NL8001982A

NL8001982A - Antibiotisch werkzame stof en werkwijze ter bereiding en toepassing van deze stof en farmaceutisch preparaat, dat deze stof bevat.

Info

Publication number: NL8001982A
Application number: NL8001982A
Authority: NL
Original assignee: Lepetit Spa
Priority date: 1979-04-07
Filing date: 1980-04-03
Publication date: 1980-10-09
Also published as: DE3013246A1; JPS6251274B2; MX5958E; AU5903680A; LU82327A1; PT71064A; SG22687G; NL192989B; AR222217A1; BE882632A; HK23584A; NO155496C; NO800869L; US4328316A; GR67279B; FI65630C; DE3013246C2; AT370130B; NZ193357A; IT1212411B

Description

*

A

Antibiotisch werkzame stof en werkwijze ter bereiding en toepassing van deze stof en farmaceutisch preparaat, dat deze stof bevat.

De uitvinding betreft een antibiotische stof, die in deze beschrijving de willekeurige aanduiding antibioticum A/16686 heeft gekregen; een werkwijze ter bereiding van deze stof door het kweken van een tot nu toe onbeschreven stam, die taxono-5 misch als een nieuwe stam van het geslacht Actinoplanes kan worden aangemerkt; en op het gebruik van deze stof als bacteriedodend middel.

Antibioticum A/16686 is een glycopeptidehoudend antibioticum met een basisch karakter, dat zuur-additiezouten kan 10 vormen. De fysiologisch aanvaardbare zuur-additiezouten van antibioticum A/16686 vallen daarom eveneens onder de uitvinding.

Voor het gemak wordt in deze beschrijving de uitdrukking "antibioticum A/16686” gebruikt voor het aanduiden van een antibioticum, dat zowel uit de vrije base als uit een fysiologisch 15 aanvaardbaar zuur-additiezout van die base kan bestaan.

Antibioticum A/16686 remt in vitro de groei van bepaalde pathogene bacteriën, meer in het bijzonder van Gram-posi-tieve bacteriën. Bovendien wordt door parenterale toediening van antibioticum A/16686 in muizen een hoge graad van bescherming tegen 20 ter toetsing toegediende besmettingen verkregen.

Zoals reeds werd opgemerkt, wordt antibioticum A/16686 verkregen door het kweken van een nieuwe stam van het geslacht Actinoplanes. Een cultuur van deze stam, die uit een in Vaghalbod (India) genomen grondmonster werd geïsoleerd, is 30 25 januari 1979 opgenomen in de permanente collectie ATCC (American

Type Culture Collection), 12301 Parklavn Drive, Rockville, Maryland 20852, Verenigde Staten van Amerika, waar de stam onder toelatings-nummer ATCC 33076 wordt bewaard.

Er volgt nu een beschrijving van de kenmerken van 80 0 1 9 82 s * 2 4

Actinoplanes sp. ATCC 33076.

Morfologie

De steun groeit goed op verschillende voedingsbodems en heeft oranje mycelium. Dit scheidt geen kleurstof af en vormt 5 geen luchtmycelium. Bij microscopisch onderzoek blijkt het vegetatieve mycelium uit vertakte hyfen met een diameter van ongeveer 1 ^urn te bestaan. Alleen op aardappel-agar worden enkele sporangiën gevormd. Deze zijn bolvormig met een erg onregelmatige oppervlakte en een doorsnede van 5»0 tot 9*0 ^um. Nadat de wand van het 10 sporangium is gebarsten, kan het vrijkomen van sporen worden waargenomen. De bijna kogelvormige sporen zijn beweeglijk (diameter 1,0-1,5 ^um). Bij analyse van de celwandkomponenten kan de aanwezigheid van meso-diaminopimelinezuur en een suikerpatroon van het type D (Lechevalier et al., Chemical composition as a criterium 15 in the classification of Actinomycetes, Adv. Applied Microbiology, 1^, 1971, Academie Press N.Y.) worden waargenomen.

Kenmerken bij het kweken

In Tabel A zijn de kenmerken van Actinoplanes sp. ATCC 33076 vermeld, als deze op verschillende standaardvoedings-20 bodems wordt gekweekt die worden aanbevolen door Shirling en Gottlieb (Intern. J. System. Bact. _1j6, 313-3^0, 1966) en door Waksman (The Actinomycetes, Vol. II The Williams and Wilkins Co. 1961). De kenmerken van de culturen werden 6 tot 1¼ dagen na het begin van de bebroeding bij 30°C bepaald.

25 Tabel A

Kenmerken bij het kweken

De bij enkele voedingsbodems vermelde nummers zijn de door Shirling en Gottlieb in "Methods for characterization of Streptomyces species, Intern J.System. Bact., 16, 313-3^0, 1966" aan deze voe-30 dingsbodems gegeven nummers.

Voedingsbodem Kenmerken cultuur

Nr. 2 (gistextract-moutagar) Overvloedige groei, gerim- peld oppervlak, lichtbruin 12 E 12 8001982 * 3

Voedingsbodem Kenmerken cultuur

Nr. 3 (havermoutagar) geringe groei, dun, lichtoranje 9 B 6

Nr. 4 (anorganische zouten-zet- matige groei, korstige opper- ' meel-agar) vlakte, oranje 11 L 12

Nr. 5 (glycerol-asparagine-agar) geringe groei, glasachtig

Nr. 6 (pepton-gistextract-ijzer- geringe groei, glasachtig tot agar) lichtbruin

Nr. 7 (tyrosine-agar) geringe groei, gladde opper- ^ vlakte, bruin 5 D 11

Havermoutagar (volgens Waksman) overvloedige groei, gerimpelde oppervlakte, oranje tot bruin 12 C 10

Agar volgens Hickey en Tresner overvoedige groei, korstige oppervlakte, oranje 116 8 ς Glucose-agar volgens Czapek matige groei, korstige opper- vlakte, oranje 11 G 8

Glucose-asparagine-agar geringe groei, korstig opper vlak, lichtoranje 11 F 6

Voedingszoutenagar matige groei, glad oppervlak, oranje 11 G 8 20 Aardappelagar overvloedige groei, gerimpeld oppervlak, bamsteenkleurig 12 E 10

Agar van Bennett overvloedige groei, gerimpeld oppervlak, oranje 11 C 8

Calciummalaatagar matige groei, glad oppervlak, lichtoranje, 10 C 6 25 ...

