JPH04273891A - 新規抗生物質ｒｋ−２８６ｄ、その製造法並びに抗腫瘍剤及び抗炎症剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規抗生物質、その製
造法並びにそれを有効成分とする抗腫瘍剤及び抗炎症剤
に関する。

【０００２】

【従来の技術】リン脂質・カルシウム（Ｃａ２＋）　依
存性の蛋白質リン酸化酵素プロテインキナーゼＣは、動
物細胞中で、情報の受容・伝達等に重要な役割を担って
いる。 また、腫瘍プロモーターであるホルボールエステルやテ
レオシジンの受容体であることも知られている。

【０００３】プロテインキナーゼＣの阻害物質は、抗腫
瘍プロモーター、細胞増殖抑制（抗ガン剤）、抗血小板
凝集（抗炎症）などの効果が期待されるため、プロテイ
ンキナーゼＣに対する阻害作用を有する新規な抗腫瘍剤
及び抗炎症剤の開発が強く望まれている。

【０００４】

【発明の解決しようとする課題】本発明の目的は、新規
抗生物質とその製造法を提供することにある。更に、本
発明の目的は、上記抗生物質を有効成分とする抗腫瘍剤
及び抗炎症剤を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明の抗生物質は、後
述の理化学的性質を有する文献未載の新規な抗生物質で
あり、ＲＫ−２８６Ｄと命名された。抗生物質ＲＫ−２
８６Ｄは公知の抗生物質ＲＫ−２８６Ｃ（特願平２−２
５８７２４号公報参照）と同様にプロテインキナーゼＣ
に対して阻害活性を示すため、抗腫瘍プロモーターある
いは抗血小板凝集を示す有用な抗腫瘍剤及び抗炎症剤と
して利用できる。

【０００６】以下に、本発明を詳細に説明する。 ＜抗生物質ＲＫ−２８６Ｄの製造＞ （使用する微生物）本発明の抗生物質ＲＫ−２８６Ｄを
生産する微生物は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ）属に属する抗生物質ＲＫ−２８６Ｄの生産
能を有する菌種である。

【０００７】その一例として、ストレプトミセス・エス
ピー・ＲＫ−２８６（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．
　ＲＫ−２８６）（以下“ＲＫ−２８６株”と称する。 ）を挙げることができる。該微生物は、上記の特性を有
し、本発明の抗生物質ＲＫ−２８６Ｄを有利に生産する
ものであり、本発明の製造法に有効に利用し得るもので
ある。また、上記ＲＫ−２８６株の自然的及び人工的変
異株は勿論、ストレプトミセス属に属する菌種で後述の
抗生物質ＲＫ−２８６Ｄの生産能を有する微生物はすべ
て本発明方法において使用することができる。

【０００８】上記ＲＫ−２８６株は、石川県七尾市で採
取された土壌中より分離された土壌放線菌であり、工業
技術院微生物工業技術研究所に平成元年３月２７日付寄
託され、その微生物受託番号は、微工研菌寄第１０６３
４号（ＦＥＲＭＰ−１０６３４）である。 （培養法及び精製法）本発明の抗生物質ＲＫ−２８６Ｄ
を得るに当っては、ストレプトミセス属に属する上記抗
生物質生産菌を、抗生物質を生産する通常の方法に従っ
て培養する。培養の形態は、液体培養でも固体培養でも
よく、工業的に有利に培養するためには、前記生産菌の
胞子懸濁液又は培養液を培地に接種し、通気撹拌培養を
行えばよい。

