NO149239B

NO149239B - Offshore-konstruksjon.

Info

Publication number: NO149239B
Application number: NO771850A
Authority: NO
Inventors: Ben Clifford Gerwick Jr
Original assignee: Exxon Production Research Co
Priority date: 1976-05-27
Filing date: 1977-05-26
Publication date: 1983-12-05
Also published as: GB1560956A; NO149239C; US4048943A; CA1074628A; NO771850L; JPS52146902A; JPS6153279B2

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av et antibiotisk stoff, danomycin.

Den foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til fremstilling av et antibiotisk stoff, danomycin, ved fermentering, samt fremgangsmåte til utvinning og rensning av det antibiotiske stoff. Det ved fremgangsmåten fremstilte antibakterielle stoff vil kunne anvendes i fortynnede opplosninger som råkonsentrat, som renset fast stoff og i ren krystallinsk form. Danomycin inhiberer effektivt veksten av gram-positive bakterier, især slike stafylokokker som er resistente overfor andre antibiotika. Danomycin er ikketoksisk og har terapeutisk virkning overfor mus som er infisert med gram-positive bakterier. Danomycin er likedan anvendelig ved behandling av infeksjoner forårsaket av gram-positive bakterier f.eks. pneumonia hos mennesker. Danomycin horer til de jernholdige antibiotika. Danomycin kaltes opprinnelig

antibiotikum nr. 425.

Ved anvendelse av fremgangsmåten ifolge den foreliggende oppfinnelse er det mulig å fremstille det antibiotiske stoff danomycin, som effektivt inhiberer veksten av gram-positive bakterier, er opploselig i vann og uopploselig i aceton, har en rodlig-orange farve, viser negativ ninhydrin-, Tollens- og Fehling-reak-sjon og i renset form smelter under spaltning med 135 - 138°C. Det omhandlede antibiotiske stoff har i vann et ultrafiolett absorbsjonsspektrum med maksima ved 270 mfi (E^Jm = 48) , 325 mp.

^Elcm = 12'6) °9 430 m^ (Eicm = 15'6^; stoffet viste seg ved analyse å inneholde : C, 48,82%; H, 7,05%; N, 7,81%; Fe, 3,13% og 0 (ved differens) 33,19%. Den optiske dreining for to tilfeldige prover på danomycin (bestemt i fortynnet opplosning ved den morkerode farve av antibiotikumet) var folgende:

Fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen er karakterisert ved at en stamme av Streptomyces albaduncus dyrkes i en vandig carbohydrat-holdig opplosning inneholdende et nitrogenholdig næringsmiddel under suhmerse, aerobe betingelser, inntil oppløsningen oppviser en vesentlig aktivitet overfor gram-positive bakterier, hvoretter danomycinet utvinnes fra oppløsningen.

Den organisme som anvendes til fremstilling av det antibiotiske stoff ifolge oppfinnelsen, isoleres fra en jordbunnsprove fra Guatemala og er en hittil ukjent art betegnet Streptomyces albaduncus av slekten Streptomyces. En kultur av den levende organisme med laboratoriebetegnelsen nr. 13246 er innlevert til "the American Type Culture Collection", Washington D.C. og har fått mikroorganismebetegnelsen A.T.C.C. 14698.

Ved en hensiktsmessig utforelsesform for fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen anvendes som Streptomyces albaduncus A.T.C.C. 14698, som i praksis ved dyrkning under de anforte betingelser har vist seg å frembringe det tilsiktede antibiotiske stoff i godt utbytte.

Nedenfor angis data vedrorende Streptomyces albaduncus A.T.C.C. nr. 14698:

Mikroskopisk morfologi:

Vegetativt mycelium : forgrenet, intet spor av fragmentering. Luftmycelium : kort, bolget, ca. 0,7 - 0,4 [i i diameter,

monopodisk forgrenet.

Sporofor-morfologi : ' sporekjedene forekommer i bånd, åpne sloyfer og primitive spiraler, sjelden i lukkede spiraler. Sporekjedene finnes på korte sidekjeder, skiftevis eller på

den annen side langs fertile hyphae. Konidier : catenulat, ovoid, ca. 1,1 - 1,4 x 1,4 -

1,8 n.

