FI65630C - Foerfarande foer framstaellning av glykopeptid-antibiotikumet a/16686 - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av glykopeptid-antibiotikumet a/16686 Download PDFInfo
- Publication number
- FI65630C FI65630C FI800881A FI800881A FI65630C FI 65630 C FI65630 C FI 65630C FI 800881 A FI800881 A FI 800881A FI 800881 A FI800881 A FI 800881A FI 65630 C FI65630 C FI 65630C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- butanol
- water
- methanol
- antibiotic
- positive
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
- C10G—CRACKING HYDROCARBON OILS; PRODUCTION OF LIQUID HYDROCARBON MIXTURES, e.g. BY DESTRUCTIVE HYDROGENATION, OLIGOMERISATION, POLYMERISATION; RECOVERY OF HYDROCARBON OILS FROM OIL-SHALE, OIL-SAND, OR GASES; REFINING MIXTURES MAINLY CONSISTING OF HYDROCARBONS; REFORMING OF NAPHTHA; MINERAL WAXES
- C10G49/00—Treatment of hydrocarbon oils, in the presence of hydrogen or hydrogen-generating compounds, not provided for in a single one of groups C10G45/02, C10G45/32, C10G45/44, C10G45/58 or C10G47/00
- C10G49/02—Treatment of hydrocarbon oils, in the presence of hydrogen or hydrogen-generating compounds, not provided for in a single one of groups C10G45/02, C10G45/32, C10G45/44, C10G45/58 or C10G47/00 characterised by the catalyst used
- C10G49/08—Treatment of hydrocarbon oils, in the presence of hydrogen or hydrogen-generating compounds, not provided for in a single one of groups C10G45/02, C10G45/32, C10G45/44, C10G45/58 or C10G47/00 characterised by the catalyst used containing crystalline alumino-silicates, e.g. molecular sieves
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J29/00—Catalysts comprising molecular sieves
- B01J29/04—Catalysts comprising molecular sieves having base-exchange properties, e.g. crystalline zeolites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C01—INORGANIC CHEMISTRY
- C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
- C01B33/00—Silicon; Compounds thereof
- C01B33/20—Silicates
- C01B33/26—Aluminium-containing silicates, i.e. silico-aluminates
- C01B33/28—Base exchange silicates, e.g. zeolites
- C01B33/2807—Zeolitic silicoaluminates with a tridimensional crystalline structure possessing molecular sieve properties; Isomorphous compounds wherein a part of the aluminium ore of the silicon present may be replaced by other elements such as gallium, germanium, phosphorus; Preparation of zeolitic molecular sieves from molecular sieves of another type or from preformed reacting mixtures
- C01B33/2884—Zeolitic silicoaluminates with a tridimensional crystalline structure possessing molecular sieve properties; Isomorphous compounds wherein a part of the aluminium ore of the silicon present may be replaced by other elements such as gallium, germanium, phosphorus; Preparation of zeolitic molecular sieves from molecular sieves of another type or from preformed reacting mixtures the aluminium or the silicon in the network being partly replaced
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C1/00—Preparation of hydrocarbons from one or more compounds, none of them being a hydrocarbon
- C07C1/02—Preparation of hydrocarbons from one or more compounds, none of them being a hydrocarbon from oxides of a carbon
- C07C1/04—Preparation of hydrocarbons from one or more compounds, none of them being a hydrocarbon from oxides of a carbon from carbon monoxide with hydrogen
- C07C1/0425—Catalysts; their physical properties
- C07C1/043—Catalysts; their physical properties characterised by the composition
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C1/00—Preparation of hydrocarbons from one or more compounds, none of them being a hydrocarbon
- C07C1/02—Preparation of hydrocarbons from one or more compounds, none of them being a hydrocarbon from oxides of a carbon
- C07C1/04—Preparation of hydrocarbons from one or more compounds, none of them being a hydrocarbon from oxides of a carbon from carbon monoxide with hydrogen
- C07C1/0425—Catalysts; their physical properties
- C07C1/043—Catalysts; their physical properties characterised by the composition
- C07C1/0435—Catalysts; their physical properties characterised by the composition containing a metal of group 8 or a compound thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C1/00—Preparation of hydrocarbons from one or more compounds, none of them being a hydrocarbon
- C07C1/02—Preparation of hydrocarbons from one or more compounds, none of them being a hydrocarbon from oxides of a carbon
- C07C1/04—Preparation of hydrocarbons from one or more compounds, none of them being a hydrocarbon from oxides of a carbon from carbon monoxide with hydrogen
- C07C1/0425—Catalysts; their physical properties
- C07C1/043—Catalysts; their physical properties characterised by the composition
- C07C1/0435—Catalysts; their physical properties characterised by the composition containing a metal of group 8 or a compound thereof
- C07C1/044—Catalysts; their physical properties characterised by the composition containing a metal of group 8 or a compound thereof containing iron
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
- C10G—CRACKING HYDROCARBON OILS; PRODUCTION OF LIQUID HYDROCARBON MIXTURES, e.g. BY DESTRUCTIVE HYDROGENATION, OLIGOMERISATION, POLYMERISATION; RECOVERY OF HYDROCARBON OILS FROM OIL-SHALE, OIL-SAND, OR GASES; REFINING MIXTURES MAINLY CONSISTING OF HYDROCARBONS; REFORMING OF NAPHTHA; MINERAL WAXES
- C10G35/00—Reforming naphtha
- C10G35/04—Catalytic reforming
- C10G35/06—Catalytic reforming characterised by the catalyst used
- C10G35/065—Catalytic reforming characterised by the catalyst used containing crystalline zeolitic molecular sieves, other than aluminosilicates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C2529/00—Catalysts comprising molecular sieves
- C07C2529/04—Catalysts comprising molecular sieves having base-exchange properties, e.g. crystalline zeolites, pillared clays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/045—Actinoplanes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/827—Actinoplanes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Geology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
FTgV-71 m n<1 icuuLUTusjuuKAisu ,γ/τπ
Mj» ™ UTLÄGGNINCSSKRIFT OOOOU
c (45) Patentti 11 :5 1724 ' v ^ (51) Kv.lkP/lnt.CI.3 C 12 P 21/00 // C 12 P 9/00 SUOMI—FINLAND (21) Pwunttlhakunw* — Pit«ntan*Öknlng 800881 (22) HaktmltpUvt — Ant6knlnf*da| 21.03*80 (23) Alkupllvi — Glltlfhtttdac 21.03.80 (41) Tullut JulklMkil — Bllvlt offuntllc 08.10.80
Patentti- ja rekisterihallitut (44) Nthtivlkilpanon Ja kuuL|ulkai*in pvm.— 29 02.84
Patent* och registerstyrelsen AnaMnn uttefd och utl.ikrtft*n publtc«r*d ^ * (32)(33)(31) Pjrrd*«jr «tuolkwt—e«t«r4 prtoritat 07.04.79
Englanti-England(GB) 7912298/79 (71) Gruppo Lepetit S.p.A., via Durando, 38, 29158 Milano, Italia-ltaiien(lT) (72) Bruno Cavalleri, Milano, Hermes Pagani, Milano, Giancarto Volpe,
Milano, Italia-ltalien(IT) (74) Munsterhielm Ky Kb (54) Menetelmä glykopeptidi-antibiootin A/16686 valmistamiseksi - Förfarande för framstSIIning av glykopeptid-antibiotikumet A/16686 Tämä keksintö koskee menetelmää valmistaa antibioottia, jota seu-raavassa kutsutaan antibiootiksi A/16686, viljelemällä tähän asti tuntematonta kantaa, joka taksonomisesti on kuvattu Actinoplanes-suvun uutena kantana.
Actinoplanes-suvun kantojen tiedetään tuottavan erilaisia klooria sisältäviä antibiootteja, joita on kuvattu esimerkiksi seuraavissa patenteissa FI-patentti 54 145, US-patentti 3978211 ja SE-patentit 376771 ja 379053.
