JPH0515385A - 新規な抗生物質アリサマイシンおよびその製法 - Google Patents

新規な抗生物質アリサマイシンおよびその製法

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JPH0515385A
JPH0515385A JP3065713A JP6571391A JPH0515385A JP H0515385 A JPH0515385 A JP H0515385A JP 3065713 A JP3065713 A JP 3065713A JP 6571391 A JP6571391 A JP 6571391A JP H0515385 A JPH0515385 A JP H0515385A
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culture
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alisamycin
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JP3065713A
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Christopher Milton M Franco
クリストフアー・ミルトン・マシユー・フランコ
Erra Koteswara S Vijayakumar
エツラ・コテスワラ・サトヤ・ビジヤヤクマル
Sugata Chatterjee
スガタ・チヤタジー
Bimal N Ganguli
ビマル・ナレツシユ・ガングリ
Juergen Blumbach
ユルゲン・ブルームバハ
Herbert Kogler
ヘルベルト・コグラー
Hans-Wolfram Fehlhaber
ハンス−ヴオルフラム・フエールハーバー
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Hoechst AG
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Hoechst AG
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】抗菌、抗腫瘍または駆虫作用を有する、新規の
抗生物質アリサマイシンを提供する。 【構成】下記式 の化合物、アリサマイシン、その製法および治療薬剤と
してのその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、アリサマイシンと称される新規
な抗生物質、本明細書においてストレプトミセス菌種培
養菌ＨＩＬ Ｙ−８８，３１５８２（Ｓｔｒ． ｓｐ．
Ｙ−８８，３１５８２）と称される微生物の新規な菌
株、その突然変異体および変異体によるその製法および
治療薬剤としてのその利用に関するものである。
【０００２】アリサマイシンは、式Ｉ
【化２】 の化合物である。Ｓｔｒ． ｓｐ． Ｙ−８８，３１５
８２は、インドのマハラタシュトラ州のアリバッグにお
いて収集され土壌から単離された。この菌は、１９８９
年１０月４日にブラウンシュヴァイクのＤｅｕｔｓｃｈ
ｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎ
ｉｓｍｅｎにブダペスト条約の条件下で寄託されている
（ＤＳＭ Ｎｏ．５５５９）。培養菌ＨＩＬ Ｙ−８
８，３１５８２の変異体および突然変異体は、Ｎ−メチ
ル−Ｎ−ニトロ−Ｎ′−ニトロソグアニジンまたは紫外
光線のような変異源を使用して既知の方法で得ることが
できる。Ｓｔｒ． ｓｐ． Ｙ−８８，３１５８２は、
放線菌目、ストレプトミセス科、ストレプトミセス属に
属する。
【０００３】Ｓｔｒ． ｓｐ． Ｙ−８８，３１５８２
は、その形態学的、培養学的および生理学的特性の若干
において既知の菌株と異なるために、新規な菌株である