【０００９】培地の栄養源としては特に限定されること
はなく、微生物の培養に通常用いられる炭素源、窒素源
その他を培地中に含有させることができる。炭素源とし
ては、澱粉、デキストリン、グリセリン、グルコース、
シュークロース、ガラクトース、トノシトール、マンニ
トールなどが、また窒素源としては、ペプトン、大豆粉
、肉エキス、米ぬか、麸、尿素、コーンスティープリカ
ー、アンモニウム塩、硝酸塩、その他の有機又は無機の
窒素化合物が用いられる。その他、無機塩類、たとえば
食塩、燐酸塩類、カリウム、カルシウム、亜鉛、マンガ
ン、鉄等の金属塩類等を適宜に添加してもよく必要に応
じて消泡剤として、動、植、鉱物油等を添加してもよい
。培養温度、培養時間等の培養条件は使用菌の発育に適
し、しかもＲＫ−２８６Ｄの生産が最高となるような条
件が選ばれる。たとえば、培地のｐＨは４〜９、特に中
性付近がよく、培養の適温は２５〜３５℃程度がよい。 しかし、これらの培養組成物、培地の水素イオン濃度、
培養温度、撹拌条件などの培養条件は使用する菌株の種
類や、外部の条件などに応じて好ましい結果が得られる
ように適宜調節されるべきであることはいうまでもない
。このようにして得られる培養物から、代謝産物を採取
するのに通常用いられる手段を適宜に利用してＲＫ−２
８６Ｄを採取して得る。たとえばＲＫ−２８６Ｄと不純
物との溶解度差を利用する手段、イオン結合力の差を利
用する手段、吸着親和力の差を利用する手段、分子量の
差を利用する手段のいずれも、それぞれ単独、又は、適
宜組合せて、あるいは反復して使用される。具体的には
、ＲＫ−２８６Ｄは、培養菌体にその大部分が存在する
。その培養菌体抽出物を各種のイオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグ
ラフィー、液体クロマトグラフィー、セルロース分配ク
ロマトグラフィー等を組合せて精製すると、ＲＫ−２８
６Ｄ及びその他の活性成分を含む画分が得られる。この
画分を凍結乾燥して得られた粉末を更に高速液体クロマ
トグラフィー（たとえばカプセルパックカラムを用い、
８０％メタノール０．１％アンモニアの系）で展開によ
り精製し、ＲＫ−２８６Ｄの精製淡黄色粉末を得る。

【００１０】こうして得られたＲＫ−２８６Ｄの理化学
的性質及び生物学的性質は次のとおりである。 溶解性　　：ジメチルスルホキシド、酢酸エチルメタノ
ールに易溶、水に不溶 分子量　　：４４１．１６９１（ＨＲ−ＥＩＭＳ）呈色
反応：ライドン−スミス、アニスアルデヒド・硫酸反応
に陽性、ニンヒドリン、ＦｅＣｌ３　反応に陰性物質の
色：淡黄色 薄層クロマトグラフィー：米国メルク社製シリカゲル　
　ＴＬＣ　プレート 溶媒　　クロロホルム：メタノール＝１０：１Ｒｆ値　
　０．６ 以上の諸性質から抗生物質ＲＫ−２８６Ｄは、以下の式
で示される新規物質であることが明らかとなった。

【００１１】

【化２】

【００１２】＜他物質との比較＞これらの理化学的及び
生物学的性質を有する抗生物質は、これまでに文献的に
報告されていないが、類似の抗生物質としてＫ−２５２
ｄ（ジャーナル　　オブアンティバイオテイクス　　３
９巻，１０７２頁，１９８６年）が知られている。しか
し抗生物質Ｋ２５２ｄと本発明の抗生物質ＲＫ−２８６
Ｄとは糖部分の構造が異なっており、分子量、分子式や
〔α〕Ｄ　の違いより明白に区別できる。 （ＲＫ−２８６Ｄを有効成分とする抗腫瘍剤及び抗炎症
剤）本発明のＲＫ−２８６Ｄを有効成分とする抗腫瘍剤
及び抗炎症剤は、経口及び非経口投与のいずれも使用可
能であり、経口投与する場合は軟・硬カプセル剤又は錠
剤、顆粒剤、細粒剤、散剤として投与され、非経口投与
する場合は、水溶性懸濁液、油性製剤などの皮下或は静
脈注射剤、点滴剤及び固体状又は懸濁粘稠状として持続
的な経皮吸収が維持できるように坐薬、塗布薬、軟膏の
ような剤型で投与され得る。

【００１３】本発明の有効成分の製剤化は、界面活性剤
、賦形剤、滑沢剤、佐剤、及び有効成分の性質を考慮し
て腸溶性製剤とするために医薬的に許容し得る皮膜形成
物質、コーティング助剤等を用い適宜行うことができ、
その具体例を挙げれば、次のとおりである。本発明の組
成物の崩壊、溶出を良好ならしめるために、界面活性剤
、例えばアルコール、エステル類、ポリエチレングリコ
ール誘導体、ソルビタンの脂肪酸エステル類、硫酸化脂
肪アルコール類等の１種又は２種以上を添加することが
できる。また、賦形剤として、例えば蔗糖、乳糖、デン
プン、結晶セルロース、マンニット、軽質無水珪酸、ア
ミン酸マグネシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム
、合成珪酸アルミニウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナ
トリウム、リン酸水素カルシウム、カルボキシメチルセ
ルロースカルシウム等の１種又は２種以上を組合せて添
加することができる。