Antibiootti A/16686 on glykopeptidi-antibiootti, jolla on emäksinen luonne ja joka pystyy muodostelmaan haopoadditiosuoloja. Tästä johtuen antibiootin A/16686 fysiologisesti hyväksyttävät happoadditio-suolat ovat osa tätä keksintöä.
Yksinkertaisuuden vuoksi on seuraavassa käytetty termiä "antibiootti A/16686" tarkoittamaan antibioottia, joka on antibiootti A/16686 vapaana emäksenä tai sen fysiologisesti hyväksyttävänä happoadditio-suolana.
Antibiootti A/16686 estää in vitro tiettyjen patogeenisten bak-teereiden, erityisesti gram-positiivisten bakteereiden kasvun. Lisäksi antibiootti A/16686 antaa, parenteraalisesti annostettaessa, korkean suojan kokeellisesti aikaansaatuja tulehduksia vastaan hiirissä.
2 65630
Kuten edellä mainittiin, antibioottia A/16686 valmistetaan viljelemällä Actinoplanes-suvun uutta kantaa. Tämän kannan, joka eristettiin Vaghalbod'issa (Intia) kerätystä maanäytteestä, viljelmä on tallennettu 30. päivänä tammikuuta 1979 ATCC:n pysyvään viljelmäkokoel-maan (American Type Culture Collection) - 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, jossa sille on annettu liittymisnumero ATCC 33076.
Actinoplanes sp. ATCC 33076:n tunnusmerkit on esitetty seuraa-vissa kappaleissa:
Morfologia
Kanta kasvaa hyvin erilaisilla väliaineilla oranssin värisellä substraattimyseelillä. Se ei tuota pigmenttiä. Ilmamyseeli puuttuu aina.
Mikroskooppisessa tutkimuksessa kasvumyseeli paljastuu haarautuneeksi hyphae'ksi, jonka läpimitta on noin 1 jim. Itiöpesäkkeitä muodostuu niukasti ainoastaan peruna-agarilla ja ne ovat pallomaisia ja niillä on hyvin epäsäännöllinen pinta ja niiden läpimitta on 5,0 - 9,0 jim. Itiöiden vapautuminen on havaittavissa itiöpesäkkeen seinän murtumisen jälkeen. Subsfääriset itiöt ovat liikkuvia (halkaisija 1,0 - 1,5 μπι). Soluseinän komponenttien analyysistä saadaan meso-diaminopime-liinihappoa ja D-tyyppiä olevaa sokerirakennetta (Lechevalier et ai., Chemical composition as a criterium in the classification of Actino-mycetes. Adv. Applied Microbiology, 1Λ, 1971· Academic Press N.Y.),
Vi 1j elytunnusmerkit
Taulukossa I on esitetty Actinoplanes ATCC 33076:n viljely-tunnusmerkit erilaisilla standardiväliaineilla Shirling'in ja Gott-lieb'in mukaan (Intern. J. System. Bact. i6, 313-3^0, 1966) ja muilla väliaineilla Waksman'in mukaan (The Actinomycetes, Voi. II - The Williams and Wilkins Co. 1961). Viljelyominaisuudet määritettiin 6-1^ vuorokauden inkuboinnin jälkeen 30°C:sessa.
TAULUKKO I
Viljelytunnusmerkit
Joidenkin viljelyväliaineiden kohdalla esitetyt numerot viittaa-vat Shirling'in ja Gottlieb'in käyttämiin numeroihin Streptomyces-la-jien karakterisointimenetelmissä - Intern. J. System. Bact. 16, 313~ -3^0, 1966.
Vlllelyvälialne VI 1.1 elytunnusmerki t Väliaine No 2 runsasta kasvua, rypistynyt pinta, (hiivauute-mallas-agar) vaalean ruskea 12 H 12 3 65630 Väliaine No 3 niukkaa kasvua, ohut, vaalean oranss: (kaurajauho-agar) 9 B 6' Väliaine No b kohtuullista kasvua, rapea pinta, (epäorgaanisia suoloja- oranssi 11 L 12 tärkkelys-agar) Väliaine No 5 niukkaa kasvua, läpinäkyvä (glyseroli-asparagiini-agar) Väliaine No 6 niukkaa kasvua, läpinäkyvästä-vaalean (peptoni-hiivauute-rauta- ruskeaan agar) Väliaine No 7 niukkaa kasvua, pehmeä pinta, (tyrosiini-agar) ruskea 5 D 11
Kaurajauho-agar runsasta kasvua, rypistynyt pinta, (Waksman'in mukaan) oranssista ruskeaan 12 C 10
Hickey'ri ja Tresner'in agar runsasta kasvua, rapea pinta, oranssi 11 G 8
Czapek-glukoosi-agar kohtuullista kasvua, rapea pinta, oranssi 11 G 8
Glukoosi-asparagiini-agar niukkaa kasvua, rapea pinta, vaalean oranssi 11 F 6
Ravinto-agar kohtuullista kasvua, pehmeä pinta, oranssi 11 G 8
Peruna-agar runsasta kasvua, rypistynyt pinta, kullanruskea 12 E 10
Bennett'in agar runsasta kasvua, rypistynyt pinta, oranssi 11 C 8
Kalsium-malaatti-agar kohtuullista kasvua, pehmeä pinta, vaalean oranssi 10 C 6
Kuorittu maito-agar runsasta kasvua, rypistynyt pinta, oranssi 9 C 2
Czapek-agar kohtuullista kasvua, rapea pinta, oranssi 10 D 7
Muna-agar kohtuullista kasvua, pehmeä pinta, läpinäkyvästä vaalean oranssiin
Peptoni-glukoosi-agar runsasta kasvua, rypistynyt pinta, oranssi 11 G 11
Agar hyvin niukkaa kasvua, pehmeä pinta, läpinäkyvä
Loeffler-seerumi hyvin niukkaa kasvua, pehmeä pinta, oranssi
Peruna niukkaa kasvua, rapea, vaalean ruskea
Liivate niukkaa kasvua, vaalean oranssi
Selluloosa hyvin niukkaa kasvua, ohut, läpinäkyvä 1+ 65630
Hiilen hyväksikäyttö
Taulukossa II on esitetty hiililähteiden hyväksikäyttö, joka on tutkittu Pridham'in ja Gottlieb'in menetelmän mukaisesti (J. Bact. 56, 107, 19^8).
TAULUKKO II
Hiililähde Hyväksikäyttö
Inositoli
Fruktoosi + ramnoosi + mannitoli ksyloosi + raffinoosi arabinoosi + selluloosa sakkaroosi + glukoosi + mannoosi + laktoosi salisiini + + tarkoittaa hyväksikäyttöä tarkoittaa ei-kasvua
Fysiologiset tunnusmerkit
Taulukossa III on esitetty kannan fysiologiset tunnusmerkit.
TAULUKKO III
Koe Tulos tärkkelyshydrolyysi positiivinen H2S-muodostus positiivinen tyrosinaasi-reaktio negatiivinen kaseiini-hydrolyysi positiivinen kalsiummaleaatti-liuotus negatiivinen gelatiinin-nesteytys positiivinen lakmusmaito-koagulaatio positiivinen lakmusraaito-peptonisaatio negatiivinen selluloosa-hajotus negatiivinen 5 65630
Antibiootin A/16686 valmistamiseksi viljellään kantaa Actino-planes sp. ATCC 33076 aerobisissa olosuhteissa vesipitoisessa ravinto-väliaineessa, Joka sisältää assimiloitavan hiililähteen, assimiloituvan typpilähteen Ja epäorgaanisia suoloja. Mainittu viljelyväliaine voi olla mikä tahansa lukuisista ravintoväliaineista, joita tavallisesti käytetään käymisessä, kuitenkin tietyt väliaineet ovat parempia. Täten esimerkiksi hyviä hiililähteitä ovat glukoosi, fruktoosi, man-noosi, sakkaroosi ja vastaavat. Typpilähteet ovat mieluimmin soija-papujauho, peptoni, lihauute, hiivauute, tryptoni, aminohapot ja vastaavat. Epäorgaanisia suoloja, joita voidaan lisätä viljelyväliainei-siin,ovat yleisesti liukenevat suolat, jotka pystyvät tuottamaan natrium-, kalium-, rauta-, sinkki-, koboltti-, magnesium-, kalsium-, ammonium-, kloridi-, karbonaatti-, sulfaatti-, nitraati-ioneja sekä vastaavia. Tavallisesti antibioottia tuottavaa kantaa esiviljellään ravistuspullossa, sen jälkeen viljdmää käytetään käymisastioiden ymp-päämiseen antibiootin A/16686 huomattavien määrien valmistamiseksi. Väliaine, jota käytetään esiviljelyssä, voi olla sama kuin suuremmissa käymisastioissa, mutta voidaan myös käyttää toista väliainetta.