とみなされる。また、以下の記載から明らかであるよう
に、アリサマイシンと称する新規な抗菌性化合物を生産
するために、Ｓｔｒ． ｓｐ． Ｙ−８８，３１５８２
は新規な菌株であるとみなされる。本発明の以下の詳細
な記載から明らかであるように、本発明のアリサマイシ
ンは、マヌマイシン級の抗生物質に属するけれども、マ
ヌマイシン（Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ４０、１５
３０〜１５５４、１９８７）、アスカマイシン（Ｊ．
Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０１、３４０２
〜３４０４、１９７９）、コラボマイシン（Ｊ． Ａｎ
ｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４１、１１７８〜１１９５、１９
８８）、Ｕ−５６４０７（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ
３６、９５０〜９５６、１９８３）およびＵ−６２１
６２（Ｊ．Ａｎｔｉｖｉｏｔｉｃｓ ３５、５５６〜５
６０、１９８２）のようなこの級のすべての既知の抗生
物質と異なっている。
【０００４】本発明の新規な抗生物質は、試験管内にお
いて、多数のグラム−陽性細菌、酵母およびかびに対し
て活性である。したがって、本発明の抗生物質は、ヒト
および家畜の医薬および動物食物における治療薬剤とし
て使用することができる。また、本発明によれば、既知
の方法で、６．５〜８．５のｐＨの栄養培地を使用して
土壌からＳｔｒ． ｓｐ． Ｙ−８８，３１５８２を単
離する方法が提供される。
【０００５】土壌から微生物を単離するために使用され
る栄養培地は、炭素および窒素源無機栄養塩および固化
剤からなる。炭素源は、例えばグルコース、澱粉、デキ
ストリン、クリセロール、シュクロースまたは糖みつで
ある。窒素源は、例えばペプトン、酵母エキス、牛エキ
ス、麦芽エキスカゼインまたはアルギニンまたはアスパ
ラギンのようなアミノ酸である。固化剤は、例えば寒天
である。無機の栄養塩は、例えばナトリウム、カリウ
ム、マグネシウム、カルシウム、鉄、亜鉛、マンガン、
銅、燐または硫黄の塩である。
【０００６】本発明の微生物は、分枝鎖状の基質菌糸か
ら気菌糸がのびている。Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｒｅｃｔｉｆ
ｌｅｘｉｂｌｉｓを代表する気菌子の頂部に胞子が直鎖
状にある。旋回または子嚢胞子の何れも観察されない。
自然胞子鎖は、１鎖当り３０より多くの胞子を含有して
いる。種々な寒天培地上の微生物の培養学的および形態
学的特性ならびにＬＬ−ジアミノピメリン酸の存在を示
す細胞壁分析を基にして、本発明者等は、生産微生物を
ストレプトミセス菌種と同定した。
【０００７】当該技術に精通せし者によく理解されるよ
うに、本発明は、上述した特定の微生物に限定されるも
のでなく、新規な抗生物質アリサマイシンを生産するこ
とのできる上記微生物から誘導されたすべての自然およ
び人工の突然変異体および変異体を包含する。
【０００８】また、本発明によれば、アリサマイシンを
生産する方法が提供される。該方法は、炭素および窒素
源、栄養無機塩および微量の元素を含有する栄養培地中
において好気性条件下で６．０〜９．０、好ましくは６
〜７の間のｐＨおよび１８〜４０℃、好ましくは２０〜
３０℃の間の温度で醗酵することによりＳｔｒ． ｓ
ｐ． Ｙ−８８，３１５８２を培養しそして次に本明細
書に記載したような既知の方法で培養ブロスから化合物
を単離することからなる。
【０００９】新規な抗生物質を生産するために栄養培地
中において使用される炭素源は、例えばグルコース、澱
粉、デキストリン、グリセロール、シュクロース、糖み
つまたは油である。新規な抗生物質を生産するために栄
養培地において使用される窒素源は、例えば大豆粉、酵
