KR830001443B1 - 항생물질 a/16686의 제법 - Google Patents

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Description

항생물질 A/16686의 제법

제1도는 항생물질 A/16686의 뉴졸법에 의한 적외부 흡수스펙트럼이고,

제2도는 항생물질 A/16686의 자외부 흡수스펙트럼이다.

본 발명은 A/16686으로 임의 표기한 항생물질, 엑티노 플레인스속의 신규 균주로 분류되는 균주를 배양하여 그것을 제조하는 방법, 그것의 항균제로써의 용도에 관한 것이다.

항생물질 A/16686은 산부가염을 생성할 수 있는 염기성의 글리코펩타이드계 항생물질이다.

따라서, 항생물질 A/16686 의 생리적으로 무독한 산부가염은 본 발명의 일부이다.

"항생물질 A/16686"은 항생물질 A/16686 유리염기 및 그것의 생리적으로 무독한 산부 가염에서 선택한 항생물질을 말한다.

항생물질 A/16686은 일부 병원균, 특히 그램 양성균의 생장을 시험관내 실험에서 억제한다. 또한 항생물질 A/16686을 쥐에 비경구적으로 투여하면, 실험적 세균감염을 거의 막을 수 있다.

상기한 바와 같이 항생물질 A/16686은 엑티노 플레인스속의 신규 균주를 배양하여 제조한다. 배갈보드(인디아)에서 수집한 토양샘플에서 분리한 이 균주의 배양액을 1979년 1월 30일에 영구 배양콜렉션 ATCC(American Type Culture Collection) 미국 매릴랜드 20852로크빌 파클론 드라이브 12301-에 공탁하여 영구번호 ATCC 33076을 갖게 되었다.

엑트노 플레인스속 ATCC 33076의 특징은 다음과 같다.

[형태학]

그 균주는 다른 배지에서 생장하여 오렌지빛 기질균 사체를 생성한다. 색소는 생성되지 않으며, 공중균사체는 존재하지 않는다. 증식균사체를 현미경으로 검사하면, 약 1㎛의 직경을 가진 분지된 균사를 볼 수 있다. 포자낭은 감자-한천배 지상에서만 약간 생성되며 불규칙한 표면을 가진 구형이며, 직경은 5.0내지 9.0㎛이다. 포자낭의 벽이 파열된 후 포자가 방출된다. 아구형의 포자는 운동성을 갖고 있다(직경이 1.0내지 1.5㎛). 세포벽 성분은 D형의 메소-디아미노 피멜산 및 서당이다. (레케발리어등, 엑티노 마이세츠의 분류 기준으로써의 화학적조성, Adv. Applied Microbiology, 14,1971, Academic Press N.Y.)

[배양상 특징]

표 1은 셜링과 고트리브(Intern. J. Systen Bact. 16, 313-340,1966)이 제시한 여러 표준 배지 및 왁스만(The Actinomycetes, II권-The Williams and wilkins Co. 1961)이 추천한 다른 배지상에 배양한 엑티노 플레인스 ATCC 33076의 배양상의 특징을 나타낸다. 30℃에서 6내지 14일 배양한 후, 특징을 조사한다.

[표 I]

[배양상의 특징]

배지의 번호는 셜링과 고트리브의 스트렙토마이세스종을 특징짓는 방법의 번호를 따른다. Intern. J. System. Bact. 16, 313-340, 1966.

[탄소 이용]

표 2는, 프리담 및 고트리브(J.Bact. 56, 107,1948)의 방법에 의해 탄소원 이용을 조사한 것이다.

[표 II]

[생리적 특징]

표 III은 균주의 생리적 특징이다.

[표 III]

항생물질 A/16686을 제조하기 위해, 동화가능한 탄소원질소원 및 무기염류를 함유한 수성영양배지에서 호기조건으로 엑티노플레인스균주 ATCC 33076을 배양한다.

상기 배지는, 발효 분야에 보통 사용되는 영양배지중 어느 것이라도 가능하나, 바람직한 특정배지가 있다.

따라서, 예를 들어 바람직한 탄소원은 글루코스, 과당, 만노스, 서당등이다.

바람직한 질소원은 소이빈밀, 펩톤, 고기추출물, 효모추출물, 트립톤, 아미노산등이다.