Ondermelkagar overvloedige groei, gerimpeld oppervlak, oranje 9 C 2

Agar volgens Czapek matige groei, korstig opper vlak, oranje 10 D 7

Ei-agar matige groei, glad oppervlak glasachtig tot lichtoranje 30 ...

Pepton-glucose-agar overvloedige groei, gerimpeld oppervlak, oranje 11 G 11

Agar zeer geringe groei, glad opper vlak, oranje

Aardappel geringe groei, korstig, licht bruin 35

Gelatine zeer geringe groei, dun, glas achtig 800 1 9 82 * / k

Voedingsbodem Eigenschappen cultuur

Cellulose zeer geringe groei, dun, glas achtig 5 Koolstofverbruik

In Tabel B worden de resultaten weergegeven van een onderzoek naar de assimilatie van verschillende koolstofbronnen volgens de methode van Pridham en Gottlieb (J. Bact. j>6, 107» 19^8).

Tabel B

10 Koolstofbron__Assimilatie_

Inositol -

Fructose +

Rhamnose +

Mannitol 15 Xylose +

Raffinose -

Arabinose +

Cellulose

Saccharose + 20 Glucose +

Mannose +

Lactose -

Salicien + + positief 25 - geen groei

Fysiologische eigenschappen

In Tabel C zijn de fysiologische eigenschappen van de stam vermeld.

8001982 5

•V

Tabel C

Proef_Resultaat_

Zetmeelhydrolyse positief H^S-ontwikkeling positief 5 Tyrosinase-reactie negatief

Caseïnehydrolyse positief oplosbaar maken van calciummalaat negatief vervloeiing van gelatine positief coagulatie 10 lakmoesmelk peptonisatie negatièf ontleding cellulose negatief

Om het antibioticum A/16686 te vormen wordt stam 15 Actinoplanes sp. ATCC 33076 onder aërobe voorwaarden in een waterig voedingsmilieu gekweekt, dat een assimileerbare koolstof-bron, een assimileerbare stikstofbron en voedingszouten bevat. Allerlei voedingsmedia die in de techniek gewoonlijk voor fermentatie worden gebruikt zijn bruikbaar, maar men geeft wel de voor-20 keur aan bepaalde media. Als koolstofbron gebruikt men bij voorkeur glucose, fructose, mannose, saccharose, en dergelijke. Als stikstofbron gebruikt men bij voorkeur soyameel, pepton, vleesextract, gistextract, trypton, aminozuren, en dergelijke. Onder de anorganische zouten, die in de voedingsmedia opgenomen kunnen worden, be-25 vinden zich de gebruikelijke, oplosbare zouten, die natrium-, kalium-, ijzer-, zink-, kobalt-, magnesium-, calcium-, ammonium-, chloride-, carbonaat-, sulfaat-, nitraat- en soortgelijke ionen kunnen afsplitsen.

De antibioticum-vormende stam wordt gewoonlijk 30 voorgekweekt in geschudde kolven. De daarmee verkregen cultuur wordt gebruikt voor het enten van fermentatievaten, waarin behoorlijke hoeveelheden antibioticum A/16686 gevormd kunnen worden. Men kan voor het kweken vein de entcultuur dezelfde voedingsbodem gebruiken als voor de grotere fermentaties, maar noodzakelijk is 35 dit niet.

800 1 9 82 .* 6 Λ

De A/16686-vormende stam kan bij temperaturen in het traject van ongeveer 20° tot ongeveer 37°G gekweekt worden, maar men past bij voorkeur temperaturen van ongeveer 28-30°C toe.

Men kan de vorming van het antibioticum tijdens de 5 fermentatie volgen door monsters van de cultuur of van extracten van het mycelium op hun antibiotische activiteit te toetsen. Hierbij kan men gebruik maken van organismen, waarvan bekend is, dat ze gevoelig zijn voor antibioticum A/16686. Een organisme, dat zich bijzonder goed leent voor dit onderzoek is Sarcina lutea. De 10 biologische toets kan gemakkelijk met behulp van de agar-diffusie-proef op agarplaten worden uitgevoerd. De maximale vorming van antibiotisch actief materiaal treedt gewoonlijk op tussen de derde en de vijfde dag. Het antibioticum, dat tijdens de fermentatie van stam Actinoplanes sp. ATCC 33076 wordt gevormd, bevindt zich 15 zowel in de kweekvloeistof als in de myceliummassa. Men kan daarom antibioticum A/16686 afscheiden door afzonderlijke extractie van de vloeistof en het mycelium.

Men kan. het mycelium het beste extraheren met methanol, maar ook andere lagere alkanolen en chloroform zijn bruik-20 baar. Antibioticum Al6686 wordt in ruwe vorm op in de techniek bekende wijze uit het extrakt afgescheiden. De kweekvloeistof wordt op analoge wijze geextraheerd, bij voorkeur met n-butanol, waarna een tweede hoeveelheid ruw antibioticum verkregen wordt door dit uit de butanoloplossing neer te slaan. Het ruwe antibioticum A/ 25 16686 wordt vervolgens gezuiverd door het uit de extractievloei- stoffen afgescheiden produkt met een mengsel van chloroform: ethanol: water (U:7:2) te behandelen, het daarbij gevormde olieachtige produkt af te scheiden en dit in water te gieten. Door deze behandeling wordt het produkt vast en kan afgefiltreerd worden en 30 verder gezuiverd door chromatografie over een kolom silicagel met een mengsel van acetonitril: 0,01 N HC1 (1; 1) als elutiemiddel. Op deze wijze wordt antibioticum A/16686 afgescheiden in de vorm van het hydrochloride, dat van zouten ontdaan kan worden door het over een kolom verknoopt dextran egel te chromatograferen.