母エキス、牛エキス、麦芽エキス、とうもろこし浸出
液、ペプトン、ゼラチンまたはカゼインである。新規な
抗生物質を生産するために栄養培地において使用される
栄養無機塩／鉱質塩は、例えば塩化ナトリウム、硫酸マ
グネシウム、硫酸アンモニウムまたは炭酸カルシウムで
ある。微量の元素としては、例えば鉄、マンガン、銅、
亜鉛またはコバルトを使用することができる。
【００１０】好ましくは、Ｓｔｒ． ｓｐ． Ｙ−８
８，３１５８２は、約２７℃およびｐＨ約７．０で培養
する。醗酵は、好ましくは、２３〜４８時間後の化合物
の最高の収量が得られたときに中止する。醗酵は、好ま
しくは深部培養である。新規な抗生物質の醗酵および形
成の方法は、寒天培地におけるスタフィロコッカスオー
レウス２０９Ｐに対する培養液および菌糸の抗菌活性に
よりおよび展開溶剤として酢酸エチルを使用したシリカ
ゲルプレート上の薄層クロマトグラフィーにより監視す
ることができる。
【００１１】もし必要ならば、デスモフェンＲ（プロピ
レンオキシドを基にした線状ポリエーテル−Ｂａｙｅｒ
ＡＧ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ）のような泡止剤を、培
養醗酵中栄養培地に使用することができる。
【００１２】アリサマイシンは、例えば、ｐＨを６．５
〜７．５に調節した後に水−不混和性溶剤で抽出するこ
とによって、培養ブロスから得ることができる。溶剤
は、酢酸エチルまたはクロロホルムである。好ましく
は、溶剤は酢酸エチルでありそして好ましくはｐＨ７．
０である。溶剤抽出液を濃縮して溶剤を除去しそしてそ
れからさらにクロマトグラフィー処理する。アリサマイ
シンは、また、アンバーライトＲＸＡＤ−４または７
（ポリスチレンまたはアクリル酸エステルを基にした多
孔性吸着剤樹脂−Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ Ｃ
ｏ．， Ｕ．Ｓ．Ａ）またはダイアイオンＲＨＰ−２０
（ポリスチレンジビニルベンゼン重合体を基にした高度
に多孔性の吸着剤樹脂−日本、三菱化成工業）のような
適当な吸着剤上の直接的な吸着剤によって、培養ブロス
から得ることができる。好ましい吸着剤は、ダイアイオ
ンＲＨＰ−２０である。本発明の化合物は、単独、相互
に組み合わされたまたは水と組み合わされたメタノール
またはアセトンのような適当な移動相を使用して吸着剤
から溶離されるそしてそれから溶離液を蒸発乾固するこ
とができる。好ましい溶離剤は、メタノールである。こ
のようにして得られた活性な溶離液を集め、そして濃縮
する。
【００１３】アリサマイシンを含有する上述した濃縮溶
離液または抽出液は、さらに、多数の方法により精製す
ることができる。例えば、有利には、さらに精製するた
めに、活性炭、アンバーライトＲＸＡＤ−４および７、
ダイアイオンＲＨＰ−２０を使用した再−吸着および溶
離方法、セファデックスＲＬＨ−２０ゲル（スエーデン
のＰｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
ＡＢ）およびその均等物を使用したゲル瀘過、アルミ
ナおよびシリカゲル上の吸着クロマトグラフィーを、組
み合わせることができる。さらに、適当な溶剤系ととも
にシリカゲルおよび変性したシリカゲル−Ｃ１８のよう
な適当な吸着剤を使用した薄層クロマトグラフィー、中
圧および高圧液体クロマトグラフィーを使用することが
できる。さらに、特定の二相溶剤系を使用した向流クロ
マトグラフィーを、該目的のためによく使用し得る。好
ましくは、溶離溶剤として酢酸エチルおよびクロロホル
ムを使用したシリカゲルクロマトグラフィーが使用され
る。単独でまたは上述した精製操作と組み合わせて使用
される他の精製方法は、有機溶剤中におけるアリサマイ
シンの示差溶解度に基づく。上述したアリサマイシンを
含有する濃抽出液または溶離液を、既知の方法でヘキサ
ンで反復沈殿することができる。また、アリサマイシン