배양배지에 혼합할 수 있는 무기염류로는, 나트륨, 칼륨, 철, 아연, 코발트, 마그네슘, 칼슘, 암모늄, 클로라이드, 카보네이트, 설페이트, 니트레이트등과 같은 이온을 생성할 수 있는 통상의 용해성 염류가 있다.

보통, 항생물질을 생성하는 균주를 진탕플라스크에서 전배양하고, 다량의 항생 물질 A/16686을 얻기 위해 자아(jar) 배양기에, 그 배양액을 접종한다. 전배양에 사용되는 배지는, 대규모 배양경우와 동일할 수 있으며, 다른 배지를 사용할 수도 있다.

A/16686을 생성하는 균주의 생장온도 범위는 약 20°내지 37℃이며, 바람직한 범위는 28°내지 30℃이다.

발효도중에, 균사체고체의 발효액 또는 추출 물샘플에 대해 항생물질활량을 시험한다.

항생물질 A/16686에 감수성을 갖고 있는 미생물을 사용한다. 특히 유용한 시험미생물은 살시나 루테아이다. 한천판상의 한천확산법으로 생물학적 시험을 실시한다. 항생물질 활량은 일반적으로 3일 내지 14일 사이에 최대이다. 엑티노 플레인스균주 ATCC 33076발효 도중에 생성되는 항생물질은 발효액 및 균사체 모두에서 발견된다. 항생물질 A/16686은 발효액 및 균사체의 분리추출로 회수한 수 있다.

균사체는 메탄올로 추출하는 것이 가장 좋으나, 다른 저급알콜 및 클로로포름 역시 적절하다. 항생물질 A/16686은 통상적 방법으로 용매를 추출하여 그 조생성물로 회수한다. 비슷하게, 발효액은 n-부탄올로 바람직하게 추출되며, 이 용액을 침전시켜 조항생물질 A/16686을 더 얻는다. 용매추출물로부터 회수한 생성물을 클로로포름 : 에탄올 : 물의 혼합물 (4 : 7 : 2)로 처리하고, 생성된 유성 생성물을 분리하고, 그것을 물에 부어, 조항생물질 A/16686을 정제한다. 그 결과, 생성물이 고체화하는데, 여과하여

n-프로판올 : n-부탄올 : N-수산화암모늄 2 : 3 : 4 또는 메탄올 : 10% 수성 암모늄 아세테이트 : 10% 수산화암모늄 10 : 9 : 1등의 염기성 용매시스템같은 적절한 용매시스템을 사용한 박충 크로마토그라피로 정제과정의 각 단계를 관리하는데, 그 결과 항생물질 A/16686의 산부가염이 유리염기로 전환된다. 상기의 과정의 목표는 사용한 특정용매 시스템에서 특정 Rf값을 갖는 순수한 항생물질 A/16686을 분리하는 것이다. 통상적인 추출 및 흡착을 포함한 다른 정제법도 사용할 수 있다. 상기의 대체적인 방법도, 상술한 박층 크로마토 그라피로 단계별로 정제과정을 관리한다. 특정 Rf값을 갖는 항생물질 A/16686 반점으로, 전문가들은 어느 공정이 순수한 항생물질 A/16686을 분리하는데 적절한지 판단할 수 있다. 필요하다면, 상기의 방법으로 얻어진 순수한 항생물질 A/16686 하이드로 클로라이드를 통상적 방법으로, 상응하는 유리염기 또는 다른 생리적으로 무독한 산부가염으로 전환한다.

항생물질 A/16686은 항균제이며, 특히 그램양성균에 유효하다. 특히, 항생물질 A/16686의 시험관내 활성스펙트럼이 표 IV에 나타나 있다.

[표 IV]

표 V는 임상적으로 분리한 스타필로코커스 오레우스, 스트렙토코커스 파이오제네스, 스트렙토코커스 뉴모니아에 및 스트랩토코커스 페칼리스 균주에 대한 항생물질 A/16686의 시험결과이다.

[표 V]

항생물질 A/16686은 또한 여러 병원균에 대해서도 높은 체내활성을 갖는다는 것이 밝혀졌다. 표 IV은 쥐의 경우, 세가지 미생물에 대한 ED₅₀값인데 항생물질 A/16686의 유효성을 알 수 있다.

