JPH03220192A - 新規抗生物質ｒｋ―１４４１ａ及びｒｋ―１４４１ｂ、その製造法並びに抗ウイルス剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新規抗生物質ＲＫ−１４４１Ａ及びＲＫ−１
４４１Ｂ並びにその製造法とＲＫ−１４４１Ａ及びＲＫ
−１４４１Ｂを有効成分とする抗ウィルス剤に関する。

（従来の技術及び発明が解決しようとする課題）現在、
エイズをはじめとする難治性のウィルス感染症があり、
これらに有効な抗ウィルス剤の開発が望まれている。本
発明者等は、抗ウィルス剤を微生物代謝産物より見出す
ことを目的として、多数の土壌中から微生物を分離し、
その代謝産物について精製、同定および用途の開発を行
ってきた。

その結果、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ）属に属する微生物の代謝産物中に文献未載の新規物
質が産生、蓄積される二との新たな知見を得、さらに該
物質の抗ウィルス作用を確認した。従って本発明の目的
は、新規抗ウイルス抗生物質とその製造法を提供するこ
とにある。更に、本発明の目的は、上記抗生物質を有効
成分とする抗ウィルス剤を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 本発明の抗生物質ＲＫ−１４４１Ａ及びＲＫ−１４４１
Ｂは、下記の構造式で表され、後述の理化学的性質を有
する文献未載の新規な抗生物質であり、優れた抗ウィル
ス活性を示すため、抗＠瘍プロモーターなどとして有用
な抗ウィルス剤である。

Ｈ０ＣＨ３ ＨＯＨ 以下に、本発明の詳細な説明する。

く抗生物質ＲＫ−１４４１Ａ及びＲＫ−１４４１Ｂの製
造〉（使用する微生物） 本発明の抗生物質ＲＫ−１４４１Ａ及びＲＫ−１４４１
Ｂを生産する微生物はストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐ：
ｏｍｙｑｅｓ）属に属する抗生物質ＲＫ−１４４１Ａ及
びＲＫ−１４４１Ｂの生産能を有する菌種である。

そゐ−例として、ストレプトミセス・エスピー＝　ＲＫ
　−１４４１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、　Ｒ
Ｋ−１４４１）（以下“ＲＫ−１４４１株”と称する。

）を挙げることができ、該微生物は、上記の特性を有し
、本発明の抗生物質ＲＫ−１４４１Ａ及びＲＫ−１４４
１Ｂを有利に生産するものであり、本発明の製造法に有
効に利用し得るものである。

また、上記ＲＫ−１４４１株の自然的及び人工的変異株
は勿論、ストレプトミセス属に属する菌種で後述の抗生
物質ＲＫ−１４４１Ａ及びＲＫ−ｉ４４１Ｂの生産能を
有する微生物はすべて本発明方法において使用すること
ができる。

上記ＲＫ−１４４１株は、埼玉県吹上町郊外で採取され
た土壌中より分離された土壌放線菌であり、工業技術院
微生物工業技術研究所に平成元年１２月１３日付寄託さ
れ、その微生物受託番号は、微工研菌寄第１１１５９号
（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１１５９）である。

ＲＫ−１４４１株は、次の菌学的性質を有する。

１、形態的特徴 本菌株、ＲＫ−１４４１株は１％酵素エキス、１％グル
コースを含む液体培地で培養し、この菌体を６Ｎ塩酸、
１１０℃、１８時間加水分解したものの薄層クロマトグ
ラフィーでは、ＬｌＬ−ジアミノピメリン酸を検出した
。寒天平板上に発育したものの顕微鏡観察では、気菌糸
は不完全な螺旋状を呈していた。