35 Elke fase van de beschreven zuivering wordt gevolgd 8001982 * t τ via dunne-laagchromatografie met behulp van een geschikt oplosmid-delsysteem, bijvoorbeeld een basisch systeem, zoals n-propanol: n-butanol; H-ammoniumhydroxyde (2:3:¼) (bovenste fase); of methanol: 10% ammoniumacetaat in water: 10% ammoniumhydroxyde (10:9:1), waarin 5 eventueel aanwezig zuur-additiezout van antibioticum A/16686 in de vrije base wordt omgezet. Alle genoemde fasen zijn daarom gericht op het isoleren van zuiver antibioticum A/16686, dat gekenmerkt wordt door een bepaalde R^-waarde in elk der gebruikte oplosmiddel-systemen.

10 Men kan ook met goed gevolg andere, in de techniek bekende zuiveringsmethoden gebruiken, zoals de gewone extractie-. en adsorptiemethoden. Deze andere methoden kunnen gemakkelijk stap voor stap uitgewerkt worden door het zuiveringsproces op de beschreven wijze via dunne-laagchromatografie te volgen. Als men 15 hierbij de d.l.c.-vlek van antibioticum A/16686 met een speciale R^-waarde volgt, zal een deskundige gemakkelijk vast kunnen stellen, welke bewerkingen bruikbaar zijn bij het isoleren van zuiver antibioticum A/16686.

Desgewenst kan het zuivere antibioticum-A/l6686-hydro-20 chloride, dat op de beschreven wijze wordt verkregen, in de vrije base worden omgezet of in een ander, fysiologisch aanvaardbaar zuur-additiezout, wat op bekende wijze kan worden uitgevoerd.

Antibioticum A/16686 is een bacteriedodend middel en is vooral actief tegen Gram-positieve miero-organismen. Bijzonder-25 heden over het in-vitro activiteitsspectrum van antibioticum A/16686 zijn in de nu volgende Tabel D samengevat: 800 1 9 82 8 *

Tabel D '

Organisme M.I.C.( ,ug/cm ) anti bioticum A/16686 S. aureus ATCC 6538 0,16 S. aureus ATCC 91^ 0,16 5 S. aureus Tour 0,31

Staphylococcus 10B Ciba 0,08 S. epidermidis ATCC 12228 0,08 S. saprophyticus NCTC 7292 0,16 M. flacus ATCC 1021+0 0,016 10 S. lutea ATCC 93U1 0,02 S. pyogenes C 203 SKF 131+00 0,01 S. pneumoniae Felton UC 1+1 0,05 S. faecalis ATCC 7080 0,31 S. foecium ATCC 1051+1 0,08 15 S. agalactiae ATCC 7077 0,02 S. mutans ATCC 27607 0,08 C. diphtheriae var.mitis ATCC 11051 0,31 C. xerosis NCTC 9755 0,02 B. subtilis ATCC 6633 0,062 20 B. cereus var.mycoides ATCC 11778 0,08 C. perfringens ISS 3051+3 0,16 P. acnes ATCC 6919 0,1+ P. acnes ATCC 6922 0,8 P. acnes ATCC 2571+6 0,1+ 25 _

In Tabel E zijn de resultaten weergegeven van’ een aantal proeven, waarbij de werking van antibioticum A/16686 op verscheidene, klinisch geïsoleerde stammen van Staphylococcus aureus, Strep-30 tococcus pyogenes, Streptocuccus pneumoniae en Streptocuccus faecalis werd onderzocht.

» 80 0 1 9 82 9

Tabel E

O

Organisme M.I.C.(/Ug/cmJ) anti bioticum A/16686 S. aureus 5^-310 L 1096 0,62 5 S. aureus 5^-560/1 L 109T ' 0,31 S. aureus 5^635 ^ 1098 0,31 S. pyogenes L 33 0,0¾ S. pyogenes L 79¾ 0,08 S. pyogenes L 800 0,0¾ 10 S. pyogenes L 801 0,16 S. pyogenes L 802 0,08 S. pyogenes L 803 0,08 S. pyogenes L 80¾ 0,62 S. pyogenes L 805 0,08 15 S. pneumoniae L 1055 0,0¾ S. pneumoniae L 1102 0,0¾ S. pneumoniae L 117¾ 0,08 S. faecalis L 768 0,31 S. faecalis L 876 0,31 20 S. faecalis L 922 0,31 S. faecalis L 9¾9 0,31 S. faecalis L 965 0,31 S. faecalis L 1139 0,62 S. foecium L 763 0,l6 25 _:_;_

Ontdekt werd, dat antibioticum A/16686 ook in vivo een hoge activiteitsgraad tegen verschillende pathogene organismen vertoont. De werkzaamheid van antibioticum A/16686 blijkt duidelijk uit Tabel F, waarin de ED^Q bij muizen tegen drie verschillende 30 micro-organismen is vermeld.

80 0 1 9 82 - 10

Tabel F

ED,-q, mg/kg sub cut aan S. aureus Tour S.pyogenes C203 ISM S. pneumoniae

Felton UC In 5 A/16686 2kt6 0,09 0,2

Gebleken is, dat antibioticum A/16686 bij gebruik met proefdieren een relatief geringe giftigheid heeft. De LD^ bij muizen bij intraperitoneale toediening ligt bijvoorbeeld ongeveer 10 tussen 500 en 750 mg/kg.