Antibioottia A/16686 tuottava kanta voi kasvaa lämpötilassa, joka on noin 20° - 37°C, ja mieluimmin lämpötilassa noin 28°-30°C.
Käymisen kuluessa antibiootin tuottoa voidaan seurata testaamalla näytteiden, jotka saadaan liemestä tai uuttamalla kiinteää raysee-liä, antibioottista aktiviteettia. Tähän tarkoitukseen ovat hyödyllisiä sellaiset organismit, joiden tiedetään olevan herkkiä antibiootille A/16686. Yksi erityisen hyödyllinen koe-organismi on Sareina lutea. Määritys suoritetaan tarkoituksenmukaisesti agar-diffuusiomenetelmäl-lä agar-levyillä. Antibioottisen aktiviteetin maksimi-tuotto tapahtuu yleensä kolmannen ja viidennen päivän välillä. Antibioottia, jota valmistetaan kannan Actinoplanes sp. ATCC 33076:n käymisellä, on sekä kasvatusliemessä että qyseelimassassa. Antibiootin A/16686 talteenotto voidaan sen tähden suorittaa uuttamalla erikseen käymisliemi ja myseeli.
Myseelimassan uuttaminen suoritetaan mieluimmin metanolilla, mutta myös muut alemmat alkoholit ja kloroformi ovat sopivia. Antibiootti A/16686 saadaan talteen uuttoliuottimesta raakatuotteenä tavallisella menetelmällä. Vastaavasti myös liemi uutetaan - mieluinanin n-butanolilla - ja lisää raakaa antibioottia A/16686 saadaan kiteyttämällä tästä liuoksesta. Raa'an antibiootin A/16686 puhdistaminen suoritetaan, sen jälkeen, käsittelemällä uuttoliuottimista saatua tuotetta kloroformi:etanoli:vesi-seoksella (^-:7:2), erottamalla muo- 6 5 6 30 dostunut öljymäinen tuote Ja kaatamalla se veteen. Tämä käsittely Johtaa tuotteen kiteytymiseen, tuote otetaan talteen suodattamalla Ja puhdistetaan edelleen kromatografisesti piihappogeelipylväässä eiuoimalla seoksella asetonitriili:0,01 N HC1 (1:1). Antibiootti A/16686, Joka tämän menetelmän mukaisesti saadaan hydrokloridin muodossa, sen Jälkeen vapautetaan suolasta kromatografisesti ristiinkytketyssä deks-traanigeelipylväässä.
Edellä esitetyn puhdistusmenetelmän Jokaista vaihetta seurataan ohutkerroskromatografisesti käyttäen sopivaa liuotinsysteemiä, kuten emäksistä liuotinsysteemiä, esimerkiksi n-propanoli:'n-buta-noli:N-ammoniumhydroksidi (2:3:^) (ylempi faasi) tai metanoli:10/S vesipitoinen ammoniumasetaatti: 10 % ammoniumhydroksidi (10:9:1), jossa antibiootin A/16686 mikä tahansa happoadditiosuola muuttuu vapaaksi emäkseksi. Kaikkien edellä esitettyjen vaiheiden tarkoituksena on eristää puhdas antibiootti A/16686, jota kuvaa tietty R^-arvo tietyssä käytetyssä liuotinsysteemissä.
Muita puhdistusmenetelmiä voidaan sopivasti käyttää, mukaanlukien tavanomaiset uutto- ja adsorptiomenetelmät. Mainittuja vaihtoehtoisia menetelmiä voidaan helposti lisätä, vaihe vaiheelta, seurattaessa puhdistuksen etenemistä ohutkerroskromatografisesti, kuten edellä esitettiin. Seurattaessa antibiootin A/16686 tlc-täplää, jolla on tietty Rf-arvo, on alan ammattimiehelle itsestään selvää, mitkä menetelmät olisivat sopivia suoritettavaksi puhtaan antibiootin A/16686 eristämiseksi.
Haluttaessa puhtaan antibiootin A/16686 hydrokloridi, joka saadaan edellä esitetyn menetelmän mukaisesti, voidaan sen jälkeen muuttaa vastaavaksi vapaaksi emäkseksi tai toiseksi fysiologisesti hyväksyttäväksi happoadditiosuolaksi tavallisilla menetelmillä.
Antibiootti A/16686 on antimikrobinen aine ja se on erityisen aktiivinen gram-positiivisia mikro-organismeja vastaan. Erityisesti, antibiootin A/16686 in vitro aktiviteettispektri on esitetty seu-raavassa taulukossa IV: 7 65630
TAULUKKO IV
Antibiootin A/16686 pienin estä-urganismi___vä konsentraatio (;ig/ml)_ 3. aureus ATCC 6538 0,16 S. aureus ATCC 9lM+ 0,l6 S. aureus Tour 0,31
Staphylococcus 10B Ciba 0,08 S. epidermidis ATCC 12228 0,08 S. saprophyticus NCTC 7292 0,l6 M. flavus ATCC 102>+0 0,016 S. lutea ATCC 93*+l 0,02 S. pyogenes C 203 SKF I3I+OO 0,01 S. pneumoniae Felton UC *+l 0,05 S. faecalis ATCC 7080 0,31 S. foecium ATCC 105*+1 0,08 S. agalactiae ATCC 7077 0,02 S. mutans ATCC 27607 0,08 C. diphtherias var.mitis ATCC 11051 0,31 C. xerosis NCTC 9755 0,02 B. subtilis ATCC 6633 0,062 B. cereus var.mycoides ATCC 11778 0,08 C. perfringens I3S 305*+3 0,16 P. acnes ATCC 6919 0,*+ P. acnes ATCC 6922 0,8 P. acnes ATCC 257*+6 0,*+
Taulukossa V on esitetty tulokset kokeista, joissa antibioottia A/16686 on testattu kliinisesti eristettyjä erilaisia Staphylococcus aureus-, Streptococcus pyogenes-, Streptococcus pneumoniae- ja Streptococcus faecalis-kantoja vastaan.
65630 8
TAULUKKO V
Organismi Antibiootin A/16686 pienin estävä g konsentraatio (jig/ml) S. aureus 5^310 L 1096 0,62 S. aureus 5^560/1 L 1097 0,31 S. aureus 5*+635 L 1098 0,31 S. pyogenes L 33 0,0^ 3. pyogenes L 79*+ 0,08 3. pyogenes L 800 0,0*+ S. pyogenes L 801 0,l6 S. pyogenes L 802 0,08 S. pyogenes L 803 0,08 S. pyogenes L 80*+ 0,62 S. pyogenes L 805 0,08 S. pneumoniae L 1055 0,0*+ S. pneumoniae L 1102 0,0*+ S. pneumoniae L 117^ 0,08 3. faecalis L 768 0,31 S. faecalis L 876 0,31 3. faecalis L 922 0,31 S. faecalis L 9*+9 0,31 S. faecalis L 965 0,31 S. faecalis L 1139 0,62 S. foecium L 763 0,l6
Antibiootilla A/16686 on myös havaittu korkea aktiviteetti in vivo erilaisia patogeenisiä organismeja vastaan. Antibiootin A/16686 tehokkuus ilmenee selvästi taulukosta VI, jossa annetaan ED^q-arvot hiirillä kolmea eri mikro-organismia vastaan.
