JPH03255082A - 新規抗生物質ｒｋ―４４１ｓ、その製造法、抗腫瘍剤並びに免疫抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明；ま、新規抗生物質ＲＫ−４４１Ｓ及びその製造
法と、ＲＫ−４４１３を有効成分とする抗腫瘍剤並ひに
免疫抑制剤に関する。

〔発明の背景： 本発明者等は、新規抗生物質の探索を目的として多数の
土壌中から微生物を分離し、その産生ずる抗生物質を分
離探索し、ストレプトミセス属に属する微生物の培養波
及グ培養菌体に文献未載の新規抗生物質ＲＫ−４４１が
産生、蓄積されることの知見を得たく特願平１−１３５
３４８号）。

本発明者等は、上記微生物の産生物につき更に研究を行
った結果、上記ＲＫ−４４１とは異なる新規抗生物質を
見いだし、本発明を完成するに至った。

一方、近年、ガン細胞が無秩序に増殖する原因が分子レ
ベルで解明されつつあるっオンコジーン（ガン遺伝子）
の発現が昂進した場合や、増殖因子のシフナル（云達が
異常になった場合に細胞がガン化すると推定される。

従来の制ガン抗生物質の多くが、細Ｉ包分裂毒（ＤＮＡ
、ＲＮＡの合成阻害剤）であったが、最近ではオンコジ
ーンの発現抑制や増殖因子のングナル伝達抑制といった
新しい作用機構に基づく制ガン剤の開発が強く望まれて
いる。

さらに、移植による拒絶反応、骨髄移植による移植片対
宿主病、自己免疫疾患等の治療及び予防に有用な免疫抑
制剤の開発も盛んに行われており、新規な免疫抑制剤が
開発されればその効果は非常に大きい。

〔発明の目的〕

本発明の目的は、抗腫瘍活性と免疫抑制作用を有する新
規抗生物質とその製造法を提供することにある。更に、
本発明の目的は、上記抗生物質を有効成分とする抗腫瘍
剤並びに免疫抑制剤を提供することにある。

〔発明の構成〕

本発明の抗生物質ＲＫ−４４１３は、下記の式で表され
る文献未載の新規な抗生物質である。抗生物質ＲＫ−４
４１３は、腫瘍細胞に対して優れた抑制効果を奏し、ま
た免疫抑制作用を有し、且つ細胞毒性がｉよいので、極
めて安全性の高い抗腫瘍剤並びに免疫抑制剤を提供する
ことができる。

ｉｅ 以下に、本発明の詳細な説明する。

〈抗生物質ＲＫ−４４１３の製造〉 （使用する微生物） 本発明の抗生物質ＲＫ−４４１３を生産する微生物；ま
ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属
する抗生物質ＲＫ−４４１，Ｓの生産能を有する菌種で
ある。

その−例として、ストレプトミセス・エスピー−ＲＫ−
４４１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、　　ＲＫ−
４４１）（以下”ＲＫ−４４１株”と称する。）を挙げ
ることができ、該微生物は、上記の特性を有し、本発明
の抗生物質ＲＫ−４４１５を有利に生産するものであり
、本発明の製造法に有効に利用し得るものである。

また、上記ＲＫ−４４１株の自然的及び人工的変異株は
勿論、ストレプトミセス属に属する菌種で後述の抗生物
質ＲＫ−４４１３の生産能を有する微生物はすべて本発
明方法において使用することができる。

上記ＲＫ−４４１株は、山梨県韮崎市で採取された土壌
中より分離された土壌放線菌であり、工業技術院微生物
工業技術研究所に昭和６３年９月３０日付で寄託され、
その微生物受託番号は、微工研菌寄第１０３０６号（Ｆ
ＥＲＭ　　Ｐ−１０３０６）である。