De uitvinding betreft derhalve tevens de toepassing van antibioticum A/16686 als bacteriebestrijdend middel, waarbij met toepassing alle mogelijkheden van industriële toepassing worden bedoeld, met inbegrip van de verwerking van antibioticum A/16686 in 15 farmaceutische produkten. Dit laatste vormt tevens een afzonderlijk aspect van de uitvinding.

Deze farmaceutische produkten, die geschikt zijn voor orale, plaatselijk of parenterale toediening, worden op de gebruikelijke, in de farmaceutische techniek bekende wijzen vervaardigd.

20 Voorbeelden van dergelijke produkten worden bijvoorbeeld beschreven cLe in Remington's Pharmaceutical Sciences, 15 druk, 1975 Mack Publishing Co. Easton, Pennsylvania. De farmaceutische produkten kunnen de vorm hebben van tabletten, capsules, poeders, zalven, vloeibare oplossingen, injectievloeistoffen, en dergelijke. De 25 doseringseenheden kunnen 0,5 tot 99$, en bij voorkeur 5 tot 80JS, van de actieve stof bevatten. De dagelijkse dosis kan vastgesteld worden met inachtneming van verschillende factoren, zoals het lichaamsgewicht, het ziekte-vervekkende organisme, en de duur en de wijze van toediening.

30 De uitvinding wordt nu nader toegelicht met de volgende voorbeelden.

Voorbeeld I

Fermentatie van stam Actinoplanés sp. ATCC 33076

Men kweekt Actinoplanés sp. ATCC volgens de schud-35 methode in kolven met een kweekvloeistof van de volgende samen- 800 1 9 82 k 11 stelling: vleesextract 3 g/liter gistextract 5 g/liter trypton 5 g/liter 5 oplosbaar zetmeel 2k g/liter glucose 1 g/liter

CaCO^ U g/liter kraanwater 1 liter

De kolven worden ongeveer 96 uur bij 28-30°C geschud, 10 waarna de culturen (telkens 1 liter) gebruikt worden om de fermen-tatievaten te enten, die elk 10 liter kweekvloeistof van de volgende samenstelling bevatten: vleesextract 1*0 g pepton 1*0 g 15 gistextract 10 g natriumchloride 25 g soyameel 100 g glucose 250 g

CaCO^ 50 g 20 kraanwater 10 liter

De fermentatievaten worden geroerd en aëroob bij 28-30°C bebroed. De antibiotische activiteit van de culturen wordt met tussenpozen bepaald met behulp van de agar-diffusiemethode en Sarcina lutea als proef organisme. De maximale activiteit wordt 72 25 tot 120 uur na het begin van de fermentatie bereikt.

Voorbeeld II

Afscheiding van antibioticum A/16686

De gehele hoeveelheid kweekvloeistof (170 liter), die op de in voorbeeld I beschreven wijze werd bereid, wordt tot 180°C 30 af gekoeld en met behulp van HC1 18?5 op een pH van 3,5 gebracht. De zure vloeistof wordt met een filtreerhulpmiddel (Clarcel Flow-Ma) gefiltreerd, waarna de op het filter achtergebleven myceliumkoek met water wordt gewassen. Hierna worden de gefiltreerde kweekvloeistof en het mycelium afzonderlijk verwerkt.

35 a) Men gebruikt 30 liter methanol om de myceliummassa te extraheren.

800 1 9 82 * 12

Vervolgens wordt deze massa nogmaals geëxtraheerd, nu met een mengsel van methanol en water (30 1 methanol en 5 1 water). Het afgewerkte mycelium wordt weggegooid en de "beide methanolextracten worden onder vacuüm en bij een temperatuur van minder dan 1+0°C in-5 gedampt, tot een waterig concentraat (é liter) is verkregen. Dit waterige concentraat wordt driemaal met 10 liter n-butanol geëxtraheerd. De extracten worden bij elkaar gevoegd en onder vacuüm sterk’ingedampt. Het verkregen concentraat wordt in petroleumether gegoten, waarbij een neerslag ontstaat, dat door afgieten wordt 10 afgescheiden en bij een nieuwe hoeveelheid petroleumether gevoegd. Dan wordt het neerslag afgefiltreerd en bij kamertemperatuur onder vacuum drooggedampt. Men verkrijgt hierbij 80 g ruw antibioticum

O

A/16686 met een M.I.C. tegen S.pneumoniae UC 1+1 van 0,1 ^ug/cm'. b) De gefiltreerde kweekvloeistof wordt, samen met het waswater 15 (in totaal 165 l) tot 10°C afgekoeld en door toevoeging van 2,5 1 geconcentreerd HC1 op een pH van 3,5 gebracht. De verkregen oplossing wordt met 80 1 n-butanol geëxtraheerd, waarna het organische extract onder vacuüm bij een temperatuur van minder dan 35°C wordt ingedampt tot een butanolconcentraat van 6 liter is ver-20 kregen. Dit concentraat wordt bij petroleumether gevoegd, het hierbij ontstane neerslag wordt door afgieten afgescheiden en bij een tweede hoeveelheid petroleumether gevoegd. Het neerslag wordt nu afgefiltreerd en bij kamertemperatuur onder vacuüm drooggedampt. Men verkrijgt hierbij 26,3 g ruw antibioticum A/16686 met een

O

25 M.I.C. tegen S.pneumoniae UC 1+1 van 0,8 ^ug/cm .

Voorbeeld III

Zuivering van antibioticum A/16686

Men behandelt 1+7,7 g van het volgens voorbeeld II a) verkregen ruwe antibioticum Α/Ί6686 met 1,1+ liter chloroform:etha-30 nol:water-mengsel (1+:7:2 volumeverhouding), waarbij een olie-achtig produkt ontstaat, dat men van de oplossing afgiet. Vervolgens voegt 3 men nog eens 70 cm van het oplosmiddelmengsel bij het olie-achtige produkt en giet dit weer af. Het olie-achtige produkt wordt door

O

behandeling met 1+1+0 cnr water vast, waarna het af gecentrifugeerd 35 en afgefiltreerd wordt.