TAULUKKO VI
ED5q rag/kg s.c.
S. aureus Tour S. pyogenes S. pneumoniae C203 ISM Felton UC l+l —j---------—~— A/16686 2»+,6 0,09 0,2 9 65630
Antibiootilla A/16686 on havaittu olevan suhteellisen alhainen myrkyllisyys, kun sitä on käytetty koe-eläimillä. Esimerkiksi LD^g--arvo, kun antibioottia annetaan intraperitoneaalisesti hiirille, on suunnilleen välillä 500 - 700 mg/kg.
Tämän keksinnön toiminnan edelleen kuvaamiseksi esitetään seu-raavat esimerkit:
Esimerkki 1
Actinoplanes sp. ATCC 33076-kannan käyminen
Actinoplanes sp. ATCC 33076:n viljelmää esiviljellään kasvattamalla kantaa ravistuspulloviljelmässä, jolla on seuraava koostumus : lihauutetta 3 g/1 hiivauutetta 5 g/1 tryptöniä 5 g/1 liukoista tärkkelystä 24 g/1 glukoosia 1 g/1
CaCOj:a 4 g/1 vesijohtovettä 1 litra
Pulloja ravistellaan noin 96 tuntia 28° - 30° C:ssa ja sen jälkeen näitä esiviljelmiä (1 litra) käytetään käymisastioiden ymp-päämiseen, joista jokainen sisältää 10 litraa seuraavaa ravintoväli-ainetta: φ 10 65630 1 ihauut et ta 1*0 g peptonia 1+0 g hiivauutetta 10 g natriumkloridia 25 g soijapapujauhetta 100 g glukoosia 250 g
CaCO^ja 50 g vesijohtovettä 10 litraa Käymiserät inkuboidaan aerobisesti, samalla hämmentäen, 28--30° C:ssa. Tietyin väliajoin määritetään antibioottinen aktiviteetti mikrobiologisesti agar-diffuusiomenetelmällä käyttäen koeorganis-mina Sareina lutea'a. Maksimiaktiviteetti saavutetaan 72-120 tunnin käymisen jälkeen.
Esimerkki 2
Antibiootin A/16686 talteenotto
Koko käymisliemi (170 1), joka on valmistettu kuten esimerkissä 1 esitettiin, jäähdytetään 10°C:seen ja pH säädetään 18 $:sella HCl:llä arvoon 3,5· Näin saatu hapan liemi suodatetaan käyttäen suo-datusapuainetta (Clarcel Flow-Ma) ja myseelikakku pestään vedellä.
Sen jälkeen suodatettua lientä ja myseeliä käsitellään edelleen erikseen.
a) Metanolia (30 1) käytetään myseelimassan uuttamiseen, joka suodatuksen jälkeen, uutetaan uudelleen seoksella metanoli/vesi (30 1 metanolia plus 5 1 vettä). Uutettu myseeli heitetään pois ja kaksi metanoliuutetta konsentroidaan tyhjössä lämpötilassa, joka on alle bO°C, jolloin saadaan vesipitoinen konsentraatti (6 1). Tämä vesipitoinen konsentraatti uutetaan kolme kertaa, joka kerta 10 litralla n-butanolia, uutteet yhdistetään ja konsentroidaan pieneen tilavuuteen tyhjössä.
Tämä konsentraatti lisätään petrolieetteriin ja muodostunut saostuma erotetaan dekantoimalla ja lisätään jälleen petrolieetteriin. Sakka erotetaan suodattamalla ja kuivataan tyhjössä huoneen lämpötilassa, jolloin saadaan 80 g antibioottia A/16686 raakatuotteena, jonka pienin estävä konsentraatio kantaa S. pneumoniae UC *+1 vastaan on 0,1 μg/ml.
b) Suodatettu liemi plus myseelikakun pesuvesi (165 1) jäähdytetään 10°C:seen ja säädetään pH-arvoon 3,5 lisäämällä konsentroitua HCl:ää (2,5 1). Saatu liuos uutetaan n-butanolilla (80 1) ja sen jälkeen orgaaninen uute konsentroidaan tyhjössä lämpötilassa, joka on 11 65630 alle 35°C, jolloin saadaan butanolikonsentraatti (6 1). Tämä konsen-traatti lisätään petrolieetteriin ja saatu sakka erotetaan dekantoi-malla ja lisätään jälleen petrolieetteriin. Kiinteä aine erotetaan suodattamalla ja kuivataan tyhjössä huoneen lämpötilassa, jolloin saadaan 26,3 g raakaa antibioottia A/16686, jonka pienin estävä kon-sentraatio kantaa S. pneumoniae UC *+1 vastaan on 0,8 yig/ml.
Esimerkki 3
Antibiootin A/16686 puhdistus i+7,7 g raakaa antibioottia A/16686, joka saadaan esimerkissä 2a), käsitellään l,1* litralla kloroformi:etanolijvesi-seosta (^:7:2, til./til./til.) ja öljymäinen tuote, joka muodostuu, erotetaan liuoksesta dekantoimalla. Sen jälkeen öljymäiseen tuotteeseen lisätään edelleen 70 ml edellä esitettyä seosta ja erottaminen toistetaan. Käsittelemällä öljymäistä tuotetta vedellä (MfO ml), se kiteytyy ja erotetaan sentrifugoimalla ja suodattamalla: a) Erotettu, kiinteä aine suspendoidaan veteen (170 ml), liuotetaan lisäämällä metanolia (*+00 ml) ja suodatetaan. Sen jälkeen liuottimet poistetaan tyhjössä lisäämällä n-butanolia lämpötilassa, joka ei koskaan ole yli 35°C:sen, saadaan noin 50 ml:n butanolikonsentraatti. Lisäämällä dietyylieetteriä (500 ml) muodostuu sakka, joka erotetaan suodattamalla ja kuivataan tyhjössä huoneen lämpötilassa, jolloin saadaan 1,012 g melko puhdasta antibioottia A/16686, jonka pienin estävä konsentraatio S. pyogenes-kantaa vastaan on 0,025 }ig/ml. Näin melko puhtaana saatu antibiootti A/16686 puhdistetaan sen jälkeen seuraavien puhdistusmenetelmien mukaisesti: 1,58 g edellä saatua antibioottia A/16686, jonka pienin estävä konsentraatio S. pyogenes-kantaa vastaan on 0,025 pg/ml, liuotetaan asetonitriilisveteen (1:1, til./til.) ja saatu liuos laitetaan pylvääseen, joka sisältää ^30 g piihappogeeliä 60 (Merck 0,06-0,2 mm) ja joka on valmistettu samaan seokseen. Pylväs kehitetään ensin käyttämällä samaa asetonitriili:vesi-seosta ja keräämällä 70fraktiota, kukin 20 ml, ja sen jälkeen käyttämällä asetonitriili:N/100 HCl:ää (1:1, til./til.) ja keräämällä edelleen 290 fraktiota, jokainen 20 ml. Pylvään eluointia seurataan ohutkerroskromatografisesti 60 F25i4.-piihappogeeli-levyillä ja määrittämällä fraktiot Sareina lutea'a vastaan. Fraktiot 130-265 yhdistetään ja liuottimet poistetaan tyhjössä n-butanolilla, jolloin saadaan 20 ml:n n-butanolikonsentraatti. Tämä jäännösliuos kaadetaan suureen määrään etyylieetteriä ja sakka, joka muodostuu, erotetaan suodattamalla ja kuivataan tyhjössä huoneen lämpötilassa P?0^Uä, jolloin saadaan 1,015 g antibioottia A/16686.