２、各種培地上における生育状態（２７℃、２０日間培
養、色調はカラー・ハーモニー・マニユアル（Ｃｏｌｏ
ｒ　Ｈａｒｍｏｎｙ　Ｍａｎｕａｌ）　による）１）ス
ターチ・イースト寒天培地 発　　　育　　：良　好 気菌糸　；多い 気菌糸色調：３＋ｇ（ベージュ茶色） 裏面色調　：５ｐｏ（チョコレート色）可溶性色素、無 ？）イーストエキス・モルトエキス寒天培地発　　　育
　　、良　好 気菌糸　：多い 気菌糸色調：２ｆｅ（灰色） 裏面色調　：５ｐｏ（チョコレート色）可溶性色素：４
ｐｉ（茶色） ３〉オートミール寒天培地 発　　　育　　：良　好 気菌糸　：多い 気菌糸色調：５ｆｅ（灰色） 裏面色調　：４ｐ＋（茶色） 可溶性色素：４ｉｅ（黄褐色） ４）スターチ・無機塩寒天培地 発　　　育　　：良　好 気菌糸　；普通 気菌糸色調：　５ｆｅ　（灰色） 裏面色調　：６βｅ　（赤茶色） 可溶性色素ニアＡｃ（ワイン色） ５）チロシン寒天培地 発　　　育　　：良　好 気菌糸　：少ない 気菌糸色調：５ｄｃ（灰色） 裏面色調　：３ｐｇ（黄金茶色） 可溶性色素：４ｐｊ２（褐色） ６）蔗糖硝酸塩寒天培地 発　　育　　：良　好 気菌糸　：少ない 気菌糸色調：３ｄｃ（黄白色） 裏面色調　：２Ｃｂ（アイポリ−） 可溶性色素；無 ７）グルコース・アスパラギン寒天培地発　　　育　　
：良　好 気菌糸　：多い 気菌糸色調：３＋ｊｃ（黄白色） 裏面色調　：３＋ｅ（黄土色） 可（容性色Ｓ：無 ８）クリセロール・アスパラギン寒天培地発　　　育　
　：良　好 気菌糸　：多い 気菌糸色調：３ｄｃ（黄白色） 裏面色調　：３＋ｅ（黄土色） 可溶性色素：２ｇｃ（前色） ９）栄養寒天培地 発　　　育　　：良　好 気菌糸　：無 裏面色調　：３ｃｂ（砂色） 可溶性色Ｓ：無 １０）ペプトン・イーストエキス・鉄寒天培地発　　　
育　　：良　好 気菌糸　：無 裏面色調　：３ｎｅ（）バーズ色） 可溶性色Ｎ：４ｐｌ（褐色） ３、糖の利用 Ｄ−グルコース　　　発育良好 Ｄ−フルクトース　　発育良好 Ｌ゛−ラムノース　　　発育良好 ラフィノース　　　　発育良好 Ｄ−キシロース　　　発育普通 Ｌ−アラビノース　　発育不良 蔗　　糖　　　　　　発育不良 イノシトール　　　　発育不良 Ｄ−マンニトール　　発育不良 上記の諸性質より、ＲＫ−１４４１株はストレプトミセ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属することは明ら
かである。

（培養法及び精製法） 本発明の抗生物質ＲＫ−１４４１Ａ及びＲＫ−１４４１
Ｂを得るに当っては、ストレプトミセス属に属する上記
抗生物質生産菌を、抗生物質を生産する通常の方法で培
養することができる。培養の形態は、液体培養でも固体
培養でもよく、工業的に有利に培養するためには、前記
生産菌の胞子懸濁液又は培養液を培地に接種し、通気撹
拌培養を行えばよい。