をメタノール：水（９９：１）から沈殿して不純物を除
去することができる。最後に、アリサマイシンを適当な
溶剤または溶剤の混合物中で結晶化することができる。
好ましい溶剤は、アセトニトリルである。
【００１４】アリサマイシンは、淡黄色の結晶性粉末で
ある。それは、水、メタノール、エタノール、ヘキサン
および石油エーテルに難溶性である。それは、アセトニ
トリル、塩化メチレン、酢酸エチルおよびクロロホルム
にかなり可溶性である。それは、プロピレングリコール
およびジメチルスルホキシドに非常に可溶性である。
【００１５】化合物は２５０℃より高い温度で融解（分
解）する。以下に示す薄層クロマトグラフィー（ＴＬ
Ｃ）系において、アリサマイシンは次のＲｆ値を有す。
【００１６】ＴＬＣプレート：予備被覆したシリカゲル
プレート：ダルムスタットのＥ．ＭｅｒｃｋからのＡｒ
ｔｉｃｌｅ Ｎｏ．５５５４ 以下に述べる条件を使用して実施した分析用の高圧液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）において、ＲＴ＝３．
５分。
【００１７】カラムパッキング：ＯＤＳ−ハイパーシル
Ｒ−１０ｕ、４×（３０＋１００）ｍｍ 流速：１．０ｍｌ／分 検出：２２０ｎｍ 溶剤：ＣＨ３ＣＮ：水中の０．１％ トリフルオロ酢酸
（５５：４５） アリサマイシンの分光検査データ １．ＵＶ（ＣＨ３ＯＨ）：λｍａｘ＝２７６ｎｍ（ｌｏ
ｇ ε＝４．６７）および３１６ｎｍ（ｌｏｇ ε＝
４．５７） ２．ＩＲ（ＫＢｒ）：図１を参照されたい。 ３．１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：表１
および図２ ４．１３Ｃ−ＮＭＲ（６７．５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：
表２〜表３および図３ ５．分子式 Ｃ２９Ｈ３２Ｎ２Ｏ７ 高分解ＦＡＢ質量スペクトロメトリー（マトリック
ス：３−ニトロペンジルアルコール、リファレンス：ポ
リエチケングリコール）；Ｍ＋Ｈ＋イオン１２Ｃ２９ １
Ｈ３３ １４Ｎ２ １６Ｏ７に対する測定値ｍ／ｚ５２１．
２２８、計算値５２１．２２９により確認した。
【００１８】
【表１】
【００１９】
【表２】
【００２０】
【表３】
【００２１】アリサマイシンは、グラム−陽性およびグ
ラム−陰性細菌に対して活性である。抗菌性検査培地に
おける寒天−ウエル法によっておよびミューラーヒント
ン寒天における寒天希釈法（ＭＩＣ）によって試験した
場合、それは、表４〜表５に示したような活性度を有
す。
【００２２】
【表４】
【００２３】
【表５】
【００２４】抗菌活性のほかに、アリサマイシンは、ま
た抗腫瘍および駆虫活性を有することが見出された。本
発明を、さらに、好ましい実施例により説明するけれど
も、本発明はこれらの実施例によって限定されるものと
してみなされるべきではない。
【００２５】実施例１ 土壌からのストレプトミセスｓｐ． Ｙ−８８，３１５
８２の単離 （ａ） 栄養単離培地の製造 培地は、１２１℃で３０分滅菌する。すべての場合にお
いて、滅菌した培地を４５℃に冷却し、ペトリープレー
トに注加しそして固化させる。
【００２６】（ｂ） 土壌懸濁液の製造 土壌１ｇを蒸留水に懸濁しそしてよく振盪する。土壌を
沈降させそして上澄液を使用して上述した単離培地のそ
れぞれに同時に接種する。
【００２７】（ｃ） 単離培地の接種 土壌懸濁液１ｍｌを、上述した栄養単離培地５０ｍｌを
含有するペトリー皿に接種する。
【００２８】（ｄ） ストレプトミセスｓｐ． Ｙ−８
８，３１５８２の単離 接種したペトリー皿を、３０℃で１０日培養しそしてス
トレプトミセスｓｐ．Ｙ−８８，３１５８２を生長微生
物の間から単離する。
【００２９】実施例２ アリサマイシンの醗酵生産のためのストレプトミセスｓ
ｐ． Ｙ−８８，３１５８２の培養 ストレプトミセスｓｐ． Ｙ−８８，３１５８２を、次