65630 12 0,67 g edellä saatua ainetta liuotetaan 24 ml:aan vettä ja 76 ml:aan metanolia. Saatu liuos laitetaan pylvääseen, joka on 3,0 x 62,0 cm ia sisältää 220 g ristiinkytkettyä dekstraania, esim. Sephadex LH--20^ :tä ja on valmistettu metanoli:veteen (7:3, til./til.). Pylväs kehitetään samalla seoksella keräämällä 10 ml:n fraktioita. Fraktiot 24-32 yhdistetään ja liuottimet poistetaan tyhjössä lämpötilassa, joka on alle 35°C, n-butanolilla, jolloin saadaan noin 10 ml:n jäännösbuta-noliliuos. Tämä liuos lisätään etyylieetteriin toivotun puhtaan antibiootin A/16686 saostamiseksi. Sakka erotetaan suodattamalla, pestään etyylieetterillä ja kuivataan tyhjössä P20g:llä huoneen lämpötilassa, jolloin saadaan 0,26 g puhdasta antibioottia A/16686.
b) Suodos poistetaan tyhjössä lämpötilassa, joka on alle 35°C, lisäämällä n-butanolia, jolloin saadaan 50 ml:n n-butanolikonsentraat-ti. Lisäämällä petrolieetteriä muodostuu sakka, joka erotetaan suodattamalla ja kuivataan tyhjössä huoneen lämpötilassa, jolloin saadaan 42,9 g osittain puhdistettua antibioottia A/16686, jolle on tunnusomaista pienin estävä konsentraatio-arvo 0,2 pg/ml S. pyogenes-kantaa vastaan. Tämä antibioottinen aine suspendoidaan veteen (2,5 1) ja liuotetaan lisäämällä 1 N NaOHsta pH-arvoon 7. Sen jälkeen saatu vesipitoinen liuos uutetaan kolme kertaa, joka kerta 5 litralla n-butanolia ja tämä orgaaninen faasi, sen jälkeen kun se on pesty vedellä, konsentroidaan 200 ml:aan tyhjössä lämpötilassa, joka on alle 35°C.
Lisäämällä dietyylieetteriä konsentraattiin, muodostuu sakka, joka suodatetaan ja kuivataan tyhjössä huoneen lämpötilassa. Kuiva tuote liuotetaan 160 ml:aan n-propanoli:n-butanoli:1 N ammoniumhyd-roksidi-seoksen (2:3:4, til./til./til.) ylempää kerrosta. Saatu liuos laitetaan 100 cm korkeaan pylvääseen, jonka halkaisija on 7,5 cm ja joka sisältää 1,7 kg piihappogeeliä 60 (Merck 0,06-0,2 mm) ja on valmistettu edellä esitettyjen liuottimien seokseen. Pylväs kehitetään käyttäen samaa seosta, kerätään 300 ml:n fraktioita. Pylvään eluointia seurataan ohutkerroskromatografisesti. Fraktiot 21-26 yhdistetään ja haihdutetaan tyhjössä lämpötilassa, joka on alle 35°C, n-butanolilla, jolloin saadaan 50 ml:n n-butanolikonsentraatti. Lisäämällä dietyylieetteriä muodostuu saostuma, joka erotetaan suodattamalla, pestään di-etyylieetterillä ja kuivataan tyhjössä PjO^llä huoneen lämpötilassa. Saadaan 1,875 g:n erä melko puhdasta antibioottia A/16686, joka sen jälkeen puhdistetaan käyttäen edellä kohdassa a) esitettyjä menetelmiä.
Antibiootti A/16686 on hydrokloridina valkea, kiteinen aine, 65630 13 joka on heikosti hydroskooppinen ja sulaa 22b-226°Cisessa. Se on hyvin liukeneva veteen ja dimetyyliformamidiin, liukeneva metanoliin, etanoliin, propanoliin ja butanoliin, mutta liukenematon etyylieet-teriin, petrolieetteriin ja bentseeniin. Antibiootin A/16686 hydro-kloridin alkuaineanalyysi, kuivattu edeltäkäsin l*K)0C;sessa inertti-atmosfäärissä, antaa tulokseksi seuraavan likimääräisen prosenttisen koostumuksen (useiden analyysien keskiarvona); hiiltä 51,73 vetyä 6,3’+ typpeä 9,96 klooria (kokonaispitoisuus) 5,8*f kloori- -ioneja ^-,7^ % ja jäännös 1
Infrapuna-absorptiospektri nujol'issa on esitetty kuvassa 1. Seuraavat absorptiomaksimit havaitaan (emissä); 3290-3070, 2930 ja 2860 (nujoi), 1765, 1630, 1510, 1W, 1375 (nujol), 1230, 1175, 1130, 1065, 1030, 1015, 980, 8MD ja 820.
Ultraviolettiabsorptiospektri on esitetty kuvassa 2 ja siinä esiintyvät seuraavat absorptiomaksimit; a) metanolissa 232 nm (El^cm = 178 > 265 nm (El^cm = 107) b) metanolissa, joka sisältää 0,1 N HCl;ää 231 nm (Ei*cm = l6?) 270 nm (El^cm = 96) c) metanolissa, joka sisältää 0,1 N NaOHsta 250 nm (El^cm = 2325 295 nm (olka) d) metanolissa, joka sisältää puskuria pH 7,38 231 nm (Efom = 167) 270 nm (Ei*cm = 96)
Ultraviolettiabsorptiospektri rekisteröitiin Beckmann DK-2 spektro-fotometrillä.
Antibiootin A/16686 hydrokloridilla on ominaiskierto^j^ekj = + *+9,7° (c = 0^3% DMFsssä).
65630 ]Λ
Antibiootilla Α/16686 havaitaan seuraavat karakteristiset reaktiot: ninhydriini (3 % etanolinen liuos) negatiivinen ninhydriini (3 % etanolinen liuos + natriumasetaatti) positiivinen 1 % FeCl^ - 1 % K^Fe(CN)6 (vesipitoinen liuos) positiivinen (vihreä)
Molisch positiivinen
Fehling negatiivinen
Biureetti positiivinen
Antroni positiivinen
Millon negatiivinen I^SO^ väk. negatiivinen KMnO^ vesipitoinen positiivinen
Antibiootin A/16686 R^-arvot paperikromatografiässä, käyttäen erilaisia eluointisysteemejä ja S. aureus ATCC 6538:aa osoitusorga-nismina, on osoitettu seuraavassa taulukossa:
TAULUKKO VII
Antibiootin A/16686 kromatografinen käyttäytyminen (Whatman no. 1 paperi)
Eluointisysteemit Rj.-arvot 1) Sörensen-puskurilla pH 6,0 kyllästetty n-butanoli 0,00 2) vedellä, joka sisältää 2 % p-tolueeni- sulfonihappoa, kyllästetty n-butanoli 0,00 3) vedellä, joka sisältää 2 % ammoniumhyd- roksidia, kyllästetty n-butanoli 0,00 *+) n-butanolilla kyllästetty SÖrensen- -puskuri, pH 6,0 0,05 5) n-butanoli :metanoli: vesi ^+:1:2 0,*+3 6) vedellä kyllästetty etyyliasetaatti 0,00 7) n-butanoli:etikkahappo:vesi 2:1:1 0,52 8) n-butanoli:pyridiini:vesi *f:3:7 0,87 * Laskeva kromatografia Ajomatka: LO cm Määrät: 20 pg yhdistettä liuotettuna vesi-metanoliin (2mg/ml).