【００１４】滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグ
ネシウム、タルク、硬化油等を１種又は２種以上添加す
ることができ、また嬌味剤及び嬌臭剤として、食塩、サ
ッカリン、糖、マンニット、オレンジ油カンゾウエキス
、クエン酸、ブドウ糖、メントール、ユーカリ油、リン
ゴ酸等の甘味剤、香料、着色料、保存料等を含有させて
もよい。

【００１５】懸濁剤、湿潤剤の如き佐剤としては、例え
ばココナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、乳酸
カルシウム、ベニバナ油、大豆リン脂質等を含有させる
ことができる。また、皮膜形成物質としては、セルロー
ス、糖類等の炭水化物誘導体として酢酸フタル酸セルロ
ース（ＣＡＰ）、またアクリル酸系共重合体、二塩基酸
モノエステル類等のポリビニル誘導体としてアクリル酸
メチル・メタクリル酸共重合体、メタアクリル酸メチル
・メタアクリル酸共重合体が挙げられる。

【００１６】また、上記皮膜形成物質をコーティングす
るに際し、通常使用されるコーティング助剤、例えば可
塑剤の他、コーティング操作時の薬剤相互の付着防止の
ための各種添加剤を添加することによって皮膜形成剤の
性質を改良したり、コーティング操作をより容易ならし
めることができる。なお、有効成分を皮膜形成物質を用
いてマイクロカプセル化してから賦形剤等と混合した剤
型としても良い。

【００１７】特に代表的な剤型における配合比は下記の
とおりである。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　特に好ましい
範囲　　　　有効成分　　　　　　　　０．１　〜９０
　　　　重量％　　　　　　０．１　〜１５　　　　重
量％　　　　賦形剤　　　　　　　　　　　１０　〜９
９．８　　　　〃　　　　　　　　　８５　〜９９．４
　　　　〃　　　　滑沢剤　　　　　　　　　　　　０
　〜５０　　　　　　〃　　　　　　　　　　０　〜２
０　　　　　　〃　　　　界面活性剤　　　　　　　　
０　〜５０　　　　　　〃　　　　　　　　　　０　〜
２０　　　　　　〃　　　　皮膜形成物質　　　　０．
１　〜５０　　　　重量％　　　　　　０．３　〜２０
　　　　重量％特に好ましい賦形剤は、乳糖、結晶セル
ロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムである
。また、投与量は、対象腫瘍を有効に治療するに十分な
量であり、腫瘍の症状、投与経路、剤型などによって左
右されるが、一般に、経口投与の場合、大人では１日当
り約０．０１〜５ｍｇ／Ｋｇ　体重（小人では、約０．
０１〜３ｍｇ／Ｋｇ　体重）の範囲で、その上限は好ま
しくは約２．５ｍｇ／Ｋｇ　体重、更に好ましくは約０
．５ｍｇ／Ｋｇ　体重程度であり、非経口投与の場合、
その上限は約０．５ｍｇ／Ｋｇ　体重程度であり、好ま
しくは約０．２５ｍｇ／Ｋｇ　体重、更に好ましくは約
０．１ｍｇ／Ｋｇ　体重が適当である。

