JPS5953243B2 - 制癌剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗生物質ＡＮＳ−１２７Ａ物質を有効成分と
して含有することを特徴とする新規な制癌剤に関するも
のである。

従来、癌化学療法剤として、アルキル化剤（ナイトロジ
エンマスタード類、工６レンイミン類、スルフォン酸エ
ステル類）、代謝拮抗物質（葉酸拮抗剤、プリン拮抗剤
、ピリミジン拮抗剤）、植物性核分裂前（コルセミド、
ビンブラスチン等）抗生物質（ザルコマイシン、カルチ
ノフイリン、マイトマイシン等）、ホルモン類（副賢ス
テロイド、男性ホルモン、女性ホルモン）及びポルフィ
リン錯塩（マーフィリン、ｃｏｐｐ ）等が用いられて
いる。

しかしながら、その殆んどは、細胞毒型の物質であり、
重大な副作用を呈するため、低毒性で優れた制癌活性を
有する制癌剤の開発が強く望まれている。

本発明者らは、低毒性で制癌活性を有する物質を探索し
て、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ）
属に属する微生物の代謝産物の生理活性につき、鋭意研
究の結果、新規抗生物質ＡＭＳ−１２７Ａ物質が、著し
く低毒性で、優れた制癌活性を有することを見出し、こ
の物質が癌治療に顕著な効果を発揮し得ることの新たな
知見を得て、本発明の制癌剤を完成するに至った。

本発明の制癌剤の有効成分は、人、家畜、犬、猫等の温
血動物に対する優れた癌化学療法剤となり得るものであ
る。

本発明に用いる制癌活性を有する抗生物質ＡＮＳ−１２
７Ａ物質について、以下説明する。

本発明の制癌活性抗生物質を産出する微生物は、ＡＭＳ
−１２７Ａ物質の生産能を有するストレプトミセス属に
属する菌種である。

その一例として、ストレプトミセス・エスピー・７９−
ＡＮ Ｓ−１２７（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ
・７９−ＡＮＳ−１２７）と呼称される微生物が前記
の特性を有する新菌株で、本発明の有効成分であるＡＮ
Ｓ−１２７Ａ物質を有利忙生産するものであり、有効に
利用し得る微生物として挙げられる。

捷た、前記ストレプトミセス・エスピー・７９−ＡＮＳ
−１２７の自然的及び人工的変異株は勿論、ストレプト
ミセス属に属する菌種で、ＡＮＳ−１２７Ａ物質の生産
能を有する微生物は、すべて使用することができる。

前記ストレプトミセス・エスピー・７９−ＡＮＳ−１２
７（以下、単に「ＡＮＳ−１２７株」という。

）は、本発明者によって埼玉県和交市で採取された土壌
試料中より発見された微生物であり、工業技術院微生物
工業技術研究所に昭和５６年３月６日付寄託され、その
微生物受託番号は、微工研菌寄第５９０１号である ＡＮＳ−１２７株は、次の菌学的性質を有する。

（Ｉ） 形態 イーストエキス・マルトエキス寒天培地及び無機塩澱粉
寒天培地上の生育について顕微鏡観察を行った結果、Ａ
ＮＳ−１２７株は、ストレプトミセス属に属する形態を
示し、その形態的特徴は次のとおりである。

１）基生菌糸 寒天中に良く生育し、良く分岐している。

２）気菌糸 色は灰色糸で、短かく、ゆるやかに屈曲し、時にゆるい
不完全ならせん糸を形成する。

分岐は少なく、輪生枝を形成しない。

電子顕微鏡によると、胞子の形状は、長円形シ又は楕円
形で、その大きさは０．９〜１．２μ×０．７〜１．０
μであり、表面は平滑である。

卸 各種培地上の性質 特許庁産業別審査基準に従い、各種培地を調整し、接種
後、２〜３週間後に観察した結果な シ次に記載する。

なお、色調の記載において０内の記号は干イスク１１ブ
チイブ・カラー・ネームズ・ディクショナリー（Ｄｅｓ
ｃｒｉｐｔｉｖｅ ＣｏｌｏｒＮａｍｅｓ Ｄｉｃｔｉ
ｏｎａｒい第４版色名記号に従ったものである。

