KR960009723B1 - 스트렙토마이세스 속의 신규한 미생물, 이로부터 제조되는 신규한 항생물질 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

요약없슴

Description

스트렙토마이세스 속의 신규한 미생물, 이로부터 제조되는 신규한 항생물질 및 이의 제조방법

제1도는 본 발명의 미생물 스트렙토마이세스속 SUN 8810-111의 균사체의 광학현미경 사진이고,

제2도는 본 발명의 항생물질 N-메틸스트렙토드리신 D의¹H-¹H-NMR스펙트럼이고,

제3도는 본 발명의 항생물질 N-메틸스트렙토드리신 D의 FAB-Mass스펙트럼이다.

본 발명은 신규한 스트렙토마이세스 속의 신규한 미생물, 이를 사용하여 농업용 항생물질을 제조하는 방법, 및 이에 따라 제조된 신규한 항생물질에 관한 것으로서, 상세하게는 토양으로부터 분리한 신규한 미생물인 스트렙토마이세스 속(Streptomyces species) SUN 8810-111, 이를 배양하는 방법에 의하여 농업용 항생물질을 제조하는 방법, 및 이에 따라 제조된 신규한 농업용 항생물질인 N-메틸스트렙토드리신 D(N-methylstreptothricin)에 관한 것이다.

스트렙토드리신(streptothricin)은 스트렙토마이세스 라벤둘라에(Strepthmyces lavendulae) 등의 방선균이 산생하는 일군의 수용성 염기성 뉴클레오시드 항생물질로서, 그램양성균과 그램음성균 뿐아니라 몇가지 병원성 진균류에 대해서도 항균효력을 가지는 것으로 알려졌다. 1942년 왁스만과 우드러프에 의해 스트렙토마이세스 라벤둘라에의 배양액에서 스트렙토드리신의 혼합물을 처음 발견한 이후로 유사한 화학구조를 가지는 많은 종류의 화합물들이 발견되어 스트렙토드리신 항생물질군을 이루고 있다. 스트렙토드리신 유도체들은 스트렙토리딘, 굴로사민 및 L-β-리진의 공통부분을 가지는데, 유도체들은 단지 L-β-리진의 수만 다르다.

스트렙토드리신 F(n=1), E(n=2), D(n=3), C(n=4), B(n=5), A(n=6).

이들 스트렙토드리신 유도체는 스트렙토마이세스 라벤둘라에, 스트렙토마이세스 노지리엔스(Strepthmyces nojiriensis) 등의 스트렙토마이세스 속 미생물로부터 생산되며 스트렙토드리신 C는 세균, 진균 뿐아니라 바이러스 및 곤충에 대해서도 활성을 보여주며, 스트렙토드리신 D 및 E에 있어서 β-리진에 있는 β-NH₃기에 아세틸화한 것은 어떤 종류의 종양세포에 대하여 활성을 나타낸 것으로 알려졌다. 스트렙토드리신 유도체들은 광범위하고도 강력한 항균 활성을 갖고 있음에도 불구하고 특징적인 독성으로 인하여 인체에 적용하는 항생제로서 실용화되지는 않았으며, 제한적인 용도로서 사용한 예가 개시되고 있을 뿐이다.

미합중국 특허 제3,962,426호에서는 스트렙토드리신 F(라세모마이신 A)의 조충구제약으로서의 용도를 개시하고 있다.

또한, 미합중국 특허 제4,560,748호에서는 스트렙토마이세스 노지리엔시스 AJ9417 FERM-BP287(FERM-P 5488) 미생물을 배양하여 제조한 항생물질 AN-201(I) 및 (II)를 개시하고 있는데, 이들은 L-리진 잔기의 아미노기가 아세틸화된 새로운 구조의 스트렙토드리신으로서 항미생물 활성 및 항종양 활성을 나타내는 것으로 기술하고 있다.