ＲＫ−４４１株は、次の菌学的性質を有する。

１、形態的特徴 本菌株、ＲＫ−４４１株を１％酵素エキス、１％グルコ
ースを含む液体培地で培養し、この菌体を６Ｎ塩酸、１
．１０℃、１８時間加水分解したものの薄層タロマドグ
ラフィーでは、Ｌ。

Ｌ−ジアミノピメリン酸を検出したが、メソジアミノピ
メリン酸：ま検出されなかった。寒天平板上に発育した
ものの電子顕微鏡観察では、気菌糸は不完全な螺旋状を
呈し、抱子表面は平滑で円筒型である。

２、　各種培地上における生育状態（２７℃、２０日間
培養、色調はディスクリブチイブ・カラー・ネームズ・
ディクショナリ　（Ｄｅｓｃｒ　ｉｐｔ　１ｖｅＣｏｌ
ｏｒ　Ｎａｍｅｓ　Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ）　　による
）１）スターチ・イースト寒天培地 発　　　　育　　；普　　　通 気菌糸：普　通 気菌糸色調　：４ｉｇ（淡黄茶色） 裏面色調　ニアｍｌ（チョコレート色）可溶性色素　：
５ｐ０（チョコレート褐色）２）イーストエキス・モル
トエキス寒天培地弁　　　　育　　：普　　　通 気菌糸：普　通 気菌糸色調　：４ｉｇ（淡黄茶色） 裏面色調　：　７ｍｌ　（チョコレート色）可溶性色素
　；ダークワイン色 ３）オートミル寒天培地 発　　　　育　　：不　　　良 気菌糸；な　し 裏面色調　：３ｃｂ（黄土色） 可溶性色素　；な　　し ４）スターチ・無機塩寒天培地 発　　　　育　　：不　　　良 気菌糸：な　し 裏面色調　：３ｃｂ（黄土色） 可溶性色素　：な　　し ５）チロシン寒天培地 発　　　　育　　：普　　　通 気菌糸：な　し 裏面色調　：ｌ！ｇ（黄褐色） 可溶性色素　：淡褐色 ６）蔗糖硝酸塩寒天培地 発　　　　育　　：不　　　良 気菌糸；な　し 裏面色調　：　３ｃｂ　（黄土色） 可溶性色素　：ｉヱ　　し ７）クルコース・アスパラギン寒天培地弁　　　　育　
　：不　　　良 気菌糸：な　し 裏面色調　：３ｉｅ（ラクダ色） 可溶性色素　ニブドウ色 ８）クリセロール・アスパラギン寒天培地弁　　　　育
　　：不　　良 気菌糸：な　し 裏面色調　：４ｎｇ（カエデ色） 可溶性色素　＋６ｉｅ（レッドウッド色〉９）栄養寒天
培地 発　　　　育　　：普　　通 気菌糸；な　し 裏面色調　：４ｉｊ７（淡褐色） 可溶性色素　：な　　し １０）ペプトン・イーストエキス・鉄寒天培地発　　　
　育　　：不　　　良 気菌糸：な　し 裏面色調　：４ｉｅ（黄褐色） 可溶性色素　：な　　し ３、糖の利用 Ｄ−グルコース　　　　　発育良好 Ｄ−フルクトース　　　　発育良好 Ｄ−キシロース　　　　　発育良好 Ｌ−ラムノース　　　　　発育普通 ラフィノース　　　　　　発育普通 Ｌ−アラビノース　　　　発育せず 蔗　糖　　　　　　　　　発育せず イノシトール　　　　　　発育せず 上記の諸性質より、ＲＫ−４４１株はストレプトミセス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属することは明らか
である。しかし、バージイズ・マニュアル・才ブ・テ゛
ターミネイティブ・バタテリオロジイ（Ｂｅｒｇｅｙ’
ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ
　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）及びインターナショナル
・ジャーナル・オブ・ンステマティック・バタテリオロ
ジイ（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
）記載のい０ ずれの菌種ミも一致しなかった。性質が類似しているも
のとして、ストレプトミセス・プルベラセウス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｕｌｖｅｒａｃｅｕｓ）が記載
されているが、この菌はオートミール寒天培地、スクー
チ無機塩培地で気菌糸形成が見され、ＲＫ−４４１株で
は気菌糸ができない点で異なる。

