＣＤＦ1マウス（オス、体重２１〜２２ｇ １０匹
／１群）に各検液を１日１回１０日間連続で腹腔内に２
１０〜２２０μｌ注射することにより各物質を１０、
５、１mg／kg体重／day投与した。投与後の経時的生存
数と０日目、５日目、１０日目の平均体重を測定し表１
１の結果を得た。
【００７４】
【表１１】
【００７５】上記の結果からも明らかなように、アドリ
アマイシン投与群は死亡例が見られ、体重増加も対照に
比べ劣るのに対し、０４０６ＴＰ−１投与群は死亡例も
なく、順調な体重増加を示した。本結果からも０４０６
ＴＰ−１の低毒性及び安全性が示唆された。
アマイシン投与群は死亡例が見られ、体重増加も対照に
比べ劣るのに対し、０４０６ＴＰ−１投与群は死亡例も
なく、順調な体重増加を示した。本結果からも０４０６
ＴＰ−１の低毒性及び安全性が示唆された。
【００７６】
【実施例５：点滴剤の製造】０４０６ＴＰ−１ ６０mg
を５％ブドウ糖溶液６０mlに溶解させ、この溶液を５％
ブドウ糖溶液４４０mlに混合し点滴剤とした。
を５％ブドウ糖溶液６０mlに溶解させ、この溶液を５％
ブドウ糖溶液４４０mlに混合し点滴剤とした。
【００７７】
【実施例６：錠剤の製造】 （１）０４０６ＴＰ−１ ５０ｇ、（２）ラクトース９
０ｇ、（３）コーンスターチ２９ｇ、（４）ステアリン
酸マグネシウム１ｇを原料として用い、錠剤を製造し
た。すなわち、（１）、（２）及び（３）（但し１７
ｇ）を混合し、（３）（但し７ｇ）から調製したペース
トとともに顆粒化した。得られた顆粒に（３）（但し５
ｇ）と（４）を加えてよく混合し、この混合物を圧縮錠
剤機により圧縮して、１錠あたり有効成分である０４０
６ＴＰ−１を５０mg含有する錠剤１０００個を製造し
た。
０ｇ、（３）コーンスターチ２９ｇ、（４）ステアリン
酸マグネシウム１ｇを原料として用い、錠剤を製造し
た。すなわち、（１）、（２）及び（３）（但し１７
ｇ）を混合し、（３）（但し７ｇ）から調製したペース
トとともに顆粒化した。得られた顆粒に（３）（但し５
ｇ）と（４）を加えてよく混合し、この混合物を圧縮錠
剤機により圧縮して、１錠あたり有効成分である０４０
６ＴＰ−１を５０mg含有する錠剤１０００個を製造し
た。
【００７８】
【発明の効果】本発明は、化合物０４０６ＴＰ−１を提
供するものである。本化合物は新規化合物であって、す
ぐれた生理活性を有し、抗腫瘍剤、免疫抑制剤等として
各種の医薬品に利用することができる。
供するものである。本化合物は新規化合物であって、す
ぐれた生理活性を有し、抗腫瘍剤、免疫抑制剤等として
各種の医薬品に利用することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:365） (72)発明者 矢沢 勝清 船橋市三山９−13−１ (72)発明者 小林 淳一 札幌市西区８軒２条西４丁目１−14−16
Claims (4)
- 【請求項１】 下記化１に示される一般式（１）を有す
る化合物０４０６ＴＰ−１又はその医薬的に許容される
塩。 【化１】 （式中、Ａｃはアセチル基、Ｍｅはメチル基を表わ
す。） - 【請求項２】 請求項１に記載の化合物０４０６ＴＰ−
１またはその医薬的に許容される塩を有効成分とする免
疫抑制剤。 - 【請求項３】 請求項１に記載の化合物０４０６ＴＰ−
１またはその医薬的に許容される塩を有効成分とする抗
腫瘍剤。 - 【請求項４】 Nocardia属に属する請求項１に記載の化
合物０４０６ＴＰ−１生産菌を培養し、培養物より該化
合物を採取することを特徴とする請求項１に記載の化合
物０４０６ＴＰ−１またはその塩の製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26110697A JP3688446B2 (ja) | 1997-01-23 | 1997-09-10 | 新規テルペン系化合物０４０６ｔｐ−１ |
| EP98101064A EP0855402B1 (en) | 1997-01-23 | 1998-01-22 | Novel terpenoid compound 0406TP-1 |
| DE69804689T DE69804689T2 (de) | 1997-01-23 | 1998-01-22 | Terpenoid Verbindung 0406TP-1 |
| US09/010,589 US5932555A (en) | 1997-01-23 | 1998-01-22 | Terpenoid compound 0406TP-1 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2310997 | 1997-01-23 | ||
| JP9-23109 | 1997-01-23 | ||
| JP26110697A JP3688446B2 (ja) | 1997-01-23 | 1997-09-10 | 新規テルペン系化合物０４０６ｔｐ−１ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10265491A true JPH10265491A (ja) | 1998-10-06 |
| JP3688446B2 JP3688446B2 (ja) | 2005-08-31 |
Family
ID=26360412
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26110697A Expired - Fee Related JP3688446B2 (ja) | 1997-01-23 | 1997-09-10 | 新規テルペン系化合物０４０６ｔｐ−１ |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5932555A (ja) |
| EP (1) | EP0855402B1 (ja) |
| JP (1) | JP3688446B2 (ja) |
| DE (1) | DE69804689T2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040138187A1 (en) | 2002-08-28 | 2004-07-15 | Reading Christopher L. | Therapeutic treatment methods |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09295980A (ja) * | 1996-04-30 | 1997-11-18 | Higeta Shoyu Co Ltd | 新規マクロライド系化合物０４０６ |
-
1997
- 1997-09-10 JP JP26110697A patent/JP3688446B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-01-22 US US09/010,589 patent/US5932555A/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-01-22 EP EP98101064A patent/EP0855402B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-22 DE DE69804689T patent/DE69804689T2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0855402A1 (en) | 1998-07-29 |
| US5932555A (en) | 1999-08-03 |
| DE69804689T2 (de) | 2003-06-26 |
| JP3688446B2 (ja) | 2005-08-31 |
| DE69804689D1 (de) | 2002-05-16 |
| EP0855402B1 (en) | 2002-04-10 |
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