培地の栄養源としでは特に限定されることはなく、微生
物の培養に通常用いられる炭素源、窒素源その他を培地
中に含有させることができる。炭素源として：ま、澱粉
、デキストリン、グリセリン、グルコース、ンユークロ
ース、ガラクトース、イノシトール、マンニトールなど
が、また窒素源として；ま、ペプトン、大豆粉、肉エキ
ス、米ぬか、麩、尿素、コーンステイープリカー、アン
モニウム塩、硝酸塩、その他の有機または無機の窒素化
合物が用いられる。その他、無機塩類、たとえば食塩、
燐酸塩類、カリウム、カルンウム、亜鉛、マンガン、鉄
等の金属塩類等を適宜に添加してもよく、必要に応じて
消泡剤として、動、植、鉱物油等を添加してもよい。培
養温度、培養時間等の培養条件は使用菌の発育に適し、
しかもＲＫ−１４４１Ａ及びＲＫ−１４４１Ｂの生産が
最高となるような条件が選ばれる。たとえば、培地のｐ
Ｈは４〜９、特に中性付近がよく、培養の適温は２５〜
３５℃程度がよい。しかし、これらの培養組成物、培地
の水素イオン濃度、培養温度、撹拌条件プ；どの培養条
件は使用する菌株の種類や、外部の条件などに応じて好
ましい結果が得られるように適宜調節されるべきである
こと；まいうまでもない。このようにして得られる培養
物から、ＲＫｌ　４４１　Ａ及びＲＫ−１４４１Ｂを得
るには、代謝産物を採取するのに通常用いられる手段を
適宜に利用して採取し得る。たとえば、ＲＫ〜１４４１
　Ａ及びＲＫ〜１４４１Ｂと不純物との溶解度差を利用
する手段、イオン結合力の差を利用する手段、吸着親和
力の差を利用する手段、分子量の差を利用する手段のい
ずれも、それぞれ単独、又は、適宜組合せて、あるいは
反復して使用される。具体的には、ＲＫ−１４４１Ａ及
びＲＫ−１４４１Ｂは、培養濾液にその大部分が存在す
る。

その培養液を各種イオン交換クロマトグラフィーゲル濾
過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、液体
クロマトグラフィー、セルロース分配クロマトグラフィ
ー等を組合せて精製すると、ＲＫ−１４４１Ａ及びＲＫ
−１４４１Ｂ及びその他の活性成分を含む画分が得られ
る。二の画分を凍結乾燥して得ろれた粉末を更に高速液
体クロマトグラフィー（たとえば、ヌクレオジル５Ｃ１
８，３０％アセトニトリルの系で展開）により精製し、
ＲＫ−１４４１Ａ及びＲＫ−１４４１Ｂの精製粉末を得
る。

こうして得られたＲＫ−１４４１Ａ及びＲＫ１４４１Ｂ
の理化学的性質及び生物学的性質は次のとおりである。

〈抗生物質ＲＫ−１４４１Ａの理化学的性質及び生物学
的性質〉 融解点：１１５〜１２０℃（分解） 元素分析：　Ｃ５７，０７、Ｈ６，０１、Ｎ９．７２比
旋光度二　二αコＤ　＝−６９２°（ｃ　Ｏ，５２、メ
タノール） 紫外線吸収スペクトル： 溶解性：水、メタノール、エタノールに易溶分子式’、
　Ｃ＋、＋Ｈ＋５ＬＯｓ 分子量：２９４ 呈色反応：ライドン−スミス反応に陽性、坂口反応に陰
性 物質の色：黄色 抗菌スペクトル二通常の寒天平板上のディスク検定法で
示した。

３１８　（５，９００） 赤外線吸収スペクトル：　３４００．１６８０．１６２
０゜１２６０　ａｍ−’ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ＋ａ　ｃｏｌ＋）〈抗生物質ＲＫ
−１４４１Ｂの理化学的性質及び生物学的性質〉 融解点：２２４〜２３５℃ 元素分析：　Ｃ５６，０９、Ｈ５，１２、Ｎ９．９ｇ比
旋光度：　二α＝ｏ＝−２１９°（ｃ　Ｏ，５４、エタ
ノール） 紫外線吸収スペクトル： ３００　（８，６００）、３１０（ｓｈ　６，６００）
赤外線吸収スペクトル：　　３４００．１６２０．１２
６０ｃｒ’溶解性：水に難溶、メタノール及びエタノー
ルに可溶、ＤＭＳ○に易溶 分子式：　Ｃ１３８１４Ｎ２０Ｓ 分子量：２７８ 呈色反応：ライドン−スミス反応に陽性、坂口反応に陰
性 物質の色：黄白色 〈他物質との比較〉 これらの理化学的性質及び生物学的性質ををする抗生物
質は、これまでに文献記載のないものであって、ＲＫ−
１４４１Ａ及びＲＫ−１４４１Ｂを新規抗生物質と結論
した。