以」二の点からＲＫ−４４１株はストレプトミセス・プ
ルベラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｕｌｖｅ
ｒａｃｅｕｓ）に近縁の新菌種と考えられる。

（培養法及び精製法） 本発明の抗生物質ＲＫ−４４１５を得るに当っては、ス
トレプトミセス属に、嘱する上記抗生物質生産菌を、抗
生物質を生産する通常の方法で培養することができる。

培養の形態は、液体培養でも固体培養てもよく、工業的
に有利に培養するためには、前記生産菌の胞子懸濁液又
は培養液を培地に接種し、通気撹拌培養を行えばよい。

培地の栄養源としては特に限定されることはなく、微生
物の培養に通常用いられる炭素源、窒素源その他を培地
中に含有させることができる。炭素源としては、澱粉、
デキストリン、グリセリン、グルコース、シュークロー
ス、ガラクトース、イノシトール、マンニトールｔどが
、また窒素源としては、ペプトン、大豆粉、肉エキス、
米ぬか、麩、尿素、コーンステイープリカー、アンモニ
ウム塩、硝酸塩、その他の有機または無機の窒素化合物
が用し）られる。その他、無機塩類、たとえば食塩、燐
酸塩類、カリウム、カルシウム□、亜鉛、マンガン、鉄
等の金属塩類等を適宜に添加してもよく、必要に応じて
消泡剤として、動、植、鉱物油等を添加してもよい。培
養温度、培養時間等の培養条件は使用菌の発育に適し、
しかもＲＫ−４４１Ｓの生産が最高となるような条件が
選ばれる。たとえば、培地のｐＨは４〜９、特に中性付
近がよく、培養の適温は２５〜３５℃程度がよい。

しかし、これらの培養組成物、培地の水素イオン濃度、
培養温度、撹拌条件などの培養条件は使用する菌株の種
類や、外部の条件などに応じて好ましい結果が得られる
ように適宜調節されるべきであることはいうまでもない
。このようにして得ら１ ２ れる培養物から、ＲＫ−４４１５を得るには、代謝産物
を採取するの：二連常用いられる手段を適宜に利用して
採取し得る。たとえば、ＲＫ−４４１Ｓと不純物との溶
解度差を利用する手段、イオン結合力の差を利用する手
段、吸着親和ツノの差を利用する手段、分子量の差を利
用する手段のいずれも、それぞれ単独、又は、適宜組合
せて、あるいは反復して使用される。具体的には、ＲＫ
４４１Ｓは、培養濾液にその大部分が存在する。

その培養液を各種のイオン交換クロマトグラフィ、ゲル
濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、液
体クロマトグラフィー、セルロース分配クロマトグラフ
ィー等を組合せて精製すると、ＲＫ−４４１３及びその
他の活性成分を含む画分が得られる。この両分を凍結乾
燥して得られた粉末を更に高速液体クロマトグラフィー
（たとえば、ヌクレオジル５Ｃ１８，５０％メタノール
の系で展開）により精製し、ＲＫ−４４１３の精製白色
粉末を得る。

こうして得られたＲＫ−４４１３の理化学的性質及び生
物学的性質は次のとおりである。

〈抗生物質ＲＫ−４４１Ｓの理化学的性質及び生物学的
性質〉 融解点：９６〜１００℃ 元素分析　：Ｃ６２，２９Ｈ６，５２ Ｎ４．９２％ 比旋光度　：　［α］　２６＝±０（ｃｏ、１、ＭｅＯ
Ｈ）紫外線吸収スペクトル：λ）ｌｅｏｌ＋　（ε）２
２２（９７１０）　、２６４（７６３０）　、３５０（
２４８５＞赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ中 ３３８０．１７１０、■６８８．１６１１．１４９５．
１３６９．１２６７．１１４３．１０４２．８６９．７
８２．７２３分子量：　２８９　（ＦＤ−ＭＳ） （分子式：Ｃ，８１５ＮＯ３） 呈色反応　；ライドン−スミス、レミュー塩化第二鉄に
陽性 抗菌作用　：動物細胞の増殖抑制効果はあるが、１■／
ｍ１２の濃度でも抗菌作 用は示さなかった。