Antibiootin A/16686 Rf-arvot, erilaisissa ohutkerroskromato-grafia-systeemeissä on esitetty seuraavassa taulukossa (olosuhteet on esitetty taulukon jälkeen): 15 65630
TAULUKKO VIII
Eluointisysteemit (til./til./til.) -arvot 1) n-propanoli :n-butanoli :N ammoniumhydroksidi 2:3:^ (ylempi faasi) 0,15 2) n-butanoli:etikkahappo:vesi *+:2:5 0,6l 3) n-butanoli:etanoli:0,1 N kloorivetyhappo 0,6l *+) kloroformi: etanoli:10# etikkahappo 1+:7:2 0,00 5) n-butanoli:etikkahappo:vesi ^:1:5 0,17 6) metanoli:10 # vesipitoinen ammoniumasetaatti: 10# ammoniumhydroksidi 10:9:1 0,52 7) n-butanoli:pyridiini:vesi:etikkahappo 6:^+:3:1 0,1+5 8) metanoli:10 # vesipitoinen ammoniumasetaatti: 10 # ammoniumhydroksidi 10:9:1 0,11 9) 0,25 M vesipitoinen NaHoP0<,:asetonitriili ill 2 * 0,68 10) metanoli:10 # vesipitoinen ammoniumasetaatti 1:1 0,65 11) n-butanoli:etikkahappo:vesi ^+:2:5 0,77
Ajomatka: noin 1*+0 mm Määrät: 2-5 μΐ yhdisteen liuosta (1 mg/ml) asetonitriili-vedessä 1:1 Näkyväksi tekeminen: a) bioautografia agarlevyillä, jotka on ympätty B. subtilis ATCC 6633: Ha; b) karbonoiminen kuumentamalla 'X-naftoli--rikkihapon kanssa; c) jodihöyry; d) kloori-toluidiini-reagenssi; e) UV-valo aallonpituudella 25^ nm; levyt 1-7, jotka ovat piihappogeeli 60 F2^if-levyjä (Merck), tehdään näkyviksi menetelmillä a, e, b, c, d, e; levyt 8, 9, jotka ovat sila-noituja piihappogeeli 60 F2^if-levyjä (Merck), tehdään näkyviksi menetelmällä e; levyt 10 ja 11, jotka ovat selluloosa F-levyjä (Merck), tehdään näkyviksi menetelmällä a.
Korkeapainekromatografiatekniikalla määritettäessä antibiootti A/I6686, joka on eristetty ja puhdistettu esimerkissä 3 esitetyllä tavalla, muodostuu pääkomponentista, jota on 70-80#, kun taas jäljelle jäävä 30-20 # jakautuu ainakin kahteen pienempään komponenttiin. Antibiootin A/16686 hydrokloridi, joka on eristetty edellä 65630 16 olevissa esimerkeissä esitetyllä tavalla, on klooria sisältävän emäksisen glykopeptidin hydrokloridi, joka eroaa klassiseen glykopeptidi-ryhmään kuuluvista antibiooteista sisältäessään klooria sekä amino-happo-komponenttiensa vaihtelevuudessa. Antibiootin A/16686 aminohappo-analyysi, happohydrolyysin jälkeen 6 N kloorivetyhapossa 110° C:sessa 6 tuntia, aminohappo-autoanalysaattorilla osoittaa seuraavien aminohappojen esiintymisen: ornitiini (118 jig/mg = 0,58 μΜ/mg), aspa-ragiinihappo (29,9 Jig/mg = 0,22 pM/mg), treoniini (68 pg/mg = 0,57 jiM/mg), glysiini (25 pg/mg = 0,33 pM/mg), alaniini (29 pg/mg = 0,32 pM/mg), leusiini (*+l pg/mg = 0,31 pM/mg) ja fenyylialaniini (b2 pg/mg = 0,25 pM/mg).
Edelleen havaittiin neljä piikkiä käytettäessä neutraaleille ja happamille aminohapoille tarkoitettua pylvästä. Kaksi näistä neljästä aminohaposta identifioitiin kaasukromatografia-massaspektrometrin avulla, sen jälkeen kun ne oli muutettu vastaaviksi metyyliesteri-trfluoriasetyyli-johdannaisiksi, ja niille saatiin seuraavat rakenteet: OH OH Cl 1¾) ί^Ί
V
CH-NH- CH-NH0 1 2 1 2
C00H I C00H II
Esimerkki >+
Vapaan emäksen eristäminen Käsittelemällä antibiootin A/16686 hydrokloridin (0,05 g) liuosta vesi(3 ml)-etanoli(8 ml)-seoksessa 1,2-epoksibutaanilla (2 ml)»muodostuu saostuma, jonka annetaan seista alhaisessa lämpötilassa päivän ajan ja sen jälkeen se erotetaan sentrifugoimalla, pestään etanolilla ja kuivataan P20^:llä tyhjössä huoneen lämpötilassa, jolloin saadaan 0,016 g vastaavaa vapaata emästä.
Käsittelemällä antibiootin A/16686 mainittua vapaata emästä farmaseuttisesti hyväksyttävällä epäorgaanisella tai orgaanisella hapolla muodostuu vastaavan hapon happoadditiosuola. Farmaseuttisesti hyväksyttäviä happoja ovat myrkyttömät hapot, jotka ovat sopivia tunnettujen terapeuttisesti hyödyllisten suolojen muodostamiseen, tällaisia happoja ovat esimerkiksi kloorivety-, bromlvety-, rikki-, fosfori-, typpi-, viini-, etikka-, meripihka-, maito-, glutamiini- tai metaanisulfonihappo.
Claims (3)
1. FeCl-, - 1 % K-jFe(CN)/ positiivinen 3 (vihreä) Molish positiivinen Fehling negatiivinen Biureetti positiivinen Antroni positiivinen Millon negatiivinen H2SCV väk· negatiivinen KMnO^ positiivinen H) seuraavat R^-arvot paperikromatografiässä, Whatman no. 1 pape rilla käyttäen S. aureus ATCC 6538:aa osoitusorganismina: eluointisysteemit Rf-arvot I) Sörensen-puskurilla pH 6,0 kyllästetty n-butanoli 0,00 2. vedellä, joka sisältää 2 % p-tolueenisulfoni- happoa, kyllästetty n-butanoli 0,00 3. vedellä, joka sisältää 2 % ammonium- hydroksidia, kyllästetty n-butanoli 0,00 !+) n-butanolilla kyllästetty Sörensen- -puskuri, pH 6,0 0,05 5. n-butanoli:metanoli;vesi ^+:1:2 0,k3 6. vedellä kyllästetty etyyliasetaatti 0,00 7. n-butanoli-etikkahappo:vesi 2:1:1 0,52 8. n-butanoli:pyridiini:vesi ^:3:7 0,87 65630 19 I) seuraavat R^-arvot erilaisissa ohutkerroskromatografia-systee-meissä, jotka on esitetty seuraavassa: eluointisysteemit (til./til./til.) R^-arvot 1. n-propanoli:n-butanoli:N ammonium- hydroksidi 2:3:4 (ylempi faasi) 0,15 2. n-butanoli:etikkahappo:vesi 4:2:5 0,61 3. n-butanoli:etanoli:Ö,1 N kloorivetyhappo 0,61 4. kloroformi:etanoli:10 % etikkahappo 4:7:2 0,00 5. n-butanoli .‘etikkahappo: vesi 4:1:5 0,17 6. metanolirlO % vesipitoinen ammonium- asetaatti:10 % ammoniumhydroksidi 10:9:1 0,52 7. n-butanolitpyridiini:vesi:etikkahappo 6:4:3:1 0,45 8. metanoli:10 % vesipitoinen ammonium- asetaatti:10 % ammoniumhydroksidi 10:9:1 0,11 9) 0,25 M vesipitoinen NaH9P0u:asetonitriili 1:1 1 0,68 10. metanoli:10 % vesipitoinen ammoniumasetaatti 1:1 0,65 11. n-butanoli:etikkahappo:vesi 4:2:5 0,77 levyt 1-7 ovat piihappogeeli 60 F2glt“levyjä, 8,9 ovat silanoituja piihappogeeli 60 F^^^-levyjä ja 10,11 ovat selluloosa F-levyjä; J) aminohappoanalyysi, happohydrolyysin jälkeen 6N kloorivety-hapossa 110° C:ssa 6 tuntia, osoittaa ainakin seuraavien tunnistettujen aminohappojen esiintymisen: ornitiini, asparagiinihappo, treonii-ni, glysiini, alaniini, leusiini, fenyylialaniini, p-hydroksi-fenyy-liglysiini ja hydroksi-, kloori-substituoitu fenyyli-glysiini\ tunnettu siitä, että viljellään kantaa Actinoplanes sp. ATCC 33076 viljelyväliaineessa, joka sisältää assimiloituvan hiililähteen, assimiloituvan typpilähteen ja epäorgaanisia suoloja, submerssisissa, aerobisissa olosuhteissa, kunnes on tuotettu huomattava määrä antibioottia A/16686 ja mainittu antibioottinen aktiviteetti otetaan talteen tavanomaisilla menetelmillä, joko vapaana emäksenä tai farmaseuttisesti hyväksyttävänä happoadditiosuolana. 20 65630