Kulturbeskrivelse:

Streptomyces albaduncus A.T.C.C. nr. 14698 har folgende dyrk-ningskarakteristika ved vekst på Bennefs agar i 10 dager ved 27 - 28°C: Koloni : Isolerte kolonier konvekse til skjold- formede, 4-7 mm i diameter, vanligvis

med radialt forlopende furer.

Vegetativ vekst : moderat, gullig-brunlig.

Luftmycelium : moderat, pulverformet til floyelsaktig,

grålig-hvitt til lyst olivengrått. Bakside : lysebrun til lysegullig-brunlig til grålig-gulligbrun.

Opploselig pigment : gullig-brunlig.

Hydroqensulfid- produks jon:

Streptomyces albaduncus frembringer ikke hydrogensulfid ved dyrkning på pepton-jernagar (Difco) tilsatt 0,1% gjærekstrakt.

Streptomyces albaduncus A.T.C.C. nr. 14698 har folgende dyrknings-karakterietika ved vekst på de anforte medier i 14 dager ved 27 - 28° C:

Sabouraud' s glucose- pepton- agar.

Vegetativ vekst : moderat, krem-farvet til lysgullig-brun. Luftmycelium : spredt, hvitt til grålig-hvitt.

Bakside : gul til gullig-brun.

Opploselig pigment : gul til gullig-orange.

Glycerol-calciummalat-agar.

Vegetativ vekst : dårlig til moderat, kremfarvet. Luftmycelium : intet.

Bakside : gullig-brunlig.

Opploselig pigment : blekgul til brunlig.

Bemerkninger : langsom klaring av mediet.

Gulerotstykker.

Ingen vekst.

Streptomyces albaduncus A.T.C.C. nr. 14698 har videre folgende karakteristika: 1. Luftmycelet er kort og bolget. Sporoforene er utformet som sloyfer eller er seilformet, sjeldent spiralformede. Sporoover-flåtenes struktur ved elektronmikroskopi er tornet. 2. Czapek's agar; veksten er lysegullig til brunlig og vokser ned i agaren. Det hvite luftmycelium er sparsomt, og det frembringes intet opploselig pigment. 3. Glycerin-Czapek's agar; veksten er liten og lysegullig til brunlig og vokser ned i agaren. Det hvite luftmycelium er sparsomt, og det frembringes et lysegullig til brunlig opploselig pigment. 4. Glycerin-ammoniumsalt-agar; Veksten er sparsom og gullig-hvit, og det frembringes intet luftmycelium og intet opploselig pigment. 5. Glukose-aspargin-agar; lysegullig til olivenbrunlig vekst, som er skinnende og vokser ned i agaren. Det hvite luftmycelium er pulveraktig, og det frembringes et aprikosgult opploselig pigment. 6. Stivelsesagar; mork gråligbrun vekst, skinnende og voksende gjennom agaren; det finnes intet luftmycelium eller opploselig pigment. Stivelsen er sterkt hydrolysert. 7. Næringsagar; liten, lysegul vekst, som gror ned gjennom agaren. Det finnes intet luftmycelium eller opploselig pigment. 8. Bennett's agar: Den gullig-olivenbrune vekst er moderat, pudd-erformet eller floyelsblbtt luftmycelium, som er hvitt eller lett brunlig samt gullig-olivenbrunlig opploselig pigment. 9. Hvetemels "Soyton-agar": Moderat gullig-olivenbrunlig vekst, hvitt luftmycelium, som er pulverformet eller floyelsblott, og som frembringer et gullig-olivenbrunlig opploselig pigment. 10. Potetskive: Blank lysegullig til brunlig vekst av liten mengde; det finnes intet luftmycelium eller opploselig pigment. 11. Gelatin: Hvite kolonier vokser på overflaten; det finnes intet luftmycelium eller opploselig pigment. Gelatinen smelter moderat. 12. Tyrosin gjærgelatin: Lysegullig, rynket kolonivekst, sparsomt luftmycelium, gullig, opploselig pigment. 13. Melk: Lysebrun ringvekst, intet luftmycelium og intet opploselig pigment. Melk fordoyes ikke. 14. Nitratopplosning: Farveldse småkuler vokser på overflaten, og det finnes intet luftmycelium eller opploselig pigment. Reduk-sjonen fra nitrat til nitrit er negativ. 15. Melanindannelsesmedium: Lysegullig vekst, som er av liten mengde og vokser ned i agaren. Det finnes intet luftmycelium eller opploselig pigment. 16. Carbonkildeutnyttelsen ble undersokt ved den av Pridham angitte fremgangsmåte, og folgende resultater ble oppnådd: God utnyttelse ble iaktatt ved anvendelse av arabinose, xylose, glukose, galactose, fructose, cellobiose, lactose, maltose, raffinose, sorbitol, inositol, mannitol, rhamnose, natriumcitrat og natriumsuccinat. Utnyttelsen av sorbose, saccharose og inulin var tvilsom eller negativ.