の組成を有する酵母エキス−麦芽エキス上で保持する。
【００３０】 この培地を、試験管に分配しそして１２１℃で３０分滅
菌する。試験管を寒天斜面培養基を製造するために斜面
位置において冷却する。この斜面培養基に培養菌を接種
しそして２８℃で１０〜１５日培養する。良好な生長お
よび胞子形成が観察される。１本の斜面培養基からの蒸
留水中の胞子の懸濁液を使用して、それぞれのフラスコ
が種子培養培地１００ｍｌを含有している５本の三角フ
ラスコに接種する。
【００３１】種子培養培地の組成 上記培地を、１００ｍｌずつの量で、５００ｍｌの三角
フラスコに分配しそして１２１℃で３０分滅菌する。フ
ラスコを冷却し、胞子懸濁液または菌糸プラグを接種し
そして１．５吋の行程の回転振盪機上で２４０ｒ．ｐ．
ｍで２７℃（±１℃）で７２時間振盪する。得られた生
長菌を使用して、それぞれのフラスコが生産培地１００
ｍｌを含有している２００本の５００ｍｌのフラスコに
２〜４％（ｖ／ｖ）で接種する。
【００３２】生産培地の組成 醗酵は、１．５吋の行程の回転振盪機上で２４０ｒ．
ｐ．ｍおよび２７℃（±１℃）で実施する。醗酵を、４
０〜４４時間の終りに中断した場合、培養濾液を寒天−
ウエル（直径６ｍｍ）法で試験したときのスタフィロコ
ッカスオーレウス２０９Ｐに対する阻止帯域の直径は２
０ｍｍであり、そして培養液のｐＨは、７．１〜７．３
０の範囲にある。細胞容量は、２０％（ｖ／ｖ）であ
る。抗生物質を含有する収穫培養ブロスを、遠心処理し
て菌糸および培養液を分離しそしてさらに実施例４に記
載したように処理する。
【００３３】実施例３ アリサマイシンを醗酵生産するためのストレプトミセス
ｓｐ． Ｙ−８８，３１５８２の培養 以下の点において相違するほかは、実施例２の操作を反
復する。Ｓｔｒ． ｓｐ． Ｙ−８８，３１５８２を次
の組成を有する寒天培地上で生長させる。 種子培養培地および生産培地の組成は、実施例２の培地
と同様である。デスモフェンＲ２ｍｌを、泡止剤として
加える。生産培地１０ｌを１５ｌの醗酵器に入れる。こ
の培地を、１２１℃で２０分、直接的および間接的水蒸
気により滅菌する。醗酵器を冷却しそして種子培養菌
（９％ｖ／ｖ）を接種する。醗酵は、１分当り１０ｌの
割合で通気しながら、１５０ｒ．ｐ．ｍで撹拌条件下で
２７℃（±１℃）で実施する。醗酵を２３〜２７時間の
終りに中断した場合、培養ブロスのｐＨは７．３であり
そして培養濾液を寒天ウエル法（直径６ｍｍ）により試
験したときのスタフィロコッカスオーレウス２０９Ｐに
対する阻止帯域の直径は、２１ｍｍである。細胞容量は
１５％（ｖ／ｖ）である。培養ブロスを、実施例５にお
けるように処理する。
【００３４】実施例４ アリサマイシンの単離および精製 実施例２から得られた培養濾液約１６ｌを、ｐＨを７．
０に調節した後、酢酸エチル１０ｌずつで２回抽出す
る。水性層を捨てそして合した酢酸エチル抽出液を真空
下で蒸発乾固する。この粗製抽出液を、最小量の酢酸エ
チルに溶解しそしてヘキサンで沈殿させる。この操作を
２回反復して乾燥粉末（０．５ｇ）を得る。この粉末
を、最小量の酢酸エチルに再溶解しそしてこれにメタノ
ール約５０ｍｌを加える。約０．５ｍｌの二重蒸留水を
加えそして溶液を−２０℃で１６時間放置する。得られ
た沈殿をアセトニトリルに溶解し、このアセトニトリル
溶液を濃縮飽和させそしてそれから４８時間−２０℃に
保持する。このようにして、純粋な結晶性のアリサマイ
シン１５０ｍｇを得た。
【００３５】実施例５ アリサマイシンの単離および精製 実施例３に説明したようにして得られた２つの醗酵器バ
ッチからの培養濾液を、集めて１７ｌの容量を得る。こ
れを、ｐＨ７．０において、それぞれ酢酸エチル１０ｌ
ずつで２回抽出する。この酢酸エチル抽出液を、濃縮乾
固して、粗製化合物４．５ｇを得る。この粗製化合物
を、最小量の酢酸エチルに溶解しそしてヘキサンで沈殿
させる。この操作を２回反復して乾燥粉末（１．２ｇ）