본 발명자들은 국립서울대학교내 토양으로부터 항생물질을 생산하는 토양균을 검색하는 도중 광범위한 항균범위를 가지며, 특히 농업용 항생물질로서 사용하기에 적합한 스트렙토드리신 유도체를 생산하는 신규한 미생물을 발견하게 되었다. 본 발명의 미생물을 배양하여, 간단하고도 산업적으로 응용이 가능한 방법으로 배양물을 분리 및 정제함으로서 신규한 스트렙토마이신 유도체를 얻을 수 있었다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기한 바와 같이 특히 농업용으로 사용하기에 적합한 항생물질을 높은 효율로 생성하는 신규한 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 미생물을 배양하여 간단하고도 수율이 높은 방법으로 분리 및 정제함으로서 특히 농업용으로 사용하기에 적합한 항생물질을 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 미생물을 상기의 제조방법에 따라 적용하여 제조되는 특히 농업용으로 사용하기에 적합한 신규한 스트렙토드리신 유도체 항생물질을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 N-메틸스트렙토드리신 D를 생산하는 스트렙토마이세스 속 SUN 8810-111에 의하여 달성된다.

본 발명의 또 다른 목적은 스트렙토마이세스 속 SUN 8810-111 미생물을 수성 영양 배지 중에서 호기적으로 배양하고, 배양물을 여과하여 이온교환수지에 흡착시켜 분리한 후 컬럼크로마토그래피를 통하여 정제하는 것을 포함하는 농업용 항생물질의 제조방법에 의하여 달성된다.

본 발명의 또 다른 목적은 하기 구조식의 N-메틸스트렙토드리신 D(N-methylstreptothricin D)에 의하여 달성된다.

본 발명의 신규한 미생물인 스트렙토마이세스 속 SUN 8810-111은 대한민국 국립서울대학교 구내의 토양으로부터 채취한 토양샘플로부터 분리되었다. 그 분리방법으로서는 토양균 분리에 사용되는 통상적인 방법이 사용될 수도 있으며, 특히 본 발명자 등에 의하여 약학회지 제35군 제4호, 348-351(1991)에 발표된 항생물질을 생성하는 토양균의 대량 검색을 위한 새로운 방법을 사용하면, 항생물질을 생산하는 토양균을 신속하고도 용이하게 선별할 수 있다.

즉, 토양을 채취하여 증류수에 현탁하고 그 희석액을 악티노마이세테스(actinomycetes) 선별 아가(agar)판에서 배양한 후, 생장한 콜로니를 실온에 두어 포자를 얻고, 이 포자를 아가 디스크(agar disk)에 옮겨 배양하며 콜로니를 순수 배양한다. 다음에는 항균 효력 검사 대상균이 이식된 아가판 위에 아가 디스크를 옮겨서 배양한 후, 아가 다시크 주위에 생성된 검색 균주의 생장 억제 영역을 측정하여 항생물질의 생성여부와 항균 스펙트럼을 평가할 수 있다.

상기와 같은 방법에 의하여 토양으로부터 분리된 본 발명의 신규한 스트렙토마이세스 속 SUN 8810-111[(Streptomyces sp. SUN 8810-111은 포자사슬 모양이 직선성 굴곡을 이루고 사슬의 길이는 3-10개 정도로 짧은 편이며 포자 표면은 매끄럽고, 성숙한 기중균체는 대부분의 배지에서 백색 내지 황색을 나타내며, 대부분의 배지에서 가용성 색소를 생성하지 않고, 콜로니의 뒷면은 대부분의 배지에서 특징적인 색소를 생성하지 않으며 회황색을 나타내고, 전분을 분해하며, 균주의 생장에 포도당, 과당, 자일로즈, 만니톨을 이용하고, 람노우즈, 이노시톨을 이용하는지는 확실하지 않다.

제1도는 본 발명의 미생물 스트렙토마이세스 속 SUN 8810-111의 균사체의광학현미경 사진이다. 본미생물의 배양특성 및 아가판 위에서의 생장특성을 다음 표 1 및 2에 나타낸다.

표 1. 스트렙토마이세스 속 SUN 8810-111의 배양특성

표 2. 스트렙토마이세스 속 SUN 8810-111의 아가판 위에서의 생장특성

G : 콜로니의 생장 상태

A : 기중균사체의 색

R : 기질균사체의 색

S : 가용성색소의 색

- : 색을 관찰할 수 없는 경우

상기와 같은 미생물학적 성질을 갖는 본 발명의 미생물 스트렙토마이세스 SUN 8810-111은 1993년 3월 29일자로 한국과학기술원에 수탁번호 KCTC 8531P로 기탁되어 있다.