Ved sammenligning med et antall Streptomycesarter viser det seg

at det er forskjellige arter som ligner Streptomyces albaduncus i visse henseender, slik som Streptomyces alboflavus, Streptomyces pseudogriseolus og Streptomyces griseolus. Samtlige disse arter kan differensieres fra den foreliggende stamme på grunn av spore-morfologien, sporeoverflatestrukturen, vekstegenskaper og fysiologiske eller biokjemiske egenskaper, slik som det skal nær-mere beskrives nedenfor.

Streptomyces alboflavus har rett og forgrenet luftmycelium og produserer nesten ingen spiraler; luftmyceliets farve er gullig-hvitt på Czapek's agar, og det finnes intet luftmycelium på glukose asparaginagar. Den reduserer nitrat til nitrit, og peptonisering av melk er positiv uten koagulering. Disse egenskaper adskiller den fra den foreliggende stamme.

Streptomyces pseudogriseolus har adskillige spiraler i sporoforene, og luftmyceliets farve er svakt gullig blandet med grått. Koagulering eller peptonisering er begge deler positive med melk. Ytterligere forskjelligheter finnes i utnyttelsen av natriumsitrat, raffinose og sorbitol.

Streptomyces griseolus har kortkjedete sporoforer med bolgede forgreninger, og det finnes ingen typiske spiraler, som svarer til den foreliggende stamme, men forskjeller iakttas, forsåvidt angår sporenes glatte overflate, den grå eller svakt grå farve av luftmyceliet på Czapek's agar og glukose asparaginagar og især frembringelsen av det brunlige, opploselige pigment ved vekst på organiske medier.

Det er en felles egenskap for streptomyceter at disses oppforsel på dyrkningsmediet endres spontant eller kan endres på kunstig måte. Det er derfor mulig fra jordbunnen eller ved konservering å oppnå mutanter eller varianter som avviker vesentlig fra den opprinnelige stamme. Disse egenskaper viser seg også ved stammene som anvendes ifolge den foreliggende oppfinnelse.

Når kunstige mutasjoner induseres i den opprinnelige stamme for

å forbedre ydeevnen, forekommer det vesentlig endrede vekstkarak-teristika og endret farve av luftmyceliet hos mutantene, som stadig frembringer danomycin. Til induksjon av kunstig mutasjon finnes det forskjellige fysikalske eller kjemiske metoder, slik som bestråling med rontgen eller ultrafiolett bestråling, samt behandling med kjemikalier, slik som sennepsforbindelser. Neden-stående to stammer er eksempler på mutasjon indusert ved bestråling med rontgen eller ultrafiolett bestråling:

Danomycin er et antibiotisk stoff som inneholder jern i molekylet, som beskrevet ovenfor. Som folge herav sammenlignes den danomycin-produserende art med forskjellige arter av slekten Streptomyces som var angitt å kunne produsere slike jernholdige antibiotika, som grisein, albomycin, ETH-22765 og ferrimycin.

Streptomyces griseus som frembringer grisein, avviker i vesentlig grad fra den foreliggende art på grunn av luftmyceliet, som har en karakteristisk vanngronn farve, mens sporoforene er rette med dusker, og at det ikke dannes typiske spiraler.