【００１８】以下に、本発明を製造例、製剤例及び試験
例によって具体的に説明するが、本発明はこれに何ら限
定されるものではない。なお、「％」は重量％を表わす
。 製造例 グルコース１ｇ、きな粉１０ｇ、麦芽エキス１０ｇ、オ
ートミール５ｇ、肉エキス２．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ
、ＭｇＳＯ４　０．１ｇを水１リットルに溶解後ｐＨ７
．２に調整した生産培地に前記ＲＫ−２８６株を接種し
て、２７℃で１４４時間通気撹拌培養した。この全培養
液を菌体と培養液に分離して、菌体はアセトン抽出後、
培養液は直接に、それぞれ酢酸エチルで抽出した。抽出
された活性物質は減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマ
トグラフィーに供した（カラムサイズ７．４×５０ｃｍ
）。活性画分は、クロロホルム：メタノール＝１０：１
で溶出される。得られた活性画分を再度シリカゲルカラ
ムクロマトグラフィー（３×５０ｃｍ、クロロホルム：
メタノール＝５０：１）にて精製した。最終的に高速液
体クロマトグラフィー（カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ　ＰＡ
Ｋ　Ｃ１８　　　φ２×２５ｃｍ）で８０％　ＭｅＯＨ
　、０．１％　ＮＨ４ＯＨ（ｐＨ８）の溶媒系で単一物
質まで精製された。この時ＲＫ−２８６Ｄの保持時間は
約２４分であり、ＲＫ−２８６Ｃは約３０分で溶出され
た。収量は４ｍｇであった。 製剤例１（注射・点滴剤）ＲＫ−２８６Ｄ、１０ｍｇを
含有するように粉末ぶどう糖５ｇを加えてバイアルに無
菌的に分配し、密封した上、窒素、ヘリウム等の不活性
ガスを密封して冷暗所に保存する。使用前に０．８５％
生理的食塩水１００ミリリットルを添加して静脈内注射
剤とし、１日、１０〜１００ミリリットルを症状に応じ
て静脈内注射又は点滴で投与する。 製剤例２（注射・点滴剤）ＲＫ−２８６Ｄ、２ｍｇを用
いて、製剤例１と同様の方法により軽症用静脈内注射剤
とし、１日、１０〜１００ミリリットルを症状に応じて
静脈内注射又は点滴で投与する。 製剤例３（腸溶性カプセル剤）ＲＫ−２８６Ｄ、０．５
ｇ、乳糖２．４６ｇ及びヒドロキシプロピルセルロース
０．０４ｇを各々とり、よく混合した後、常法に従って
粒状に成形し、これをよく乾燥して篩別してビン、ヒー
トシール包装などに適した顆粒剤を製造する。次に、酢
酸フタル酸セルロース０．５ｇ及びヒドロキシプロピル
メチルセルロースフタレート０．５ｇを溶解して被覆基
材となし、前記顆粒を浮遊流動させつつこの基材を被覆
して腸溶性の顆粒剤とする。この組成物をカプセルに充
填して腸溶性カプセル製剤１００個を製造する。 製剤例４（軟膏剤）プラスチベース７０％及びポリアク
リル酸ナトリウム３０％からなる基剤９９．９重量部に
、ＲＫ−２８６Ｃ０．１重量部を混和して軟膏剤を得た
。 試験例 ヒト骨髄性白血病細胞Ｋ５６２を１０％牛胎児血清を含
むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。培養は３７℃、５
％の炭酸ガス培養器にて行った。

【００１９】細胞密度を１０５　細胞／ミリリットルに
合わせた後、終濃度０．１μｇ　／ミリリットルとなる
ようにホルボールエステル（ｐｈｏｒｂｏｌ　１２，１
３−ｄｉｂｕｔｙｒａｔｅ）　を加えた。３０分後（こ
の間、細胞は炭酸ガス培養器中に静置）、顕微鏡で観察
するとＫ５６２細胞表面に著しい形態変化（水泡化）が
生じた。これは、プロテインキナーゼＣの活性化による
ものである。図３に、形態変化した細胞の割合と薬剤の
モル濃度との関係を示したが、ＲＫ−２８６Ｄ物質をホ
ルボールエステルとともに細胞に加えると、その形態変
化を抑制していることがわかる。これは、プロテインキ
ナーゼＣ活性の阻害によるものであり、阻害活性（ＩＣ
５０）は、約３１．６μＭ　を示した。

【００２０】

【発明の効果】上記の試験結果より、抗生物質ＲＫ−２
８６Ｄは、プロテインキナーゼＣに対する阻害活性を示
すため、抗腫瘍剤プロモーター、細胞増殖抑制（抗ガン
剤）、抗血小板凝集（抗炎症）などの効果を生じる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の抗生物質ＲＫ−２８６Ｄのメタノール
溶液中（２．５μｇ　／μｌ　）での紫外線吸収スペク
トルを示す図である。

【図２】抗生物質ＲＫ−２８６Ｄの赤外線吸収スペクト
ル（ＫＢｒ　中）を示す図である。

【図３】抗生物質ＲＫ−２８６Ｄ及び公知の抗生物質Ｒ
Ｋ−２８６ＣのプロテインキナーゼＣに対する阻害活性
を示す図である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　下記の式で示される抗生物質ＲＫ−２
   ８６Ｄ。 【化１】
2. 【請求項２】　　ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
   ｙｃｅｓ）属に属する抗生物質ＲＫ−２８６Ｄ生産菌を
   培養し、その培養物から抗生物質ＲＫ−２８６Ｄを分離
   採取することを特徴とする抗生物質ＲＫ−２８６Ｄの製
   造法。
3. 【請求項３】　　抗生物質ＲＫ−２８６Ｄ生産菌がスト
   レプトミセス・エスピー・ＲＫ−２８６（Ｓｔｒｅｐｔ
   ｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．　ＲＫ−２８６）である請求項２
   に記載の製造法。
4. 【請求項４】　　抗生物質ＲＫ−２８６Ｄを有効成分と
   して含有することを特徴とする抗腫瘍剤。
5. 【請求項５】　　抗生物質ＲＫ−２８６Ｄを有効成分と
   して含有することを特徴とする抗炎症剤。