800 1 9 82 13 . , 3 a) Het afgescheiden neerslag wordt in 170 cm water gesuspendeerd

O

en door toevoeging van 400 cnr methanol opgelost, waarna de oplossing gefiltreerd wordt. Vervolgens worden de oplosmiddelen onder vacuüm af gedampt hij een temperatuur, die steeds lager is dan 35°C, 3 5 waarbij n-butanol wordt toegevoegd, zodat ongeveer 50 cm butanol- 3 ...

concentraat wordt verkregen. Hier voegt men 500 cm diethylether bij, waarbij een neerslag ontstaat, dat afgefiltreerd en onder vacuüm bij kamertemperatuur gedroogd wordt. Men verkrijgt 1,012 g tamelijk zuiver antibioticum A/16686 met een M.I.C. tegen S.pyogenes 3 10 van 0,025 ^ug/cm . Het op deze wijze verkregen, tamelijk zuivere antibioticum A/16686 wordt vervolgens op de volgende wijze verder gezuiverd: Men lost 1,58 g van het verkregen antibioticum A/16686 met een M.I.C. tegen S. pyogenes van 0,025 /Ug/cm op in een mengsel van 1 vol.deel acetonitril op 1 vol.deel water en brengt de ver-15 kregen oplossing in een kolom met 4-30 g silicagel 60 (Merck 0,06-0,2 mm), die met hetzelfde mengsel is bereid. De kolom wordt eerst met hetzelfde acetonitril-watermengsel ontwikkeld, waarbij men 70 . 3 fracties, elk van 20 cm', opvangt. Vervolgens gaat men over op acetonitril: 0,01 N HC1 (1:1, vol. verhouding) en vangt hiermee nog . 3 20 eens 290 fracties, elk van 20 cm', op. Het elueren van de kolom wordt gevolgd met behulp van dunne-laagchromatografie op 60 F si-licagelplaten en door de fracties tegen Sarcina lutea te toetsen.

De fracties 130 tot 2β5 worden bij elkaar gevoegd, waarna de oplosmiddelen onder vacuüm onder toevoeging van n-butanol worden af- 3 25 gedampt, zodat 20 cm n-butanolconcentraat wordt verkregen. Dit concentraat wordt in een grote hoeveelheid ethylether gegoten, waarna het daarbij ontstane neerslag wordt afgefiltreerd en bij kamertemperatuur onder vacuüm over P2°$ gedroogd. De opbrengst is 1,015 g antibioticum A/16686.

30 Van het verkregen antibioticum lost men 0,67 g op in 3 3 een mengsel van 24 cnr water en j6 cnr methanol. De verkregen oplossing wordt in een kolom van 3,0 x 62,0 cm met 220 g Sephadex LH-20 gebracht, die was bereid met methanol: water (7:3, vol.verhouding). De kolom wordt ontwikkeld met hetzelfde mengsel, waarbij

O

35 fracties van 10 cm worden opgevangen. De fracties 24 tot 32 wor- 800 1 9 82

1U

den bij elkaar gevoegd, waarna de oplosmiddelen onder toevoeging

van n-butanol onder vacuüm bij een temperatuur van minder dan 35°C

3 worden afgedampt en een butanolconcentraat van ongeveer 10 cm achterblijft. Deze oplossing wordt in ethylether gegoten, waarin het 5 gezochte zuivere antibioticum A/16686 neerslaat. Het neerslag wordt afgefiltreerd, met ethylether gewassen en onder vacuüm bij kamertemperatuur over gedroogd. Men verkrijgt 0,26 g zuiver antibioticum A/16686.

b) Het filtraat wordt ondervacuüm bij een temperatuur van minder 10 dan 35°C onder toevoeging van n-butanol afgedampt, waarbij 50 cm^ n-butanolconcentraat wordt verkregen. Door toevoeging van petro-leumether ontstaat een neerslag, dat afgefiltreerd en onder vacuüm bij kamertemperatuur gedroogd wordt. Men verkrijgt hiermee 1+2,9 g gedeeltelijk gezuiverd antibioticum A/16686, dat een M.I.C.-waarde 15 tegenover S. pyogenes van 0,2 ^ug/cm heeft. Deze antibiotische stof wordt in 2,5 1 water gesuspendeerd en opgelost door toevoeging van 1 N KaOH tot een pH van 7 is bereikt. Vervolgens wordt de waterige oplossing driemaal met 5 liter n-butanol geëxtraheerd, de extracten worden samengevoegd, met water gewassen en onder vacuüm 20 bij een temperatuur van minder dan 35°C tot 200 cm^ ingedampt.

Men voegt diethylether bij het concentraat, waardoor een neerslag ontstaat, dat afgefiltreerd en onder vacuüm bij kamer- 3 temperatuur gedroogd wordt. Het gedroogd produkt wordt in 160 cm

van de bovenste laag van een mengsel van n-propanol:n-butanol:1 N

25 ammoniumhydroxyde (2:3:1+, vol.verhouding) opgelost. De verkregen oplossing wordt in een kolom van 7,5 x 100 cm gebracht, die 1,7 kg silicagel 60 (Merck 0,06-0,2 mm) bevat, bereid in het bovengenoemde oplosmiddelmengsel. De kolom wordt met hetzelfde mengsel ontwikkeld, ... 3 waarbij fracties van 300 cm worden opgevangen. De elutie van de 30 kolom wordt gecontroleerd met behulp van dunne-laagchromatografie.