５（１）シューク
ロース・硝酸寒天培地 生育：極めて悪く、薄く表面に生育する。

基生菌糸の色は無色である。

気菌糸二着生しない。

可溶性色素：生成しない。

３（２）グルコース・アスパラギン寒
天培地生育：普通の生育が見られ、裏面の菌体の色はク
リーム色（１／２ ｃａ）である。

気菌糸：着生しないか、僅かに灰色 （２ｉｈ）の気菌糸を着生する。

４可溶性色素：生成しない。

（３） グリセリン・アスパラギン寒天培地生育：良
好な生育を示し、裏面の菌体の色は明るい茶灰色（２ｇ
ｅ）を経そ濃 い褐色（２ｐｎ）となる。

気菌糸二重ばらに着生し、ベルベット状でベージュ・グ
レー（３ｉｈ）ないし 灰色（５ｉｈ）を呈する。

可溶性色素：生成しない。

（４）無機塩・澱粉寒天培地 生育：良好な生育を示し、裏面の菌体の色は濃い褐色（
２ｐｎ）を呈する。

気菌糸：豊富に着生し、粉状で灰色 （５ｉｈ 〜５ｆｅ） を呈する 可溶性色素：生成しない。

（５）チロシン寒天培地 生育：良好な生育が見られ、裏面の菌体の色はオリーブ
灰色（１′ｖ２ｉ ｇ）な いしオリーブ黒色（１’１２ｐｎ）を 呈する。

気菌糸：良く着生し、粉状で明るい茶灰色（２ｆｅ〜３
ｉｈ） を呈する。

可溶性色素：生成しない。

（６）栄養寒天培地 生育：やや不良で、表面は平滑、透明の生育が見られ、
菌体の色は淡黄色 （２ｇｃ）を示す。

気菌糸：着生しない。

可溶性色素：生成しない。

（７） イースト・エキストラクト、マルト・エキス
トラクト寒天培地 生育：極めて良好な生育を示し、裏面の菌体の色は明る
い褐色（３ｎ ｉ ）より暗い褐色（３ｐｎ）を呈する
。

気菌糸：良く着生し、粉状で灰色（３ｉｈ）を呈する。

可溶性色素：褐色の可溶性色素を生成する。

（８）オートミール寒天培地 生育：極めて良好な生育を示し、平滑、拡がった生育が
見られ、菌体の色は灰 黒色（５ｍｉ）を呈する。

気菌糸：豊富に着生し、粉状で灰色 （３ｉｈ〜５ｉｈ）を呈する。

可溶性色素：生成しない。

（９） ペプトン・イーストエキストラクト・鉄寒天
培地 生育：生育は不良、表面は平滑で透明である。

気菌糸二着生しない。

可溶性色素：生成しない。

（ト）生理的性質 （１）生育温度：２７℃で最適の生育が見られる。

（２）澱粉分解カニ強い。

（３）脱脂粉乳：徐々にペプトン化する。

（４）メラニン様色素の生成：栄養寒天培地、チロシン
寒天培地、ペプトン・イーストエキストラクト・鉄寒天
培地上では、メラニン様色素の生成は見られないが、イ
ースト・エキストラクト・マルト・エキストラクト寒天
培地上でメラニン様の褐色の色素を生成する。

（５） ゼラチンの液化カニ液化しない。

（６）硝酸塩還元：還元しない。

■各種炭素源の利用性 プリダハムによる糖料用培地〔ディフコ （Ｄｉｆｃｏ ）製〕に等積の糖を添加してＡＮＳ−１
２７株を培養しンこ結果は次のとおりである。

（糖類） （生育） Ｌ−アラビノース 丑 り−キシロース ＋ Ｄ−グルコース 廿 り−フラクトース ± シュークロース ± Ｌ−イノシトール − Ｌ−ラムノース ± ラフィノース − Ｄ−マンニトール 十 ′無添加
− ＋：良く生育する。