상기의 미생물은 수성 영양 배지에서 배양시 신규한 스트렙토드리신 유도체를 다량으로 생성하는데, 이를 간단하고도 수율이 높은 방법으로 분리 및 정제하면 특히 농업용으로 사용하기 적합한 스트렙토드리신 유도체 항생물질을 효율적으로 제조할 수 있다.

즉, 본 발명의 스트렙토마이세스 속 SUN 8810-111 미생물을 수성 영양 배지 중에서 호기적으로 배양하고, 배양물을 여과하여 이온교화수지에 흡착시켜 분리한 후 컬럼크로마토그래피를 통하여 정제하는 것을 포함하는 간단하고도 신속한 방법에 의하여 특히 농업용으로 사용하기 적합한 신규한 항생물질인 N-메틸스트렙토드리신 D를 제조할 수 있다.

이하에서는 본 발명의 신규한 미생물을 사용하여 신규한 항생물질 N-메틸스트렙토드리신 D를 제조하는 방법을 상세히 설명한다.

(1) 미생물 배양

항생물질의 생산량은 일반적으로 미생물의 배지의 성분과 배양조건에 크게 영향을 받는다. 본 발명의 미생물이 항생물질을 생산하는 양은 특히 배지와 배양시간에 의존한다.

본 발명의 항생물질 생산에 적합한 배지는 통상적인 복합 탄소원 및 복합 질소원을 함유하도록 하고 바람직하게는 탄산칼슘을 적어도 0.6% 함유하도록 조제하고 중성의 pH로 조절하여 통상의 방법으로 멸균한다.

액체배지의 탄소원으로는 포도당, 과당, 서당 등과 같은 당류를 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 질소원으로는 효모추출물, 맥아추출물, 옥수수 침지액, 황산암모늄, 요소 등 미생물이 이용할 수 있는 질소화합물을 사용할 수 있고, 기타 무기염류로는 염화나트륨, 황산철, 인산수소이칼륨, 수산화칼슘 등을 사용할 수 있다. 또한 이러한 탄소원, 질소원, 무기염류 외에 미생물의 생육에 필요한 각종의 유기물, 무기물 또는 통상적으로 사용되는 거품제거제 등을 사용할 수 있다.

상기와 같이 조제한 배지에, 본 발명의 미생물의 균체를 직접 접종하거나, 별도로 사전 배양한 종균 배양액을 접종하여 28-30℃의 온도에서 180rpm으로 진탕 배양한다. 배양시간은 65시간 이상으로 하고, 바람직하게는 80-90시간 배양한다.

(2) N-메틸스트렙토드리신 D의 분리 및 정제

균주배양물을 여과하여 배양액과 균체를 분리하고 배양액을 산성형 양이온교환수지에 부하하여 흡착시키고 물 및 약산성 용액으로 세척한 다음 산성 용액으로 용출시켜 수집한다. 활성 분획을 염기성형 음이온 교환수지를 통과시켜 중화한 다음 진공중에서 증발농축한다. 잔류물을 메탄올에 녹여서 여과하여 불순물을 제거한 후 셀룰로오스 컬럼 크로마토그래피 상에서 n-BuOH-EtOH-AcOH-H₂O(10 : 10 : 2 : 5,v/v)를 용출액으로 하여 분리함으로써 본 발명의 항생물질을 얻는다.

상기에서 얻은 항생물질의¹H-NMR 및¹³C-NMR 분석결과치를 공지의 스트렙토드리신 D의 자료와 비교한 결과, 하기의 표 3 및 4에 나타낸 바와 같이 대부분의 신호들이 정확히 일치하고 단지¹H-NMR 분석결과에서 2.86rpm과¹³C-NMR 분석결과에서 35.6rpm에 N-메틸기에 대한 신호가 특징적으로 관찰되었으며, N-메틸기의 위치는 다음의 그림에 나타난 자료를 근거로 하여 스트렙토드리신의 락탐고리 질소에 위치하는 것이 확인되어 구조가 결정되었다.