Adskillige Streptomyces-arter, slik som Streptomyces griseoflavus, Streptomyces galilaeus, Streptomyces lavendulae, Streptomyces pilosus, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces olivaceus, Streptomyces aureofaciens og Streptomyces polychromogenes angis

å frembringe jernholdige antibiotika, og disse arter avviker fra stammen ifolge den foreliggende oppfinnelse på folgende måte: Streptomyces griseoflavus har like og monopodisk forgrenede sporoforer og danner ikke typiske spiraler. Vekstfarven er rodlig-brunlig eller orange på Czapek's agar og sitrongullig på glukose-asparaginagar.

Streptomyces galilaeus har monopodisk forgrenede sporoforer med uregelmessige åpne spiraler. Sporenes overflatestruktur er glatt, og veksten er carmin til carminrod på glycerol Czapek's agar. Streptomyces lavendulae har lange, monopodisk forgrenede sporoforer med korte, tette spiraler av den hoyredreiende type, og luftmyceliet er lavendelfarvet på de fleste medier.

Streptomyces pilosus har lodden sporeoverflate og frembringer et brunlig, opploselig pigment.

Streptomyces viridochromogenes har tallrike spiraler og frembringer et brunlig, opploselig pigment.

Streptomyces olivaceus har lange spiraler og danner askegrått til lyst olivengrått luftmycelium på Czapek<1>s agar.

Streptomyces aureofaciens har åpne spiraler og danner askegrått eller morkt-grått luftmycelium på glukose asparaginagar.

Streptomyces polychromogenes har lyst carmin til carminfarvet luftmycelium.

Som ovenfor anfort sammenlignes den danomycinfrembringende art med beslektede arter av hensyn til taxonomien eller de frembragte antibiotika, og man kom til det resultat, at den foreliggende art er en ny art av slekten Streptomyces, som betegnes Streptomyces albaduncus nov.sp.

Streptomyces albaduncus frembringer ved vekst under egnede betingelser danomycin. En fermenteringsvæske inneholdende danomycin fremstilles ved podning av sporer eller mycelia av den danomycinfrembringende organisme i et egnet medium, og deretter dyrke dette under aerobe betingelser. Til fremstilling av danomycin er det mulig å anvende dyrkning på et fast medium, men til fremstilling i storre målestokk dyrkes hensiktsmessig i et flytende medium. Dyrkningstemperaturen vil kunne varieres mellom 20 og 35°C, innenfor hvilket intervall organismen vil kunne vokse, men en temperatur på 25 - 30°C og noytral pH-verdi foretrekkes. Ved den submerse, aerobe fermentering av organismen til fremstilling av danomycin inneholder mediet som carbonkilde en i handelen til-gjengelig glyceridolje eller et carbonhydrat, som glyserol, glukose, maltose, saccharose, lactose, dextrin, stivelse o.s.v. i ren eller rå form, og som nitrogenkilde et organisk stoff, som sojabonnemel "distillers solubles", peanut-mel, bomullsfro-mel, kjottekstrakt, pepton, fiskemel, gjærekstrakt, maisstopevæske o.s.v. og eventuelt uorganiske nitrogenkilder, som nitrat og ammoniumsalter samt mineralsalter, som natriumklorid, kalium-klorid og magnesiumsulfat og puffere som kalsiumkarbonat eller fosfat og spor av tungmetallsalter. I utluftede, submerse kulturer anvendes et antiskummemiddel, som flytende parafin, fettoljer eller siliconer. Det vil til fremstilling av danomycin kunne anvendes mere enn en type carbonkilde, nitrogenkilde eller anti-skumstoff. I alminnelighet fortsettes dyrkningen inntil minst flere hundrede mcg/ml danomycin er akkumulert i mediet.