±：生育する。±：生育するが、極めて悪い。

−二生育しない。ＡＮＳ−１２７株の菌学的性質は上記
の如くであるが、ＡＮＳ−１２７株は、■灰色素の短い
波状に屈曲した気菌糸を形成し、胞子の表面は平滑であ
ること、■基中菌糸の色は褐色ないし濃褐色であること
、■メラニン様色素は生成しないが、イースト・エキス
トラクト、マルト・エキストラクト寒天培地上において
メラニン様色素の生成が見られること、■可溶性色素は
生成しないこと、■糖の利用性は、グルコース、アラビ
ノース、キシロースを良く利用するが、他の糖は利用し
ないか、僅かに利用すること等の特徴を有する。

この特徴的性質につき、野々村氏による［ジャーナル・
オプ・ファーメンテ−ジョン・テクノロジー」第５２巻
、第２号記載の放線菌Ｉ、 Ｓ、 Ｐ。

株４５８菌種の分類法の記載〔キイ・フォア・クラシフ
ィケーション・アンド・アイデンティフィケーション・
オブ・４５８スペシス・オプ０ザ・ストレプトミセス・
インクルーデッド・イン・Ｉ、 Ｓ、 Ｐ、 （Ｋｅ
ｙ ｆｏｒ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄｉ
ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ４５８５ｐｅｃｉ
ｅｓ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔ−ｏｍｙｃｅｓ １ｎｃｌｕ
ｄｅｄ ｉｎ Ｉ、 Ｓ、 Ｐ、 ） ）及びワック
スマン著［ザ・アクノミセテスＪ １９６１年版第２巻
の分類法により類似の放線菌の菌種を照合し、比較した
結果、糖の利用性、メラニン色素の形成等の性質におい
て差異がみられるが、気菌糸及び胞子の形態並びに各種
培地上の性質の所見が類似するので、ＡＮＳ−１２７株
はストレプトミセス・アンチビオティカス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏ −ｔｉｃｕｓ ）
ＩＫ近似するものと考えられる。

しかしながら、ＡＮＳ−１２７株は、ＡＮＳ−１２７Ａ
物質の生産能を有するという点においてストレプトミセ
ス・アンチビオティカスに属する他の菌株と明らかに相
異が認められるため、ストレプトミセス・アンチビオテ
ィカスに属する新菌株とすることが妥当であると結論さ
れた。

次に、本発明の有効成分を得るに肖っては、ストレプト
ミセス属に属するＡＮＳ−１２７Ａ物質生産菌を、抗生
物質を生産する通常の方法で培養することができる。

培養の形態は、液体培養でも固体培養でもよく、工業的
に有利に培養するためには、前記生産菌の胞子懸濁液又
は培養液を培地に接種し、通気攪拌培養を行えばよい。

培地の栄養源としては特に限定されることはなく、微生
物の培養に通常用いられる炭素源、窒素源その他を培地
中に含有させることができる。

炭素源としては、澱粉、デキストリン、グリセリン、グ
ルコース、シュークロース、′ガラクトース、イノシト
ール、マンニトールなどが、また窒素源としてはペプト
ン、大豆粉、肉エキス、米ねか、皺、尿素、コーンステ
イープリカー、アンモニウム塩、硝酸塩、その他の有機
または無機の窒素化合物が用いられる。

その他、無機塩類、たとえば、食塩、燐酸塩類、カリウ
ム、カルシウム、亜鉛、マンガン、鉄等の金属塩類等を
適宜に添加してもよく、必要に応じて消泡剤として、動
・植・鉱物油等を添加してもよい。

培養温度、培養時間等の培養条件は使用菌の発育に適し
、しかもＡＮＳ−１２７Ａ物質の生産が最高となるよう
な条件が選ばれる。

たとえば、培地のＰＨは４〜９、特に中性付近がよく、
培養の適温は２５°−３５℃程度がよい しかし、これらの培養組成物、培地の水素イオン濃度、
培養温度、攪拌条件などの培養条件は使用する菌株の種
類や、外部の条件などに応じて好ましい結果が得られる
ように適宜調節されるべきであることはいうまでもない
。