표 3. 스트렙토드리신 D와 본 발명의 항생물질에 있어서¹H-NMR데이타 비교

* : 물 중에서 측정

^#: Δδ=δ(스트렙토드리신 D)-δ(본 발명의 항생물질)

표 4. 스트렙토드리신 D와 본 발명의 항생물질에 있어서¹³C-NMR데이타 비교

* : Δδ=δ(본 발명의 항생물질)-δ(스트렙토드리신 D)

제2도 및 제3도는 상기에서 얻은 본 발명의 항생물질 N-메틸스트렙토드리신 D의¹H-¹H-cosy 스펙트럼 및 FAB-Mass스펙트럼을 보여준다.

상기와 같이 구조가 확인된 본 발명의 N-메틸스트렙토드리신 D는 지금까지 보고된 바가 없는 신규한 항생물질로서 그 전체구조는 다음과 같다.

상기와 같은 구조식을 갖는 본 발명의 N-메틸스트렙토드리신은 산 및 염기에 대하여 안정하고 대부분의 유기용매에 잘 녹으며, 특히 수용성이므로 약제학적으로 이용 가능성이 높다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 미생물 스트렙토마이세스 속 SUN 8810-111을 사용하여 본 발명의 항생물질 N-메틸스트렙토드리신을 제조하는 방법을 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명을 이로써 한정하는 것은 아니다.

실시예 1

(1) 미생물 배양

카제인 가수분해물 0.25%, 육즙 0.1%, 콩분말 1.0%, 옥수수 침지액 0.5%, 포도당 2.0%, 인산수소이칼륨 0.2% 및 침강탄산칼슘 1.0%를 포함하도록 배지를 조제하여 pH를 중성으로 조절하고 멸균하였다.

상기와 같이 조제한 배지에, 본 발명의 미생물의 균체를 직접 접종하여 28-30℃의 온도에서 180rpm으로 80시간 배양하였다.

(2) N-메틸스트렙토드리신 D의 분리 및 정제

균주배양물 1l를 여과하여 배양액과 균체를 분리하여, 배양액을 다이아이온(Diaion) WK-20(H⁺) 이온 교환수지에 흡착시키고 증류수 및 0.005 내지 0.05N-HCl로 세척한 다음 0.06N-HCl로 용출시켜 용출액을 수집하였다. 활성 분획을 다이아이온 WA-30(OH^-) 이온 교환수지를 통과시켜 중화한 다음 진공 중에서 증발농축하였다. 잔류물을 메탄올 50ml에 녹여서 여과하여 불순물을 제거한 후 셀룰로오스 컬럼 크로마토그래피 상에서 n-BuOH-EtOH-AcOH-H₂O(10:10:2:5,v/v)를 용출액으로 분리하여 본 발명의 항생물질 19mg을 얻었다.

실시예 2

TSB 3% 및 침강탄산칼슘 0.6%를 포함하도록 배지를 조제하여 pH를 중성으로 조절하고 멸균하였다.

상기와 같이 조제한 배지에, 본 발명의 미생물의 균체를 직접 접종하여 28-30℃의 온도에서 180rpm으로 90시간 배양하였다.

균주배양물 1l을 가지고 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 본 발명의 항생물질을 분리 및 정제하였다.

본 발명의 신규한 항생물질 N-메틸스트렙토드리신 D의 항균 활성을 평가하기 위하여 그 MIC를 스트렙토드리신 D와 비교하여 하기의 표 5에 나타낸다.

표 5. N-메틸스트렙토드리신 D와 스트렙토드리신 D의 MIC

A^*: N-메틸스트렙토드리신 D

B^**: 스트렙토드리신 D

검정조건 : 피리쿨라리아 오리자에 ; 영양 한천 배지, 그밖의 균주 ; 무엘러 힌톤 배지

상기의 MIC로부터 알 수 있듯이, 본 발명의 신규한 항생물질인 N-메틸스트렙토드리신 D는 스트렙토드리신 D와 유사한 정도로 그램 양성균 및 그램 음성균, 그리고 진균류를 포함하여 거의 모든 원핵생물, 진균 및 효모에 대하여 항균 활성을 갖는 것으로 여겨진다.

본 발명자들은 본 발명의 항생물질이 특히 식물의 질병을 유발하는 미생물에 대하여 강한 항균 활성을 갖고 있다는 점에 주목하여, 벼의 도열병 뿐아니라 각종 과수의 병해에 유용한 농업용 항생물질로서 매우 유용하다는 것을 발견하였다.