（ＲＫ−１４４１Ａ及びＲＫ−１４４１Ｂを有効成分と
する抗ウィルス剤） 本発明のＲＫ−１４４１Ａ及びＢを有効成分とする抗ウ
ィルス剤は、経口及び非経口投与のいずれも使用可能で
あり、経口投与する場合は軟・硬カプセル剤又は錠剤、
顆粒剤、細粒剤、散剤として投与され、非経口投与する
場合は、水溶性懸濁液、油性製剤などの皮下或は静脈注
射剤、点滴剤及び固体状又は懸濁粘稠状として持続的な
粘膜吸収が維持できるように坐薬のような剤型で投与さ
れ得る。

本発明の有効成分の製剤化は、界面活性剤、賦形剤、滑
沢剤、佐剤、及び有効成分の性質を考慮して腸溶性製剤
とするために医薬的に許容し得る皮膜形成物質、コーテ
ィング助剤等を用いて適宜行うことができ、その具体例
を挙げれば、次のとおりである。

本発明の組成物の崩壊、溶出を良好ならしめるために、
界面活性剤、例えばアルコール、エステル類、ポリエチ
レングリコール誘導体、ソルビタンの脂肪酸エステル類
、硫酸化脂肪アルコール類等の１種又は２種以上を添加
することができる。

また、賦形剤として、例えば蔗糖、乳糖、デンプン、結
晶でルロース、マンニット、軽質無水珪酸、アルミン酸
マグネシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、合成
珪酸アルミニウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウ
ム、リン酸水素カルシウム、カルボキシメチルセルロー
スカルシウム等の１種又は２種以上を組合わせて添加す
ることができる。

滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タ
ルク、硬化油等を１種又は２種以上添加することができ
、また矯味剤及び矯臭剤として、食塩、サッカリン、糖
、マンニット、オレンジ油カンゾウエキス、クエン酸、
ブドウ糖、メントーノベユーカリ油、リンゴ酸等の甘味
剤、香料、着色料、保存料等を含有させてもよい。

懸濁剤、湿潤剤の如き佐剤としては、例えばココナ／ツ
油、オリーブ油、コマ油、落花主油、乳酸力ルンウム、
ベニバナ油、大豆リン脂質等を含有させることができる
。

また、皮膜形成物質としては、セルロース、糖類等の炭
水化物誘導体として酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）
、またアクリル酸系共重合体、二塩基酸モノエステル類
等のポリビニル誘導体としてアクリル酸メチル・メタア
クリル酸共重合体、メタアクリル酸メチノペメタアクリ
ル酸共重合体が挙げられる。

また、上記皮膜形成物質をコーティングするに際し、通
常使用されるコーティング助剤、例えば可塑剤の他、コ
ーティング操作時の薬剤相互の付着防止のための各種添
加剤を添加することによって皮膜形成剤の性質を改良し
たり、コーティング操作をより容易ならしめることがで
きる。なお、有効成分を皮膜形成物質を用いてマイクロ
カプセル化してから賦形剤等と混合した剤型としても良
い。

特に代表的な剤型における配合比は下記のとおっである
。

有効成分 賦形剤 滑沢剤 界面活性剤 皮膜形成物質 ０．１〜９０　　重量％ １０〜９９８　〃 ０〜５Ｑ　　　　／１ ０〜５０〃 ０．１〜５Ｑ　　　　／／ 特に好ましい範囲 ０．１〜１５　　重量％ ８５〜９９４ノｌ Ｏ〜２０１１ Ｏ〜２０／１ Ｏ３３〜２０７１ 特に好ましい賦形剤；ま、乳糖、結晶セルロース、カル
ホキ／メチルセルロース力ルンウムである。