De fracties 21 tot 26 worden bij elkaar gevoegd en onder vacuüm bij een temperatuur van minder dan 35°C onder toevoeging van n- 3 butanol afgedampt, waarbij 50 cm n-butanolconcentraat wordt verkregen. Door toevoeging van diëthylether wordt een neerslag gevormd, 35 dat afgefiltreerd wordt, met diëthylether gewassen en onder vacuüm 800 1 9 82 15 bij kamertemperatuur over P^Q,- gedroogd. Men verkrijgt 1,875 behoorlijk zuiver antibioticum A/16686, dat op dezelfde wijze als hierboven voor a) is beschreven derder wordt gezuiverd.

In de vorm van het hydrochloride bestaat antibioticum 5 A/16686 uit een wit, kristallijn, licht hygroscopisch materiaal, dat bij 224-22è°C smelt. Het is zeer geod oplosbaar in water en dimethylformamide, oplosbaar in methanol, ethanol, propanol en butanol, maar onoplosbaar in ethylether, petroleumether en benzeen. De elementenanalyse van antibioticum A/16686 dat eerst bij 140°C 10 onder een inerte atmosfeer is gedroogd, levert (als gemiddelde van verscheidene analyses) ongeveer de volgende procentuele samenstelling op: koolstof 51,75/1»; waterstof 6,34#; stikstof 9,96$; chloor (het gehele gehalte) 5,84?; chloorionen 4,74#; en residu 1$.

In Figuur 1 van de begeleidende tekeningen is het in-15 frarood absorptiespectrum in nujol weergegeven.

In dit spectrum worden de volgende absorptiemaxima waargenomen ( in cm“^): 3290-3070, 2930 en 2860 (nujol), 1765, 1630, 1510, 1455, 1375 (nujol), 1230, 1175, 1130, 1065, 1030, 1015, 980, 840 en 820.

2Q In Figuur 2 van de bijgevoegde tekeningen is het ultra violet absorptiespectrum afgeheeld, en daarin kunnen de volgende absorptiemaxima worden waargenomen: a) in methanol 232 nm (e!* = 178) 1 cm 25 265 nm (E = 107) i cm b) in methanol met 0,1 N HC1 231 nm (E?* = 167) Ί cm 30 270 nm (E^cm “ 96)

c) in methanol met 0,1 N NaOH

250 nm (e]* = 232) • 1 cm 295 nm (schouder) 35 800 1 9 82 16 d) in methanol met een buffer voor een pH van 7,38 231 nm (E.1^ = 167) 1 cm 1¾ 270 nm (E* = 96) I cm 5 De ultraviolet spectra werden geregistreerd met een

Beckmann DK-2 Spectrofotometer.

Antibioticum A/16686-hydrochloride heeft een specifieke draaiing /“α_7^ van +1*9,7° (c * 0,1*3# in DMF)

Antibioticum A/16686 vertoont de volgende, kenmerkende 10 reacties: ninhydrien (3# oplossing in ethanol) negatief ninhydrien (3# oplossing in ethanol + natriumacetaat) positief 1# FeCl^ + 1# K^Fe (CN)g (oplossing in water) positfef(groen)

Molisch positief 15 Fehling negatief

Biureet positief

Anthron positief

Millon negatief

Geconcentreerd HgSO^ negatief 20 KMnOj^, in water positief

In de volgende tabel zijn de Rf-waarden van antibioticum A/16686 bij papierchromatografie met verschillende elutie-systemen en S.aureus ATCC 6538 als proeforganisme vermeld:

Tabel G

25 Resultaten papierchromatografie (Whatman papier, nr. 1)* met antibioticum A/16686)

Elutiesysteem R^-waarde 1) n-butanol, verzadigd met de buffer van Sorensen, pH 6,0 0,00 2o 2) n-butanol, verzadigd met water, dat 2# p-tolueen- sulfonzuur bevat 0,00 3) n-butanol, verzadigd met water, dat 2% ammonium- hydroxyde bevat 0,00 1*) buffer van Sorensen, pH 6,0, verzadigd met n- butanol 0,05 2^ 5) n-butanol rmethanol: wat er, 1*:1:2 0,1*3 800 1 9 82 .

17

Elutiesysteem R^-waarde 6) ethylacetaat, verzadigd met water 0,00 7) n-butanol:azijnzuur:water 2:1:1 0,52 8) n-butanol:pyridine:water 4:3:7 0,87 5 Dalende chromatografie

Rm: 40 cm

Hoeveelheden: 20 /Ug verbinding, opgelost in water: methanol (2 mg/cm ). D R^-waarden van antibioticum A/l6686in verschillende dunne-laagchromatografie-systemen zijn in de nu volgende 10 tabel H weergegeven (de voorwaarden zijn eveneens in de tabel vermeld).