３ ４ 〈他物質との比較〉 これらの理化学的性質及び生物学的性質を有する抗生物
質は、前記の構造式で表され、文献未載のため新規抗生
物質と結論した。

（ＲＫ−４４１Ｓを有効成分とする抗腫瘍剤並びに免疫
抑制剤） 本発明のＲＫ−４４１３を有効成分とする抗腫瘍剤並び
に免疫抑制剤は、経口及び非経口投与のいずれも使用可
能であり、経口投与する場合は軟硬カプセル剤又は錠剤
、顆粒剤、細粒剤、散剤として投与され、非経口投与す
る場合は、水溶性懸濁液、油性製剤などの皮下或は静脈
注射剤、点滴剤及び固体状又は懸濁粘稠状として持続的
な粘膜吸収が維持できるように生薬のような剤型で投与
され得る。

本発明の有効成分の製剤化は、界面活性剤、賦形剤、滑
沢剤、佐剤、及び有効成分の性質を考慮して腸溶性製剤
とするために医薬的に許容し得る皮膜形成物質、コーテ
ィング助剤等を用いて適宜行うことができ、その具体例
を挙げれば、次のとおりである。

本発明の組成物の崩壊、溶出を良好ならしめるために、
界面活性剤、例えばアルコール、エステル類、ポリエチ
レングリコール誘導体、ソルビタンの脂肪酸エステル類
、硫酸化脂肪アルコール類等の１種又は２種以上を添加
することができる。

また、賦形剤こして、例えば蔗糖、乳頭、デンプン、結
晶セルロース、マンニット、軽質無水珪酸、アルミン酸
マグネシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、合成
珪酸アルミニウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウ
ム、リン酸水素カルシウム、カルボキシメチルセルロー
スカルシウム等の１種又は２種以上を組合わせて添加す
ることができる。

滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ク
ルク、硬化油等を１種又は２種以上添加することができ
、また矯味剤及び培臭剤として、食塩、サッカリン、糖
、マンニット、オレンジ油カンゾウエキス、クエン酸、
ブドウ糖、メントール、ユーカリ油、リンゴ酸等の甘味
剤、香料、着５ ６ 色材、保存料等を含有させてもよい。

ｕｆｆｉ剤、湿潤剤の如き佐剤としては、例えばココナ
ツツ油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、乳酸カルシウ
ム、ベニバナ油、大豆リン脂質等を含有させることがで
きる。

また、皮膜形成物質としては、セルロース、糖類等の炭
水化物誘導体として酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）
、またアクリル酸系共重合体、二塩基酸モノエステル類
等のポリビニル誘導体としてアクリル酸メチル・メタア
クリル酸共重合体、メタアクリル酸メチル・メタアクリ
ル酸共重合体が挙げられる。

また、上記皮膜形成物質をコーティングするに際し、通
常使用されるコーティング助剤、例えば可塑剤の他、コ
ーティング操作時の薬剤相互の付着防止のための各種添
加剤を添加することによって皮膜形成剤の性質を改良し
たり、コーティング操作をより容易ならしめることがで
きる。なお、有効成分を皮膜形成物質を用いてマイクロ
カプセル化してから賦形剤等と混合した剤型としても良
い。