Alminnelige fremgangsmåter til isolering og rensning av en liten mengde aktiv forbindelse fra et fermenteringsmedium vil kunne anvendes på danomycin. Danomycin vil f.eks. kunne isoleres ved anvendelse av forskjellig absorberingsevne, opploselighet og fordelingskoeffisient mellom den aktive forbindelse og forurens-ningene. F.eks. kan danomycin i næringssubstratfiltratet absor-beres på aktivt kull, som utvaskes med vann og vandig methanol eller vandig ethanol, og deretter elueres med vandig butanol eller vandig aceton. Eluatene forenes, konsentreres i vakuum til torrhet, og det fremkommer herved et rå-pulver. Ved utnyttelse av kromatografi på kull og en fraksjon-collector kan den aktive forbindelse ytterligere renses. Ved tilsetning av en storre mengde av et egnet organisk opplosningsmiddel, som aceton til det vandige konsentrat av de aktive fraksjoner, kan danomycin bunnfelles og isoleres. Inneholdte urenheter bunnfelles og fjernes ved tilsetning av et passende organisk opplosningsmiddel, som methanol eller ethanol til et vandig konsentrat av de aktive fraksjoner.

Ekstraksjon ved hjelp av organiske opplosningsmidler vil likeledes kunne anvendes til rensning av danomycin.

F.eks. kan den aktive forbindelse ekstraheres med en egnet opp-losningsmiddelblanding, som fenol-kloroform eller benzylalkohol-butanol. Ekstraktene kan etter utvaskning med ansyret vann, alka-lisk vann og rent vann overfores til vann med tilsetning av egnede ikke-polare, organiske opplosningsmidler, som ether eller hydro-carboner.

Det vil likeledes ved rensning av danomycin kunne anvendes mot-stromsteknikk. F.eks. er det mulig å fremstille danomycin med stor renhet ved fordeling mellom et opplosningsmiddelsystem av fenol-kloroform-pH 6,0 puffer (1:9:10) eller med en blanding av benzylalkohol-butanol-n/100-saltsyre-20% saltvann (20:10:3:30).

Ved sammenligning av danomycins ovénanforte fysikalsk-kjemiske

og biologiske egenskaper med de tilsvarende egenskaper fra andre kjente antibiotika viser det seg at danomycin er et hittil ukjent antibiotikum. Danomycin ligner grisein, albomycin, ferrimycin, LA-5352 og andre jernholdige antibiotika hva angår vannopploselig-hetsegenskapen og den rodlig-orange farve. Men ved sammenligning av danomycins antibakterielle spektrum med de andres spektrum viser det seg at danomycin avviker fra grisein og albomycin hva angår virkningen overfor gram-negative bakterier, fra ferrimycin ved virkning mot Bacillus sphericus og fra LA-5352 ved virkning mot hemolytiske streptokokker.

Da danomycin i særlig grad er aktiv overfor gram-positive bakterier, sammenlignes det med andre jernholdige antibiotika som ferrimycin og LA-5352, som likeledes er aktive overfor gram-positive bakterier, ved papirkromatografi. Som vist nedenfor avviker danomycin fra disse antibiotika.

Danomycin har i sitt infrardde spektrum karakteristiske absorbsjonsmaksima ved 1160-1165, 865-880, 810 og 680-690 cm<-1>, hvilke absorbsjonsmaksima ikke forekommer i spektrene for ferrimycin 'eller LA-5352.

Ved sammenligning av danomycins ultrafiolette spektrum med de andre antibiotikas spektre viser det seg at danomycin avviker fra de andre på folgende måte:

Oppfinnelsen er som folger belyst ved eksempler:

Et dyrkningsmedium (100 ml) inneholdende de ovenfor anfbrte bestanddeler steriliseres i en kolbe på 500 ml og ble inokulert med en podningskultur av Streptomyces albaduncus og ble dyrket ved 27 - 1°C i 8 dager under omrystning, hvorved fremstillingen av danomycin i fermenteringsvæsken nådde 240 mcg/ml.

EKSEMPEL 2

Bestanddeler av mediet

Et dyrkningsmedium (100 ml) inneholdende de ovenfor anforte bestanddeler, ble sterilisert i en kolbe på 500 ml, ble inokulert med en podningskultur av Streptomyces albaduncus og ble dyrket ved 27 - 1°C i 8 dager under omrystning, hvorved fremstillingen av danomycin i fermenteringsvæsken nådde 440 mcg/ml.