Tabel H

Elutiesysteem (vol. verhouding) R^-waarde 1) n-propanol:n-butanol: 1N amraoniumhydroxyde 2:3:¼ ^ (bovenste fase) 0,15 2) n-butanol:azijnzuur:water 4:2:5 0,61 3) n-butanol:ethanol:0,1 N zoutzuur 0,61 4) chloroform:ethanol:10% azijnzuur k:J:2 0,00 5) n-butanol:azijnzuur:water U:1:5 0,17 2q 6) methanol:1052 ammoniumacetaat in water: 1052 ammo- niumhydroxyde 10:9:1 0,52 7) n-butanol:pyridine:water:azijnzuur 6:4:3:1 0,45 8) methanol:10# ammoniumacetaat in water:10¾ ammoniumhydroxyde 10:9:1 0*11 9) 0,25 M NaHgPO^ in water:acetonitril 1:1 0,68 25 10) methanol:1052 ammoniumacetaat in water 1:1 0,65 11) n-butanol:azijnzuur:water 4:2:5 0,77

Rm: ongeveer 140 mm

O

Hoeveelheden: 2-5 ^uliter van een oplossing (1 mg/cm ) van de verbinding in acetonitril:water 1:1 30 Zichtbaar maken: a) bioautografie op agarplaten, geënt met B.subti-lis ATCC 6633; b) verkolen door verhitting met o-nafthol-zwavelzuur; c) jodiumdamp; d) chloor-toluxdinereagens; e) ultraviolet licht bij 25¼ nm 1 tot 7 — Silicagel 60 F,,^-platen (Merck); zichtbaar te maken volgens a, b, c, d, e 35 8 en 9 — Gesilaniseerde silicagel 60 Fg^ (Merck); zichtbaar te 8001982 18 maken volgens e 10 en 11 — Cellulose F platen (Merck); zichtbaar te maken volgens a.

Bij bepaling met zeer nauwkeurige chromatografische 5 technieken, blijkt het op de in Voorbeeld III beschreven wijze afgescheiden en gezuiverde antibioticum A/16686 voor 70-805? uit een eerste komponent te bestaan en voor de overige 30-205? uit tenminste twee andere komponenten.

Het volgens de voorbeelden geïsoleerde antibioticum 10 A/16686-hydrochloride is het hydrochloride vein een chloor-houdend basisch glycopeptide, dat zich op verschillende manieren van andere antibiotica van de klassieke glycopeptidegroep onderscheidt: zo bevat het chloor en heeft het een grotere verscheidenheid aan aminozuurkomponenten. Analyse met behulp van een aminozuur-autoana-15 lysator van de aminozuren in antibioticum A/16686, nadat men het 6 uur lang bij 110°C in 6 N zoutzuur had gehydrolyseerd, duidde op de aanwezigheid van de hieronder vermelde aminozuren: ornithine (118 ^ug/mg =0,58 ^umol/mg), asparaginezuur (29,2^ug/mg 1 0,22 jA/ mg), threonine (68 yug/mg = 0,57 /uM/mg), glycine 25 /Ug/mg 1 0,33 20 ^uM/mg), analine (29 ^ug/mg » 0,32 ^uM/mg), leucine U1 ^ug/mg 1 0,31 yUM/mg) en fenylalanine {b2 ^ug/mg.= 0,25 yuM/mg).

Met de kolom voor neutrale en zure aminozuren werden nog eens vier toppen vastgesteld. Twee van deze aminozuren konden met behulp van gaschromatografie-massaspectrometrie geïdentificeerd 25 worden, nadat ze in de overeenkomstige methylester-trifluoracetyl-derivaten waren omgezet. Vastgesteld werd, dat ze de structuurfor-mules 1 en 2 hebben.

Voorbeeld IV

Afscheiding van dé vrije base 30 Als men een oplossing van antibioticum A/16686-hydro-

O O

chloride (0,0 g) in water (3 cm ) met ethanol (8 cm ) behandelt met 3 2 cm 1,2-epoxybutaan ontstaat een neerslag, dat men een dag bij lage temperatuur laat staan en dan afcentrifugeert, met ethanol wast en onder vacuüm bij kamertemperatuur over Ρ,,Ο^ droogt. Hierbij 35 verkrijgt men 0,016 g van de vrije base.

800 1 9 82 19

Door behandeling van deze vrije, basische vorm van antibioticum A/16686 met een farmaceutisch aanvaardbaar anorganisch of organisch zuur kan men het overeenkomstige zuur-additiezout bereiden. Farmaceutisch aanvaardbare zuren zijn niet giftige zuren, 5 die bruikbaar zijn voor de bereiding van geschikte zouten, voor verwerking in therapeutische preparaten, zoals zoutzuur, broomvater-stofzuur, zwavelzuur, fosforzuur, salpeterzuur, wijnsteenzuur, azijnzuur, bamsteenzuur, melkzuur, glutaminezuur en methaansulfonzuur. 1 800 1 9 82 t

Claims

1. Antibiotisch werkzame stof, in de vorm van het basische antibioticum A/16686 of van een niet-giftig, farmaceutisch aanvaardbaar zuur-additiezout daarvan, met het kenmerk, dat deze in de vorm van het hydrochloride:

5 A) een witte, kristallijne stof is, die bij 22k-226°C smelt; B) zeer goed in water en dimethylformamide oplost; goed in methanol, ethanol, propanol en butanol oplost; en onoplosbaar is in diëthyl-ether, petroleumether en benzeen; C) volgens de elementanalyse bij benadering de volgende samenstel-10 ling heeft: 51,73? C, 6,3*+? H, 9,96? N, 5,81+? Cl (in totaal), k,7k% Cl-ionen en 1? residu; D) een infrarood absorptiespectrum in nujol vertoont, waarin de volgende absorptiemaxima waarneembaar zijn: (zie figuur 1 van de begeleidende tekeningen): 3290-3070, 2930 en 2860 (nujol), 1765, 15 1630, 1510, 11+55, 1375 (nujol), 1230, 1175, 1130, 1065, 1030, 1015, 980, 81+0 en 820 cm"^; E) een ultraviolet absorptiespectrum met de volgende absorptiemaxima (zie figuur'2 van de bijgevoegde tekeningen) heeft: a) in methanol: 20 232 nm (e|* 178) 1 cm 265 nm (>!* = 107) 1 cm b) in methanol met 0,1 N HC1: 231 nm (e]* = 167) i czn 25 270 nm (e!* = 96) Ί cm_ c) in methanol met 0,1 N NaOH: 250 nm (E^cm = 232) 30 295 nm (schouder) d) in methanol met een buffer, pH « 7,38: 231 nm (E^cm * 167) 270 nm (E^cm = 96) 800 1 9 82 F) een specifieke draaiing, /“a van + 1*9»7° (c = 0,43# in DMF) vertoont; G) de volgende, kenmerkende reacties vertoont: ninhydrien (3% oplossing in ethanol) negatief 5 ninhydrien (3% oplossing in ethanol + natriumacetaat) positief Λ$ FeCl^ + 1# K3Fe(CN)6 positief (groen) Pehling negatief Molisch positief