を得、これをシリカゲル（１００〜２００メッシュ）を
充填した８×１５ｃｍのカラスカラム上に充填する。ア
リサマイシンを、クロロホルム：酢酸エチル（７０：３
０）〜（６５：３５）勾配溶剤で溶離する。アリサマイ
シンを含有する活性溶離液（１．５１）を、濃縮乾固し
（０．４２ｇ）そしてそれから最小量の酢酸エチルに溶
解し、これにメタノール約５０ｍｌを加える。このメタ
ノール性溶液に二重蒸留水約０．５ｍｌを加えそしてこ
の溶液を最低１６時間−２０℃に保持する。得られた沈
殿を最小量の酢酸エチルそしてそれからアセトニトリル
５０ｍｌに溶解する。このアセトニトリル溶液を、−２
０℃で最低４８時間保持する。このようにして、純粋な
黄色の結晶性アリサマイシン１１０ｍｇを得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】アリサマイシンのＩＲ（ＫＢｒ）スペクトルを
示す図である。
【図２】アリサマイシンの１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ
ＣＤＣｌ３）を示す図である
【図３】アリサマイシンの１３Ｃ−ＮＭＲ（６７．５Ｍ
Ｈｚ ＣＤＣＬ３）を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 17/02 Ｃ１２Ｒ 1:465） 7804−4Ｂ (72)発明者 エツラ・コテスワラ・サトヤ・ビジヤヤク マル インド国ボンベイ400080．ムランド／ウエ スト．ダルガロード．ヘキストクオーター ズ ケイ−３ (72)発明者 スガタ・チヤタジー インド国ボンベイ400082．ムランド／ウエ スト．ダルガロード．ヘキストクオーター ズ エイチ１／２ (72)発明者 ビマル・ナレツシユ・ガングリ インド国ボンベイ400071・チエンブール． セントラルアベニユー173 (72)発明者 ユルゲン・ブルームバハ インド国ボンベイ400006．ネピーアンシー ロード（番地なし） (72)発明者 ヘルベルト・コグラー ドイツ連邦共和国デー−6233ケルクハイム ／タウヌス．ブレスラウアーシユトラーセ 39 (72)発明者 ハンス−ヴオルフラム・フエールハーバー ドイツ連邦共和国デー−6270イートシユタ イン／タウヌス．トーマス−マン−シユト ラーセ５アー

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式 【化１】 の化合物アリサマイシン。
  2. 【請求項２】 炭素源、窒素源、栄養無機塩および微量
    の元素を含有する栄養培地中で、好気的条件下で放線菌
    培養菌Ｙ−８８，３１５８２（ＤＳＭ ５５５９） を
    培養することからなる請求項１記載の化合物の製法。
  3. 【請求項３】 培養を１８〜４０℃の間の温度で実施す
    る請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 培養を６〜９の間のｐＨで実施する請求
    項２記載の方法。
  5. 【請求項５】 培養を２７℃（±１℃）の温度および約
    ７のｐＨで実施する請求項２〜４の何れかの項記載の方
    法。
  6. 【請求項６】 培養を２３時間より長い時間実施する請
    求項２〜５の何れかの項記載の方法。
  7. 【請求項７】 培養を深部培養として実施する請求項２
    〜６の何れかの項記載の方法。
  8. 【請求項８】 もし適当である場合は、慣用の補助剤お
    よび（または）ベヒクルと一緒に請求項１記載の化合物
    を含有する薬学的組成物。
  9. 【請求項９】 抗菌、抗腫瘍または駆虫作用を有する薬
    学的組成物を製造するための請求項１記載の化合物の使
    用。
  10. 【請求項１０】 放線菌培養菌Ｙ−８８，３１５８２
    （ＤＳＭ ５５５９）。
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