1. Menetelmä valmistaa glykopeptidi-antibioottia, joka on antibiootti A/16686 vapaana emäksenä tai farmaseuttisesti hyväksyttävänä happoadditiosuolana ja jolla hydrokloridinsa muodossa on seuraavat tunnusmerkit: A) valkea, kiteinen aine, joka sulaa 224-226°C:ssa; B) hyvin liukeneva veteen ja dimetyyliformamidiin; liukeneva meta- noliin, etanoliin, propanoliin ja butanoliin, mutta liukenematon etyylieetteriin, petrolieetteriin ja bentseeniin; C) likimääräinen alkuainekoostumus: 51,73 % hiiltä, 6,34 % vetyä, 9,96 % typpeä, 5,84 % klooria (kokonaispitoisuus), 4,74 % kloori-ioneja ja 1 % jäännöstä; D) infrapuna-absorptiospektri nujolissa, seuraavat havaittavat absorptiomaksimit (katso kuva 1): 3290-3070, 2930 ja 2860 (nujol), 1765, 1630, 1510, 1455, 1375 (nujol), 1230, 1175, 1130, 1065, 1030, 1015, 980, 840 ja 820 cnT^j E) ultraviolettiabsorptiospektri, jossa seuraavat absorptiomaksi-mit (katso kuva 2): a) metanolissa: 232 nm <eJ' = 178) 265 nm (E**m s 107) b) metanolissa, joka sisältää 0,1 N HCl:ää 231 nm (E*% = 167) JLcm 270 nm (E*% = 96) lcm β 5630 18 c) metanolissa, joka sisältää 0,1 N NaOH:ta: 250 nm (E^m = 232) 295 nm (olka) d) metanolissa, joka sisältää puskuria pH 7,38: 231 nm (E^m = I67) 270 nm (E^m = 96) F) ominaiskierto\j=k] + *+9,7° (c = 0,^3 % DMFjssä); G) seuraavat karakteristiset reaktiot: ninhydriini (3 % etanolinen liuos) negatiivinen ninhydriini (3 % etanolinen liuos + natriumasetaatti) positiivinen
2. Vaatimuksen 1 mukainen menetelmä tuottaa glykopeptidi-anti-bioottia, joka on antibiootti A/16686 vapaana emäksenä tai sen myrkytön farmaseuttisesti hyväksyttävä happoadditiosuola, tunnettu siitä, että mainittu antibioottinen aktiviteetti otetaan talteen uuttamalla erikseen viljelyliemi ja myseeli orgaanisella liuottimena, joka on alempi alkanoli tai kloroformi, antibioottista ainetta, joka saadaan uuttoliuottimista, käsitellään kloroformi:etanoli:vesi-seoksella (4:7:2, til./til./til.), öljymäinen tuote, joka erottuu, kaadetaan veteen, kiteytynyt tuote erotetaan ja puhdistetaan edelleen kromatografisesti piihappogeelipylväässä eluoimalla asetonitriili: 0,01 N HCl-seoksella (1:1, til./til.), jolloin saadaan antibiootin A/16686 hydrokloridia, josta poistetaan suola kromatografisesti ris-tiinkytkettyä dekstraania sisältävässä pylväässä, ja haluttaessa antibiootin A/16686 hydrokloridi muutetaan vastaavaksi vapaaksi emäkseksi tai toiseksi fysiologisesti hyväksyttäväksi happoadditiosuolak-si tavanomaisilla menetelmillä.
3. Vaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan antibiootin A/16686 hydrokloridi. 65630 21 PATEN TKRAV
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB7912298 | 1979-04-07 | ||
| GB7912298 | 1979-04-07 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI800881A FI800881A (fi) | 1980-10-08 |
| FI65630B FI65630B (fi) | 1984-02-29 |
| FI65630C true FI65630C (fi) | 1984-06-11 |
Family
ID=10504421
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI800881A FI65630C (fi) | 1979-04-07 | 1980-03-21 | Foerfarande foer framstaellning av glykopeptid-antibiotikumet a/16686 |
Country Status (30)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4303646A (fi) |
| JP (2) | JPS5697237A (fi) |
| AR (1) | AR222217A1 (fi) |
| AT (1) | AT370130B (fi) |
| AU (2) | AU533951B2 (fi) |
| BE (1) | BE882632A (fi) |
| CA (1) | CA1142866A (fi) |
| CH (1) | CH655515B (fi) |
| DE (1) | DE3013246A1 (fi) |
| DK (1) | DK149336C (fi) |
| ES (1) | ES490236A0 (fi) |
| FI (1) | FI65630C (fi) |
| FR (1) | FR2452931A1 (fi) |
| GR (1) | GR67279B (fi) |
| HK (1) | HK23584A (fi) |
| HU (1) | HU181534B (fi) |
| IE (1) | IE49327B1 (fi) |
| IL (1) | IL59704A (fi) |
| IT (1) | IT1212411B (fi) |
| LU (1) | LU82327A1 (fi) |
| MX (1) | MX5958E (fi) |
| NL (1) | NL192989C (fi) |
| NO (1) | NO155496C (fi) |
| NZ (1) | NZ193357A (fi) |
| PH (1) | PH17230A (fi) |
| PT (1) | PT71064A (fi) |
| SE (1) | SE441188B (fi) |
| SG (1) | SG22687G (fi) |
| YU (1) | YU41917B (fi) |
| ZA (1) | ZA801629B (fi) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0046201B1 (en) | 1980-08-16 | 1984-04-11 | Gruppo Lepetit S.P.A. | Antibiotic a/16686 factor a2, the process for the preparation thereof, and the co-produced antibiotic a/16686 factors a1 and a3 |
| US4375513A (en) * | 1980-12-18 | 1983-03-01 | Eli Lilly And Company | Biologically pure culture of Actinoplanes missouriensis |
| US4613503A (en) * | 1984-10-11 | 1986-09-23 | The Dow Chemical Company | Antibiotic A26201-1 and antibiotic A26201-2 produced by a novel strain of actinoplanes |
| US4859599A (en) * | 1984-10-11 | 1989-08-22 | The Dow Chemical Company | Antibiotic A26201-1 and antibiotic A26201-2 produced by a novel strain of actinoplanes |
| GB8624806D0 (en) * | 1986-10-16 | 1986-11-19 | Pfizer Ltd | Glycopeptide antibiotic |
| GB8720980D0 (en) * | 1987-09-07 | 1987-10-14 | Lepetit Spa | Derivatives |
| GB8729989D0 (en) * | 1987-12-23 | 1988-02-03 | Lepetit Spa | Novel hydrogenated derivatives of antibiotic a/16686 |
| GB8808658D0 (en) * | 1988-04-13 | 1988-05-18 | Lepetit Spa | Aglycons of a/16686 antibiotics |
| AU2001245263A1 (en) * | 2000-01-21 | 2001-07-31 | Kosan Biosciences, Inc. | Method for cloning polyketide synthase genes |
| US7257562B2 (en) * | 2000-10-13 | 2007-08-14 | Thallion Pharmaceuticals Inc. | High throughput method for discovery of gene clusters |
| ATE292684T1 (de) * | 2000-10-13 | 2005-04-15 | Ecopia Biosciences Inc | Ramoplaninbiosynthesegenkluster |
| US20030211567A1 (en) * | 2001-07-24 | 2003-11-13 | Ecopia Biosciences, Inc. | Compositions, methods and systems for discovery of lipopeptides |
| CA2476567A1 (en) | 2002-03-08 | 2003-09-18 | Vicuron Pharmaceuticals Inc. | A process for the production of ramoplanin-like amide derivatives |
| WO2003089641A2 (en) * | 2002-04-17 | 2003-10-30 | Ecopia Biosciences Inc. | Dual condensation/epimerization domain in non-ribosomal peptide synthetase systems |