10 Biureet positief Anthron positief Millon negatief Geconc. HgSO^ negatief KMnO^ positief

15 H) bij papierchromatografie op Whatman papier nr 1 met S.aureus ATCC 6538 als proeforganisme de volgende R^-waarden vertoont: Elutiesysteem Ef-waarde 1. n-butanol, verzadigd met buffer van Sorensen, pH = 6,0 0,00 2Q 2) n-butanol, verzadigd met water, dat 2% p-tolueen- sulfonzuur bevat 0,00 3. n-butanol, verzadigd met water, dat 2% ammonium- hydroxyde bevat 0,00 *0 buffer van Sorensen, pH 6,0, verzadigd met n- butanol 0,05 25 5) n-butanol:methanol:water 4:1:2 0,43 6. ethylacetaat, verzadigd met water 0,00 7. n-butanol:azijnzuur:water 2:1:1 0,52 8. n-butanol:pyridine:water 4:3:7 0,87 i) in de verschillende, hieronder vermelde systemen..voor dunne- 2o laagchromatografie de volgende R^-waarden vertoont: 8001982 * Elutiesysteem (volumeverhouding) R^-waarde 1. n-propanol:n-butanol: N aromoniumhydroxyde 2:3:^ (bovenste fase) 0,15 2. n-butanol:azijnzuur:water b:2.:5 0,61 ^ 3) n-butanol:ethanol:0,1 M zoutzuur 0,61 b) chloroform:ethanol:T0¾ azijnzuur b:J:2 0,00 5. n-butanol:azijnzuur:water 1:5 0,17 6. methanol:10¾ ammoniumacetaat in water:10# ammonium- hydroxyde 10:9:1 0,52 7. n-butanol:pyridine:water:azijnzuur 6:U:3:1 0,1+5 10 8) methanol: 10¾ ammoniumacetaat in water :10¾ ammonium- hydroxyde in water 10:9:1 0,11 9) 0,25 M NaHgPO^ in water:acetonitril 1:1 0,68 10. methanol:10¾ ammoniumacetaat in water 1:1 0,65 11. n-butanol:azijnzuur:water ^:2:5 0,77 15. tot 7 op silicagel 60 -platen; 8 en 9 op gesilaniseerd Silocagel 60,^ 10 en 11 op cellulose F platen. J) na 6 uur hydrolyse bij 110°C in 6 N HC1 een aminozuur-analyse vertoont, die duidt op de aanwezigheid van tenminste de volgende, herkende aminozuren: ornithine, asparaginezuur, threonine, glycine, 20 alanine, leucine, fenylalanine, p-bydroxyfenylglycine en hydroxy-chloorgesubstitueerde fenylglycine.

2. Werkwijze ter bereiding van een antibiotisch Werkzame stof volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men de stam Actinoplanes sp. ATCC 33076 kweekt in een voedingsvloeistof, die 25 assimileerbare koolstof-, en stikstofbronnen en anorganische voe-dingszouten bevat, dat dit aëroob en in ondergedompelde toestand wordt uitgevoerd tot een aanmerkelijke hoeveelheid antibioticum A/16686 is gevormd, en dat men de stof met antibiotische werking op in de techniek bekende wijze isoleert.

3. Werkwijze ter bereiding van een antibiotisch werk zame stof volgens conclusie 1 en 2, met het lenmerk, dat men de stam Actinoplanes sp. ATCC 33076 in een kweekvloeistof, die assimileerbare koolstof- en stikstofbronnen en anorganische voedingszouten bevat, kweekt, dat dit aëroob en in ondergedompelde toestand wordt 35 uitgevoerd tot een aanmerkelijke hoeveelheid stof met antibiotische werking is gevormd, dat men de stof met antibiotische werking af- 8001982 λ * scheidt door afzonderlijke extractie van kweekvloeistof en mycelium met een organisch oplosmiddel, bestaande uit een lagere alkanol of chloroform, dat men de uit de extracten verkregen antibiotische stof behandelt met een mengsel van chloroform:ethanol:water 5 (^:7:2), dat men het zich daarbij afscheidende, olie-achtige produkt in water giet, dat men het ontstane neerslag afscheidt en verder zuivert door chromatografie over een kolom silicagel met een mengsel van acetonitril: 0,01 N HC1 (1:1) als elutiemiddel en daarmee antibioticum A/16686-hydrochloride verkrijgt, dat voor chromato-10 grafie over een kolom met verknoopt dextrinegel van zouten wordt ontdaan, en dat men desgewenst het gezuiverde antibioticum A/16686— hydrochloride op bekende wijze in de vrije base of in een ander, fysiologisch aanvaardbaar zout omzet. k. Antibiotisch werkzame stof volgens conclusie 1, met 15 het kenmerk, dat deze in antibioticum A/16686-hydrochloride bestaat.

5. Toepassing van antibioticum A/16686 in de vorm van de vrije base of van een fysoplogisch aanvaardbaar zuur-additie-zout als bacteriebestrijdend middel.

6. Farmaceutisch preparaat, met het kenmerk, dat dit 20 als actieve stof antibioticum A/16686 in de vorm van de vrije base of van een fysiologisch aanvaardbaar zuur-additiezout bevat. 800 1 9 82