このようにして得られる培養物から、ＡＮＳ−１２７Ａ
物質を得るには、代謝産物を採叡するのに通常用いられ
る手段が適宜利用される たとえば、ＡＮＳ−１２７Ａ
物質と不純物との溶解度差を利用する手段、吸着親和力
の差を利用する手段のいずれも、それぞれ単独で、また
は組合わせて、あるいは反復して使用される。

具体的には、ＡＮＳ−１２７Ａ物質は培養ろ液にその大
部分が存在するが、その有機溶剤への溶解性の差を利用
して酢酸エチル、酢酸フチル、クロロホルム、ブタノー
ルなどを用いて培養涙液より抽出することができる。

抽出液を減圧下に濃縮すると、ＡＮＳ−１２７Ａ物質の
粗抽出物が得られる。

このものは多量の不純物を含んでいるので、シリカゲル
、アルミナ等の吸着クロマトグラフィーに付して、更に
精製する。

例えば、シリカゲルのカラムをクロロホルムで調製して
おき、これに前記粗抽出物をクロロホルム−メタノール
の混合溶剤の少量に溶かしたものを流し込む。

引き続き同じ溶剤系を用いて展開溶出を行う。

溶出液をフラクションコレクターにて一定量づつ分取す
る。

生物活性を示すフラクションを集めて濃縮すると精製粉
末が得られる。

更に精製を行へために、同様のシリカゲルクロマトグラ
フィーなくり返して行う。

分取フラクションを高速液体クロマトグラフィー、或い
は薄層クロマトグラフィーにより紫外部吸収により分析
しながら単一画分を集める。

この濃縮物を更に精製するために、６０チアセトニルを
用いて逆層カラムを用いて高速液体クロマトを行い、単
一ピークの画分を分取する。

これを減圧濃縮して残渣を含水メタノールの少量に溶解
し、冷蔵することによりＡＮＳ−１２７Ａ物質は無色の
結晶として析出する。

これを涙取乾燥することによってＡＮＳ−１２７Ａ物質
の純品を得ることができる。

かくして得られたＡＮＳ−１２７Ａ物質の理化学的性質
は次のとおりである。

（ＡＮＳ−１２７Ａ物質の理化学性質〕 （１）元素分析値 炭素：６６．６７係、水素：３．７２％ 酸素：２９．５８％、窒素： ０％ （２）分子量（ＦＤマススペクトルによる）７０ （３）融点 ； ３０７℃ （４）旋光分散 メタノール中、２２０〜６００ｍμの範囲で光学不活性
である。

（５）紫外線吸収スペクトル メタノール及び０．１規定塩酸メタノール中、２６２ｍ
μ（ε、３７０００）に極大吸収を、３３７ｍμ（ε、
３６００）に肩の吸収をそれぞれ示す。

また、０．１規定苛性ソーダメタノール中、２７４ｍμ
（ε、３７０００）に極大吸収を、３２６ｍμ（ε、１
５２００）に肩の吸収をそれぞれ示す。

（６）赤外線吸収スペクトル 臭什カリ錠剤で測定した主な極太値は次のとおりである ３４３０．２９２０，１６５０，１６１７゜１５７１．
１５１０，１４６５，１４３６゜１２４０．１１８８，
１１７０ｃｍ−１ （７）溶解性 アセトン、メタノール、酢酸エチルに易溶、クロロホル
ムに可溶、水に難溶である。

（８）呈色反応 塩化鉄反応及び過マンガン酸カリ反応は陽性、２．４−
ジニトロフェニルヒドラジン反応は陰性である。

（９）塩基性、中性、酸性の区別 弱酸性物質であり、６６．７ ％ジオキサン中における
ＰＫａ’は８．６及び１０．７である。

（１ω物質の色 無色の結晶である。

（１１）毒性 マウスに対する腹腔内投与で、１００■／ｋｇで全く毒
性を示さなかった。

本発明の制癌剤は、経口及び非経口投与のいずれも使用
可能であり、経口投与する場合は、軟・硬カプセル剤又
は錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤として投与され、非経口
投与する場合は、水溶性懸濁液、油性製剤などの皮下或
いは静脈注射剤、点滴剤及び固体状又は懸濁粘稠液状と
して持続的な粘膜吸収が維持できるように生薬のような
剤型で投与され得る。