도열병(稻熱病)은 벼의 가장 중요한 병으로, 벼의 생육 전기에 걸쳐 발생하여 심각한 피해를 주는데, 병원균은 모닐리아과에 속하는 피리쿨라리에 오리자에(Pyricularia oryzae)이다. 쌀을 주식으로 하는 우리나라에서는 이의 방제에 노력을 기울여 왔으며, 저항성 품종을 재배하거나 도열병용의 살균제를 산포하여 방제하였는데, 본 발명의 항생물질이 이 원인균에 대하여 강한 항균 활성을 가지므로, 이의 방제약으로 사용할 수 있는 것이다.

즉, 본 발명의 항생물질이 식물의 질병을 유발하는 미생물, 특히 벼의 도열병의 원인균에 대하여 강한 항균활성을 가지며, 본 발명의 미생물로부터 간단하고도 경제적인 방법에 의해 대량 생산할 수 있으며, 특히 수용성으로 약제의 제조에 용이하다는 점을 고려할 때 본 발명의 항생물질은 농업용 항생물질로서 사용할 수 있을 것이다.

앞서 언급한 바와 같이 본 발명의 화합물은 산, 염기에 대하여 안정하고 수용성이므로 특히 농업용 약제의 제조에 유용하다는 장점이 있다. 즉, 본 발명의 화합물은 단독으로 물에 용해하거나, 또는 다른 적절한 용매 및 첨가제와 혼합하여 용액상으로 제조하여, 분무, 디핑 등의 방법에 의해 식물체에 직접 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 사용량은 방제 대상 미생물, 감염의 성질 및 정도에 따라 변화될 수 있으며, 농원예용으로 사용될 때는 여러가지 제제형태가 가능하다. 예를 들면, 분제, 조분제, 용해성 분말, 희석유제, 유화농축물, 수성 또는 유성 현탁액 또는 용액(직접 또는 희석하여 분무될 수 있다), 에어로솔 또는 캡슐로 제제화될 수 있다. 제제는 활성화합물을 담체 또는 희석제, 예를 들면 용매, 고체담체 또는 임의의 표면 활성제와 혼합 및/또는 마쇄함으로써 공지방법에 의해 제조될 수 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 신균한 미생물 스트렙토마이세스 속 SNU 1188-111을 사용하여, 본 발명의 제조방법에 따라 경제적이고도 대량으로 제조될 수 있는 본 발명의 신규한 항생물질 N-스트렙토드리신 D은, 식물의 질병을 유발하는 미생물에 대하여 강한 항균활성을 가지며, 산 염기에 안정하고 수용성으로 약제의 제조에 용이하다는 점을 고려할 때, 농업용으로서 그 산업적 이용 가치가 높은 항생물질이라 할 수 있다.

Claims (6)

1. N-메틸스트렙토드리신 D를 생산하는 스트렙토마이세스 속 SUN 8810-111(수탁번호 KCTC 8531P).
2. 스트렙토마이세스 속 SUN 8810-111 미생물을 수성 영양배지 중에서 호기적으로 배양하고, 배양물을 여과하여 이온교환수지에 흡착시켜 분리한 후 칼럼크로마토그래피를 통하여 정제하는 것을 포함하는 N-메틸스트렙토드리신 D의 제조방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 배지가 탄산칼슘을 적어도 0.6% 포함하도록 조제하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
4. 제2항에 있어서, 상기 배양이 80 내지 90시간 동안의 진탕배양인 것을 특징으로 하는 제조방법.
5. 제2항에 있어서, 상기 제조방법이 균주배양액을 산성형 양이온 교환수지에 부하하여 흡착시키고 물 및 약산성 용액으로 세척한 다음 산성 용액으로 용출시켜 수집하고, 활성 분획을 염기성형 음이온 교환수지를 통과시켜 중화한 다음 진공 중에서 증발농축하고 잔류물을 메탄올에 녹여서 여과하고, 셀룰로즈 칼럼 크로마토그래피 상에서 n-BuOH-EtOH-AcOH-H₂O(10:10:2:5,v/v)을 용출액으로 하여 분리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
6. 하기 구조식의 N-메틸스트렙토드리신 D.