EKSEMPEL 3

Fermenteringsvæsken ble filtrert og pH-verdien ble innstilt til 7-8 og ble absorbert ved hjelp av 0,5% aktivt kull. Kullet ble vasket med vann og deretter med 5% vandig methanol, og danomycinet ble eluert med vann-mettet n-butanol. Det aktive eluat ble konsentrert til torrhet og det rå, faste danomycin, som herved fremkom, ble opplost i vann og ble renset ved kullkolonnekrornato-grafi. Kolonnen ble vasket med vann og 50% vandig methanol og ble deretter eluert fraksjonert med 60% vandig aceton. Det renere preparat som herved fremkom, ble opplost igjen i en liten mengde vann, og ble utfelt ved tilsetning av 10 volumdeler aceton, hvoretter danomycinet ble ytterligere ekstrahert med 95% ethanol for å fjerne en liten mengde urenheter. Det herved fremkomne rodlig-brune danomycin opploses i vann og ekstraheres med en blanding av fenol-kloroform (1:1). Ekstraktet ble utvasket med en 0,5%-vandig opplosning av natriumbikarbonat, n/100 saltsyre og vann i den nevnte rekkefolge og ble deretter overfort til vann ved tilsetning av ether og petroleumether. Et rent danomycin preparat fremkommer deretter ved frysetorring.

EKSEMPEL 4

Danomycin kan renses ved motstrbmsfordeling. Danomycin motstroms-behandles med et opplosningsmiddelsystem av benzylalkohol-n-butanol-n/100 saltsyre-20% vandig opplosning av natriumklorid (20:10:3: 30) ved anvendelse av et spisst ror nr. 9 i 35 overfbringer. Innholdet av aktive ror samles, og det fremkom et rent danomycin-preparat ved frysetorring. Den herved fremstilte danomycin viste seg å være ren som folge av den korrekte fordelingskurve, som av-tegnes etter de biologiske verdier og absorbsjonsevnene ved 420

m|i med den teoretiske kurve.

Danomycin er et rodlig-orangefarvet antibiotikum, som inneholder jern i molekylet. Det er opploselig i vann, 50% vandig ethanol,

50% vandig methanol og fenol-kloroform (1:1) og noe opploselig i 95% methanol og 95% ethanol, men uopploselig i aceton og andre organiske opplosningsmidler. Ninhydrin-Tollens og Fehlings reak-sjoner er alle negative, men adskillige ninhydrinpositive stoffer kan skjelnes ved papir-kromatografi i surt hydrolysat av danomycin. Motstromsfordeling kan anvendes overfor danomycin i et sys-tem bestående av benzylalkohol-n-butanol-n/100 HCl-20% vandig opplosning av NaCl (20:10:3:30) til fremstilling av et rent preparat. Den herved fremstilte danomycinforbindelse smelter ved 135-138°C under spaltning.

Analyse. Funnet C, 48,82; H, 7,05; N, 7,81; Fe, 3,13. På basis

av disse analytiske data og den antagelse at bare et jernatom er til stede, beregnes danomycins empiriske molekylformel til å

være <C>73<H>125<0>37<N>10<F>e og molekvlvekten 1791.

Danomycins ultrafiolette absorbsjonsspektrum i vann viser absorbsjonsmaksima ved 270 m|a (E<1%> = 48), 325 mp. (E^m = 12,6) og 430

mfl ( E^ = 15, 6) . Det infrarode absorbsjonsspektrum av danomycin i kaliumbromid viser karakteristiske absorbsjonsbånd ved folgende bølgelengder: 3200-3280,2920,1720-1725, 1630-1640, 1570-1580,1495-1500, 1455-1470, 1220-1230, 1160-1165, 1010-1040, 865-880, 810,

755 og 680-690 cm<-1>.

Ved utfdreise av papirkromatografi i forskjellige opplosnings-middelsystemer fremkom folgende danomycin Rf-verdier: våt n-butanol, 0,05; 3% vandig ammoniumklorid, 0,95; 80% fenol, 0,95; 50% vandig aceton, 0,85; n-butanol-methanol-vann (4:1:2) og 1,5% methyl-orange, 0,50; n-butanol-methanol-vann (4:1:2), 0,30; benzen-methanol (4:1), 0,05; vann 1,0; n-butanol-eddiksyre-vann (4:1:5), 0,23; n-butanol-eddiksyre-vann (4:1:2), 0,35; n-butanol-eddiksyre-vann (2:1:1), 0,50; ethanol-vann (3:1) + 2% natriumklorid, 0,65; n-butanol-ethanol-eddiksyre-vann (25:25:3:47), 0,85. Danomycin har de ovenfor anfbrte egenskaper og ved sammenligning av disse egenskaper med egenskapene for andre jernholdige antibiotika, som grisein, albomycin, LA-5352 og ferrimycin, viser det seg mulig å adskille danomycin fra disse andre antibiotika.