また、投与量は、対象腫瘍を有効：こ治療するに十分な
量であり、腫瘍の症状、投与経路、剤型などによって左
右されるが、一般に、経口投与の場合、大人では１日当
り、約０．０１〜Ｄｍｇ／ｋｇ体重（小人では、約００
１〜３ｍｇ／ｋｇ体重）の範囲で、その上限は好ましく
は約２．５　ｍｇ　／　ｋｇ体重、更に好ましくは約０
．５ｒｎｇ／ｋｇ体重程度であり、非経口投与の場合、
その上限は約０．５■／ｋｇ体重程度であり、好ましく
は約０．２５ｍｇ／ｋｇ体重、更に好ましくは約０．１
ｍｇ／ｋｇ体重が適当である。

（実施例） 以下に、本発明を製造例、製剤例及び試験例によって具
体的に説明するが、本発明はこれに河ろ限定されるもの
ではなｊ、）。

なお、「％」は重量％を表わす。

製造例 ＲＫ−１４４１株の醗酵液５βをセライトと共に濾過し
て、培養上清を得る。それを活性炭０．８！に吸着させ
た後、７０％アセトン２βにて活性物質を溶８させた。

溶出液を減圧濃縮し、次に、ソリ力ゲル力ラムクロマト
グラフィー（φ４０×４００ｍｍ）に供した。酢酸エチ
ル−エタノール（２０：１→ｌＯ：１−４：１→１：１
）の溶媒で活性画分の溶出を行った。ＲＫ−１４４１Ａ
は１０：１に、ＲＫ−１４４１Ｂは４：１の画分に回収
された。各々の濃縮液は、最終的に逆相系ＨＰＬＣ（セ
ンシューバックＮ５１７８のカラム）により単一に精製
された。この時のＨＰＬＣの条件は、３０％アセトニ）
　ＩＪル水溶液を移動相として、じＶ２２０ｎｍで溶ａ
物の検出を行った。得られたＲＫ−１４４１Ａは、約２
０ｍｇ、Ｂは約４０ｍｇξのっＩ−。

製剤例１　（注射・点滴剤） ＲＫ−１４４１Ａ、１０ｍｇを含有するように粉末ぶど
う糖５ｇを加えてバイアルに無菌的に分配し、密封した
上、窒素、ヘリウム等の不溶性ガスを密封して冷暗所に
保存する。使用前に０．８５％生理的食塩水１００ｍ１
を添加して静脈内注射剤とし、−日、１０〜１００ｍ１
を症状に応じて静脈内注射又は点滴で投与する。

製剤例２　（注射・点滴剤） ＲＫ　　１４４１Ｂ、２ｍｇを用イテ、製剤例１と同様
の方法により軽症用静脈内注射とし、１日、１０〜１０
０−を症状に応じて静脈内注射又は点滴で投与する。

製剤例３　（腸溶性カプセル剤） ＲＫ−１４４１Ａ、０．５ｇ、乳糖２．４６ｇ及びヒド
ロキシプロピルセルロース０．０４ｇを各々とり、よく
混合した後、常法に従って粒状に成形し、これをよ（乾
燥して篩別してビン、ヒートシール包装などに適した顆
粒剤を製造する。次に、酢酸フタル酸セルロース０．５
　ｇ及びヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレ−
）　０．５　ｇヲ溶解シテ被覆基材となし、前記顆粒を
浮遊流動させつつこの基材を被覆して腸溶性の顆粒剤と
する。この組成物をカプセルに充填して腸溶性カプセル
製剤１００個を製造する。

試験例 １）ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ）　ＡＴＣＣ１１９８４とバク
テリオファージ１１９８４Ｂを混合し、寒天平板培地上
に重層した。通常、２８℃、２４時間のインキュベート
によりストレプトミセス・グリセウスは完全に溶菌する
が、ペーパーディスクに抗ウィルス剤を染み込ませたも
のを寒天平板培地に置くと、ディスクの周囲にストレプ
トミセス・グリセウスの生育が回復する。ＲＫ−１４４
１Ａは２５μｇ／ｄｉｓｋで、ＲＫ−１４４１Ｂは５０
ｇｇ／ｄｉｓｋで抗フアージ活性を示した。