| US7317001B2 (en) * | 2002-06-06 | 2008-01-08 | Oscient Pharmaceuticals Corporation | Use of ramoplanin to treat diseases associated with the use of antibiotics |
| AU2003274927A1 (en) * | 2002-08-23 | 2004-03-11 | Genome Therapeutics Corporation | Methods and reagents for preventing bacteremias |
| US20040127403A1 (en) * | 2002-09-06 | 2004-07-01 | Francesco Parenti | Methods for treating and preventing Gram-positive bacteremias |
| WO2004096143A2 (en) * | 2003-04-25 | 2004-11-11 | Oscient Pharmaceuticals Corporation | Methods for reducing or preventing transmission of nosocomial pathogens in a health care facility |
| CA2945768A1 (en) | 2014-04-16 | 2015-10-22 | Nanotherapeutics, Inc. | Methods of treatment of c. difficile spores with ramoplanin |
| US20180002741A1 (en) | 2016-07-01 | 2018-01-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs | Method of diagnosis and treating gastrointestinal and neurological diseases associated with species of genus clostridium |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BE790627A (fr) * | 1971-10-27 | 1973-04-27 | Lilly Co Eli | L'antibiotique a477 et son procede de preparation |
| GB1458512A (en) * | 1973-11-22 | 1976-12-15 | Lepetit Spa | Antibiotic substance |
| US4038383A (en) * | 1975-01-17 | 1977-07-26 | Pfizer Inc. | Mixture of antibiotics produced by a species of actinoplanes |
| US4001397A (en) * | 1975-08-11 | 1977-01-04 | Pfizer Inc. | Antibiotic compound 41,012 |
| US4115552A (en) * | 1976-04-19 | 1978-09-19 | Eli Lilly And Company | Factor A and B of antibiotic A-4696 |
| US4169887A (en) * | 1978-02-21 | 1979-10-02 | Pfizer Inc. | Antibiotics produced by species of actinoplanes |
| JPS54135703A (en) * | 1978-04-11 | 1979-10-22 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | Antibiotic ab-102 and preparation thereof |
-
1980
- 1980-03-20 ZA ZA00801629A patent/ZA801629B/xx unknown
- 1980-03-21 FI FI800881A patent/FI65630C/fi not_active IP Right Cessation
- 1980-03-22 GR GR61511A patent/GR67279B/el unknown
- 1980-03-25 NO NO800869A patent/NO155496C/no unknown
- 1980-03-25 IL IL59704A patent/IL59704A/xx unknown
- 1980-03-31 PH PH23840A patent/PH17230A/en unknown
- 1980-03-31 US US06/135,560 patent/US4303646A/en not_active Expired - Lifetime
- 1980-04-01 DK DK140080A patent/DK149336C/da not_active IP Right Cessation
- 1980-04-01 CH CH256780A patent/CH655515B/it unknown
- 1980-04-01 AU AU57036/80A patent/AU533951B2/en not_active Expired
- 1980-04-02 ES ES490236A patent/ES490236A0/es active Granted
- 1980-04-03 SE SE8002601A patent/SE441188B/sv not_active IP Right Cessation
- 1980-04-03 LU LU82327A patent/LU82327A1/fr unknown
- 1980-04-03 IE IE697/80A patent/IE49327B1/en not_active IP Right Cessation
- 1980-04-03 HU HU80822A patent/HU181534B/hu unknown
- 1980-04-03 NZ NZ193357A patent/NZ193357A/xx unknown
- 1980-04-03 NL NL8001982A patent/NL192989C/nl not_active IP Right Cessation
- 1980-04-03 DE DE19803013246 patent/DE3013246A1/de active Granted
- 1980-04-03 FR FR8007547A patent/FR2452931A1/fr active Granted
- 1980-04-03 IT IT8021162A patent/IT1212411B/it active
- 1980-04-03 BE BE0/200117A patent/BE882632A/fr not_active IP Right Cessation
- 1980-04-03 PT PT71064A patent/PT71064A/pt unknown
- 1980-04-04 AT AT0187480A patent/AT370130B/de not_active IP Right Cessation
- 1980-04-04 YU YU935/80A patent/YU41917B/xx unknown
- 1980-04-07 AR AR280577A patent/AR222217A1/es active
- 1980-04-07 MX MX808745U patent/MX5958E/es unknown
- 1980-04-07 JP JP4476480A patent/JPS5697237A/ja active Granted
- 1980-04-08 CA CA000349360A patent/CA1142866A/en not_active Expired
- 1980-06-04 AU AU59036/80A patent/AU535727B2/en not_active Ceased
- 1980-12-11 US US06/215,310 patent/US4328316A/en not_active Expired - Lifetime
-
1984
- 1984-03-15 HK HK235/84A patent/HK23584A/xx not_active IP Right Cessation
-
1987
- 1987-03-06 SG SG226/87A patent/SG22687G/en unknown
- 1987-04-13 JP JP62088966A patent/JPS62282579A/ja active Granted
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI65630C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av glykopeptid-antibiotikumet a/16686 | |
| Coronelli et al. | Purpuromycin, a new antibiotic isolated from Actinoplanes ianthinogenes N. sp. | |
| PL98593B1 (pl) | Sposob wytwarzania nowego antybiotyku teichomycyny 8327 | |
| US5278052A (en) | Process for the simultaneous production of benanomicins A and B | |
| JPH04261140A (ja) | 新規α−グルコシダーゼ阻害物質、プラジマイシンＱ | |
| EP0046201B1 (en) | Antibiotic a/16686 factor a2, the process for the preparation thereof, and the co-produced antibiotic a/16686 factors a1 and a3 | |
| US4252898A (en) | Antibiotics A6888C and A6888X | |
| EP1285928B1 (en) | Antibiotics tripropeptins and process for producing the same | |
| US4174390A (en) | Antibiotic A-7413 and process for preparation thereof | |
| US5271935A (en) | Antibiotic, cammunocin, a process for the preparation thereof, and the use thereof as a pharmaceutical | |
| US20090023665A1 (en) | Antibiotics ge 81112 factors a, b, b1, pharmaceutically acceptable salts and compositions, and use thereof | |
| US5109122A (en) | Antibiotics, dexylosylbenanomicin B | |
| GB2045231A (en) | Antibiotic A/16686 and its preparation from actinoplanes | |
| US4358584A (en) | Antibiotics A6888C and A6888X | |
| US5140101A (en) | Antiviral antibiotic BU-4344V | |
| CA1090728A (en) | Antibiotic a-7413 mixture comprising factors a,b,c and d and a process for producing it | |
| US5256548A (en) | Antiviral antibiotic BU-4344V | |
| US4032631A (en) | Mixture of antibiotics produced by new species of micromonospora | |
| KR830001443B1 (ko) | 항생물질 a/16686의 제법 | |
| US4830967A (en) | Process for producing antibiotic A80438 | |
| US4366147A (en) | Antibiotic A-7413 and process for preparation thereof | |
| US4482488A (en) | Antibiotic A53868 and process for production thereof | |
| IE913058A1 (en) | Antibiotic ge1655 complex and its factors a, b, and c | |
| KR810000089B1 (ko) | A-35512 항생물질의 제조방법 | |
| EP0515927A2 (en) | Pradimicin antibiotics |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: BIOSEARCH ITALIA S.P.A |
|
| MA | Patent expired |
Owner name: BIOSEARCH ITALIA S.P.A |