本発明の有効成分の製剤化は、界面活性剤、賦形剤、滑
沢剤、佐剤、及び有効成分の性質を考慮して腸溶性製剤
とするために医薬的に許容し得る皮膜形成物質、コーテ
ィング助剤等を用いて適宜行うことができ、その具体例
を挙げれば、次のとおりである。

本発明の組成物の崩喰、溶出を良好ならしめるために、
界面活性剤、例えばアルコール、エステル類、ポリエチ
レングリコール誘導体、ソルビタンの脂肪酸エステル類
、硫酸化脂肪アルコール類等の１種又は２種以上を添加
することができる。

また、賦形剤として、例えば蔗糖、乳糖、デンプン、結
晶セルロース、マンニット、軽質無水珪酸、アルミン酸
マグネシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、合成
珪酸アルミニウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウ
ム、リン酸水素カルシウム、カルボキシメチルセルロー
スカルシウム等の１種又は２種以上を組合せて添加する
ことができる。

滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タ
ルク、硬化油等を１種又は２種以上添加述※スルことが
でき、また矯味剤及び矯臭剤として、食塩、サッカリン
、糖、マンニット、オレンジ油カンゾウエキス、クエン
酸、ブドウ糖、メントール、ユーカリ油、リンゴ酸等の
甘味剤、香料、着色料、保存料等を含有させてもよい。

懸濁剤、湿潤剤の如き佐剤としては、例えばココナツト
油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、乳酸カルシウム、
ベニバナ油、大豆リン脂質等を含有させることができる また皮膜形成物質としては、セルロース、糖類等の炭水
化物誘導体として酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、
またアクリル酸系共重合体、二塩基酸モノエステル類等
のポリビニル誘導体としてアクリル酸メチル・メタアク
リル酸共重合体、メタアクリル酸メチル・メタアクリル
酸共重合体が挙げられる。

また、上記皮膜形成物質をコーティングするに際シ、通
常使用されるコーティング助剤、例えば可塑剤の他、コ
ーティング操作時の薬剤相互の付着防止のための各種添
加剤を添加することによって皮膜形成剤の性質を改良し
たり、コーティング操作をより容易ならしめることがで
きる。

なお、有効成分を皮膜形成物質を用いてマイクロカプセ
ル化してから賦形剤等と混合した剤型としても良い。

特に代表的な剤型における配合比は下記の通りである。

特に好ましい賦形剤は、乳糖、結晶セルローズ、カルボ
キシメチルセルロースカルシウムである。

また、投与量は、対象腫瘍を有効に治療するに十分な量
であり、腫瘍の症状、投与経路、剤型などによって左右
されるが、一般に、経口投与の場合、大人では１日当り
、約０．０１〜１００１１１９／に９体重（小人テハ、
０．０１〜６０ｍ９／に９体重）の範囲で、その上限は
好ましくは約５０■／ゆ体重、更に好ましくは約１０ｍ
９／に９体重程度であり、非経口投与の場合、その上限
は約１０ｍ１Ｉ／に９体重一度であり、好ましくは５ｍ
ｌ！／ｋｇ体重、更に好ましくは２１１ＩＩｉＩ／ｋｇ
体重が適当である。

次に、ＡＮＳ１２７Ａ物質の制癌活性を確認した制癌性
試験について述べる。

〔１〕 フレンド白血病細胞（ｍｏｕｓｅ ｅｒｙｔ
ｈｒｏｉｄｌｅｕｋｅｍ ｉａ ｃｅｌｌ 、 Ｂ ８
細胞）に対する試験ＧＩＢＣＯ製ＲＡＭのＦ−１２培地
に、１５％の牛胎児血清及び６０１１１１７／ｌのカナ
マイシンを加えたものに、２５ Ｘ １０’ ｃｅｌｌ
／ｖｔｌとなるようにＢ８細胞を接種し、これに所定
量の被験化合物な加える（最終容量５ｍｌり。