[표 VI]

항생물질 A/16686은 시험동물에 사용할 때의 독성은 비교적 적었다. 예를 들어, 항생물질을 쥐에 복강내 투여할 때 LD₅₀은 500내지 750mg/kg이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 항생물질 A/16686을 항균제로 사용하는 것인데, "사용"이라 함은 산업적 응용을 의미하며, 따라서 본 발명의 또 다른 특징인 항생물질 A/16686을 약제학적 조성물로 제조하는 것도 포함한다.

경구, 외용 또는 비경구투여에 적절한 이들 약제학적 조성물은 약제학분야의 전문가에게 공지된 방법으로 제조한다. 이들 제형의 예는 Rhemingtons Pharmaceutical Science 15판, 1975 Mack Publishing Co. Easton Pennsylvania에 설명되어 있다. 이들 형태 가운데에는 정제, 캡슐제, 산제, 연고, 용액, 주사액등이 포함된다. 용량단위에는 활성성분 0.5내지 99%가 바람직하게는 내지 80퍼센트가 함유된다.

체중, 감염된 미생물. 감염정도, 투여시간과 방법등과 같은 인자를 고려하여 1일 용량을 결정한다. 다음 실시예는 더 충분히 본 발명을 설명한다.

[실시예 1]

엑티노 플레인스종 균주 ATCC 33076균주의 배양

엑티노 플인스종 균주 ATCC 33076을 다음 조성을 가진 진탕 플라스크에서 전배양한다.

고기추출물 3g/ι 글루코스 1g/ι

효모추출물 5g/ι CaCO₃4g/ι

트립톤 5g/ι 수도물 1g/ι

용성전분 24g/ι

플라스크를 약 96시간동안 28내지 30℃로 진탕하고, 다음 영양배지 10ι를 함유하는 자아(jar)배양기에 전배양액(1ι)을 접종한다.

고기추출물 40g 소이빈밀 100g

펩톤 40g 글루코스 250g

효모추출물 10g CaCO₃50g

염화나트륨 25g 수도물 10ι

발효배치를 28내지 30℃에서 교반하면서 호기적으로 배양한다. 시험미생물을 살시나 루테아로 하여, 일정시간 간격으로 한천확산법에 의해 항생물질 활성을 시험한다. 발효 시간이 72내지 120시간 경과할 때, 최대활성이 나타난다.

[실시예 2]

항생물질 A/16686의 회수

실시예 1에서 설명한 대로 제조한 발효액(170ι)를 10℃에서 냉각하고 18%HCl로 pH를 3.5로 조절한다. 생성된 산성발효액을 필터에이드 (aid) (claracl Flow Ma)를 사용하여 여과하고, 균사체 케이크를 물로 세척한다. 여과한 발효액 및 균사체에 대해 각각 반응을 진행한다. a) 균사체를 메탄올(30ι)로 추출하고, 여과한 후 메탄올/물(30ι의 메탄올, 5ι의 물)의 혼합물로 다시 추출한다. 균사체를 제거하고, 메탄올추출물을 진공하에 40℃이하 온도에서 농축물(6ι)을 얻는다. 이 수성농축물을 매회 10ι의 n-

이 농축물을 석유 에테르에 가하고, 생성된 침전을 경사하여 분리하고, 추가량의 석유 에테르에 가한다. 침전을 여과 분리하고, 상온에서 진공건조하여 에스·뉴모니아에 UC41에 대한 M.I.C.가 0.1㎍/mι인 항생물질 A/16686 조물질 80g을 얻는다.

b) 여과 발효액과 세척액(165ι)을 10℃로 냉각하고, 농염산(12.5ι)을 가해 pH 3.5로 조절한다. 얻은 용액을 n-부탄올(80ι)로 추출하고, 유기추출물을 35℃이하의 온도에서 진공농축하여 부탄올 농축물(6ι)을 얻는다. 이 농축물을 석유 에테르에 가해 침전시키고, 침전을 경사분리하여 추가량의 석유 에테르에 가한다.

고체를 여과 분리하고, 상온에서 진공 건조하여 에스·뉴모니아에 UC41에 대한 M.I.C.가 0.8㎍/mι인 조항생물질 A/16686 26.3g을 얻는다.