２）　エシェリヒア・ｍｌす（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　ｃｏｌｉ）とバクテリオファージＴ４を混合し、寒天
平板培地上に重層した。通常、３７℃、２４時間のイン
キュベートによりストレプトミセス・グリセウスは完全
に溶菌するが、ペーパーディスクに抗ウィルス剤を染み
込ませたものを寒天平板培地に置くと、ディスクの周囲
にストレプトミセス・グリセウスの生育が回復する。Ｒ
Ｋ−１４４１Ａは５０　μｇ　／ｄｉｓｋで、ＲＫ−１
４４１Ｂは１００μｇ／ｄｉｓｋで抗フアージ活性を示
した。

３）　マウス腺維芽細１１ｆｉＮＩＨ３Ｔ３にハーベー
のネスミ肉腫ウィルス（ヘルパー：モロニーのネズミ白
血病ウィルス）を感染させた５　１２日間培養すると細
胞が癌化してフォーカスを形成するが、この時、ＲＫ−
１４４１ＡをＩＬ４ｔｇ／ｍ／！。

ＲＫ−１４４１Ｂを３０μｇ／ｍｌ加えるとその形成が
阻害された。

ａ）　バタテリオファージＢとＴ４に対する阻止活性は
、３　ｍｍ径のペーパーディスクの周囲に放線菌あるし
）は大腸菌の生育が見られる最小量（μｇ／ｄｉｓｋ）
。

ｂ）　　Ｓ９ｇｒｉｓｅｕｓ　、　Ｅ、ｃｏｌｉに対す
る阻止活性はペーパーディスクの周囲に生育阻止用がで
きる最小量（μｇ／ｄｉｓｋ）。

ｃ）　　Ｈ−ＭＳＶ　Ｏ）阻止活性は、Ｈ−Ｍ　Ｓ　Ｖ
　（Ｍ　ｏ−Ｍ　Ｌ　Ｖ）を感染させ、薬剤存在下で１
２日間培養してフォーカス形成を抑制する最小濃度（μ
ｇ／ｍ１２）。

ｄ）　　ＮＩＨ３Ｔ３に対して細胞毒性を示す濃度（μ
ｇ／ｄ）は、薬剤存在下で７日間培養した時の細胞形態
で判定。

（発ジ弓の効果） 上記の試験結果より、抗生物質ＲＫ−１４４１、へ及び
Ｂ；ま、抗ウィルス活性、抗＠瘍活性などの効果が期待
される。

【図面の簡単な説明】

第１図：ま、本発明の抗生物質ＲＫ−１４４１Ａの５０
％エタノール溶液中での紫外線吸収スペクトルを示す図
であり、 第２図：ま、抗生物質ＲＫ−１４４１Ｂの５０％エタノ
ール溶液中での紫外線吸収スペクトルを示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記の式で表される新規抗生物質ＲＫ−１４４１
   Ａ及びＲＫ−１４４１Ｂ。 ＲＫ−１４４１Ａ：▲数式、化学式、表等があります▼ ＲＫ−１４４１Ｂ：▲数式、化学式、表等があります▼ （２）ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）
   属に属する抗生物質ＲＫ−１４４１生産菌を培養し、そ
   の培養物から抗生物質ＲＫ−１４４１Ａ及びＲＫ−１４
   ４１Ｂを分離採取することを特徴とする抗生物質ＲＫ−
   １４４１Ａ及びＲＫ−１４４１Ｂの製造法。（３）抗生
   物質ＲＫ−１４４１生産菌がストレプトミセス・エスピ
   ー・ＲＫ−１４４１（Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ　ｓ
   ｐ．ＲＫ−１４４１）である特許請求の範囲第２項に記
   載の製造法。 （４）抗生物質ＲＫ−１４４１Ａ及びＲＫ−１４４１Ｂ
   を有効成分として含有することを特徴とする抗ウィルス
   剤。