特に代表的な剤型における配合比は下記のとおりである
。

特に好ましい範囲 有効成分　　０．１〜９０重量％　０．１〜１５重量％
賦形剤　　　　ｌＯ〜９９．８　　〃８５〜９９．４　
　〃滑沢剤　　　　０〜５０　　〃　　０〜２０〃界面
活性剤　　０〜５０　　〃　　０〜２０〃皮膜形成物質
　０．１〜５０〃０．３〜２０〃特に好ましい賦形剤は
、乳糖、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース
カルシウムである。

また、投与量は、対象疾患を有効に治療するに十分な量
であり、症状、投与経路、剤型などによって左右される
が、一般に、経口投与の場合、大人では１日当り、約０
．０１〜５　ｍｇ／ｋｇ体重（小人では、約０．０１〜
３　ｍｇ／ｋｇ体重）の範囲で、ソノ上限は好ましくは
約２．５ｍｇ／ｋｇ体重、更に好ましくは約０．５　ｍ
ｇ　／　ｋｇ体重程度であり、非経口投与の場合、その
上限は約０．５ｍｇ／ｋｇ体重程度であり、７ ８ 好ましくは約０．２５■／ｋｇ体重、更に好ましく）ま
約０．１　ｍｇ　／　ｋｇ体重が適当である。

以下に、本発明を製造例、製剤例及び試験例ｊこよっで
具体的Ｌ　Ｍｌｉ明するが、本発明はこれに何ら限定さ
れるものではない。

なお、「％−：ま重量％を表わず。

製造例 グルコース２％、可溶性デンプン１％、肉エキス０．１
％、乾燥酵母０．４％、大豆粉２，５％、食塩０．２％
、リン酸第２カリウム０．　ＯＯ５％の組成からなる７
２ｚの培地に前記ＲＫ−４４１株を接種して、２７℃で
６６時時間上う培養した。この培養液を塩酸でｐＨ３に
調整し濾過すると６０１の濾液が得られたので、活性物
質を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層から得られた
油状の活性物質２７、７　ｇをシリカゲルカラム（７，
４８４０ｃｍ）の上部ｊこ付加し、クロロホルム：メタ
ノール＝９６：４の溶出液にて展開した。活性画分を濃
縮乾固（３，５ｇ）後、少量のクロロホルム：こ溶解し
、シリカゲルカラム（２，４Ｘ　５６ｃｍ）の上部に付
加した。これをクウロホルム：メタノール＝９２＋８で
展開すると活性物質３００ｍｇが得られた。８０％メタ
ノールに溶解させた活性物質をセファデックスＬＨ２０
カラム（２，６Ｘ９５ｃｍ）の上部に付加し８０％メタ
ノールで展開すると、溶出液量約４００ａｌｌ！で活性
物質が溶出された。これを濃縮後、凍結乾燥すると、１
．８ｍｇの粉末が得られた。最終的に高速液体クロマト
グラフィーで純粋なＲＫ４４１Ｓ物質を４．５　ｍｇ得
た。用いたカラムはヌクレオジル＝ｃ、ｓ　（２０Ｘ　
３００ｍｍ＞で、溶剤は５０％メタノールで流速は７．
０　ｍｉｄ／ｍｉｎ　とした。

製剤ＦＡＩ（注射・点滴剤） ＲＫ−４４ｉＳ、１０■を含有するように粉末ぶどう糖
５ｇを加えてバイアルに無菌的に分配し、密封した上、
窒素、ヘリウム等の不活性ガスを密封して冷暗所に保存
する。使用前に０．８５％生理的食塩水１００−を添加
して静脈内注射剤とし、１日、ｌＯ〜１００−を症状に
応じて静脈内注射又は点滴で投与する。

９ ０ 製剤例２　（注射・点滴剤） ＲＫ−４４１３，２ｍｇを用５）で、製剤例１と同様の
方法により軽症用静脈内注射とし、１日、１０〜１００
ｍ４ｆを症状に応じて静脈内注射又は点滴で投与する。