[실시예 3]

항생물질 A/16686의 정제

실시예 2a)에서 얻은 조항생물질 A/16686 47.7g을 14.1ι의 클로로포름 : 에탄올 : 물의 혼합물 (4 : 7 : 2, V/V/V)로 처리하고, 그 유성생물을 경사하여 분리한다. 상기혼합물 70mι를 유성 생성물에 더 가하고, 분리를 반복한다. 유성생성물을 물(440mι)로 처리하면, 고체화하며, 이를 원심분리 및 여과로 분리한다.

a) 분리한 고체를 물(170mι)에 현탁시키고, 메탄올(400mι)을 가해 용해하고, 여과한다. 35℃를 넘지 않는 온도에서 진공하에 n-부탄올을 가해 용매를 분리해내, 약 50mι의 부탄과 농축물을 얻는다. 디에틸에테르(500mι)를 가하면, 침전이 생성되는데, 이를 여과 분리하고 상온에서 진공 건조하여 에스. 파이오제네스에 대한 M.I.C.가 0.025㎍/mι인 비교적 순수한 항생물질 A/16686 1.012g을 얻는다. 이와 같이 하여 얻은 비교적 순수한 항생물질 A/16686을 다음과 같이 정제한다.

상기의 항생물질 A/16686 1.58g을 아세토니트릴 : 물(1 : 1, V/V)에 용해하고, 동일혼합물로 제조된 실리카겔 60(Merck 0.06 0.2mm)430을 함유하는 칼럼에 생성된 용액을 적용한다.

처음에는 동일한 아세토니트릴·물의 혼합물로 칼럼을 전개시켜 각 20mι씩의 70분획을 받고, 다음에는 아세토니트릴 : N/100 HCl(1 : 1, V/V)을 사용하여 각 20mι씩의 290분획을 더 받는다. 60F₂₅₄실리카 겔판상의 박층크로 마토그라피와 살시나 루테아에 대한 시험으로 칼럼의 용출을 관리한다. 분획 130내지 265를 합해 진공하에 n-부탄올로 용매를 분리하여 250mι의 n-부탄을 농축물을 얻는다. 이것을 다량의 에틸에스테르에 붓고, 생성된 침전을 여과분리하고 상온에서 P₂O₅상에서 진공건조하여 항생물질 A/16686 1.015g을 얻는다.

상기물질 0.67g을 24mι의 물 및 76mι의 메탄올에 용해한다. 생성된 용액을 메탄올 : 물(7 : 3, V/V)로 제조한 세파덱스 LH-20 220g을 함유한 3.0×62.0cm칼럼에 적용한다. 칼럼을 동일 혼합물로 전개시켜 10mι분획을 받는다. 분획 24내지 32를 합해, 35℃이하 온도에서 진공하에 n-부탄올로 용매를 분리해낸다. 이 용액을 에틸에테르에 가해 원하는 순수한 항생물질 A/16686을 침전시킨다. 침전을 여과 분리하고, 에틸아세테이트로 세척하고, 상온에서 P₂O₅상에서 진공 건조하여 순수한 항생

b) 35℃이하에서 진공하에 n-부탄올을 가해 여액을 분리하여 50mι의 부탄을 농축물을 얻는다. 석유 에테르를 가하면 침전이 생성되며, 이를 여과 분리하여 상온에서 진공 건조하여 부분적으로 정제된 항생물질 A/16686 42.9g을 얻는다. 예스. 파이오 제네스에 대한 M.I.C.값은 0.2㎍/mι이다. 이 항생물질을 물(2.5ι)에 현탁시키고 1N NaOH을 pH 7까지 가해 용해시킨다. 얻은 수용액을 매회 5ι의 n-부탄올로 3회 추출하고, 물로 세척한후 이 유기상을 35℃ 이하에서 진공하에 200mι로 농축한다.

농축물에 디에틸에테르를 가하면, 침전이 생성되는데, 이를 여과하고 상온에서 진공건조한다. 건조한 생성물을, n-프로판올 : n-부탄올-1N수산화암모늄 혼합액 160mι(2 : 3 : 4 V/V/V)의 상층에 용해한다. 생성된 용액을, 상기 용매혼합물로 제조한 시리카겔 60(Merck 0.06내지 0.2mm) 1.7kg을 함유한 7.5cm의 직경을 가진 100cm 높이의 칼럼에 적용한다. 컬럼을 동일혼합물을 사용하여 전개하고 300mι분획을 받는다. 칼럼용출을 크로마토그라피로 관리한다. 분획 21내지 26을 합해, 35℃ 이하에서 진공하여 n-

흡수극대치는 다음 파수(cm^-1)에 나타난다. 3290내지 3070, 2930 및 2860(뉴졸), 1765, 1630, 1510, 1455, 1375(뉴졸), 1230, 1175, 1130, 1065, 1030 '1015, 980, 840 및 820

도면 2는 자외부 흡수스펙트럼이며 흡수 극대치는 다음과 같다.