Danomycins biologiske egenskaper er folgende:

1. Antimikrobielt spektrum:

Den minimale inhibitoriske konsentrasjon av danomycin overfor gram-positive, gram-negative, syre-faste bakterier og fungi ble bestemt ved seriemessig agar fortynningsteknikk. Resultatene er vist nedenfor i tabell I. Danomycin er aktivt overfor koagulase-positive stafylokokker, innbefattet arter som er resistente overfor alminnelige anvendte antibiotika. 2. Virkningen av pH-verdien på den antibakterielle aktivitet: Virkningen ble undersokt ved fortynningsmetoden i flytende medium, idet inokuleringsstorrelsen var 10 fortynning av 12 timers kulturer av proveorganismer. Som vist i tabell II ble ikke canomy-cinets aktivitet påvirket av mediets pH-verdi: 3. Virkningen av serum på den antibakterielle aktivitet: Virkningen ble undersokt ved hjelp av fortynningsmetoden. Som vist i tabell III, har serum ikke noen virkning på danomycinets aktivitet. 4. Danomycins antibakterielle aktivitet i forhold til klinisk isolert koagulase-positive stafylokokker.

Aktivitetene av danomycin og syv alminnelig anvendte antibiotika ble undersokt overfor 60 stammer av koagulase-positive stafylokokker, som var isolert fra pasienter fra forskjellige hospitaler. Resultatene er anfort nedenfor i tabell IV. Det ble iakttatt en temmelig bred fordeling av stammene som var resistente overfor de alminnelig anvendte antibiotika, mens fordelingen av stammer som var resistente overfor danomycin, bare viste seg å være 1,7%.

5. Toksisitet:

Toksisiteten av danomycin er meget liten, idet den intravenøse LD^Q-verdi er 3,250 mg/kg hos mus. Det forekom ingen dodsfall ved intraperitoneal dosis på 5000 mg/kg. Kronisk toksisitet ble undersokt hos rotter; selv ved en injeksjon interperitonealt med 100 mg/kg danomycin hos rotter daglig i 90 dager ble ingen skadelig virkning med hensyn til disse rotters vekst eller adferd iakttatt. 6. Kjemoterapeutisk virkning overfor eksperimental infeksjon hos mus: Mus infisertes intraperitonealt med Staphylococcus aureus(Smith-stamme) , idet inoculumsstorrelsen var 100 ganger UD^-verdien av patogenet, og danomycin ble inngitt subcutant etter bakterieinfek-sjonen. Middelhelbredelsesdosis etter en enkelt injeksjon (CD^Q) viste seg å være 0,04 mg/kg. Til sammenligning ble undersokt natriumpenicillin G, og CD^-verdien viste seg å være 0,3 mg/kg.

Det antibiotiske stoff fremstilt ifolge den foreliggende oppfinnelse er en verdifull forbindelse til påvisning av forurensning med gram-negative bakterier, fungi, gjær og lignende ved den kom-mersielle fremstilling av enzymet amylase ved fermentering av Bacillus subtilis. Det er således mulig ved tilsetning av 1-1000 mcg/ml og fortrinnsvis ca. 10 mcg/ml av det antibiotiske stoff til en aliquot mengde av et podet medium etterfulgt av incubering å oppnå vekst av uonskede organismer og påvise disse visuelt.

Claims

1. Fremgangsmåte til fremstilling av et antibiotisk stoff, danomycin, karakterisert ved at en stamme av Streptomyces albaduncus dyrkes i en vandig carbohydratopplosning inneholdende et nitrogenholdig næringsmiddel under submerse, aerobe betingelser, hvoretter danomycin utvinnes fra opplosningen.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at som Streptomyces albaduncus anvendes A.T.C.C. 14698.