製剤例３　（腸溶性カプセル剤） ＲＫ−４４１３，０，５ｇ、乳糖２．４６　ｇ及びヒド
ロキンプロピルセルロース０．０４　ｇを各々とり、よ
く混合した後、常法に従って粒状に成形し、これをよく
乾燥して篩別してビン、ヒートンール包装などに適した
顆粒剤を製造する。次に、酢酸フタル酸セルロース０．
５　ｇ及びヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレ
ート０．５ｇを溶解シて被覆基材となし、前記顆粒を浮
遊流動させつつこの基材を被覆して腸溶性の顆粒剤とす
る。この組成物をカプセルに充填して腸溶性カプセル製
剤１００個を製造する。

試験例１ （上皮増殖因子（ＥＧＦ）に反応して生じるマウス上皮
細胞のＤＮＡ阻害試験） 静止期のマウス上皮細胞に１０％牛脂仔血清を添加して
１７時間後に３Ｈラベルのチミジンを培地に加えた（１
μＣｉ　／　ｒｄ　）。５時間ラベルした細胞の酸不溶
性画分の放射活性を液体シンチレーションカウンターで
計数するとＤ　Ｎ　Ａ合成重が測定された。阻害率は次
の方法により算出した。

阻害率（％〉 この結果を以下に示す。

ＲＫ−４４１Ｓ１　　　１００　　　　なし〃３　　　
１００　　　　なし 〃　　　　　１０　　　１００　　　　なし試験例２ （コンカナバリンＡ　（ＣｏｎＡ）　　に反応して生じ
るマウス膵臓細胞の幼若化抑制試験） Ｂａｌｂ／ｃマウスの膵臓細胞を調製し、それに１０１ ２ μｇ／７！の（：ｏｎＡを添加した。２日間細胞を炭酸
ガス培養器で培養した後、ＭＴＴ試薬（Ｄｉｍｅｔｈｙ
ｌ−ｔｈ＋ａｚｏｙｌ　ｄｉｐｈｅｎｙｌ　ｔｅｔｒａ
ｚｏｌｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）を添加して５７０ｎｍ
の吸光度の増加を測定した。５７０ｎｍの吸光度の増加
とリンパ球の幼若化とは相関するのて、ＲＫ−４４１ｓ
物質の添加により吸光度の増加が阻害されることから幼
若化が抑制されることが解る。阻害率は次の方法により
算出した。

阻害率（％） （発明の効果） 上記の試験結果より、本発明の抗生物質は、上記細胞に
対して極めて低濃度で高い腫瘍、免疫抑制効果を示す。

また、細胞毒性もその濃度では認められず、安全性の高
い薬剤である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の抗生物質ＲＫ−４４１３の紫外線吸
収スペクトルを示す図であり、第２図は、抗生物質ＲＫ
−４４１３の赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ中）を示す
図である。 この結果を以下に示す。 なし なし なし なし ３ ４ 特開平３−２５５０８２　（８） 特開平３ ２５５０８２　（９） 手 続 補 正 書 （方式） ２、発明の名称 新規抗生物質ＲＫ−４４１３，その 製造法、抗腫瘍剤並びに免疫抑制剤 ；３．補正をする者 事件との関係 出 願 人 名 称 （６７９） 理 化 学 研 究 所 ４、代 理 人

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の式で表される抗生物質ＲＫ−４４１Ｓ。 ▲数式、化学式、表等があります▼
2. （２）ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）
   属に属する抗生物質ＲＫ−４４１Ｓ生産菌を培養し、そ
   の培養物から抗生物質ＲＫ−４４１Ｓを分離採取するこ
   とを特徴とする抗生物質ＲＫ−４４１Ｓの製造法。
3. （３）抗生物質ＲＫ−４４１Ｓ生産菌がストレプトミセ
   ス・エスピー・ＲＫ−４４１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
   ｓｓｐ．ＲＫ−４４１）である特許請求の範囲第２項に
   記載の製造法。
4. （４）抗生物質ＲＫ−４４１Ｓを有効成分として含有す
   ることを特徴とする抗腫瘍剤並びに免疫抑制剤。