자외부 흡수 스펙트럼은 Beckmann DK-2 Spectrophotometer로 측정한다.

항생물질 A/16686 하이드로 클로라이드 비선광도

는 +49.7°(C=0.43% DMF중에서) 항생물질 A/16686은 다음 반응을 나타낸다.

검출균을 에스. 오레오스 ATCC 6538로 하고, 다른 용출시스템을 사용하여, 페이퍼 크로마토그라피할 때 항생물질 A/16686의 Rf값은 다음과 같다.

[표 Ⅶ]

다음 표에 항생물질 A/16686의 여러 박층크로 마토그라 피시스템에서 Rf의 값이 나와있다(조건은 표 아래와 같다)

[표 VIII]

실러카겔 60F₂₅₄판(Merck) 1내지 7; 가시화 a, e, b, c, d, e

실리카겔 60F₂₅₄판(Merck) 8내지 9; 가시화 e

셀룰로스 F판(Merck) 10, 11; 가시화 a

고도의 크로마토그라피 테크닉으로, 실시예 3과 같이 분리정제된 항생물질 A/16686은 70내지 80%의 주성분으로 이루어지며, 나머지 30내지 20%는 최소한 두 가지의 부수 성분이다.

전기 실시예에서 설명된 대로 분리한 항생물질 A/16886 하이드로클로 라이드는 염소를 함유한 염기성 글리코펩타이드의 하이드로 클로라이드인데, 전형적일 글리코펩타이드 그룹에 속하는 항생물 질과는 염소를 함유하는 점과 구성 아미노산 종류에서 다르다. 110℃에서 6시간동안, 6N 염산으로 산가수분해한 후, 항생물질 A/16686을 아미노산 자동분석기로 분석한 결과는 다음과 같다. 오르니틴(118㎍/mg=0.58μM/mg) 아스파르트산(29.2㎛/mg=0.22μM/mg) 트레오닌(68㎍/mg=0.57μM/mg) 글리신(25㎍/mg=0.33μM/mg) 알라닌(29㎍/mg=0.32μM/mg) 로이신(41㎍/mg=0.31μM/mg) 및 페닐알라닌(42㎍/mg=0.25μM/mg)중성 및 산성 아미노산용 칼럼을 사용하여 피크네개를 더 찾아내었다. 그들의 상응하는 에스 테르-트리플루오로 아세틸 유도체로 전환한 후, 가스크로마토 그라피-질량분석법으로, 이중 두 아미노산을 확인하고 구조를 다음과 같이 결정하였다.

[실시예 4]

유리염기의 분리

물(3mι) 에탄올(8mι)에 항생물질 A/16686 하이드로클로라이드(0.05g)를 녹인 용액을 1.2-에폭 시부탄(2mι)으로 처리하면 침전이 생성되는데, 저온에서 하루동안 정치한 후, 이를 원심 분리하여 분리하고, 에탄올로 세척하고 상온에서 진공하에 P₂O₅상에서 건조하여 상응하는 유리염기 0.016g을 얻는다.

항생물질 A/16686의 상기 유리염기형을 약제학적으로 무독한 무기 또는 유기산으로 처리하면 상응하는 산부 가염이 생성된다. 약제학적으로 무독한 산은 염산, 브론산, 인산, 질산, 타타르산, 아세트산, 석신산락트산, 글루탐산 또는 메탄설폰산등과 같은 이 분야에 공지된 치료상 유용한 염생성에 적절한 무독한 산이다.

Claims (1)

1. 엑티노 플레인스속 균주 ATCC 33076을, 동화가능한 탄소원, 질소원 및 무기염류를 함유한 배양배지에서 액침호기 조건하에, 항생물질이 상당량 생성될 때까지 배양하고, 그 항생물질 활량(activity)을 회수하여 상술한 물리적, 화학적 특성을 갖는 항생물질 A/16686 유리염기 및 그것의 약제학적으로 무독한 산부가염을 포함하는 항생물질을 염화물의 형태로 제조하는 방법.

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