７．５チＣ０２中、３７°Ｇ７日間培養した後、オル＊
７ （０ｒｋｉｎ ）のベンジジン染色法により染色
し、染色された細胞数、すなわち、赤血球への分化によ
りヘモグロビンを生成するようになった細胞数を測定し
、分化誘導率を求める。

染色された細胞数 分化誘導率（侍： Ｘ １００全細胞
数 〔２〕マウス骨髄性白血病細胞（ｍｏｕｓｅ ｍｙｅｌ
ｏｉｄｌｅｕｋｅｍ ｉａ ｃｅｌｌ 、 Ｍ １ ）
に対する試験ＧＩＢＣＯ製イーグルＭＥＭ培地に、１０
係の馬血清及び６０〜／ｌの力斗マイシンを加えたもの
に、５． ＯＸ １０’ ｃｅｌｌ ／ｍｌとなるよう
にＭ１細胞を接種し、これに所定量の被験化合物を加え
る（最終容量５ ｍｌ ）。

７．５％Ｃ０２中、３７°Ｃ７日間培養した後、貧食細
胞、あ、るいは顆粒球への分化により誘導されたリゾチ
ーム活性を調べる。

なお、リゾチーム活性の１単位（ｕｎｉｔ ） とは
、ミクロコツカス拳すソ°デイクテイカス（Ｍｉｃｒｏ
ｃｏｃｃｕｓｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ ）菌体の懸
濁液を基質として、リゾチームを作用させ、ＰＨ６，２
４、温度２５℃で測定し、４５０ｍμの波長の吸光度を
毎分０．００１減少させるようなリゾチームの量をいう
。

なお、後述の試験例では、分化誘導作用をもって、制癌
活性を示した。

以下に、本発明を製剤例及び試験例によって具体的に説
明する。

製剤例 １（注射・点滴剤） ＡＮＳ−１２７Ａ物質１０■を含有するように粉末ぶど
う糖５ｇを加えてバイアルに無菌的に分配し、密封した
上、窒素、ヘリウム等の不活性ガスを封入して冷暗所に
保存する。

使用前°にエタノールに溶解し、０．８５％生理的食塩
水１００ｒｒＬｌを添加して静脈内注射剤とし、１日、
１０〜１００ｒｕｌを症状に応じて静脈内注射又は点滴
で投与する。

製剤例 ２（注射・点滴剤） ＡＮＳ−１２７Ａ物質２ｍ’ｉを用イテ、製剤例１と同
様の方法により軽症用静脈内注射剤とし、１日、１０〜
１００ＴｒＬｌを症状に応じて静脈内注射又は点滴で投
与する。

製剤例 ３（腸溶性カプセル剤） ＡＭＳ−１２７Ａ物質５ｇ、乳糖２，４６ｇ及びヒドロ
キシプロピルセルロース０．０４ｇを各々とり、よく混
合した後、常法に従って粒状に成形し、これをよく乾燥
して篩別してビン、ヒートシール包装などに適した顆粒
剤を製造する。

次に、酢酸フタル酸セルロース０．５．９及びヒドロキ
シプロピルメチルセルロースフタレ−） ０．５．９を
溶解して被覆基材となし、前記顆粒を浮遊流動させつ＼
この基材を被覆して腸溶性の顆粒剤とする。

この組成物をカプセルに充填して腸溶性カプセル製剤１
００個を製造する。

試験例 ＡＮＳ−１２７Ａ物質を用い、前記試験法〔１〕及び〔
２〕 より、フレンド白血病細胞の分化誘導率及びマウ
ス骨髄性白血病細胞の分化誘導によるリゾチーム活性を
調べたところ、それぞれ、第１表及び第２表に示す結果
が得られた。

第１表 上記試験例の結果から明らかなように、ＡＮＳ−１２７
Ａ物質は癌細胞に対して、正常細胞への分化誘導作用を
示すことから、毒性の少ない優れた制癌活性を示すこと
が立証された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 抗生物質ＡＮＳ−１２７Ａ物質を有効成分として含
   有することを特徴とする制癌剤。 ２ 非経口投与形態による特許請求の範囲第１項記載の
   制癌剤。 ３ 経口投与形態による特許請求の範囲第１項記載の制
   癌剤。